專利名稱：包含果膠甲酯酶和兩種底物的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合物。具體而言，本發(fā)明涉及一種用作食料或在食料制備中使用的組合物。更具體的說，本發(fā)明涉及一種用作食料或在食料制備中使用的組合物，所述組合物包含果膠或果膠衍生物，或由果膠或果膠衍生物制備。
在現(xiàn)代工業(yè)中果膠是一種重要的物品。例如它可以在諸如果醬制備的食料工業(yè)中用作增稠劑或膠凝劑。
果膠是一種一般在植物細(xì)胞壁中以原果膠形式發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)多糖。果膠主鏈包括α-1-4鏈接的半乳糖醛酸殘基，這些殘基由少數(shù)1，2鏈接的α-L-鼠李糖單元間隔。另外，果膠包括多個(gè)具有幾乎交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖鏈的高度分支區(qū)域。這些高分支區(qū)域也包含其它糖單元(諸如D-半乳糖、L-阿拉伯糖和木糖)，它們通過糖苷鍵連接于鼠李糖單元的C3或C4原子上，或者連接于半乳糖醛酸單元的C2或C3原子上。α-1-4鏈接的半乳糖醛酸殘基的長(zhǎng)鏈一般稱為“平滑”區(qū)，而所述高度分支區(qū)一般稱為“毛狀區(qū)”。
酯化半乳糖醛酸殘基的一些羧基(例如甲基化羧基基團(tuán))。典型的羧基酯化在半乳糖醛酸殘基聚合之后發(fā)生。然而，將所有的羧基酯化(例如甲基化)是非常罕有的。通常，酯化度在0-90％之間變化。如果50％或更多的羧基酯化，那么生成的果膠稱為“高酯果膠”(簡(jiǎn)稱為“HE果膠”)或“高甲氧基果膠”。如果少于50％的羧基酯化，那么生成的果膠稱為“低酯果膠”(簡(jiǎn)稱為“LE果膠”)或“低甲氧基果膠”。如果50％的羧基酯化，那么生成的果膠稱為“中酯果膠”(簡(jiǎn)稱為“ME果膠”)或“中甲氧基果膠”。如果果膠不包含任何酯化的基團(tuán)或僅包含少數(shù)酯化的基團(tuán)，通常稱其為果膠酸。
果膠結(jié)構(gòu)，特別是酯化(例如甲基化)度，決定了果膠的許多所得的物理和/或化學(xué)性質(zhì)。例如果膠膠凝取決于果膠的化學(xué)性質(zhì)，尤其是酯化度。然而，除此之外，果膠膠凝也取決于可溶性固體的含量、pH值和鈣離子濃度。關(guān)于后者，相信鈣離子與游離羧基、具體的說是那些在LE果膠上的游離羧基形成絡(luò)合物。
按照果膠酶攻擊果膠分子的半乳糖醛酸聚糖部分的方式對(duì)其分類。Pilnik和Voragen(Food Enzymology，編輯P.F.Fox；Elsevier；(1991)；第303-337頁(yè))撰寫了一些果膠酶的綜述。具體而言，果膠甲酯酶(EC 3.1.1.11)，或者稱為PME，使HE果膠脫酯為L(zhǎng)E果膠或果膠酸。相反，作為實(shí)例，果膠解聚酶分裂在半乳糖醛酸基(galacturonosyl)甲酯殘基之間的糖苷鍵。
更具體而言，PME活性產(chǎn)生游離羧基和游離甲醇。利用自動(dòng)滴定可以很容易監(jiān)測(cè)游離羧基的增加。在這方面，較早的研究顯示一些PME以隨機(jī)方式使果膠脫酯，在此情況下它們將在一個(gè)或一個(gè)以上的果膠鏈上的任何酯化(例如甲基化)的半乳糖醛酸殘基脫酯。將果膠隨機(jī)脫酯的PME的實(shí)例可以由諸如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(參見WO94/25575)和日本曲霉(Aspergillus japonicus)(Ishii等1980 J Food Sci 44第611-14頁(yè))的真菌來(lái)源獲得。Baron等(1980 Lebensm.Wiss.M-Technol13第330-333頁(yè))顯然分離出了來(lái)自黑曲霉(Aspergillus niger)的真菌PME。據(jù)報(bào)導(dǎo)這種真菌PME的分子量為39000道爾頓，等電點(diǎn)為3.9，最適pH值為4.5，Km值(mg/ml)為3。
相反，已知一些PME以一種區(qū)段式方式將果膠脫酯，在此情況下相信它們或者在非還原末端，或者緊靠游離羧基之處攻擊果膠，然后通過單鏈機(jī)制沿果膠分子繼續(xù)攻擊，從而產(chǎn)生非酯化的半乳糖醛酸單元(它們可以是鈣敏感性的)區(qū)段。這種將果膠區(qū)段式酶促脫酯的酶的實(shí)例是植物PME。已經(jīng)提出在柑桔中存在最多12種PME的同種型(Pilnik W.和Voragen A.G.J.(Food Enzymology(編輯P.F.Fox)；Elsevier；(1991)；第303-337頁(yè))。這些同種型有不同的性質(zhì)。
可以通過高效離子交換層析辨別游離羧基的隨機(jī)或區(qū)段式的分布狀態(tài)(Schols等Food Hydrocolloids 1989 6第115-121頁(yè))。這些實(shí)驗(yàn)經(jīng)常用來(lái)在巴氏消毒后檢查柑桔汁中不希望的、殘余的PME活性，因?yàn)闅堄郟ME除了在柑桔汁中產(chǎn)生甲醇外，還可以在橙汁中引起通常所說的“混濁損失(cloud loss)”。
諸如由天然植物源獲得的果膠的PME底物，一般是DE大約為70％的高酯果膠形式。必須向包含這些高酯PME底物的提取物中加入糖，以提供足夠的可溶性固體來(lái)引發(fā)膠凝。通常需要最少55％的可溶性固體。當(dāng)可溶性固體百分比少于55％時(shí)，凝縮傾向于更經(jīng)常發(fā)生。當(dāng)確實(shí)發(fā)生凝縮時(shí)，必須使用昂貴的添加劑引發(fā)膠凝。
Versteeg等(J Food Sci 45(1980)第969-971頁(yè))顯然分離了一種來(lái)自橙的PME。據(jù)報(bào)導(dǎo)此植物PME在多種不同性質(zhì)的同種型中存在。同種型I的分子量為36000道爾頓，等電點(diǎn)10.0，最適pH值7.6，Km值(mg/ml)為0.083。同種型II的分子量為36200道爾頓，等電點(diǎn)11.0，最適pH值8.8，Km值(mg/ml)為0.0046。同種型III(HMW-PE)的分子量為54000道爾頓，等電點(diǎn)10.2，最適pH值8，Km值(mg/ml)為0.041。然而，至今關(guān)于這些PME的序列資料仍很有限。
根據(jù)Pilnik和Voragen(出處同上)，可以在許多其它高等植物中發(fā)現(xiàn)PME，諸如蘋果、杏、鱷梨、香蕉、漿果、酸橙、葡萄柚、橘子、櫻桃、醋栗、葡萄、芒果、番木瓜、西番蓮果、桃、梨、李子、豆、胡蘿卜、花椰菜、黃瓜、韭、洋蔥、豌豆、馬鈴薯、蘿卜和西紅柿。然而，至今關(guān)于這些PME的序列資料同樣很有限。
在WO-A-97/03574中報(bào)導(dǎo)了一種植物PME(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。此PME有如下特征分子量為大約36 kD至大約64 kD；當(dāng)在0.15 M NaCl中用0.5％酸橙果膠檢測(cè)時(shí)，最適pH值為7-8；最適溫度為至少50℃；溫度穩(wěn)定性范圍由10℃至最少40℃；Km值為0.07％；活性最大在大約0.25 M NaCl水平；活性最大在大約0.2 M Na2SO4水平；活性最大在大約0.3 M NaNO3水平。
在WO 97/31102中報(bào)導(dǎo)了另一種PME(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。
PME在工業(yè)上有重要的應(yīng)用。例如，它們可以用于或用作鈣離子螯合劑。在這方面，根據(jù)Pilnik和Voragen所述(出處同上)，可以在提取汁之后，通過向柑桔皮加入氫氧化鈣漿液制備家畜飼料。在加入氫氧化鈣之后，用高pH值和鈣離子激活任何在柑桔皮中的天然PME，引起果膠快速脫酯，并發(fā)生果膠酸鈣凝結(jié)。釋放束縛液相，并將其輕易壓出，以便僅一部分原始含水量需要通過昂貴的熱干燥去除。然后使用壓出液作為動(dòng)物飼料。
如上所述，由棘孢曲霉得到一種PME(WO 94/25575)。顯然此PME可用于提高包含果膠底物的堅(jiān)固度，或?qū)⒐z脫甲基，或提高含果膠底物的粘性。
在由含果膠的水果或蔬菜原料制備的食料(諸如果醬或防腐劑)的制備中，也開始普遍使用PME。例如WO-A-94/25575進(jìn)一步報(bào)導(dǎo)了使用得自棘孢曲霉的PME制備橙皮馬末蘭果醬和番茄醬。
JP-A-63/209553公開了在多價(jià)金屬離予存在的情況下，通過果膠甲酯酶作用于果膠多糖得到的凝膠以及其生產(chǎn)方法，所述果膠多糖包含作為主要成分的高甲氧基聚α-1，4-D-半乳糖醛酸酐(galacturonide)鏈。
Pilnik和Voragen(出處同上)列出了內(nèi)源PME的用途，包括如果果汁包含太多源自水果的果膠，則將該內(nèi)源PME加入到果汁中降低果汁的粘性；將該內(nèi)源PME作為果膠酶溶液加入到在柑桔類水果中的白色氣體泡沫上，為了有利于從完整果汁部分中去除果皮和其它膜，將水果加熱至果核溫度為20℃至40℃(US-A-4284651)；以及用于保護(hù)和提高幾種加工的水果和蔬菜的組織和堅(jiān)固定，所述加工水果和蔬菜諸如蘋果(Wiley和Lee 1970 Food Technol 24 1168-70)、罐裝西紅柿(Hsu等1965 J Food Sci 30第583-588頁(yè))和罐裝馬鈴薯(Bartolome和Hoff1972 J Agric Food Chem 20第262-266頁(yè))。
Glahn和Rolin(1994 Food Ingredients Europe，Conf Proceedings第252-256頁(yè))報(bào)導(dǎo)了用于和酸奶飲料相互作用的工業(yè)“GENU果膠類型YM-100”的設(shè)想的應(yīng)用。根本沒有關(guān)于GENU果膠類型YM-100如何制備的細(xì)節(jié)。
EP-A-0664300公開了制備鈣敏感性果膠的化學(xué)分級(jí)分離法。該鈣敏感性果膠據(jù)說有益于食料工業(yè)。
因此，果膠和脫酯果膠，還有PME，具有工業(yè)價(jià)值。
現(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)，在例如食料的制備中使用PME得到的利益在某種程度上取決于使用的PME的質(zhì)和量和類型，以及可能存在于用來(lái)制備食料的材料中的PME底物(具體的說是果膠)的質(zhì)和量和類型。例如，如果所述底物是水果材料或蔬菜材料，那么在該物質(zhì)中的天然果膠的量和/或結(jié)構(gòu)將由于水果材料或蔬菜材料的類型不同而不同。這也通過在WO-A-94/25575中提供的數(shù)據(jù)、尤其是圖7得到了證明，其中可清楚地看到其PME系統(tǒng)是不理想的。
按照本發(fā)明我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，加入另外的PME底物使人們能夠從在制備例如食料時(shí)使用PME中獲得甚至更多的利益。
在這方面，加入另外的PME底物將克服任何與PME底物的量和質(zhì)不同有關(guān)的問題，所述PME底物可以在用于制備例如食料的材料中發(fā)現(xiàn)。
按照本發(fā)明的第一方面，提供一種包括果膠甲酯酶(“PME”)、第一PME底物和第二PME底物的組合物；其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
按照本發(fā)明的第二方面，提供一種制備組合物的方法，它包括形成一種PME、第一PME底物和第二PME底物的混合物；其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
按照本發(fā)明的第三方面，提供一種包括向第一PME底物中加入PME和第二PME底物的方法；其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
按照本發(fā)明的第四方面，提供一種包括本發(fā)明其它方面或由本發(fā)明其它方面制備或通過本發(fā)明其它方面制備的食料。
按照本發(fā)明的第五方面，也提供一種由果膠甲酯酶(“PME”)、第一PME底物和第二PME底物制成的組合物；其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
按照本發(fā)明的第六方面，提供一種賦予包含第一PME底物的反應(yīng)介質(zhì)穩(wěn)定性的方法，所述方法包括至少加入PME和第二PME底物；其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
因此，在廣泛意義上來(lái)說，本發(fā)明提供一種包括PME、第一PME底物和第二PME底物的組合物；其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
就本發(fā)明而言，不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。所述術(shù)語(yǔ)“不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生”是指所述第一PME底物不是在原位由所述第二PME底物產(chǎn)生和/或所述第二PME底物不是在原位由所述第一PME底物產(chǎn)生。所以，就本發(fā)明來(lái)說，所述第一PME底物不是在原位由所述第二PME底物產(chǎn)生，反之亦然。因此，例如，本發(fā)明的組合物不僅僅包括大量第一PME底物，其中一部分該P(yáng)ME底物已由PME酶部分改性。相反，也一定存在第二PME底物，其中該第二PME底物不是在原位由所述第一PME底物產(chǎn)生。
就本發(fā)明的組合物來(lái)說，可以存在另外的、不同的PME底物。
在本發(fā)明的組合物中或用于本發(fā)明的組合物的PME底物可以由不同的來(lái)源獲得和/或可以具有不同的化學(xué)組成。
同樣，就本發(fā)明的組合物來(lái)說，可以存在另外的、不同的PME酶。
如果有超過一種PME存在，那么所述PME酶可以由不同的來(lái)源獲得和/或可以具有不同的組成和/或可以有不同的反應(yīng)性分布型(例如不同的最適pH值和/或不同的最適溫度)。
就本發(fā)明來(lái)說，所述PME酶可以以隨機(jī)方式或以區(qū)段式方式使PME底物脫酯。如果有超過一種的PME，則每種PME獨(dú)立選自可以以隨機(jī)方式使PME底物脫酯的PME或可以以區(qū)段式方式使PME底物脫酯的PME。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述(或至少一種)PME酶以區(qū)段式方式使PME底物脫酯。
如果有超過一種的PME，則每種PME獨(dú)立選自對(duì)鈉離子敏感(Na-敏感)的PME酶、或?qū)︹c離子不敏感(Na-不敏感)的PME酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述(或至少一種)PME酶是Na-敏感的PME酶。
所述PME可以得自天然源，乃至從天然源獲得或可以化學(xué)合成。
例如，所述PME可以由真菌獲得，作為實(shí)例諸如真菌來(lái)源的PME(即得自真菌的PME)。
另一方面，所述PME可以由細(xì)菌獲得，作為實(shí)例如細(xì)菌來(lái)源的PME(即得自細(xì)菌的PME)。
另一方面，所述PME可以由植物獲得，作為實(shí)例諸如植物來(lái)源的PME(即得自植物的PME)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述PME使用重組DNA技術(shù)制備。
例如，所述PME可以是如在WO-A-97/03574中公開的重組PME，或是在或者WO-A-94/25575或者WO-A-97/31102中公開的PME，以及在那些專利申請(qǐng)中公開的序列的變異體、衍生物或同系物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述PME是WO-A-97/03574(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中的重組PME，諸如SEQ.I.D.No.1或SEQ.I.D.No.2(它們分別由SEQ.I.D.No.3和SEQ.I.D.No.4提出的核苷酸序列編碼)的PME或其變異體、衍生物或同系物；和/或WO-A-94/25575(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)的PME或其變異體、衍生物或同系物。
與本發(fā)明所述重組酶有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“變異體”、“同系物”或“片段”包括對(duì)所述序列的一個(gè)(或多個(gè))氨基酸的任何置換、變異、修飾、替代、缺失或添加，只要所生成的氨基酸序列具有PME活性，優(yōu)選其活性與包括SEQ I.D.No.s 1和2所示序列的任何一個(gè)或多個(gè)序列的重組酶至少相同。具體來(lái)說，只要所生成的重組酶具有PME活性，那么術(shù)語(yǔ)“同系物”包括與結(jié)構(gòu)和/或功能有關(guān)的同源性。對(duì)于序列同源性(即相似性)來(lái)說，優(yōu)選是同所附序列表所示的序列至少75％同源，更優(yōu)選是至少85％同源，更優(yōu)選是至少90％同源。更優(yōu)選是同所附序列表所示的序列至少95％同源，更優(yōu)選是至少98％同源。
與編碼本發(fā)明所述重組酶的核苷酸序列有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“變異體”、“同系物”或“片段”包括對(duì)所述序列的一個(gè)(或多個(gè))氨基酸的任何置換、變異、修飾、替代、缺失或添加，只要所生成的核苷酸序列編碼具有PME活性的重組酶，優(yōu)選編碼其活性與包括SEQ I.D.No.1和2所示序列的任何一個(gè)或多個(gè)序列的重組酶的活性至少相同的重組酶。具體來(lái)說，只要所生成的核苷酸序列編碼具有PME活性的重組酶，那么術(shù)語(yǔ)“同系物”包括與結(jié)構(gòu)和/或功能有關(guān)的同源性。對(duì)于序列同源性(即相似性)來(lái)說，優(yōu)選是至少75％同源，更優(yōu)選是至少85％同源，更優(yōu)選是至少90％同源。更優(yōu)選是至少95％同源，更優(yōu)選是至少98％同源。
上述術(shù)語(yǔ)和所述序列的等位變異同義。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種所述PME底物是果膠或是可得自果膠的底物或是由果膠衍生的底物(例如果膠衍生物)。
術(shù)語(yǔ)“由果膠衍生”包括衍生的果膠、降解(諸如部分降解)的果膠和改性的果膠。改性的果膠的實(shí)例是用諸如PME的酶預(yù)先處理的果膠。果膠衍生物的實(shí)例是經(jīng)過化學(xué)處理(例如酰胺化)的果膠。
最好是，每種所述第一PME底物和所述第二PME底物都獨(dú)立選自果膠、可得自果膠的底物或由果膠衍生的底物。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)所述第一PME底物和所述第二PME底物都是果膠。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，或者所述第一PME底物，或者所述第二PME底物是改性的果膠，特別是酶改性的果膠，優(yōu)選是PME處理的果膠。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二PME底物是這樣一種改性的果膠。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種所述第一PME底物和所述第二PME底物都是這樣一種改性的果膠。
所述第一PME底物最好是存在于(即在原位)植物或植物材料中。所述植物可以是轉(zhuǎn)基因植物，諸如經(jīng)過基因工程改造以產(chǎn)生不同水平和/或類型的果膠的植物。另外，所述植物材料可以由轉(zhuǎn)基因植物獲得，諸如經(jīng)過基因工程改造以產(chǎn)生不同水平和/或類型的果膠的植物。
所述植物或植物材料可以是蔬菜、水果或其它類型的包含或產(chǎn)生果膠的植物，或者可以得自它們。
所述植物料最好是蔬菜材料和/或水果材料。
所述蔬菜材料和/或水果材料最好是漿(mash)。
所述第一PME底物和/或所述第二PME底物可以是低酯果膠、中酯果膠或高酯果膠的任何一種或多種。
所述第二PME底物最好是低酯果膠、中酯果膠或高酯果膠?？梢栽赪O-A-97/03574第58頁(yè)(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中找到檢測(cè)所述PME底物酯化度的方法。為了便于參考，在實(shí)施例部分(下文)陳述了此方法。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二PME底物是高酯果膠。
對(duì)于本發(fā)明來(lái)說，所述第一PME底物和所述第二PME底物獨(dú)立選自對(duì)鈣離子敏感(Ca-敏感)的PME底物或?qū)︹}離子不敏感(Ca-不敏感)的PME底物?？梢栽赪O-A-97/03574第57頁(yè)(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中找到檢測(cè)鈣離子敏感性的方法。為了便于參考，在實(shí)施例部分(下文)陳述了此方法。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第二PME底物是鈣敏感性的。
最好是將所述第二PME底物加入到所述第一PME底物中。在此，術(shù)語(yǔ)“加入到”就物理意義上講包括將所述第二PME底物加入到所述第一PME底物中，反之亦然。
可以在加入所述第二PME底物的同時(shí)，或在加入所述第二PME底物之前，或在加入所述第二PME底物之后，加入PME。
因此，本發(fā)明至少包括以下可能性在加入所述第二PME底物的同時(shí)向所述第一PME底物中加入PME；在加入所述第一PME底物的同時(shí)向所述第二PME底物中加入PME；在加入所述第一PME底物的同時(shí)向PME中加入所述第二PME底物；同時(shí)向反應(yīng)容器中加入PME和所述第一PME底物和所述第二PME底物；在加入到所述第二PME底物之前溫育所述第一PME底物和PME；在加入到所述第一PME底物之前溫育所述第二PME底物和PME；在加入到所述第二PME底物之前溫育所述第一PME底物和PME，然后加入更多的PME(它可以和另一種PME相同或不同)；在加入到所述第一PME底物之前溫育所述第二PME底物和PME，然后加入更多的PME(它可以和另一種PME相同或不同)；在加入到所述第二PME底物之前溫育所述第一PME底物和PME，然后加入另外一種PME底物(它可以和所述其它的PME底物相同或不同)；在加入到所述第一PME底物之前溫育所述第二PME底物和PME，然后加入另外一種PME底物(它可以和所述其它的PME底物相同或不同)；向與PME(它可以和另一種PME相同或不同)溫育的所述第二PME底物中加入與PME溫育的所述第一PME底物；向與PME(它可以和另一種PME相同或不同)溫育后的所述第二PME底物(任選地其中所述反應(yīng)已經(jīng)終止-諸如通過使用加熱)中加入與PME溫育后的所述第一PME底物(其中所述反應(yīng)可以選擇性的終止-諸如通過使用加熱)；以及其任何組合。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選是包括以下任何一種或多種在加入所述第二PME底物的同時(shí)向所述第一PME底物中加入PME；在加入所述第一PME底物的同時(shí)向所述第二PME底物中加入PME；在加入所述第一PME底物的同時(shí)向PME中加入所述第二PME底物；同時(shí)向反應(yīng)容器中加入PME和所述第一PME底物和所述第二PME底物；在加入到所述第二PME底物之前溫育所述第一PME底物和PME；在加入到所述第一PME底物之前溫育所述第二PME底物和PME；在加入到所述第二PME底物之前溫育所述第一PME底物和PME，然后加入更多的PME(它可以和另一種PME相同或不同)；在加入到所述第一PME底物之前溫肓所述第二PME底物和PME，然后加入更多的PME(它可以和另一種PME相同或不同)；在加入到所述第二PME底物之前溫育所述第一PME底物和PME，然后加入另外一種PME底物(它可以和所述其它的PME底物相同或不同)；在加入到所述第一PME底物之前溫育所述第二PME底物和PME，然后加入另外一種PME底物(它可以和所述其它的PME底物相同或不同)；向與PME(它可以和另一種PME相同或不同)溫育的所述第二PME底物中加入與PME溫育的所述第一PME底物。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可能制備高酯的、PME預(yù)處理的第二PME底物，然后可以將其加入到第一PME底物中。在此情況下，使用不同的PME(諸如但不限于重組、植物、真菌和細(xì)菌PME)以將所述第二PME底物改性，以便提供在組合系統(tǒng)中具有不同功能性的PME底物，應(yīng)該是可能的。
換句話說，本發(fā)明的這個(gè)實(shí)施方案提供一種包括一種PME、第一PME底物和第二PME底物的組合物；其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生；并且其中至少所述第二PME底物已由PME預(yù)處理。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，向高酯的、PME預(yù)處理的第一PME底物中加入PME底物是可能的。在此情況下，使用不同的PME(諸如但不限于重組、植物、真菌和細(xì)菌PME)以將所述第二PME底物改性，以便提供在組合系統(tǒng)中具有不同功能性的PME底物，應(yīng)該是可能的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備高酯的、PME預(yù)處理的第二PME底物，然后可以將其加入到高酯的、PME預(yù)處理的第一PME底物中是可能的。在此情況下，使用不同的PME(諸如但不限于重組、植物、真菌和細(xì)菌PME)以將所述第二PME底物改性，以便提供在組合系統(tǒng)中具有不同功能性的PME底物，應(yīng)該是可能的。
所述組合物可以包括一種或多種其它組分，諸如一種或多種合適的食物成分。典型的食物成分包括酸(諸如檸檬酸)或糖(諸如蔗糖、葡萄糖或轉(zhuǎn)化糖)或水果或其它酶、防腐劑、染色劑和其它合適的組分中的任何一種或多種。
本發(fā)明的組合物可以用于制備食料。例如，它可以是食料制備中的起始劑或中間體。
另一方面，本發(fā)明的組合物可以是食料本身。
術(shù)語(yǔ)“食料”可以包括用于人和/或動(dòng)物消耗的食物。典型的食料包括果醬、柑橘醬(marmalade)、果子凍、乳制品(諸如牛奶或干酪)、肉制品、禽制品、魚制品和焙烤食品。所述食料甚至可以是飲料。所述飲料可以是保加利亞奶酒飲品、果汁或包含乳清蛋白的飲料。
所述(或每種類型的任何一種或多種)PME可以和其它類型的酶一起使用。
其它類型的酶的實(shí)例包括其它果膠酶、果膠解聚酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠酸裂合酶、果膠裂合酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、半乳聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、內(nèi)-β-葡聚糖酶、阿拉伯酶、乙酰酯酶或果膠釋放酶或其組合。
這些其它類型的酶可以與所述PME同一時(shí)間加入，或在加入所述PME之前或之后加入。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述PME可以和一種或多種聚半乳糖醛酸酶一起使用，諸如內(nèi)-聚-半乳糖醛酸酶(諸如WO-A-89/12648中的內(nèi)-聚-半乳糖醛酸酶，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)和/或外-聚-半乳糖醛酸酶(諸如WO-A-94/14966中的外-聚-半乳糖醛酸酶，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。此優(yōu)選實(shí)施方案對(duì)果醬和柑橘醬生產(chǎn)有益，因?yàn)樗锰幚淼腜ME底物可以達(dá)到對(duì)鈣敏感性的更多控制。如上所指出，WO-A-97/03574的論述就如何通過使用重組DNA技術(shù)制備用于本發(fā)明的合適的PME提供了有用的指導(dǎo)。在下文列舉了這些論述中的一些。
為了表達(dá)重組PME，宿主生物可以是原核或真核生物。合適的原核宿主的實(shí)例包括大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。在本領(lǐng)域中關(guān)于轉(zhuǎn)化原核宿主的論述有許多文件記載，例如查看Sambrook等(Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。如果使用原核宿主，那么可能需要在轉(zhuǎn)化之前，諸如通過除去內(nèi)含子，對(duì)所述基因進(jìn)行合適的修飾。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主生物可以是曲霉屬，諸如黑曲霉?？梢园凑障率龅恼撌鲋苽滢D(zhuǎn)基因曲霉Rambosek，J.和Leach，J.1987(在絲狀真菌中的重組DNA進(jìn)展和前景，CRC Crit.Rev Biotechnol.6357-393)，Davis R.W.1994(在曲霉屬中的異源基因表達(dá)和蛋白質(zhì)分泌，載于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(編輯)Aspergillus50 years on.Progress in industrial microbiology第29卷，Elsevier Amsterdam 1994第525-560頁(yè))，Balance，D.J.1991(用于絲狀真菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和真菌基因結(jié)構(gòu)的概述，在Leong，S.A.，Berka R.M.(編輯)Molecular IndustrialMycology.Systems and Applications for Filamentous Fungi.MarcelDekker Inc.紐約1991，第1-29頁(yè))和Turner G.1994(用于遺傳操作的載體，載于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(編輯)Aspergillus50 years on.Progress in industrial microbiology第29卷，Elsevier阿姆斯特丹1994第641-666頁(yè))。然而，下列評(píng)論提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因曲霉屬的那些論述的摘要。
幾乎一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，絲狀真菌廣泛用于許多類型的生產(chǎn)有機(jī)化合物和酶的工業(yè)中。
例如，傳統(tǒng)日本酒曲和大豆發(fā)酵使用曲霉菌。此外，在本世紀(jì)黑曲霉用于生產(chǎn)有機(jī)酸(特別是檸檬酸)和用于生產(chǎn)在工業(yè)中使用的各種各樣的酶。
絲狀真菌在工業(yè)中為何如此廣泛的使用有兩個(gè)主要原因。首先，絲狀真菌可以產(chǎn)生大量的細(xì)胞外產(chǎn)物，例如酶和有機(jī)化合物，諸如抗生素或有機(jī)酸。其次，絲狀真菌可以在諸如谷物、糠、甜菜粕等的低成本物質(zhì)上生長(zhǎng)。同樣的原因使絲狀真菌成為作為用于異源表達(dá)重組PME的宿主的有吸引力的生物。
為了制備轉(zhuǎn)基因曲霉，通過將必需核苷酸序列插入到為在絲狀真菌中表達(dá)而設(shè)計(jì)的構(gòu)成物中，而制備表達(dá)構(gòu)成物。
已經(jīng)研制了幾種類型的用于異源表達(dá)的構(gòu)成物。這些構(gòu)成物可以包含一種在真菌中有效的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的實(shí)例包括用于高度表達(dá)細(xì)胞外酶的真菌啟動(dòng)子，諸如葡糖淀粉酶啟動(dòng)子或α-淀粉酶啟動(dòng)子。所述核苷酸序列可以融合于信號(hào)序列，所述信號(hào)序列指導(dǎo)由所述核苷酸序列編碼的蛋白的分泌。通常使用來(lái)自真菌的信號(hào)序列。在真菌中的活性終止子終止所述表達(dá)系統(tǒng)。
開發(fā)了在真菌中另一種類型的表達(dá)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中所述核苷酸序列可以同較小或較大部分的編碼穩(wěn)定蛋白的真菌基因融合。這可以穩(wěn)定由所述核苷酸序列編碼的蛋白。在這個(gè)系統(tǒng)中，可以在真菌蛋白和由所述核苷酸序列編碼的蛋白之間引入特定蛋白酶識(shí)別的切割位點(diǎn)，所以可以在這個(gè)位置由所述特定蛋白酶切割產(chǎn)生的融合蛋白，因此釋放出由所述核苷酸序列編碼的蛋白。作為實(shí)例，可以引入由在至少一些曲霉菌中發(fā)現(xiàn)的KEX-2樣肽酶識(shí)別的位點(diǎn)。這樣的融合導(dǎo)致在體內(nèi)切割，引起對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的保護(hù)，而不是保護(hù)較大的融合蛋白。
已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了幾種編碼細(xì)菌、真菌、脊椎動(dòng)物和植物蛋白的基因在曲霉中的異源表達(dá)。如果所述核苷酸序列沒有融合于信號(hào)序列，那么可以在細(xì)胞內(nèi)沉積所述蛋白。這類蛋白將在細(xì)胞質(zhì)中累積，并通常沒有糖基化，這對(duì)一些細(xì)菌蛋白可能有利。如果所述核苷酸序列帶有信號(hào)序列，則所述蛋白將在細(xì)胞外累積。
關(guān)于產(chǎn)物穩(wěn)定性和宿主菌株的修飾，當(dāng)一些異源蛋白分泌到真菌培養(yǎng)液中時(shí)，它們不是很穩(wěn)定。大多數(shù)真菌產(chǎn)生幾種降解異源蛋白的細(xì)胞外蛋白酶。為避免這個(gè)問題，用蛋白酶產(chǎn)生減少的特定真菌菌株作為用于異源生產(chǎn)的宿主。
為轉(zhuǎn)化絲狀真菌，開發(fā)了幾種用于許多絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方案(Ballance 1991，出處同上)。它們中許多是基于原生質(zhì)體制備和使用PEG和Ca2+離子將DNA引入到所述原生質(zhì)體中。然后再生所述轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，并用不同的選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化的真菌。其中用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)記是許多諸如argB、trpC、niaD和pyrG的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的標(biāo)記；諸如苯菌靈抗性、潮霉素抗性和腐草霉素抗性的抗生素抗性標(biāo)記。常用的轉(zhuǎn)化標(biāo)記是高拷貝數(shù)的、允許真菌以丙烯酰胺作為唯一氮源生長(zhǎng)的構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因生物可以是酵母。在此情況下，酵母也已廣泛用作異源基因表達(dá)的載體。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)有很長(zhǎng)的工業(yè)應(yīng)用史，包括用于異源基因表達(dá)。Goodey等(1987，Yeast Biotechnology，D R Berry等編輯，第401-429頁(yè)，Allen和Unwin，倫敦)和King等(1989，Molecular and Cell Biology of Yeasts，E F Walton和G T Yarronton編輯，第107-133頁(yè)，Blackie，格拉斯哥)綜述了在釀酒酵母中的異源基因表達(dá)。
釀酒酵母很適合異源基因表達(dá)有幾個(gè)原因。首先，它對(duì)人是非致病性的，并且不能產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。其次，伴隨著幾個(gè)世紀(jì)的用于不同目的的商業(yè)開發(fā)，它具有很長(zhǎng)的安全使用史。這造成了公眾的廣泛接受。第三，致力于對(duì)生物的廣泛商業(yè)應(yīng)用和研究產(chǎn)生了大量關(guān)于釀酒酵母的遺傳學(xué)和生理學(xué)以及大規(guī)模發(fā)酵特性的知識(shí)。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“酵母作為異源基因表達(dá)的載體”，Yeast，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison編輯，第2版，AcademicPress Ltd.)給出了對(duì)在釀酒酵母中異源基因表達(dá)和基因產(chǎn)物分泌的原理的綜述。
可得到幾種類型的酵母載體，包括整合型載體和自主復(fù)制型質(zhì)粒載體，所述整合型載體需要和用于維持它們的宿主基因組重組。
為了制備轉(zhuǎn)基因酵母菌，通過將所述核苷酸序列插入到為在酵母中表達(dá)而設(shè)計(jì)的構(gòu)成物中制備表達(dá)構(gòu)成物。已經(jīng)研制了幾種類型的用于異源表達(dá)的構(gòu)成物。所述構(gòu)成物包括與所述核苷酸序列融合的、在酵母中有效的啟動(dòng)子，通常使用來(lái)自酵母的啟動(dòng)子，諸如GAL1啟動(dòng)子。通常使用來(lái)自酵母的信號(hào)序列，諸如編碼SUC2信號(hào)肽的序列。一種在酵母中有效的終止子終止所述表達(dá)系統(tǒng)。
為了轉(zhuǎn)化酵母，已開發(fā)了幾種轉(zhuǎn)化方案。例如，可以按照Hinnen等(1978，Proceeding of the National Academy of Sciences of the USA75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，倫敦，275，104)和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的論述制備轉(zhuǎn)基因酵母菌。
使用不同的選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。其中用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)記是許多諸如LEU2、HIS4和TRP1的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記和諸如氨基糖苷抗生素標(biāo)記(例如G418)的顯性抗生素抗性標(biāo)記。
另一種宿主生物是植物。在這方面，本領(lǐng)域關(guān)于制備轉(zhuǎn)基因植物的文獻(xiàn)很充分。有兩個(gè)文獻(xiàn)提供了一些關(guān)于可以使用其制備轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)類型的背景評(píng)述，這兩個(gè)文獻(xiàn)是EP-B-0470145和CA-A-2006454，下文列出了其中的一些評(píng)述。
構(gòu)建基因修飾植物的基本原理是在所述植物的基因組中插入遺傳信息，以便獲得對(duì)所插入的遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定維持。
存在幾種插入遺傳信息的技術(shù)，兩個(gè)主要原則是通過使用載體系統(tǒng)直接引入遺傳信息和間接引入遺傳信息?？梢栽赑otrykus(Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech三月/四月1994 17-27)的論文中發(fā)現(xiàn)對(duì)一般技術(shù)的綜述。
用于植物的合適的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以包含一種載體，但它可以包含兩種載體。在兩種載體的情況下，所述載體系統(tǒng)一般稱為雙載體系統(tǒng)。在Gynheung An等(1980)雙載體系統(tǒng)，Plant Molecular Biology ManualA3，1-19中更詳細(xì)地描述了雙載體系統(tǒng)。
一個(gè)廣泛使用的用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、具有給定啟動(dòng)子或核苷酸序列或構(gòu)成物的系統(tǒng)是基于對(duì)來(lái)自根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti質(zhì)粒和來(lái)自毛根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri質(zhì)粒的使用，這在An等(1986)，Plant Physiol.81，301-305和ButcherD.N.等(1980)Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中進(jìn)行了描述。
已經(jīng)構(gòu)建了幾種不同的Ti和Ri質(zhì)粒，它們適于構(gòu)建的上述植物或植物細(xì)胞。這種Ti質(zhì)粒的非限制性的實(shí)例是pGV3850。
最好應(yīng)當(dāng)將所述核苷酸序列或構(gòu)成物插入到Ti質(zhì)粒T-DNA的末端序列之間或鄰近T-DNA序列之處，以避免破壞緊靠在T-DNA邊緣周圍的序列，因?yàn)檫@些區(qū)域中至少一個(gè)區(qū)域似乎對(duì)將修飾的T-DNA插入到植物基因組中是必需的。
正如由上述說明可以明白的，如果所述生物是植物，那么所述載體系統(tǒng)最好是一個(gè)包括對(duì)感染所述植物必需的序列(例如vir區(qū))和至少一個(gè)T-DNA序列的邊緣部分的載體系統(tǒng)，所述邊緣部分位于與遺傳構(gòu)成物相同的載體上。所述載體系統(tǒng)最好是根瘤土壤桿菌Ti質(zhì)粒或毛根土壤桿菌Ri質(zhì)?；蚱溲苌?，因?yàn)檫@些質(zhì)粒是廣為人知的，并在轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建中廣泛使用，存在許多基于這些質(zhì)?；蚱溲苌锏妮d體系統(tǒng)。
在轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建中，在將所述載體插入到所述植物之前，首先可以在所述載體可以在其中復(fù)制且易于操作的微生物中構(gòu)建核苷酸序列。有用的微生物的實(shí)例是大腸桿菌，但也可以使用其它具有上述性質(zhì)的微生物。當(dāng)在大腸桿菌中構(gòu)建如上定義的載體系統(tǒng)的載體時(shí)，如果必要，將其轉(zhuǎn)移到合適的土壤桿菌菌株中，例如根瘤土壤桿菌。因此最好將帶有所述核苷酸序列或構(gòu)成物的Ti-質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到合適的土壤桿菌菌株中，例如根瘤土壤桿菌，以便獲得帶有所述核苷酸序列的土壤桿菌細(xì)胞，隨后將該DNA轉(zhuǎn)移到待修飾的植物細(xì)胞中。
正如在CA-A-2006454中報(bào)導(dǎo)的，可使用大量克隆載體，它們包括在大腸桿菌中的復(fù)制系統(tǒng)和能夠選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記。所述載體包括例如pBR 322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC 184等。
這樣可以將所述核苷酸序列引入到所述載體中的合適的限制位置上。包含的質(zhì)粒用于在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化。在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞，然后收獲并裂解細(xì)胞。然后回收所述質(zhì)粒。作為分析方法，有一般使用的序列分析、限制性酶切分析、電泳和其它的生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法。每次操作后，可以限制性酶切所使用的DNA序列，并與下一種DNA序列連接?？梢栽谙嗤虿煌馁|(zhì)粒中克隆每種序列。
在每次向植物中引入所需啟動(dòng)子或構(gòu)成物或核苷酸后，存在和/或插入另外的DNA序列可能是必需的。例如，如果使用Ti-或Ri-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，則可以連接位于引入的基因側(cè)翼區(qū)域的Ti-或Ri-質(zhì)粒T-DNA的至少右邊界，然而經(jīng)常是右邊界和左邊界。已經(jīng)集中研究了用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的T-DNA的應(yīng)用，并在EP-A-120516；Hoekema，載于The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第五章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等，EMEO J.(1985)4277-284中對(duì)其進(jìn)行了描述。
用土壤桿菌直接感染植物組織是已經(jīng)廣泛使用的簡(jiǎn)單技術(shù)，在Butcher D.N.等(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中對(duì)其進(jìn)行了描述。關(guān)于這個(gè)主題的其它論述參見Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech三月/四月1994 17-27)。關(guān)于這個(gè)技術(shù)，可以在所述植物的某一部分或組織上，即在所述植物的葉、根、莖的部分或其它部分進(jìn)行植物感染。
一般用具有所述啟動(dòng)子和/或GOI的土壤桿菌直接感染植物組織，在待感染的植物上制造創(chuàng)傷，例如通過用剃刀切所述植物，或用針刺破所述植物，或用研磨劑磨破所述植物。接著用土壤桿菌接種所述傷口。然后讓接種的植物或植物部分在合適的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并讓其發(fā)育成成熟植物。
當(dāng)構(gòu)建植物細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞可以按照熟知的組織培養(yǎng)法生長(zhǎng)和保持，諸如通過在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述細(xì)胞，所述培養(yǎng)基提供諸如氨基酸、植物激素、維生素等的必需生長(zhǎng)因子?？梢允褂靡阎挠杉?xì)胞或組織培養(yǎng)物再生植物的方法，例如通過使用抗生素選擇轉(zhuǎn)化的苗，和通過在包含合適的營(yíng)養(yǎng)物、植物激素等的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)所述苗，完成由轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為基因修飾植物。
可以在EP-A-0449375中找到關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的其它論述。
總之，描述了適于用做食料或適于在食料制備中使用的組合物。所述組合物包括一種PME、第一PME底物和第二PME底物；其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
如上所指出，諸如由天然植物源獲得的果膠的PME底物，一般是DE為大約70％的高酯果膠形式。必須向包含這些高酯PME底物的提取物中加入糖，以提供足夠的可溶性固體引發(fā)膠凝。通常需要最少55％的可溶性固體。當(dāng)可溶性固體百分比少于55％時(shí)，凝縮往往會(huì)發(fā)生得更頻繁。當(dāng)凝縮真的發(fā)生時(shí)，必須使用昂貴的添加劑引發(fā)膠凝。
至于本發(fā)明，我們發(fā)現(xiàn)，通過加入第二高酯PME底物可能使包含高酯PME底物的提取物產(chǎn)生膠凝是意想不到的。這些組合的高酯PME底物在可溶性固體少于50％的水平下的膠凝能力增加，完全出乎意料。先有技術(shù)一直講高酯果膠在膠凝可以發(fā)生之前一般需要最少55％的可溶性固體含量。
因此，按照本發(fā)明該優(yōu)選實(shí)施方案的最廣泛的方面，我們提供一個(gè)處于固化凝膠狀態(tài)的、可溶性固體含量少于50％(w/w)的令水系統(tǒng)；其中通過使用高酯PME底物產(chǎn)生膠凝。在運(yùn)方面，可以通過在實(shí)施方案部分提及的步驟(在下文)測(cè)定固化凝膠狀態(tài)。
本發(fā)明與WO-A-94/25575的論述的區(qū)別在于該專利申請(qǐng)沒有公開乃至提出一種包括PME、第一PME底物和第二PME底物的組合物；更不用說提出一種組合物，其中不論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。對(duì)于JP-A-63/209533的論述同樣如此。
也注意到在WO-A-94/25575中第12頁(yè)(6-14行)的論述甚至背離了本發(fā)明。在這方面，在WO-A-94/25575中7和8行使用的術(shù)語(yǔ)“基于蔬菜或水果的產(chǎn)物”沒有明確公開PME底物。而且，隨后的在WO-A-94/25575中12至14行的一句話“另一方面(我們強(qiáng)調(diào))，可以使用酶……對(duì)果膠的天然內(nèi)容物脫甲基”明確指出WO-A-94/25575設(shè)想的反應(yīng)介質(zhì)只涉及一種PME底物，并沒有涉及如在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的至少兩種PME底物。
現(xiàn)在僅通過實(shí)施方案描述本發(fā)明，其中參考附圖

圖1是條形圖(顯示PPME改性、加入的果膠和+/-鈣的影響)。
圖2是條形圖(顯示PPME處理水果和果膠(P66)的影響)。方案方案I鈣敏感度指標(biāo)(CF)以溶解在57.6毫克鈣/克果膠溶液中的果膠的粘度除以在不加鈣的溶液中正好等量的果膠的粘度測(cè)量鈣敏感度。鈣不敏感的果膠的CF值為1。
將4.2克果膠樣品溶解在550毫升有效攪拌的熱水中。將所述溶液冷卻到大約20℃，并用1N HCl將其pH值調(diào)節(jié)至1.5。用水將果膠溶液調(diào)節(jié)至700毫升并攪拌。逐一將145克該溶液計(jì)量加入4個(gè)粘度玻璃杯中。在攪拌下將10毫升水加入到兩個(gè)玻璃杯中(雙測(cè)定)，并在攪拌下將10毫升250mM CaCl2溶液加入到另兩個(gè)玻璃杯中。
在有效的磁力攪拌下，將50毫升醋酸鹽緩沖液(0.5 M，pH值大約4.6)加入到所有四個(gè)粘度玻璃杯中，從而使果膠溶液的pH值升至超過4.0。移開磁力攪拌器，并將玻璃杯置于20℃過夜。在第二天用Brookfield粘度計(jì)測(cè)量粘度。如下計(jì)算鈣敏感度指標(biāo)
方案II酯化度(％DE)向50毫升60％異丙醇和5％ HCl的溶液中加入2.5克果膠樣品，并攪拌10分鐘。通過一玻璃濾器過濾果膠溶液，并將其用15毫升60％異丙醇/5％ HCl的溶液洗滌6次，接著再用60％異丙醇洗滌，直至濾液不含氯化物。所述濾液在80℃整夜干燥。
在錐形瓶中合并20.0毫升0.5 N NaOH和20.0毫升0.5 N HCl，并加入2滴酚酞(phenolphtalein)。用0.1 N NaOH對(duì)其滴定，直至出現(xiàn)持久的變色。所述0.5 N HCl應(yīng)當(dāng)稍強(qiáng)于所述0.5 N NaOH。加入的0.1 N NaOH的體積稱為V0。
將0.5克干燥的果膠樣品(所述濾液)放入錐形瓶中，并用96％的乙醇使所述樣品濕潤(rùn)。加入100毫升新近煮沸并冷卻的蒸餾水，攪拌所得的溶液，直至果膠完全溶解。然后加入5滴酚酞，并用0.1N NaOH滴定所述溶液(直至變色，并且pH值為8.5)。在此使用的0.1 N NaOH的量稱為V1。加入20.0毫升0.5 N NaOH并劇烈振搖燒瓶，然后使其靜置15分鐘。加入20.0毫升0.5 N HCl，振搖所述燒瓶直至粉紅色消失。然后加入3滴酚酞，接著將所得的溶液用0.1 N NaOH滴定。所用的0.1 N NaOH的體積稱為V2。
如下計(jì)算酯化度(％DE％總羧基)%DE=V2-V0V1+(V2-V0)]]>制備食物介紹作為介紹，按照本發(fā)明的食物組合物可以包含一種或多種其它組分，諸如一種或多種食物成分。典型的食物組分包括酸(諸如檸檬酸)或糖(諸如蔗糖、葡萄糖或轉(zhuǎn)化糖)或水果或酶中的任何一種或多種。
例如，水果不僅給予了凝膠味道、顏色和結(jié)構(gòu)，而且給予了果膠、酸和少量固體。根據(jù)水果中天然香料和色素的水平，水果用量一般是果醬的25％至60％。普通水果的固體含量在10％ Brix左右，但也可以使用一般在65％至70％ Brix的水果濃縮物。水果的pH值隨所述水果而變化很大，但多數(shù)水果的pH值在3.0和3.5之間。
果膠含量也隨該水果而變化。例如，紅醋栗、黑醋栗和橙的果膠含量高，可以通過只加入少量額外的果膠，得到來(lái)自這些水果的滿意的凝膠。GRINDSTEDTM果膠的選擇取決于該果醬的類型。例如，GRINDSTEDTM果膠SS 200用于不包含水果塊的果醬或只包含很小水果塊的果醬。在這種果醬中的水果分離不成問題，并因此可以使用慢凝果膠和較低的灌裝溫度。在包含大水果塊或整個(gè)水果的果醬中使用GRINDSTEDTM果膠RS 400，所述整個(gè)水果例如櫻桃或草莓。在包含整個(gè)水果的果醬中可能難以避免水果分離，所以必需使用諸如GRINDSTEDTM果膠RS 400的快凝果膠。
果膠類型的選擇也取決于該容器的尺寸。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)廣口瓶時(shí)，灌裝溫度相對(duì)于果膠穩(wěn)定性而言較為不重要，因?yàn)樵诠嘌b后廣口瓶降溫相對(duì)較快，果膠將不降解。然而，如果將果醬灌入大容器中，例如500或1000公斤的容器，則冷卻時(shí)間將會(huì)很長(zhǎng)。在這種大容器的中央，果膠尤其易遭降解，在中央的凝膠比在邊緣的果膠更脆弱。因此，更慢速凝結(jié)的果膠一般用于大容器，讓其在較低溫度灌裝，從而避免果膠降解。
因?yàn)楦鞣N諸如以下的原因?qū)⑻羌尤氲焦u中1.為提供可溶性固體-在HE果膠膠凝前，它們可能需要最少55％的可溶性固體含量2.為提供甜味3.為提供增加的物理、化學(xué)和微生物穩(wěn)定性4.為提供改善的口感5.為提供改善的顏色和光澤蔗糖是通常使用的糖，但根據(jù)需要的味道、變甜效果、結(jié)晶或結(jié)構(gòu)，也可以適當(dāng)?shù)厥褂闷渌?。價(jià)格也可以影響使用的糖的類型。
轉(zhuǎn)化糖和蔗糖具有相同的變甜效果，但是葡萄糖漿、葡萄糖和山梨糖醇的變甜效果降低。高果糖玉米漿和果糖具有比蔗糖更高的變甜效果。
在某種程度上，改變糖的組成將影響凝膠的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度以及膠凝溫度。
由于兩個(gè)原因加入酸1)部分原因是為了降低pH水平至3.0-3.2，以獲得具有所述果膠的滿意的凝膠，和2)部分原因是為了增強(qiáng)水果的香味。使用HE果膠的膠凝的最適pH值取決于該果膠的類型和固體的含量。
如果在65％-68％ Brix的果醬中使用GRINDSTEDTM果膠SS 200，則最適pH值是3.0-3.2。
如果固體含量高于65％-68％ Brix，則最適pH值是3.1-3.3。
相反，如果固體含量較低，則最適pH值是2.8-3.0。
如果使用GRINDSTEDTM果膠RS 400，則最適pH值大約比用GRINDSTEDTM果膠SS 200高0.2單位。
最常使用的酸是在50％(w/v)溶液中的檸檬酸一水合物。
可以使用其它酸(諸如蘋果酸、酒石酸或磷酸)，但必須一直在溶液中。
根據(jù)法規(guī)、價(jià)格和在成品中需要的酸度甜味選擇酸。
檸檬酸給予成品的酸味相對(duì)較強(qiáng)，但蘋果酸產(chǎn)生較溫和但更持久的味道。
酒石酸可以產(chǎn)生微苦的味道，而磷酸產(chǎn)生較甜的味道。
酶促處理的果膠可以防止在生產(chǎn)可溶性固體含量低的柑橘醬和果醬時(shí)可能經(jīng)常發(fā)生的凝縮。具有25％ SS的低糖果醬和柑橘醬配方
*典型的水果包括草莓、蘋果、櫻桃、柑桔類水果和黑醋栗。**或任何其它食用酸1所述酶改性的果膠可以是WO-A-97/03574中的果膠2所述PME可以是WO-A-97/03574中的PME。步驟制備果膠溶液1.干法混合酶改性的果膠和糖
2.在熱水(80℃)中溶解果膠-糖混合料，充分?jǐn)嚢韫u1.混合水果、糖和水2.將水果混合料短時(shí)間煮沸，并冷卻至40℃3.冷卻至40℃后，加入PME溶液4.水果混合料的反應(yīng)時(shí)間是1小時(shí)5.將水果混合料加熱至85℃幾分鐘，將所述果醬蒸發(fā)至需要的可溶性固體含量6.加入果膠溶液7.加入防腐劑并調(diào)節(jié)pH值8.將所述果醬冷卻至灌裝溫度，灌裝并冷卻至室溫這個(gè)實(shí)施例可以通過加入至少一種其它合適的食物成分或用至少一種其它合適的食物成分取代而加以修改，和/或通過加入另一種合適的酶(諸如葡聚糖酶)而加以修改。具有50％ SS的低糖果醬和柑橘醬配方
>*典型的水果包括草莓、蘋果、櫻桃、柑橘類水果和黑醋栗。**或任何其它食用酸1所述酶改性的果膠可以是WO-A-97/03574中的果膠2所述PME可以是WO-A-97/03574中的PME。步驟果膠溶液的制備1.干法混合酶改性的果膠和糖2.在熱水(80℃)中溶解果膠-糖混合料，充分?jǐn)嚢韫u1.混合水果和水2.將水果混合料短時(shí)間煮沸，并冷卻至40℃3.冷卻至40℃后，加入PME溶液4.水果混合料的反應(yīng)時(shí)間是1小時(shí)5.將所述水果混合料加熱至85℃幾分鐘6.加入余下的糖和果膠溶液，將所述果醬蒸發(fā)至需要的可溶性固體含量7.將所述果醬冷卻至灌裝溫度，灌裝并冷卻至室溫這個(gè)實(shí)施例可以通過加入至少一種其它合適的食物成分或用至少一種其它合適的食物成分取代而加以修改，和/或通過加入另一種合適的酶(諸如葡聚糖酶)而加以修改。
對(duì)本發(fā)明的修改對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的。例如，正如以上實(shí)施例指出的，另外的實(shí)施例將包括使用PME和葡聚糖酶二者，以獲得具有較低酯化度的果膠(例如慢凝果膠)。制備植物PME改性的桔漿(orange mash)步驟I在攪拌器中將桔子片勻漿并煮沸15分鐘，以滅活任何內(nèi)源酶。冷凍/融化后，加入20％(w/w)糖，并用預(yù)加熱的(95-100℃)去離子水將桔漿1∶1稀釋。將所述漿轉(zhuǎn)移至玻璃燒杯中，分別將其pH值和溫度調(diào)節(jié)至7.0(使用10％ NaOH)和40℃。
以113μl/200g桔漿的濃度將純化的植物PME(300μmol/min/ml)和所述桔漿于40℃溫育15分鐘，之后使用檸檬酸(50％ w/v)將其pH值調(diào)節(jié)至3.2(+/-0.6)。為滅活加入的植物PME，將所述桔漿于85℃熱處理3分鐘。雖然植物PME活性一般需要加入NaCl來(lái)確保活性，但制備該酶改性的桔漿不需要任何加入的外源性NaCl，因?yàn)榇嬖谧銐虻膬?nèi)源性NaCl(24ppm)確保PME活性。
于5℃將植物PME處理的桔漿(大約90克)儲(chǔ)存在結(jié)晶皿(直徑60毫米，高度35毫米)中。所有的果膠膠凝測(cè)量均在處理的三天內(nèi)進(jìn)行，并產(chǎn)生可重現(xiàn)的結(jié)果。步驟II-選擇、制備和加入果膠底物選擇選擇要使用的三種果膠底物。所有三種底物，GRINDSTEDTM果膠SS200、P66和P60底物的酯化度(％DE)均高。它們的酯化度分別為65％、66％和60％。P60和P66都通過植物PME預(yù)處理GRINDSTEDTM超快速凝結(jié)(URS)果膠產(chǎn)生，而GRINDSTEDTM果膠SS200未處理。所述三種底物中的兩種，P60和P66，是鈣敏感性的，而GRINDSTEDTM果膠SS200是鈣非敏感性的。所述底物中只有一種，GRINDSTEDTM果膠SS200，是市售的。
制備通過下述步驟，用植物PME預(yù)處理GRINDSTEDTMURS果膠，產(chǎn)生P66和P60在0.15 M NaCl中溶解GRINDSTEDTMURS果膠，并用植物PME于40℃在pH 7.0下將其處理幾小時(shí)。在將pH值調(diào)節(jié)至3.0后，將溶解的果膠加熱至100℃ 5-10分鐘，以使存在的任何PME失活，在此之后用異丙醇沉淀溶解的果膠，并在使用前干燥。將所有三種果膠底物制備成8％的溶液，并用磁力攪拌器使其在預(yù)加熱(80℃)的去離子水中完全溶解。
加入在將每種果膠底物加入到植物PME酶改性的桔漿中時(shí)使用高速磁力攪拌器，以確保溶液均一。步驟III-制備和加入檸檬酸鈣在高溫下通過加入或者作為漿液或者作為水合物的鈣，可以引發(fā)果膠膠凝。向混合物中加入終濃度為5mM的的檸檬酸鈣(C12H10Ca3O144H2O)。步驟IV-測(cè)量凝膠強(qiáng)度使用結(jié)構(gòu)分析儀(Texture Analyser)，通過抗壓試驗(yàn)，測(cè)定果膠膠凝的程度/凝膠強(qiáng)度。在“The Chemistry and Technology of Pectin”編輯Reginald H Walker；Academic Press；(1991)第240頁(yè)(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中描述了該方法。
在SMS TA-XT2結(jié)構(gòu)分析儀(Reciproter)上使用冷藏(5℃)的探針(P25/L)，以2.0毫米/秒的速度和30％的穿透率，對(duì)由加壓產(chǎn)生的粘度進(jìn)行測(cè)量。樣品溫度是5℃。在壓力曲線上的壓力峰值表示以牛頓單位計(jì)的凝膠強(qiáng)度。步驟V-測(cè)試凝縮和凝固凝縮的定義是果膠凝膠不能形成固體。如果凝膠在包含它的反應(yīng)器中翻轉(zhuǎn)后不能保持完整，那么就認(rèn)為其顯示凝縮。如果凝膠在包含它的反應(yīng)器中翻轉(zhuǎn)后能保持完整，那么就認(rèn)為其顯示凝固。完整的凝膠與不完整的凝膠相比顯示很平坦的表面。結(jié)果植物PME處理的桔漿的表征植物PME處理桔漿產(chǎn)生具有55.2％的平均酯化度(％DE)的高酯果膠(按照方案II測(cè)定％DE)。表I.鈣(0.096/克檸檬酸鈣/100/克桔漿)和/或植物PME處理對(duì)桔漿凝膠強(qiáng)度的影響
<p>通過或者用植物PME處理，或者加入鈣，稍微改變提取的桔漿的凝膠強(qiáng)度(表I)。然而，用植物PME連續(xù)處理桔漿，接著加入鈣，沒有對(duì)獲得的凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生協(xié)同作用。目視檢查所述凝膠表明它們?nèi)渴且后w形式。
這些結(jié)果證明，盡管在其酯化度(55.2％的％ DE)和其對(duì)低水平內(nèi)源鈣的響應(yīng)方面，植物PME處理桔漿產(chǎn)生更均一的產(chǎn)物，但在鈣膠凝或增加的凝膠強(qiáng)度方面，酶改性的桔漿對(duì)外源加入的鈣沒有反應(yīng)。
這些結(jié)果也證明，植物PME處理的桔漿與或者內(nèi)源，或者外源加入的鈣離子反應(yīng)，不足以滿足對(duì)凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生令人滿意的增加。
在鈣存在或不存在時(shí)，向植物PME改性的桔漿中加入諸如P66或P60的第二果膠底物，與未處理的桔漿對(duì)照相比，凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生顯著的增加(表II；圖1)。具體地說，P66和P60果膠底物，在鈣存在時(shí)將每種底物加入到植物PME改性的桔漿中以后，它們分別對(duì)凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生3倍和5倍的增加。凝膠強(qiáng)度增加的倍數(shù)略低于宣布的兩種果膠底物在沒有鈣時(shí)在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的增加倍數(shù)。
向植物PME改性的桔漿中加入GRINDSTEDTM果膠SS200底物，沒有使凝膠強(qiáng)度產(chǎn)生成倍的增加，因?yàn)镚RINDSTEDTM果膠SS200底物不是PME預(yù)處理的，因此證明組合的底物不可能膠凝。
表II.組合果膠底物和鈣對(duì)獲得的凝膠強(qiáng)度的影響<
<p>在鈣存在而不是在其不存在時(shí)，將P66果膠底物和植物PME改性的桔漿混合后獲得凝固的凝膠。相反，或者在鈣存在或者在鈣不存在時(shí)，將P60果膠底物和植物PME改性的桔漿混合后產(chǎn)生凝固的凝膠。
圖2圖解說明了PME處理和存在鈣這二者對(duì)果膠膠凝的相加作用。該圖提出了當(dāng)在鈣存在和不存在時(shí)，將P66果膠底物加入到或者未處理的，或者PME處理的桔漿中時(shí)，觀察到的凝膠強(qiáng)度(或硬度)的相對(duì)增長(zhǎng)百分比。在每個(gè)條柱的后面列出了凝膠強(qiáng)度(N)的精確值，而在每個(gè)條柱的頂部列出了凝膠強(qiáng)度的相對(duì)增長(zhǎng)百分比。從左至右看圖，條柱1指出了未處理的桔漿的凝膠強(qiáng)度低，目測(cè)檢查它是液體形式。當(dāng)將諸如P66的第二果膠底物在沒有鈣的情況下加入到未處理的桔漿中時(shí)，對(duì)得到的凝膠強(qiáng)度沒有影響(條柱2)。然而，如果將P66加入到植物PME處理的桔漿中，會(huì)觀察到果膠粘度增加(條柱3)。在鈣存在時(shí)通過將P66和未處理的桔漿混合，觀察到果膠粘度相似的增長(zhǎng)(條柱4)。最后，如果在鈣存在時(shí)將P66加入到植物PME處理的桔漿中，則獲得凝固的凝膠(條柱5)。獲得的結(jié)果與進(jìn)行生了底物的混合和PME處理的順序無(wú)關(guān)。因此，如果GRINDSTEDTMURS果膠底物和桔漿制備物混合，并在存在鈣的情況下進(jìn)行PME處理，或者如果在存在鈣的情況下將GRINDSTEDTMURS果膠底物和桔漿制備物分別用PME預(yù)處理，然后將它們混合，則獲得凝固的凝膠。
重復(fù)在圖1和圖2中描述的實(shí)驗(yàn)，并在表III中列出了結(jié)果。目測(cè)由這些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的凝膠證實(shí)了較早的發(fā)現(xiàn)(i)單獨(dú)的桔漿或用植物PME和鈣或者單獨(dú)或者組合處理后的桔漿，將不引發(fā)凝膠強(qiáng)度的增加。
(ii)單獨(dú)將鈣加入到GRINDSTEDTMURS果膠中不改變果膠的功能性。同樣，如果沒有用植物PME處理GRINDSTEDTMURS果膠，則當(dāng)它和植物PME處理的桔漿在或者存在鈣或者不存在鈣下混合時(shí)，觀察到粘度增加，但不凝固。
(iii)用植物PME處理GRINDSTEDTMURS果膠產(chǎn)生P66，在鈣存在的情況下當(dāng)它同植物PME處理的桔漿混合時(shí)，使果膠功能性更強(qiáng)。在凝膠樣品中引發(fā)凝固表明這種增加的功能性。
(iv)用植物PME處理兩種果膠底物，諸如桔漿和GRINDSTEDTMURS果膠，產(chǎn)生功能性更強(qiáng)的高酯果膠，它在鈣存在時(shí)能夠引發(fā)低固體果醬凝固。
表III. 組合果膠底物和鈣對(duì)觀察到的凝膠強(qiáng)度的影響
*是GRINDSTEDTMURS果膠。討論當(dāng)由桔漿勻漿制備低可溶性固體果醬時(shí)，即使在植物PME處理或加入外源鈣后，也沒有觀察到膠凝。而且，如果將諸如P66的第二高酯果膠加入到未處理的桔漿制備物中，即使用植物PME酶預(yù)處理第二果膠底物使其更具功能性，也沒有影響其膠凝能力。然而，如果諸如P66的第二高酯果膠底物在鈣存在下與未處理的桔漿混合，將觀察到凝膠粘度增加。如果相同的高酯果膠底物(P66)同植物PME處理的桔漿在沒有鈣時(shí)混合，則在凝膠粘度的增加方面觀察到相似的效果。
這些結(jié)果指出，或者通過在桔漿和諸如P66的高酯果膠底物混合前用植物PME處理桔漿，或者通過在鈣存在時(shí)將未處理的桔漿和P66混合，可以引發(fā)凝膠粘度增加。所述結(jié)果也指出，在鈣存在時(shí)P66和植物PME處理的桔漿混合將造成凝膠凝固。獲得該效果與進(jìn)行混合和用PME處理底物的順序無(wú)關(guān)。因此，或者通過在混合前用PME預(yù)處理果膠底物，或者通過在鈣存在時(shí)PME處理混合底物，將觀察到凝膠凝固?？偨Y(jié)當(dāng)由桔漿制備低可溶性固體果醬時(shí)，即使在用植物PME處理桔漿后或加入外源鈣后，也沒有觀察到膠凝。
如果將第二高酯果膠底物加入到未處理的桔漿中，即使在加入前用植物PME酶預(yù)處理使其更具功能性，對(duì)其凝膠能力也無(wú)影響。
將植物PME處理的桔漿同PME預(yù)處理的高酯果膠底物混合，在鈣存在或不存在時(shí)，將產(chǎn)生凝膠強(qiáng)度顯著增加和功能性提高的凝膠。因此，在鈣存在時(shí)PME處理或者單獨(dú)或者組合的果膠底物，通過使所述果膠底物作為高酯底物更具功能性而提高它們的膠凝能力。序列SEQ.I.D.NO.1MIKNMTDTDM MIMRTSNNRK LIEETSTVDG WPAWLSTGDR RLLQSSSVTP 50NVVVAADGSG NFKTVAAAVA AAPQGGTKRY IIRIKAGVYR ENVEVTKKHK100NIMFIGDGRT RTIITGSRNV VDGSTTFKSA TVAVVGEGFL ARDITFQNTA150GFSKHQAVAL RVGADLSAFY NCDMLAYQDT LYVHSNRQFF VNCLIAGTVD200FIFGNAAAVL QNCDIHARKP NSGQKNMVTA QGRADPNQNT GIVIQKSRIG250ATSDLKPVQG SFPTYLGRPW DEYSRTVIMQ SSITDVIHPA GWHEWDGNFA300LNTLFYGEHQ NAGAGAGTSG RVKWKGFRVI TSATEAQAFT PGSFIAGSSW350LGSTGFPFSL GL 362SEQ.I.D.NO.2MTRIKEFFTK LSESSTNQNI SNIPKKKKKL FLALFATLLV VAAVIGIVAG 50VNSRKNSGDN GNEPHHAILK SSCSSTRYPD LCFSAIAAVP EASKKVTSQK100DVIEMSLNIT TTAVEHNYFG IQKLLKRTNL TKREKVALHD CLETIDETLD150ELHKAVEDLE EYPNKKSLSQ HADDLKTLMS AAMTNQGTCL DGFSHDDANK200HVRDALSDGQ VHVEKMCSNA LAMIKNMTDT DMMIMRTSNN RKLIEETSTV250DGWPAWLSTG DRRLLQSSSV TPNVVVAADG SGNFKTVAAS VAAAPQGGTK300RYIIRIKAGV YRENVEVTKK HKNIMFIGDG RTRTIITGSR NVVDGSTTFK350SATVAVVGEG FLARDITFQN TAGPSKHQAV ALRVGADLSA FYNCDMLAYQ400DTLYVHSNRQ FFVNCLIAGT VDFIFGNAAA VLQNCDIHAR KPNSGQKNMV450TAQGRADPNQ NTGIVIQKSR IGATSDLKPV QGSFPTYLGR PWKEYSRTVI500MQSSITDVIH PAGWHEWDGN FALNTLFYGE HQNAGAGAGT SGRVKWKGFR550VITSATEAQA FTPGSFIAGS SWIGSTGFPF SLGL 584SEQ.I.D.NO.3GTAGCAATGC GCTTGCTATG ATCAAGAACA TGACTGACAC CGACATGATG 50ATCATGAGGA CTTCAAACAA CAGGAAGCTG ATAGAGGAGA CCAGTACGGT100TGATGGGTGG CCGGCGTGGC TGTCCACCGG AGACAGGAGG CTGTTGCAGT150CCTCGTCGGT GACACCGAAC GTGGTGGTGG CAGCAGATGG CAGCGGAAAC200TTTAAGACGG TGGCGGCAGC GGTGGCGGCG GCTCCTCAGG GAGGCACTAA250GCGGTATATT ATTAGGATTA AAGCCGGTGT TTATCGGGAA AATGTTGAGG 300TGACAAAGAA GCATAAAAAT ATAATGTTCA TCGGTGACGG GAGGACTAGA 350ACTATCATCA CAGGAAGTAG AAATGTGGTT GATGGAAGCA CAACTTTCAA 400GTCTGCTACA GTTGCTGTTG TTGGTGAAGG ATTCTTGGCC CGAGACATTA 450CATTCCAAAA CACAGCCGGC CCCTCAAAGC ACCAGGCGGT GGCACTACGA 500GTGGGAGCTG ACCTTTCAGC ATTTTACAAT TGCGATATGT TAGCTTACCA 550AGACACACTC TACGTCCACT CGAACCGCCA GTTCTTTGTG AACTGCTTAA 600TTGCTGGCAC GGTTGATTTT ATTTTTGGTA ACGCTGCAGC CGTGTTACAA 650AATTGTGACA TCCATGCACG AAAGCCCAAT TCCGGCCAAA AAAATATGGT 700CACAGCCCAA GGCAGGGCTG ACCCTAACCA AAACACCGGC ATTGTCATTC 750AAAAATCTAG GATTGGTGCC ACCTCCGATT TAAAACCGGT TCAGGGTAGT 800TTCCCGACGT ACCTCGGCAG GCCCTGGAAG GAGTACTCGA GGACGGTGAT 850CATGCAGTCA TCGATTACTG ACGTGATCCA CCCTGCCGGG TGGCACGAGT 900GGGATGGTAA CTTCGCGTTG AACACATTGT TTTACGGAGA GCATCAGAAC 950GCCGGAGCCG GTGCCGGAAC TTCAGGGAGA GTGAAATGGA AGGGATTTAG 1000GGTTATTACA AGTGCTACCG AGGCTCAAGC TTTTACTCCT GGAAGCTTCA 1050TTGCTGGTAG TAGCTGGCTG GGCTCCACTG GTTTCCCATT CTCCCTTGGT 1100TTGTAATATT CACTAGGAGT TTTAATTAAT ATGTTTTGTA TTAGTGGATC 1150CATAGGTCTC TGGTCTTTCA ATTTGTAATA TTTGATTGAG CGTGTCTTAT 1200TCGTGGCTTC GATTTCACAA ATACTATTGT GTGATTAACA AGAAATAAAA 1250TAGCATGGGA AGAATAATAA TTTCCGGCTT CTTTAAAAAA AAAAAAAAAA 1300AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1323SEQ.I.D.NO.4CTTTTGTTCT CTCTTATCGA GAAAAAAAAT GACCCGCATA AAAGAATTCT 50TCACAAAACT TTCTGAATCT TCTACCAACC AAAACATTTC CAATATTCCC 100AAGAAAAAAA AGAAACTATT CTTAGCTCTT TTTGCAACGC TACTCGTTGT 150CGCTGCCGTA ATCGGCATTG TCGCCGGAGT GAACTCAAGA AAAAACTCCG 200GCGACAACGG CAACGAGCCT CATCATGCTA TCCTCAAATC ATCATGCAGC 250AGCACAAGGT ACCCGGACTT ATGCTTTTCG GCTATTGCTG CCGTTCCAGA 300GGCCTCCAAA AAGGTGACAA GCCAAAAGGA CGTTATTGAG ATGTCCTTAA 350ACATCACAAC AACAGCCGTG GAACACAACT ACTTCGGGAT TCAGAAGCTC 400TTGAAGAGAA CGAATCTCAC CAAACGGGAA AAGGTTGCTC TCCATGACTG 450TCTTGAGACG ATCGATGAGA CTCTTGATGA GTTACACAAA GCCGTCGAGG 500ATCTTGAGGA GTACCCGAAC AAGAAATCTT TATCACAGCA TGCGGATGAT 550CTCAAAACCC TAATGAGTGC CGCGATGACC AATCAGGGGA CGTGTCTTGA 600TGGGTTCTCT CATGATGATG CTAATAAGCA CGTGCGGGAT GCGTTGTCAG 650ACGGCCAGGT TCATGTTGAG AAGATGTGTA GCAATGCGCT TGCTATGATC 700AAGAACATGA CTGACACTGA CATGATGATC ATGAGGACTT CAAACAACAG 750GAAGCTGATA GAGGAGACCA GTACGGTTGA TGGGTGGCCG GCGTGGCTGT 800CCACCGGAGA CAGGAGGCTG TTGCAGTCCT CGTCGGTGAC ACCGAACGTG 850GTGGTGGCAG CAGATGGCAG CGGAAACTTT AAGACGGTGG CGGCATCGGT 900GGCGGCGGCT CCTCAGGGAG GCACTAAGCG GTATATTATT AGGATTAAAG 950CCGGTGTTTA TCGGGAAAAT GTTGAGGTGA CAAAGAAGCA TAAAAATATA1000ATGTTCATCG GTGACGGGAG GACTAGAACT ATCATCACAG GGAGTAGAAA1050TGTGGTTGAT GGAAGCACAA CTTTCAAGTC TGCTACAGTT GCTGTTGTTG1100GTGAAGGATT CTTGGCCCGA GACATTACAT TCCAAAACAC AGCCGGCCCC1150TCAAAGCACC AGGCGGTGGC ACTACGAGTG GGAGCTGACC TTTCAGCATT1200TTACAATTGC GATATGTTAG CTTACCAAGA CACACTCTAC GTCCACTCGA1250ACCGCCAGTT CTTTGTGAAC TGCTTAATTG CTGGCACGGT TGATTTTATT1300TTTGGTAACG CTGCAGCCGT GTTACAAAAT TGTGACATCC ATGCACGAAA1350GCCCAATTCC GGCCAAAAAA ATATGGTCAC AGCCCAAGGC AGGGCTGACC1400CTAACCAAAA CACCGGCATT GTCATTCAAA AATCTAGGAT TGGTGCCACC1450TCCGATTTAA AACCGGTTCA GGGTAGTTTC CCGACGTACC TCGGCAGGCC1500CTGGAAGGAG TACTCGAGGA CGGTGATCAT GCAGTCATCG ATTACTGACG1550TGATCCACCC TGCCGGGTGG CACGAGTGGG ATGGTAACTT CGCGTTGAAC1600ACATTGTTTT ACGGAGAGCA TCAGAACGCC GGAGCCGGTG CCGGAACTTC1650AGGGAGAGTT AAATGGAAGG GATTTAGGGT TATTACAAGT GCTAACGAGG1700CTCAAGCTTT TACTCCTGGA AGCTTCATTG CTGGTAGTAG CTGGCTGGGC1750TCCACTGGTT TCCCATTCTC CCTTGGTTTG TAATATTCAC TAGGAGTTTT1800AATTAATATG TTTTGTATTA GTGGATCCAT AGGTCTCTGG TCTTTCAATT1850TGTAATATTT GATTGAGCGT GTCTTATTCG TGGCTTCGAT TTCACAAATA1900CTATTGTGTG ATTAACAAGA AATAAAAATG CATGGGAAGA ATAATAATTT1950CCGGCTTCTT TAAATTAAAA AAAAA 197權(quán)利要求
1.包含果膠甲酯酶(“PME”)、第一PME底物和第二PME底物的組合物；其中無(wú)論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
2.按照權(quán)利要求1的組合物，其中所述PME利用重組DNA技術(shù)制備。
3.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的組合物，其中至少一種所述PME底物是果膠，或是可得自果膠的底物，或是由果膠衍生的底物。
4.按照權(quán)利要求3的組合物，其中所述第一PME底物和所述第二PME底物每種都獨(dú)立選自果膠，或是可得自果膠的底物，或是由果膠衍生的底物。
5.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述第一PME底物存在于植物和/或植物材料中。
6.按照權(quán)利要求5的組合物，其中所述植物或植物材料是蔬菜、蔬菜材料、水果或水果材料中的任何一種或多種。
7.按照權(quán)利要求5和權(quán)利要求6的組合物，其中所述第一PME底物存在于蔬菜材料和/或水果材料中。
8.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述蔬菜材料和或所述水果材料是漿料。
9.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物是食料或用于制備食料。
10.按照前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中將所述第二PME底物加入到所述第一PME底物中。
11.制備組合物的方法，所述方法包括形成PME、第一PME底物和第二PME底物的混合物；其中無(wú)論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其中所述PME由前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定義。
13.按照權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的方法，其中所述第一PME底物由前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定義。
14.按照權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二PME底物由前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所定義。
15.按照權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于制備食料。
16.包括向第一PME底物加入PME和第二PME底物的工藝；其中無(wú)論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
17.賦予包含第一PME底物的反應(yīng)介質(zhì)穩(wěn)定性的工藝，所述方法包括至少加入PME和第二PME底物；其中無(wú)論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
18.按照權(quán)利要求17的工藝，其中所述反應(yīng)介質(zhì)是食料或用于制備食料。
19.由PME、第一PME底物和第二PME底物制備的組合物；其中無(wú)論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
20.處于凝固凝膠狀態(tài)的含水系統(tǒng)，它的可溶性固體含量低于50％(w/w)；其中所述膠凝利用高酯PME底物產(chǎn)生。
21.包含PME、第一PME底物和第二PME底物的組合物；其中無(wú)論是所述第一PME底物，還是所述第二PME底物，都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生；并且其中至少所述第二PME底物經(jīng)PME預(yù)處理。
22.包括按照任一前述權(quán)利要求或按照任一前述權(quán)利要求由本發(fā)明或通過本發(fā)明制備的食料。
23.大致如本文所述的組合物或工藝或方法或食料。
全文摘要
描述了一種適于用作食料或在食料制備中使用的組合物。所述組合物包含果膠甲酯酶(“PME”)、第一PME底物和第二PME底物,其中無(wú)論是所述第一PME底物,還是所述第二PME底物,都不是在原位由所述另一種底物產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A23L1/03GK1260687SQ98806280
公開日2000年7月19日 申請(qǐng)日期1998年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月24日
發(fā)明者J·D·克賴貝格, T·M·I·E·克里斯藤森, S·希特爾 申請(qǐng)人:丹尼斯科有限公司