專利名稱：滴定復(fù)合病毒組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒組合物領(lǐng)域；更具體地說本發(fā)明涉及一種確定包含不同活病毒種或型的組合物中的各個(gè)種，或更具體地說指定的病毒種的各種血清型的病毒數(shù)量的方法。
現(xiàn)有技術(shù)已知分析病毒組合物中各種病毒種或病毒型的量的方法。通常采用的方法由使用多克隆抗體中和不希望分析的病毒，并接著確定剩余病毒的量組成。當(dāng)需要確定在用于抗脊髓灰質(zhì)炎疫苗接種的組合物中I、II、III型減毒活病毒的數(shù)量時(shí)情況尤其如此。然而，這些方法并不總是可行的，因?yàn)槟承r(shí)候中和存在于組合物中的一些病毒，而不干擾希望分析的病毒是困難的，甚至是不可能的，尤其是在欲滴定包含特定病毒，如登革病毒的幾種血清型的病毒組合物時(shí)。這是因?yàn)闆]有型特異性多克隆抗體；能識(shí)別特異性指定型的單克隆抗體通常不夠中和；甚至有時(shí)沒有已知的中和單克隆抗體。然而，在一些情況下，尤其是在疫苗工業(yè)，必須制備以完全確定的比例包含不同病毒種，或某一病毒種不同血清型的病毒組合物。而且，藥物學(xué)要求使得必須隨后能以可靠的方式定量地控制所制備的產(chǎn)物的組成。
因此希望能夠獲得使復(fù)合病毒組合物無需修飾就能被滴定的方法。
為此目的，本發(fā)明涉及一種確定包含不同活病毒種或型的組合物中的各種病毒型或病毒種的病毒量的方法，特征在于它包含下面步驟在不誘導(dǎo)病毒干擾的允許細(xì)胞中繁殖各種型或種的病毒，使用特異性單克隆抗體分析各種型或種的病毒。
根據(jù)本發(fā)明的方法被用于包含一些不同種的病毒和/或同一種的一些血清型的組合物。病毒尤其可為導(dǎo)致脊髓灰質(zhì)炎、風(fēng)疹、流行性腮腺炎、麻疹或登革熱的病毒或其它輪狀病毒。包含這些病毒的組合物可為疫苗組合物，其中雖然病毒毒性被減弱，但病毒被維持在活的狀態(tài)。因此，組合物可為例如包含脊髓灰質(zhì)炎病毒的三種血清型的疫苗組合物或包含登革病毒的四種血清型的組合物。當(dāng)病毒的抗原性極為相關(guān)并且一種血清型的中和通過交叉反應(yīng)導(dǎo)致其它血清型的中和時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的方法尤為令人關(guān)注。
根據(jù)本發(fā)明，存在于待檢測的組合物中的病毒以各種稀釋度在不誘導(dǎo)病毒干擾的允許細(xì)胞中繁殖。因此可以使用Vero細(xì)胞。
將細(xì)胞置于適宜于培養(yǎng)細(xì)胞的平板的各孔中并接著接種病毒懸液。
用于病毒繁殖的培養(yǎng)基為根據(jù)采用的細(xì)胞以及待滴定的病毒的性質(zhì)而加以調(diào)整的常規(guī)培養(yǎng)基。在CO2氣氛下，在病毒的最適生長溫度下，將病毒溫育，溫育時(shí)間取決于具體病毒(例如在登革病毒的情況下為一周)，然后除去細(xì)胞培養(yǎng)物上清；接著使用例如預(yù)冷的丙酮固定細(xì)胞。
接著根據(jù)進(jìn)行的滴定使用種或血清型特異的單克隆抗體確定各種稀釋度存在的病毒量。使用熒光素標(biāo)記的抗一種抗體或使用適宜于ELISA檢測的底物使反應(yīng)顯色。通過Spearman和Karber法確定病毒效價(jià)并以感染50％細(xì)胞培養(yǎng)物的劑量表示(CCID50)。
使用特異于病毒組合物中希望滴定的病毒種或型的各種單克隆抗體平行進(jìn)行相同的過程。
因此，使用該方法可令人驚奇地滴定存在于沒有一種血清型占優(yōu)勢的病毒組合物中的各種血清型。
實(shí)施例滴定四種一價(jià)疫苗組合物，其中每一種包含一種登革病毒的血清型，以及在分析時(shí)通過混合等量的四種檢測的一價(jià)組合物制備的組合物。
以下面的方式在96孔微量平板中進(jìn)行滴定-使用包含5％胎牛血清和2g/l碳酸氫鈉的MEM培養(yǎng)基制備各種組合物的連續(xù)稀釋物，-將由此獲得的病毒懸液以10孔/稀釋度的比例接種至已建立一天的Vero細(xì)胞層(參考ATCCCCL81VERO)上。在至少一個(gè)96孔平板中滴定一價(jià)懸液和四價(jià)組合物的效價(jià)，-接著36℃下，5％CO2中，將平板保溫一周，-除去細(xì)胞培養(yǎng)物上清，用冷卻至-20℃的丙酮將細(xì)胞固定于平板上，-使用特異于疫苗組合物中血清型的單克隆抗體檢測病毒的存在。采用的抗體來自由CDC(疾病控制中心，Atlanta，美國)提供的雜交瘤。
國際1血清型用來自雜交瘤D2-1F1-3的抗體標(biāo)記國際2血清型用來自雜交瘤3H5-1-12的抗體標(biāo)記國際3血清型用來自雜交瘤5D4-11-24的抗體標(biāo)記國際4血清型用來自雜交瘤1H10-6-7的抗體標(biāo)記-使用熒光素標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體使反應(yīng)顯色。
使用熒光顯微鏡讀取結(jié)果。計(jì)數(shù)各種稀釋度情況下具有至少一個(gè)感染灶(具熒光)的孔數(shù)目。
產(chǎn)物的效價(jià)相當(dāng)于導(dǎo)致50％細(xì)胞層受影響的稀釋度(即為50％的孔)并通過Spearman和Karber法確定。它以CCID50的log10以表示。
借助于平行進(jìn)行的各種分析，獲得下面的結(jié)果
注意到獲得的結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果一致；對于四價(jià)混合物中各種病毒型所觀察到的效價(jià)的差異變化為約0.5 log10CCID50，它相當(dāng)于制備混合物時(shí)各種血清型的1/4稀釋度。
因此，根據(jù)本發(fā)明可使用非中和單克隆抗體分析存在于病毒組合物中的各種血清型，而不誘導(dǎo)不同血清型之間的干擾。
權(quán)利要求
1.確定包含不同活病毒種或型的組合物中的各種病毒型或病毒種的病毒數(shù)量的方法，特征在于它包含下面步驟在不誘導(dǎo)任何病毒干擾的允許細(xì)胞中繁殖各種型或種的病毒，使用特異性的單克隆抗體分析各種型或種的病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于繁殖在Vero細(xì)胞中進(jìn)行。
3.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，特征在于包含不同活病毒種或型的組合物為疫苗組合物。
4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，特征在于包含不同活病毒種或型的組合物為包含四種減毒活登革病毒血清型的組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，特征在于包含不同治病毒種或型的組合物為包含三種活的減毒脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，特征在于包含不同活病毒種或型的組合物為包含不同型輪狀病毒的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種確定包含不同種或型的活病毒的組合物中各種型或種的病毒量的方法,由下面步驟組成:在不誘導(dǎo)病毒干擾的允許細(xì)胞中繁殖各種型或種的病毒;使用特異性的單克隆抗體分析各種型或種的病毒。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1259207SQ98805813
公開日2000年7月5日 申請日期1998年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月4日
發(fā)明者C·格爾迪爾, J·F·薩魯佐 申請人:巴斯德梅里厄血清及疫苗公司