專利名稱：新pp的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種新ppGpp合成酶以及涉及使用上述新ppGpp合成酶的用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善感興趣蛋白產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明的背景在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，分泌的蛋白穿過(guò)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁輸出，隨后釋放到外部培養(yǎng)基中。
革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌諸如枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌等具有高含量的外蛋白質(zhì)，并且事實(shí)上許多芽孢桿菌胞外酶已用于工業(yè)上。
在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中許多蛋白質(zhì)參與分泌機(jī)制。
WO 94/19471描述了參與芽孢桿菌分泌機(jī)制的PrsA蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步描述了涉及PrsA蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)的用于改善感興趣的外蛋白的分泌的表達(dá)系統(tǒng)。
Dedhia等(生物技術(shù)與生物工程(Biotechnology andBioengineering)53379-386(1997))描述了比野生型表達(dá)更少量的ppGpp合成酶的革蘭氏陰性大腸桿菌菌株(relA)。這種革蘭氏陰性大腸桿菌菌株具有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)蛋白質(zhì)的改善產(chǎn)生。
本發(fā)明的總結(jié)本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌例如芽孢桿菌菌株中改善感興趣蛋白產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)。
本方法基于從芽孢桿菌菌種枯草芽孢桿菌(序列1)和解淀粉芽孢桿菌(序列3)克隆的都是編碼具ppGpp合成酶活性的多肽的新DNA序列。
此處公開(kāi)的新DNA序列資料可用于通過(guò)例如標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)從革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌克隆類似的DNA序列。參看例如此處的工作實(shí)施例(參看下文)。
此DNA序列資料提供了構(gòu)建一種表達(dá)系統(tǒng)的可能性，該表達(dá)系統(tǒng)用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中增進(jìn)表達(dá)至少一種感興趣蛋白，其中上述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌比野生型表達(dá)更少量的具有ppGpp合成酶活性的多肽。
相應(yīng)地，在一方面，本發(fā)明提供了一種選自包括(a)編碼一種具有ppGpp合成酶活性的多肽的并含有序列1所示從核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸的序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物種同系物；(c)編碼具有ppGpp合成酶活性的并至少70％與序列2中氨基酸殘基1至氨基酸殘基734的氨基酸序列相同的多肽的多核苷酸分子；(d)與(a)，(b)或(c)互補(bǔ)的分子；以及(e)(a)，(b)，(c)或(d)的簡(jiǎn)并核苷酸序列的組中的分離的多核苷酸分子。
本發(fā)明第二方面提供了一種含有下面可操作連接的元件的表達(dá)載體一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；一個(gè)選自含有(a)編碼一種具有ppGpp合成酶活性的多肽的并含有序列1所示從核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸的序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物種同系物；(c)編碼具有ppGpp合成酶活性的并至少70％與序列2中從氨基酸殘基1至氨基酸殘基734的氨基酸序列相同的多肽的多核苷酸分子；以及(d)(a)，(b)或(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列的組中的DNA片段；及一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。
本發(fā)明第三方面提供了一種引入了上述表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中上述細(xì)胞表達(dá)由DNA片段編碼的多肽。
本發(fā)明第四方面提供了一種具有ppGpp合成酶活性的選自包括(a)含有序列2所示從氨基酸殘基1至氨基酸殘基734的氨基酸殘基的序列的多肽分子；(b)(a)的物種同系物的組中的分離的多肽。
本發(fā)明的另一方面提供了含有純化的本發(fā)明多肽及其它多肽的一種組合物。
本發(fā)明的又一方面提供了生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括培養(yǎng)引入了上述表達(dá)載體的細(xì)胞，借此上述細(xì)胞表達(dá)DNA片段編碼的多肽以及回收多肽。
本發(fā)明的再一個(gè)方面涉及一種用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善至少一種感興趣蛋白質(zhì)產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)含有一種比野生型表達(dá)更少量本發(fā)明多肽的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
本發(fā)明最后一個(gè)方面涉及一種用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善至少一種感興趣蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法，該方法包括i)培養(yǎng)依據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)；和ii)從產(chǎn)生的培養(yǎng)肉湯或表達(dá)系統(tǒng)純化感興趣的上述蛋白質(zhì)。定義在進(jìn)一步詳細(xì)討論本發(fā)明之前，首先定義下列術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)“物種同系物(species homlog)”意圖包括“定向進(jìn)化同源物(ortholog)”和/或“平行進(jìn)化同源物(paralog)”。
術(shù)語(yǔ)“定向進(jìn)化同源物”指從一個(gè)物種獲取的一種多肽或蛋白質(zhì)與來(lái)自不同物種的類似多肽或蛋白質(zhì)具有同源性。
術(shù)語(yǔ)“平行進(jìn)化同源物”指從一個(gè)給定物種獲取的一種多肽或蛋白質(zhì)與來(lái)自同一物種的不同多肽或蛋白質(zhì)具有同源性。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”指一個(gè)線性或環(huán)狀DNA分子，它含有與其它片段可操作連接以使其轉(zhuǎn)錄的編碼感興趣多肽的片段。這種其它片段可能包括啟動(dòng)子和終止子序列，并可選地包括一個(gè)或更多的復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)或更多的可選擇標(biāo)記，一個(gè)增強(qiáng)子，一個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)，等等。表達(dá)載體通常來(lái)源自質(zhì)?；虿《綝NA，或含有兩種元件。本發(fā)明的表達(dá)載體可以是任何可方便的進(jìn)行重組DNA流程的表達(dá)載體，載體的選擇通常依賴于要引入載體的宿主細(xì)胞。因而，載體可能是自主復(fù)制載體，即以染色體外實(shí)體存在的，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒。替代的，載體可以是在引入宿主細(xì)胞后整合到宿主基因組并與它整合進(jìn)的染色體共同復(fù)制。
此處與多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)聯(lián)合使用的術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)”或“重組地表達(dá)的(recombinantly expressed)”按照本技術(shù)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)定義來(lái)定義。一種蛋白質(zhì)的重組表達(dá)通常通過(guò)使用緊鄰的上面所述的表達(dá)載體來(lái)進(jìn)行。
當(dāng)用于一種多核苷酸分子時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指將多核苷酸從其天然遺傳環(huán)境取出從而不含其它外部的或不想要的編碼序列，并且以適用于基因工程蛋白質(zhì)產(chǎn)生系統(tǒng)的形式存在。這種分離的分子是從其天然環(huán)境分離的，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含它們通常相連的其它基因，但可能包括天然存在的5′和3′不翻譯區(qū)諸如啟動(dòng)子和終止子。相關(guān)區(qū)域的確認(rèn)對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯然的(參看例如，Dynan和Tijan，自然(Nature)316774-78，1985)。術(shù)語(yǔ)“一種分離的多核苷酸”可由術(shù)語(yǔ)“一種克隆的多核苷酸”代替。
用于蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“分離的”指蛋白質(zhì)處于非其天然環(huán)境的條件下。優(yōu)選的形式是，分離的蛋白質(zhì)事實(shí)上不含其它蛋白質(zhì)，特別是其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(參看下面))。優(yōu)選地提供高純化形式的蛋白質(zhì)，即由SDS-PAGE測(cè)定的，高于80％純度，更優(yōu)選地超過(guò)95％純度，甚至更優(yōu)選地超過(guò)99％純度。
術(shù)語(yǔ)“同源雜質(zhì)”意思是從獲取本發(fā)明多肽的同源細(xì)胞中產(chǎn)生的任何雜質(zhì)(即本發(fā)明多肽之外的另一種多肽)。
此處與一種特定微生物來(lái)源聯(lián)用的術(shù)語(yǔ)“獲取”是指由特定來(lái)源或來(lái)自來(lái)源的基因插入的細(xì)胞產(chǎn)生的多核苷酸和/或多肽。
當(dāng)指DNA片段時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可操作連接的”指片段的排列使它們?yōu)槠淠康囊恢滦惺构δ埽缭趩?dòng)子起始轉(zhuǎn)錄，經(jīng)過(guò)編碼片段至終止子。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指從5′到3′末端閱讀的脫氧核糖核酸或核糖核酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可能從天然來(lái)源分離，體外合成，或?qū)⑻烊缓秃铣傻姆肿勇?lián)合來(lái)制備。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸分子的互補(bǔ)物”指與參考序列相比具有互補(bǔ)堿基序列和反方向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG3′與5′CCCGTGCAT3′互補(bǔ)。
術(shù)語(yǔ)“簡(jiǎn)并核苷酸序列”指含一個(gè)或多個(gè)簡(jiǎn)并密碼子的核苷酸序列(與編碼多肽的參考多核苷酸分子相比)。簡(jiǎn)并密碼子含有不同的三聯(lián)體核苷酸，但編碼同一氨基酸殘基(即，GAU和GAC三聯(lián)體均編碼天冬氨酸)。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指含有提供RNA聚合酶結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列的基因的一部分。啟動(dòng)子序列通常但不總是發(fā)現(xiàn)于基因的5′非編碼區(qū)。
術(shù)語(yǔ)“分泌性信號(hào)序列”指編碼一種多肽(一種“分泌肽”)的DNA序列，該多肽作為一種大多肽的組分，引導(dǎo)大多肽穿過(guò)它在其中合成的細(xì)胞的分泌途徑。大多肽通常在穿過(guò)分泌途徑中切割除去分泌肽。
用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)系統(tǒng)”指比野生型表達(dá)更少量依據(jù)本發(fā)明的具有ppGpp合成酶活性的多肽的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。感興趣的蛋白質(zhì)可能是例如一種重組表達(dá)的蛋白質(zhì)。
此處與緊鄰的上面所述的表達(dá)系統(tǒng)相連使用的術(shù)語(yǔ)“野生型量”指依據(jù)本發(fā)明的多肽表達(dá)水平的野生型(天然的)量，即在革蘭氏陽(yáng)性菌株被修飾為表達(dá)更少量上述多肽之前的表達(dá)量。
術(shù)語(yǔ)“外蛋白(exoprotein)”指從感興趣細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)。一種外蛋白通常含有如上所述的分泌性信號(hào)序列。
術(shù)語(yǔ)“ppGpp合成酶”指依據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域定義的ppGpp合成酶。
大腸桿菌中ppGpp的合成由至少兩種途徑控制(Dedhia等，生物技術(shù)和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)53379-386(1997))。大腸桿菌中由relA基因編碼的酶ppGpp合成酶I(PSI)(EC 2.7.6.5)在對(duì)氨基酸缺失的嚴(yán)格反應(yīng)中負(fù)責(zé)ppGpp的合成(Block，R.，Haseltine，W.A.1974。ppGpp和ppGppp的體外合成(In vitro synthe sis of ppGpp and ppGppp)，pp.747-761。見(jiàn)于M，Nomura，A.Tissieres，和P.Lengyel(編者)，核糖體(Ribosomes)。冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，冷泉港紐約(Cold Spring HarborN.Y.))。當(dāng)細(xì)菌的生長(zhǎng)由于主要碳源的耗盡而減慢時(shí)，由不依賴于relA基因的途徑激活嚴(yán)格反應(yīng)(Hemandez，V.J.，Bremer，H.1991。大腸桿菌ppGpp合成酶II活性需要spoT(E.coli ppGpp Synthetase II activity requires spoT.)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，2665991-5999)。第二種酶，由spoT基因編碼的ppGpp合成酶II(PSII)，負(fù)責(zé)催化ppGpp的合成(Hernandez，V.J.，Bremer，H.1991。大腸桿菌ppGpp合成酶II活性需要spoT。生物化學(xué)雜志(J.Biol，Chem.)2665991-5999)。
本文中的“ppGpp合成酶”意圖包括如上所述的具有ppGpp合成酶I活性的酶(EC 2.7.6.5)和/或具有ppGpp合成酶II活性的酶。
術(shù)語(yǔ)“ppGpp合成酶”可替代為“(p)ppGpp合成酶”。
術(shù)語(yǔ)“ppGpp合成酶基因”是指編碼具有ppGpp合成酶活性的多肽的DNA序列。
本發(fā)明的詳細(xì)描述怎樣使用本發(fā)明的一個(gè)序列獲取其它相關(guān)序列此處公開(kāi)的涉及編碼本發(fā)明ppGpp合成酶的多核苷酸序列的序列資料可用作確認(rèn)其它同源ppGpp合成酶的工具。例如，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從不同的微生物來(lái)源，特別是不同的芽孢桿菌菌種擴(kuò)增編碼其它同源ppGpp合成酶的序列。
進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參考此處的工作實(shí)施例(參見(jiàn)下面)。
測(cè)定活性的檢測(cè)依據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，諸如通過(guò)離子對(duì)反相高效液相層析分離核苷酸后在254nm的紫外吸收，可測(cè)定本發(fā)明具有ppGpp合成酶活性的多肽的ppGpp合成酶活性。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參考Baracchini等(Mol GenGenet(1988)213379-387)。
使用本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的感興趣蛋白質(zhì)可通過(guò)與上述感興趣蛋白質(zhì)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)活性分析方法來(lái)測(cè)定活性。特別是當(dāng)感興趣蛋白質(zhì)是一種酶時(shí)，本技術(shù)領(lǐng)域描述了多種相關(guān)酶活性分析方法。對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言特別是對(duì)酶，確定與感興趣蛋白質(zhì)相關(guān)的有效的分析方法是常規(guī)工作。
多核苷酸在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少在介質(zhì)嚴(yán)格條件下，本發(fā)明的分離的多核苷酸將與序列1的類似大小區(qū)域或其互補(bǔ)序列雜交。
特別地，至少在介質(zhì)嚴(yán)格條件下，但優(yōu)選地在下面詳述的高度嚴(yán)格條件下，本發(fā)明的多核苷酸將與含有序列1中位置21-2225所示序列的雙鏈DNA探針雜交。
測(cè)定培養(yǎng)基中或高度嚴(yán)格時(shí)核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間的雜交的適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件包括在5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等.1989)中預(yù)浸泡含有要雜交的DNA片段或RNA的濾膜10分鐘，在5×SSC，5×Denhardt溶液(Sambrook等，1989)，0.5％SDS和100μg/ml變性超聲波處理的鮭精DNA(Sambrook等.1989)溶液中預(yù)雜交濾膜，隨后在大約45℃含有濃度為10ng/ml的隨機(jī)引物的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.1326-13)，32P-dCTP-標(biāo)記的(特異活性＞1×109cpm/μg)探針的同樣溶液中雜交12個(gè)小時(shí)。然后至少在60℃(培養(yǎng)基嚴(yán)格)，更優(yōu)選地至少65℃(培養(yǎng)基/高度嚴(yán)格)，甚至更優(yōu)選地至少70℃(高度嚴(yán)格)，以及甚至更優(yōu)選地至少75℃(非常高度嚴(yán)格)下，2×SSC，0.5％SDS中30分鐘洗兩次。
使用X-射線底片檢測(cè)到在這些條件下寡核苷酸探針雜交的分子。
如前面所述，本發(fā)明分離的多核苷酸包括DNA和RNA。本技術(shù)領(lǐng)域分離DNA和RNA的方法是眾所周知的。
使用鹽酸胍抽題隨后通過(guò)氯化銫梯度離心分離制備總RNA(Chirgwin等，生物化學(xué)(Biochemistry)1852-94，1979)。使用Aviv和Leder的方法(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)691408-1412，1972)從總RNA中制備Poly(A)+RNA。使用已知方法從poly(A)-RNA制備互補(bǔ)的DNA(cDNA)。然后通過(guò)例如雜交或PCR確認(rèn)和分離編碼本發(fā)明的具有ppGpp合成酶活性的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了來(lái)自不同細(xì)菌菌株的對(duì)應(yīng)多肽和多核苷酸(定向進(jìn)化同源物或平行進(jìn)化同源的)。特別興趣的是來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌株的ppGpp合成酶多肽，革蘭氏陽(yáng)性菌株包括芽孢桿菌菌種諸如枯草芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，Bacillus clausii，或特別地是地衣芽孢桿菌。
序列1所示的本發(fā)明多核苷酸從枯草芽孢桿菌菌株168(NCIB 10106)獲得。
將本發(fā)明提供的資料和組合物與常規(guī)克隆技術(shù)相結(jié)合能夠克隆本發(fā)明的具有ppGpp合成酶活性的多肽的物種同系物。例如，使用從表達(dá)該蛋白的細(xì)胞類型獲得的mRNA能夠克隆cDNA。利用從此處公開(kāi)的序列設(shè)計(jì)的探針通過(guò)探測(cè)Northern印跡可以確認(rèn)適當(dāng)來(lái)源的mRNA。然后從陽(yáng)性細(xì)胞的mRNA制備文庫(kù)。然后通過(guò)多種方法，諸如用基于公開(kāi)序列的完全的或部分cDNA或一組或更多組簡(jiǎn)并探針進(jìn)行探測(cè)，分離到編碼本發(fā)明的具有ppGpp合成酶活性多肽的cDNA。亦可使用從此處公開(kāi)序列設(shè)計(jì)的引物利用聚合酶鏈反應(yīng)或PCR(Mullis，U.S.Patent 4,683,202)克隆cDNA。其中的另一種方法是，使用cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使用抗relA-bac抗體或與具有ppGpp合成酶活性的多肽相關(guān)的活性測(cè)定方法檢測(cè)感興趣cDNA的表達(dá)。亦可使用類似的技術(shù)分離基因組克隆。
多肽本發(fā)明亦提供了大體上與序列2多肽同源的以及它們的物種同系物(平行進(jìn)化同源物或定同進(jìn)化同源物)的分離的ppGpp合成酶多肽。此處使用的術(shù)語(yǔ)“大體上同源的”是指與序列2所示序列或它們的定向進(jìn)化同源物或平行進(jìn)化同源物具有70％，更優(yōu)選地至少80％序列相同的多肽。這類多肽將更優(yōu)選地至少90％，并最優(yōu)選地95％或更多與序列2或其定向進(jìn)化同源物或平行進(jìn)化同源物相同。序列相同性的百分?jǐn)?shù)是由常規(guī)方法測(cè)定的，通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序諸如GCG程序包中提供的GAP(Wisconsin Package程序手冊(cè)，版本8，1994年8月，遺傳計(jì)算組(Genetics Computer Group)，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物學(xué)雜志(Journal ofMolecular Biolgy)，48，443-453)。利用給定的用于多肽序列比較的設(shè)置使用GAPGAP產(chǎn)生懲罰(GAP Creation penalty)3.0，GAP延伸懲罰(GAPextension penalty)0.1。
多核苷酸分子的序列相同性是通過(guò)類似的方法使用GAP測(cè)定的，使用了用于DNA序列比較的下列設(shè)置GAP產(chǎn)生懲罰5.0及GAP延伸懲罰0.3。
大體上同源的蛋白質(zhì)和多肽表征為具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，缺失或添加。這些變化優(yōu)選地很微小，是保守的氨基酸取代(參看表2)，和沒(méi)有顯著影響蛋白質(zhì)或多肽的折疊或活性的其它取代；小的缺失，典型地是1到30個(gè)氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸，諸如一個(gè)氨基端甲硫氨酸殘基，一個(gè)至大約20-25殘基的接頭肽，或有助于純化的的小的延伸(一種親合標(biāo)記)，諸如聚組氨酸片段，蛋白質(zhì)A(Nilsson等，歐洲分子生物學(xué)雜志(EMBO J.)41075，1985；Nilsson等，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)1983，1991。一般參看Ford等，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(Protein Expression andPurification)295-107，1991，以參考文獻(xiàn)形式并于此處)。可從商業(yè)供應(yīng)商獲取編碼親合標(biāo)記的DNA(例如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；NewEngland Biolabs，Beverly，MA)。
表2保守性氨基酸取代堿性的精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的谷氨酸天冬氨酸極性的谷氨酰胺天冬酰胺疏水的亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族的苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸除了20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(諸如4-羥脯氨酸，6-N-甲基賴氨酸，2-氨基異丁酸，異纈氨酸(isovaline)和α-甲基絲氨酸(a-methylserine))可以取代本發(fā)明多肽的氨基酸殘基。有限量的非保守氨基酸，不是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷笔窃诘鞍踪|(zhì)合成后進(jìn)行了修飾，和/或其側(cè)鏈具有與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸可化學(xué)化成或優(yōu)選地購(gòu)得商品，包括2-哌啶酸，噻唑烷羧酸，脫氫脯氨酸，3-和4-甲基脯氨酸，以及3，3-二甲基脯氨酸。
按照本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法，諸如定位誘變或丙氨酸掃描誘變(alanine-scanning mutagenesis)(Cunningham和Wells，科學(xué)(Science)2441081-1085，1989)能夠確定本發(fā)明ppGpp合成酶多肽中關(guān)鍵的氨基酸。在后一種技術(shù)中，將單個(gè)丙氨酸突變引入到分子中的每一個(gè)殘基，并測(cè)定產(chǎn)生的突變分子的生物學(xué)活性(即ppGpp合成酶活性)從而確認(rèn)對(duì)分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。亦可參看Hilton等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2714699-4708，1996。還可以將諸如核磁共振，晶體學(xué)，電子衍射或光親合標(biāo)記測(cè)定的結(jié)構(gòu)的物理分析與假定的接觸部位氨基酸的突變相結(jié)合，確定配體-受體或其它生物學(xué)相互作用的位點(diǎn)。參看例如，de Vos等，科學(xué)(Science)255306-312，1992；Smith等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224899-904，1992；Wlodaver等，F(xiàn)EBS Lett.30959-64，1992。也可以通過(guò)與本發(fā)明多肽相關(guān)多肽的同源性分析推斷一致的關(guān)鍵氨基酸。
使用已知的方法誘變，重組和/或改組隨后是相關(guān)篩選方案，諸如Reidhaar-Olson和Sauer(科學(xué)(Science)24153-57，1988)，Bowie和Sauer(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)862152-2156，1989)，WO95/17413，或WO 95/22625所公開(kāi)的，可以進(jìn)行多氨基酸取代和檢測(cè)。簡(jiǎn)言之，這些作者公開(kāi)的方法是同時(shí)隨機(jī)化多肽中的兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，或重組/改組不同的突變(WO 95/17413，WO 95/22625)，隨后選擇功能性多肽，然后將誘變的多肽測(cè)定確定每個(gè)位點(diǎn)允許取代的圖譜。其它可以使用的方法包括噬菌體展示(例如Lowman等，生物化學(xué)(Biochem.)3010832-10837，1991；Landner等，U.S.Patent No.5,223,409；Huse，WIPOPublication WO 92/06204)和區(qū)域定位誘變(Derbyshire等，基因(Gene)46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
可將上面公開(kāi)的誘變/改組方法與高生產(chǎn)率，自動(dòng)的篩選方法結(jié)合來(lái)檢測(cè)宿主細(xì)胞中克隆的突變多肽的活性?？梢詮乃拗骷?xì)胞回收編碼活性多肽的突變DNA分子并使用現(xiàn)代化儀器快速測(cè)序。這些方法能夠快速測(cè)定感興趣多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并可用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
使用上面討論的方法，本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定和/或制備多種大體上與序列2中殘基1至734同源的并保持野生型蛋白質(zhì)ppGpp合成酶活性的多肽。
蛋白質(zhì)的生產(chǎn)依據(jù)常規(guī)技術(shù)，可在基因工程的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，其片段和融合蛋白。合適的宿主細(xì)胞是那些可由外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的并可在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞類型，包括細(xì)菌，真菌細(xì)胞，以及培養(yǎng)的較高等真核細(xì)胞。優(yōu)選地是細(xì)菌細(xì)胞，特別是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的培養(yǎng)細(xì)胞。來(lái)自芽孢桿菌屬的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞是特別優(yōu)選的，諸如枯草芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽胞桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，Bacillus clausii，或特別地是地衣芽孢桿菌。
操作克隆的DNA分子和將外源DNA引入多種宿主細(xì)胞的技術(shù)公開(kāi)于Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA LaboratoryManual.，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，冷泉港，紐約(Cold Spring Harbor，NY)，1989；Ausubel等(編者)，分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wileyand Sons，Inc.，NY，1987；以及(枯草芽孢桿菌及其它革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(Bacillus Subtilis and other Gram-Positive Bacteria)，Sonensheim等，1993，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)(American Society for Microbiowgy)，Washington D.C.)，以參考文獻(xiàn)并于此處。
一般而言，編碼本發(fā)明ppGpp合成酶多肽的DNA序列可操作地連接到其表達(dá)所需的其它遺傳元件，通常在表達(dá)載體內(nèi)包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子。載體通常也將含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記以及一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，但本技術(shù)領(lǐng)域熟練人員將認(rèn)識(shí)到在某些系統(tǒng)中選擇性標(biāo)記可由分離的載體提供，并且外源DNA的復(fù)制可通過(guò)整合到宿主細(xì)胞基因組來(lái)實(shí)現(xiàn)。啟動(dòng)子，終止子，選擇性標(biāo)記，載體和其它元件的選擇是本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)設(shè)計(jì)工作。許多這類元件在文獻(xiàn)中有敘述并可通過(guò)商品供應(yīng)商得到。
為了引導(dǎo)多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，在表達(dá)載體中提供了分泌性信號(hào)序列(亦稱為前導(dǎo)序列，前原序列或前序列)。分泌性信號(hào)序列可以是多肽的，或從其它外蛋白衍生的，或從頭合成的。分泌性信號(hào)序列在正確的閱讀框中與DNA序列連接。分泌性信號(hào)序列通常在編碼感興趣多肽的DNA序列的5′位置，但某些信號(hào)序列也可位于感興趣DNA序列的其它位置(參看例如，Welch等，U.S.Patent No.5,037,743；Holland等，U.S.Patent No.5,143,830)。
按照常規(guī)方法在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和選擇的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)所需的其它成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本技術(shù)領(lǐng)域熟知多種合適的培養(yǎng)基，包括確定成分培養(yǎng)基和復(fù)雜培養(yǎng)基并且通常包括一種碳源，一種氮源，必需氨基酸，維生素和礦物質(zhì)。如果需要，培養(yǎng)基中也可含有諸如生長(zhǎng)因子或血清等組分。生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常通過(guò)例如與表達(dá)載體或共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞攜帶的選擇性標(biāo)記互補(bǔ)的藥物選擇或某種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏來(lái)選擇含有外源附加DNA的細(xì)胞。
蛋白質(zhì)分離可使用分級(jí)和/或常規(guī)純化方法和材料純化表達(dá)的重組多肽(或嵌合多肽)。可以使用硫酸銨沉淀和酸或離液劑抽提進(jìn)行樣品分級(jí)。純化步驟舉例可包括羥基磷灰石，尺寸排阻層析氣相色譜(FPLC)和反相高效液相色譜。合適的陰離子交換介質(zhì)包括衍生化葡聚糖，瓊脂糖，纖維素，聚丙烯酰胺，特殊硅石等等。優(yōu)選地是PEI，DEAE，QAE和Q衍生物，特別優(yōu)選地是DEAE快速流動(dòng)瓊脂糖凝膠(DEAE Fast-Flow Separose)(Pharmacia，Piscataway，NJ)。色譜介質(zhì)舉例包括從苯基，丁基，或辛基衍生的介質(zhì)，諸如苯基-瓊脂糖凝膠FF(Pharmacia)，Toyopearl丁基650(Toyopearl butyl 650)(Toso Haas，Montgomeryville，PA)，辛基瓊脂糖凝膠(Pharmacia)及其類似物；或聚丙烯酸樹(shù)脂，諸如Amberchrom CG71(Toso Haas)及其類似物。合適的固相載體包括在它們使用的條件下是不溶的玻璃珠，硅石為基礎(chǔ)的樹(shù)脂，纖維素樹(shù)脂，瓊脂糖珠，交聯(lián)瓊脂糖珠，聚苯乙烯珠，交聯(lián)聚丙烯酰胺樹(shù)脂及其類似物。可使用反應(yīng)基團(tuán)修飾載體使其通過(guò)氨基，羧基，巰基，羥基和/或糖組分粘附蛋白質(zhì)。偶聯(lián)化學(xué)的例子包括溴化氰活化，N-羥基琥珀酰亞胺活化，環(huán)氧化物活化，巰基活化，酰肼活化，以及用于碳二亞胺偶聯(lián)化學(xué)的羧基或氨基衍生物。這些及其它固相介質(zhì)為本技術(shù)領(lǐng)域熟知和廣泛應(yīng)用，并可從商品供應(yīng)商得到。特定方法的選擇是常規(guī)的設(shè)計(jì)工作并且部分由選擇的載體的性質(zhì)來(lái)確定。參看例如親合層析原理和方法(AftinityChromatographyPrinciples & Methods)，Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，Sweden，1988。
優(yōu)選地將蛋白純化到＞80％純度，更優(yōu)選地到＞90％純度，甚至更優(yōu)選地＞95％，以及特別優(yōu)選地接近完全純化狀態(tài)，即對(duì)污染的大分子特別是其它蛋白質(zhì)和核酸而言超過(guò)99.9％純度，并且不含感染性和熱原性試劑。優(yōu)選地，純化的蛋白質(zhì)大體上不含其它蛋白質(zhì)，特別是細(xì)菌來(lái)源特別是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌來(lái)源的其它蛋白質(zhì)。純度是由SDS-PAGE測(cè)定的。
也可以通過(guò)化學(xué)合成制備本發(fā)明的多肽或其片段。本發(fā)明的多肽可能是單體或多體；糖基化的或非糖基化的；pegylated or nonpegylated；并且可能含或不含起始甲硫氨酸殘基。
多核苷酸/多肽的使用如下面詳述，此處公開(kāi)的與本發(fā)明具ppGpp合成酶活性的多肽有關(guān)的資料對(duì)于構(gòu)建用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中增進(jìn)生產(chǎn)感興趣蛋白的表達(dá)系統(tǒng)是必需的。
用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中增強(qiáng)外蛋白的分泌的表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明一方面涉及一種用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善至少一種感興趣蛋白產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)含有與野生型相比表達(dá)更少量本發(fā)明的多肽的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
優(yōu)選地感興趣蛋白是一種外蛋白。
優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“用于改善至少一種感興趣蛋白產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)”是一種具有一種或多種緊鄰的下面所述的改進(jìn)特征的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)的改進(jìn)特征包括的特征是諸如改進(jìn)利用生長(zhǎng)培養(yǎng)基的能力，生長(zhǎng)到更高細(xì)胞密度的能力，在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力，生產(chǎn)宿主的芽孢形成缺陷，增加感興趣的蛋白的表達(dá)，測(cè)定為發(fā)酵肉湯中積累的感興趣蛋白的量或每個(gè)時(shí)間單位每細(xì)胞質(zhì)量產(chǎn)生的感興趣蛋白量，減少發(fā)酵肉湯形成泡沫的傾向，發(fā)酵肉湯降低粘度，降低生產(chǎn)宿主產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物的降解，生產(chǎn)者生物體降低裂解的傾向(減少自溶)，在生產(chǎn)培養(yǎng)基中更高含量的高產(chǎn)細(xì)胞，發(fā)酵中減少色素或有色物質(zhì)的形成，以及改進(jìn)的發(fā)酵肉湯能夠更容易和有效的進(jìn)行回收步驟從而導(dǎo)致改進(jìn)的回收產(chǎn)率。
如上所述本發(fā)明的relA-Bac多肽是一種具有ppGpp合成酶活性的多肽。
在生產(chǎn)微生物中有比野生型更少量的ppGpp的好處ppGpp是一種真正的警戒因子(alarmone)，即它的濃度在正常生長(zhǎng)條件下很低(P.Neubauer等(J.of Biotechnology(1995)43195-204)并且當(dāng)生物體暴露于饑餓或其它肋迫因子時(shí)，ppGpp的胞內(nèi)濃度迅速增高。當(dāng)胞內(nèi)ppGpp濃度改善時(shí)核糖體RNA(rRNA)濃度降低，這樣又可能造成·翻譯的降低從而減少所需蛋白的產(chǎn)生。
·因?yàn)檠b載mRNA的核糖體數(shù)量的減少導(dǎo)致mRNA的保護(hù)減少，使核酸酶活性升高，所以給定mRNA有更高的不穩(wěn)定性。
·信使RNA鏈延長(zhǎng)速率的降低(生物化學(xué)雜志(J.of BiologicalChemistry)(1997)27212265-12271))。
相應(yīng)地，為了獲得改善感興趣蛋白產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)，在用于表達(dá)上述感興趣蛋白質(zhì)的生產(chǎn)細(xì)胞中比野生型表達(dá)更少量ppGpp合成酶是有利的。
一系列能夠在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中表達(dá)更少量感興趣多肽的技術(shù)在本技術(shù)領(lǐng)域是已知的，特別是優(yōu)選的芽孢桿菌屬的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(枯草芽孢桿菌和其它革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，Sonen sheim等，1993，美國(guó)微生物學(xué)會(huì)(American Society for Microbiology)，Washington D.C.)。
表達(dá)更少量本發(fā)明具ppGpp合成酶活性的多肽的合適技術(shù)包括諸如刪除或用其它方法破壞(例如破壞正確的閱讀框)本發(fā)明的ppGpp合成酶基因(其某些或所有拷貝)(例如在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌染色體上)，截短ppGpp合成酶基因(例如引入終止密碼子)，使用與ppGpp合成酶基因轉(zhuǎn)錄的mRNA反義的mRNA，和/或改變改善表達(dá)的調(diào)節(jié)元件，例如使用弱啟動(dòng)子，等等技術(shù)。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參照(Sarnbrook等，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloningAlaboratory manual)，Cold Spring Harbor Lab.，Cold SpringHarbor，NY；Ausubel，F(xiàn).M.等(編者)“分子生物學(xué)現(xiàn)代技術(shù)(CurrentProtocols in Molecular Biology)”。John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編者)“芽孢桿菌分子生物學(xué)方法(Molecular BiologicalMethods for Bacillus)”。John Wiley and Sons，1990)。
基于此處提供的DNA和/或氨基酸序列資料，選擇特定的策略在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中表達(dá)比野生型更少量的本發(fā)明具ppGpp合成酶活性的多肽對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是常規(guī)工作。
為了確定本發(fā)明具ppGpp合成酶活性的多肽減少表達(dá)的程度，可使用任何與ppGpp合成酶活性相關(guān)的檢測(cè)方法/測(cè)定方法(此處描述了合適的檢測(cè)方法(參看上文))。測(cè)定了在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞修飾前后產(chǎn)生的本發(fā)明具ppGpp合成酶活性的多肽的量，表達(dá)降低的程度可相對(duì)于未修飾的野生型(對(duì)照)細(xì)胞來(lái)測(cè)定。
依據(jù)本發(fā)明的具有ppGpp合成酶活性的多肽減少表達(dá)的程度優(yōu)選地是二倍降低表達(dá)，更優(yōu)選地四倍降低表達(dá)，甚至更優(yōu)選地十倍降低表達(dá)，最優(yōu)選地本發(fā)明具有ppGpp合成酶活性的多肽的表達(dá)完全受到破壞。
優(yōu)選地本發(fā)明具有ppGpp合成酶活性的多肽是從芽孢桿菌菌種獲得的多肽，諸如來(lái)自遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，Bacillus clausii，或特別地來(lái)自枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)中革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌可通過(guò)“蛋白質(zhì)生產(chǎn)”部分(參看上文)描述的對(duì)宿主細(xì)胞的常規(guī)方法來(lái)培養(yǎng)。
優(yōu)選地革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌是芽孢桿菌菌種，諸如枯草芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，Bacillusclausii，或地衣芽孢桿菌。
相對(duì)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，感興趣的蛋白可以是同源蛋白或異源蛋白。
優(yōu)選地，感興趣的蛋白是重組表達(dá)的。
感興趣蛋白質(zhì)可能是任何感興趣的蛋白質(zhì)。然而優(yōu)選地感興趣的蛋白質(zhì)是一種外蛋白質(zhì)，特別地是蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支鏈淀粉酶(pullanase)，纖維素酶，葡糖異構(gòu)酶，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，CGT酶(環(huán)化糊精葡糖酸轉(zhuǎn)移酶)，植酸酶，葡糖氧化酶，葡糖基轉(zhuǎn)移酶，漆酶，木聚糖酶，細(xì)菌蛋白質(zhì)毒素，微生物表面蛋白質(zhì)，病毒蛋白質(zhì)，或藥物蛋白質(zhì)。
為了測(cè)定感興趣蛋白質(zhì)優(yōu)選地是感興趣外蛋白質(zhì)改善產(chǎn)生的程度，可以使用對(duì)應(yīng)該蛋白(例如外蛋白)的任何相關(guān)活性分析方法/測(cè)定方法。
感興趣蛋白質(zhì)改善產(chǎn)生的程度可以相對(duì)于在革蘭氏陽(yáng)性菌株未改變以表達(dá)少量本發(fā)明多肽之前的蛋白產(chǎn)生水平來(lái)確定。
使用本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)致至少一種感興趣蛋白至少改善產(chǎn)出2倍，更優(yōu)選地至少一種感興趣蛋白至少改善產(chǎn)出4倍，甚至更優(yōu)選地至少一種感興趣蛋白至少改善產(chǎn)出10倍。
感興趣蛋白可以通過(guò)例如“蛋白質(zhì)分離”部分(參看上文)所述的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)分離。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善產(chǎn)生至少一種感興趣蛋白的方法，該方法包括i)培養(yǎng)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)；和ii)從產(chǎn)生的培養(yǎng)肉湯或表達(dá)系統(tǒng)純化上述感興趣的蛋白質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中上述培養(yǎng)是通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)行的。
補(bǔ)料分批發(fā)酵是一種標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵方法，特別是對(duì)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)。
補(bǔ)料分批發(fā)酵在基本生化工程(Bungary，Henry R.BASIC BiochemicalEngineening(2nded.).TroyBiLine Associates，1993)中一般描述為這種類型的系統(tǒng)，“當(dāng)其濃度降低至設(shè)定點(diǎn)時(shí)加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”。為了準(zhǔn)確，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的添加通常由計(jì)算機(jī)控制。一種優(yōu)選的控制補(bǔ)料的方法是監(jiān)測(cè)發(fā)酵罐或反應(yīng)器中該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度。
以不同的劑量添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以保證在任何時(shí)間發(fā)酵罐中都不會(huì)存在太多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。如果存在太多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可能會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)控制方式的補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，反應(yīng)可在高產(chǎn)率運(yùn)行而不會(huì)過(guò)載。
Neubauer，P.等(1995，生物技術(shù)雜志(Jouncal of Biotechnology)43 P.197-198)描述了一個(gè)合適的補(bǔ)料分批發(fā)酵的例子。
這個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的原理是許多直接參與蛋白質(zhì)合成的諸如RNA聚合酶，延伸因子和起始因子等細(xì)胞內(nèi)含物會(huì)由于營(yíng)養(yǎng)和能量的缺乏而減少以及由relA基因編碼的(p)ppGpp合成酶而介導(dǎo)，Dedhia，N.等，(1997)生物技術(shù)和生物工程(Biotechnology and Bioengineering)53(4)p379-386。
因而，使用具有降低表達(dá)的本發(fā)明的具有ppGpp合成酶活性多肽的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在這種補(bǔ)料分批發(fā)酵中可改善感興趣蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
替代地，上述培養(yǎng)可使用例如下面所述的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵技術(shù)中的一個(gè)來(lái)完成分批發(fā)酵在分批發(fā)酵中，接種后細(xì)胞生長(zhǎng)，直到某種底物組分耗盡或某種抑制劑積累；或通過(guò)下面標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的一種進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵；以恒定速率進(jìn)行恒化器營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)料；利用控制泵速率的反饋保持培養(yǎng)物固定濁度的恒濁器。當(dāng)細(xì)胞濃度低于設(shè)置點(diǎn)時(shí)恒濁器的控制器減緩補(bǔ)料使生長(zhǎng)能夠重建濁度。如果超過(guò)設(shè)置點(diǎn)，泵加速來(lái)稀釋細(xì)胞濃度；或恒營(yíng)養(yǎng)(nustat，nutritstat，或auxostat(同義詞))補(bǔ)料培養(yǎng)基來(lái)保持某因子恒定。
由下列非限定實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。材料和方法通用分子生物學(xué)方法除非特別說(shuō)明，DNA的操作和轉(zhuǎn)化使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook等，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular cloningAlaboratorymanual)，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F(xiàn).M，等(編者)“分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(Current protocols in MolecularBiology)”.John Wiley and Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編者)“芽孢桿菌分子生物學(xué)方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)”.John Wiley and Sons，1990)。
按照供應(yīng)商的說(shuō)明使用DNA操作的酶。DNA操作的酶除非特別說(shuō)明，DNA操作使用的所有酶諸如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶等來(lái)自New England Biolabs，Inc.實(shí)施例實(shí)施例1鑒定從不同芽孢桿菌獲取的其它ppGpp合成酶PCR反應(yīng)。對(duì)菌落將重新分離的在含有10μg/ml卡那霉素，10mM磷酸鉀pH7.0及0.4％葡萄糖的LB瓊脂平板上培養(yǎng)18小時(shí)的菌落懸浮于10μl1×PCR緩沖液(Super TaqTMDNA聚合酶)中加熱至96℃5分鐘，20000×g離心2分鐘。從上清中取5μl用作PCR反應(yīng)(30循環(huán))的模板，使用下面的不同引物和Super TaqTMDNA聚合酶并遵循制造商的說(shuō)明(Enzyme technologies Ltd.)。
PCR反應(yīng)的引物。使用了含有與序列1中所示枯草芽孢桿菌relA-Bac序列(下面劃線)相同的寡聚核苷酸組分的DNA引物(引物#104775至#104780)擴(kuò)增來(lái)自枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的DNA片段。
與序列1所示DNA序列相關(guān)的位置。下面未劃線的引物序列是用于克隆目的的接頭序列，含有限制性酶消化的適當(dāng)位點(diǎn)。
用于來(lái)自枯草芽孢桿菌的relA-Bac基因5′末端的引物(有義引物)#1047755′-CCG AAT TCA AAG GTG ATT CCA TGG CGA ACG-3′(位置9至30)#1047765′-CCG AAT TCG GTG ATT CCA TGG CGA ACG-3′(位置12至30)用于枯草芽孢桿菌relA-Bac基因內(nèi)部部分3′-末端的引物(反義引物)#1047775′-GCG GAT CCG CTT TAG GCC C-3′(位置987至969)。#1047785′-CAT GCA TTT CAA AGG TGC GG-3′(位置1020至1001)用于枯草芽孢桿菌relA-Bac基因3′-末端的引物(反義引物)#1047795′-CCT TTA GTT CAT GAC GCG GCG C-3′(位置2228至2207)#1047805′-GTG TTT AGC GGC CGC TGA ACA ACT AAT CTC-3′(位置2227至2256)#1135545′-ATA AGC ATG CGC TGA ACA ACT AAT CTC-3′(位置2256至2239)。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。在含有溴化乙錠的0.7％瓊脂糖凝膠上檢測(cè)了來(lái)自枯草芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和遲緩芽孢桿菌的PCR產(chǎn)物以確定是否有DNA存在并且如果存在，估計(jì)DNA的大小。獲得的PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。
解淀粉芽孢桿菌使用引物104775，104777，PCR片段大小約為980堿基對(duì)(bp)。
遲緩芽孢桿菌使用引物104775，104777，PCR片段大小大約為980bp和680bp。兩種PCR片段均可用于進(jìn)一步克隆遲緩芽孢桿菌的ppGpp合成酶。
地衣芽孢桿菌使用引物104776，104778，PCR片段大小大約為800bp；使用引物104776，104779，PCR片段大小大約1900bp。
將PCR擴(kuò)增的DNA片段測(cè)序并使用此序列資料克隆依據(jù)本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌和遲緩芽孢桿菌的ppGpp合成酶。按照本技術(shù)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行克隆。解淀粉芽孢桿菌全長(zhǎng)ppGpp合成酶的克隆使用由引物104775，104777(參看上面)以及PCR(反義)引物#113554擴(kuò)增的大小約980bp的解淀粉芽孢桿菌PCR片段，從解淀粉芽孢桿菌菌株獲得了一段PCR片段并按照制造商的方法在自動(dòng)DNA測(cè)序儀上進(jìn)行DNA測(cè)序。
此DNA序列及相應(yīng)的成熟蛋白質(zhì)序列顯示于序列3和4中。實(shí)施例2同源性/預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)本發(fā)明部分基于從枯草芽孢桿菌菌株獲得的編碼具ppGpp合成酶活性并與其它微生物ppGpp合成酶同源的多肽的新多核苷酸序列的發(fā)現(xiàn)。該多肽命名為relA-Bac。
定義本發(fā)明具有ppGpp合成酶活性的新多肽的標(biāo)準(zhǔn)最初是通過(guò)查詢眾所周知的數(shù)據(jù)庫(kù)Genebank(EMBL，Heidelberg)中與本發(fā)明的新relA-Bac序列同源的序列來(lái)鑒定的。
使用此處進(jìn)一步詳細(xì)描述(參看下文)的常規(guī)百分?jǐn)?shù)序列相同程序，relA-Bac(序列1)與本領(lǐng)域已知的ppGpp合成酶的DNA序列相同性顯示于下面的表1，并且相應(yīng)的氨基酸序列相同性顯示于表II。表II。DNA序列間的同源性。用于相似性的序列是來(lái)自EMBL的Genebank記錄的編碼DNA序列(CDS)，其基因座列于表中。GB_BA SEDEXB！X72832 S.equisimilisGB_BA VSU13769！U13769 Vibrio sp.GB_BA ECOSPOT ！M24503 E.coliGB_BA ECORELA ！J04039 E.coli

上面的DNA序列編碼的肽序列間的同源性。

從以上可以知道，雖然此處為了說(shuō)明的目的描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但在不偏離本發(fā)明精神和范圍情況下可以進(jìn)行多種改變。相應(yīng)地，本發(fā)明不受除了所附的權(quán)利要求書(shū)之外的限制。
此外，要求作為此申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)的丹麥專利申請(qǐng)DK 0726/97，以及隨同此申請(qǐng)的摘要中的公開(kāi)內(nèi)容，以參考文獻(xiàn)并于本發(fā)明。
序列表序列1顯示分離的本發(fā)明多核苷酸序列，含有編碼表現(xiàn)ppGpp合成酶活性的多肽的DNA序列。多肽命名為relA-Bac，來(lái)自枯草芽孢桿菌菌株。
(2)序列資料1(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2278堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(vi)最初來(lái)源(A)生物體relA-bac(B)菌株枯草芽孢桿菌(ix)特征(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置21..2222(xi)序列描述序列1ATTTTAAAAA AGGTGATTCC ATG GCG AAC GAA CAA GTA TTG ACT GCC GAG 50Met Ala Asn Glu Gln Val Leu Thr Ala Glu1 5 10CAA GTT ATA GAT AAA GCA CGC AGC TAT CTA TCT GAT GAG CAT ATC GCA98Gln Val Ile Asp Lys Ala Arg Ser Tyr Leu Ser Asp Glu His Ile Ala15 20 25TTT GTC GAA AAA GCA TAT CTG TAC GCT GAA GAT GCT CAT CGC GAG CAA 146Phe Val Glu Lys Ala Tyr Leu Tyr Ala Glu Asp Ala His Arg Glu Gln30 35 40TAC CGC AAA TCG GGC GAG CCA TAT ATT ATT CAT CCG ATT CAG GTT GCG 194Tyr Arg Lys Ser Gly Glu Pro Tyr Ile Ile His Pro Ile Gln Val Ala45 50 55GGG ATA CTC GTT GAT CTT GAA ATG GAC CCT TCC ACA ATC GCG GGC GGA 242Gly Ile Leu Val Asp Leu Glu Met Asp Pro Ser Thr Ile Ala Gly Gly60 65 70TTT TTG CAC GAT GTC GTG GAA GAT ACA GAT GTG ACG CTC GAT GAC CTG 290Phe Leu His Asp Val Val Glu Asp Thr Asp Val Thr Leu Asp Asp Leu75 80 85 90AAA GAA GCA TTT TCC GAA GAA GTG GCA ATG CTT GTA GAC GGC GTA ACG 338Lys Glu Ala Phe Ser Glu Glu Val Ala Met Leu Val Asp Gly Val Thr95 100 105AAA CTC GGC AAA ATT AAA TAT AAA TCT CAA GAG GAA CAG CAG GCG GAA 386Lys Leu Gly Lys Ile Lys Tyr Lys Ser Gln Glu Glu Gln Gln Ala Glu110 115 120AAT CAT CGC AAA ATG TTT GTC GCT ATG GCT CAA GAT ATC AGG GTC ATA 434Asn His Arg Lys Met Phe Val Ala Met Ala Gln Asp Ile Arg Val Ile125 130 135TTG ATC AAG CTG GCG GAT CGT CTT CAC AAT ATG CGG ACA CTG AAA CAT 482Leu Ile Lys Leu Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Leu Lys His140 145 150CTG CCT CAG GAA AAA CAG CGG AGA ATC TCC AAT GAA ACG CTG GAA ATT 530Leu Pro Gln Glu Lys Gln Arg Arg Ile Ser Asn Glu Thr Leu Glu Ile155 160 165 170TTT GCT CCT TTG GCG CAT CGT CTC GGG ATT TCA AAA ATT AAG TGG GAA 578Phe Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Trp Glu175 180 185TTG GAA GAT ACG GCG CTC CGT TAT TTG AAC CCT CAG CAA TAT TAC AGA 626Leu Glu Asp Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Asn Pro Gln Gln Tyr Tyr Arg190 195 200ATT GTC AAC CTC ATG AAG AAG AAA CGT GCA GAA CGA GAG CTT TAT GTC 674Ile Val Asn Leu Met Lys Lys Lys Arg Ala Glu Arg Glu Leu Tyr Val205 210 215GAT GAG GTT GTC AAT GAA GTG AAG AAA CGT GTC GAA GAA GTA AAT ATC 722Asp Glu Val Val Asn Glu Val Lys Lys Arg Val Glu Glu Val Asn Ile220 225 230AAG GCT GAC TTC TCG GGA CGC CCG AAA CAT ATT TAC AGC ATT TAT CGA 770Lys Ala Asp Phe Ser Gly Arg Pro Lys His Ile Tyr Ser Ile Tyr Arg235 240 245 250AAA ATG GTG CTG CAA AAT AAG CAA TTC AAT GAA ATT TAC GAT TTG TTG 818Lys Met Val Leu Gln Asn Lys Gln Phe Asn Glu Ile Tyr Asp Leu Leu255 260 265GCT GTC CGT ATT CTT GTG AAT AGC ATA AAG GAC TGC TAC GCG GTG CTT 866Ala Val Arg Ile Leu Val Asn Ser Ile Lys Asp Cys Tyr Ala Val Leu270 275 280GGC ATC ATT CAC ACA TGC TGG AAA CCG ATG CCA GGC AGA TTC AAA GAT 914Gly Ile Ile His Thr Cys Trp Lys Pro Met Pro Gly Arg Phe Lys Asp285 290 295TAT ATC GCA ATG CCG AAG CCG AAT ATG TAT CAA TCG CTT CAT ACA ACG 962Tyr Ile Ala Met Pro Lys Pro Asn Met Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr300 305 310GTT ATT GGG CCT AAA GCG GAT CCG CTT GAA GTG CAG ATC CGC ACC TTT 1010Val Ile Gly Pro Lys Ala Asp Pro Leu Glu Val Gln Ile Arg Thr Phe315 320 325 330GAA ATG CAT GAA ATA GCG GAA TAC GGG GTT GCG GCT CAC TGG GCT TAT 1058Glu Met His Glu Ile Ala Glu Tyr Gly Val Ala Ala His Trp Ala Tyr335 340 345AAA GAA GGG AAA GCA GCC AAT GAA GGT GCA ACC TTT GAG AAA AAG CTT 1106Lys Glu Gly Lys Ala Ala Asn Glu Gly Ala Thr Phe Glu Lys Lys Leu350 355 360TCT TGG TTC CGT GAA ATT TTA GAA TTT CAA AAT GAA TCG ACA GAT GCA 1154Ser Trp Phe Arg Glu Ile Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Thr Asp Ala365 370 375GAA GAA TTT ATG GAA TCG CTC AAA ATT GAT TTG TTC TCT GAC ATG GTG 1202Glu Glu Phe Met Glu Ser Leu Lys Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Val380 385 390TAT GTC TTT ACG CCA AAA GGA GAT GTA ATC GAG CTT CCG TCC GGT TCT 1250Tyr Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Ile Glu Leu Pro Ser Gly Ser395 400 405 410GTT CCG ATT GAC TTT TCT TAC CGG ATT CAC TCT GAA ATC GGC AAT AAA 1298Val Pro Ile Asp Phe Ser Tyr Arg Ile His Ser Glu Ile Gly Asn Lys415 420 425ACA ATC GGT GCC AAA GTA AAC GGA AAA ATG GTT ACG CTT GAC CAT AAG 1346Thr Ile Gly Ala Lys Val Asn Gly Lys Met Val Thr Leu Asp His Lys430 435 440CTT CGG ACA GGT GAT ATC GTT GAA ATT CTC ACC TCT AAG CAT TCC TAC 1394Leu Arg Thr Gly Asp Ile Val Glu Ile Leu Thr Ser Lys His Ser Tyr445 450 455GGT CCG AGC CAG GAT TGG GTG AAG CTT GCC CAA ACA TCC CAA GCG AAG 1442Gly Pro Ser Gln Asp Trp Val Lys Leu Ala Gln Thr Ser Gln Ala Lys460 465 470CAT AAA ATC CGT CAA TTC TTT AAG AAA CAG CGG CGT GAA GAA AAT GTC 1490His Lys Ile Arg Gln Phe Phe Lys Lys Gln Arg Arg Glu Glu Asn Val475 480 485 490GAA AAA GGC CGT GAG CTG GTC GAA AAA GAA ATT AAA AAC TTG GAT TTT 1538Glu Lys Gly Arg Glu Leu Val Glu Lys Glu Ile Lys Asn Leu Asp Phe495 500 505GAA TTG AAG GAT GTT TTA ACG CCG GAG AAT ATT CAA AAG GTT GCT GAC 1586Glu Leu Lys Asp Val Leu Thr Pro Glu Asn Ile Gln Lys Val Ala Asp510 515 520AAA TTT AAT TTC TCA AAT GAA GAG GAT ATG TAC GCG GCG GTC GGT TAC 1634Lys Phe Asn Phe Ser Asn Glu Glu Asp Met Tyr Ala Ala Val Gly Tyr525 530 535AAC GGC ATC ACA GCT CTG CAG GTG GCG AAC CGC CTA ACA GAA AAA GAG 1682Asn Gly Ile Thr Ala Leu Gln Val Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Glu540 545 550AGA AAG CAG CGC GAC CAG GAA GAA CAG GAA AAG ATC GTT CAG GAA GTC 1730Arg Lys Gln Arg Asp Gln Glu Glu Gln Glu Lys Ile Val Gln Glu Val555 560 565 570ACT GGG GAA CCT AAG CCA TAC CCG CAA GGA AGA AAA CGG GAA GCT GGC 1778Thr Gly Glu Pro Lys Pro Tyr Pro Gln Gly Arg Lys Arg Glu Ala Gly575 580 585GTT CGT GTC AAG GGC ATT GAC AAC CTC CTT GTC CGT TTA TCA AAA TGC 1826Val Arg Val Lys Gly Ile Asp Asn Leu Leu Val Arg Leu Ser Lys Cys590 595 600TGC AAT CCT GTG CCA GGT GAT GAT ATT GTC GGC TTT ATC ACA AAA GGC 1874Cys Asn Pro Val Pro Gly Asp Asp Ile Val Gly Phe Ile Thr Lys Gly605 610 615AGA GGG GTT TCG GTC CAT CGC GAA GAC TGT CCG AAT GTC AAA ACG AAT 1922Arg Gly Val Ser Val His Arg Glu Asp Cys Pro Asn Val Lys Thr Asn620 625 630GAA GCC CAA GAG CGG CTG ATC CCG GTA GAG TGG GAA CAT GAG TCA CAA 1970Glu Ala Gln Glu Arg Leu Ile Pro Val Glu Trp Glu His Glu Ser Gln635 640 645 650GTT CAA AAG CGC AAG GAA TAC AAT GTT GAG ATA GAG ATT CTT GGG TAT 2018Val Gln Lys Arg Lys Glu Tyr Asn Val Glu Ile Glu Ile Leu Gly Tyr655 660 665GAC CGC CGC GGA TTG CTG AAC GAG GTA CTC CAG GCA GTG AAT GAA ACG 2066Asp Arg Arg Gly Leu Leu Asn Glu Val Leu Gln Ala Val Asn Glu Thr670 675 680AAA ACC AAT ATT TCA TCT GTC TCT GGC AAA TCG GAT CGC AAT AAA GTG 2114Lys Thr Asn Ile Ser Ser Val Ser Gly Lys Ser Asp Arg Asn Lys Val685 690 695GCA ACC ATC CAT ATG GCG ATT TTT ATC CAG AAT ATC AAT CAC TTG CAT 2162Ala Thr Ile His Met Ala Ile Phe Ile Gln Asn Ile Asn His Leu His700 705 710AAA GTC GTC GAG CGT ATT AAA CAG ATT AGA GAT ATC TAT TCT GTG CGC 2210Lys Val Val Glu Arg Ile Lys Gln Ile Arg Asp Ile Tyr Ser Val Arg715 720 725 730CGC GTC ATG AAC TAAAGGGGTT AGAAAAGAGA TTAGTTGTTC AGCGAGTAAC 2262Arg Val Met AsnAGAAGCAAGC GTTACA2278序列2顯示本發(fā)明relA-Bac多肽的氨基酸序列(2)序列2資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度734氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列2Met Ala Asn Glu Gln Val Leu Thr Ala Glu Gln Val Ile Asp Lys Ala1 5 10 15Arg Ser Tyr Leu Ser Asp Glu His Ile Ala Phe Val Glu Lys Ala Tyr20 25 30Leu Tyr Ala Glu Asp Ala His Arg Glu Gln Tyr Arg Lys Ser Gly Glu35 40 45Pro Tyr Ile Ile His Pro Ile Gln Val Ala Gly Ile Leu Val Asp Leu50 55 60Glu Met Asp Pro Ser Thr Ile Ala Gly Gly Phe Leu His Asp Val Val65 70 75 80Glu Asp Thr Asp Val Thr Leu Asp Asp Leu Lys Glu Ala Phe Ser Glu85 90 95Glu Val Ala Met Leu Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Gly Lys Ile Lys100 105 110Tyr Lys Ser Gln Glu Glu Gln Gln Ala Glu Asn His Arg Lys Met Phe115 120 125Val Ala Met Ala Gln Asp Ile Arg Val Ile Leu Ile Lys Leu Ala Asp130 135 140Arg Leu His Asn Met Arg Thr Leu Lys His Leu Pro Gln Glu Lys Gln145 150 155 160Arg Arg Ile Ser Asn Glu Thr Leu Glu Ile Phe Ala Pro Leu Ala His165 170 175Arg Leu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Trp Glu Leu Glu Asp Thr Ala Leu180 185 190Arg Tyr Leu Asn Pro Gln Gln Tyr Tyr Arg Ile Val Asn Leu Met Lys195 200 205Lys Lys Arg Ala Glu Arg Glu Leu Tyr Val Asp Glu Val Val Asn Glu210 215 220Val Lys Lys Arg Val Glu Glu Val Asn Ile Lys Ala Asp Phe Ser Gly225 230 235 240Arg Pro Lys His Ile Tyr Ser Ile Tyr Arg Lys Met Val Leu Gln Asn245 250 255Lys Gln Phe Asn Glu Ile Tyr Asp Leu Leu Ala Val Arg Ile Leu Val260 265 270Asn Ser Ile Lys Asp Cys Tyr Ala Val Leu Gly Ile Ile His Thr Cys275 280 285Trp Lys Pro Met Pro Gly Arg Phe Lys Asp Tyr Ile Ala Met Pro Lys290 295 300Pro Asn Met Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr Val Ile Gly Pro Lys Ala305 310 315 320Asp Pro Leu Glu Val Gln Ile Arg Thr Phe Glu Met His Glu Ile Ala325 330 335Glu Tyr Gly Val Ala Ala His Trp Ala Tyr Lys Glu Gly Lys Ala Ala340 345 350Asn Glu Gly Ala Thr Phe Glu Lys Lys Leu Ser Trp Phe Arg Glu Ile355 360 365Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Thr Asp Ala Glu Glu Phe Met Glu Ser370 375 380Leu Lys Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Val Tyr Val Phe Thr Pro Lys385 390 395 400Gly Asp Val Ile Glu Leu Pro Ser Gly Ser Val Pro Ile Asp Phe Ser405 410 415Tyr Arg Ile His Ser Glu Ile Gly Asn Lys Thr Ile Gly Ala Lys Val420 425 430Asn Gly Lys Met Val Thr Leu Asp His Lys Leu Arg Thr Gly Asp Ile435 440 445Val Glu Ile Leu Thr Ser Lys His r Tyr Gly Pro Ser Gln Asp Trp450 455 460Val Lys Leu Ala Gln Thr Ser Gln Ala Lys His Lys Ile Arg Gln Phe465 470 475 480Phe Lys Lys Gln Arg Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys Gly Arg Glu Leu485 490 495Val Glu Lys Glu Ile Lys Asn Leu Asp Phe Glu Leu Lys Asp Val Leu500 505 510Thr Pro Glu Asn Ile Gln Lys Val Ala Asp Lys Phe Asn Phe Ser Asn515 520 525Glu Glu Asp Met Tyr Ala Ala Val Gly Tyr Asn Gly Ile Thr Ala Leu530 535 540Gln Val Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Glu Arg Lys Gln Arg Asp Gln545 550 555 560Glu Glu Gln Glu Lys Ile Val Gln Glu Val Thr Gly Glu Pro Lys Pro565 570 575Tyr Pro Gln Gly Arg Lys Arg Glu Ala Gly Val Arg Val Lys Gly Ile580 585 590Asp Asn Leu Leu Val Arg Leu Ser Lys Cys Cys Asn Pro Val Pro Gly595 600 605Asp Asp Ile Val Gly Phe Ile Thr Lys Gly Arg Gly Val Ser Val His610 615 620Arg Glu Asp Cys Pro Asn Val Lys Thr Asn Glu Ala Gln Glu Arg Leu625 630 635 640Ile Pro Val Glu Trp Glu His Glu Ser Gln Val Gln Lys Arg Lys Glu645 650 655Tyr Asn Val Glu Ile Glu Ile Leu Gly Tyr Asp Arg Arg Gly Leu Leu660 665 670Asn Glu Val Leu Gln Ala Val Asn Glu Thr Lys Thr Asn Ile Ser Ser675 680 685Val Ser Gly Lys Ser Asp Arg Asn Lys Val Ala Thr Ile His Met Ala690 695 700Ile Phe Ile Gln Asn Ile Asn His Leu His Lys Val Val Glu Arg Ile705 710 715 720Lys Gln Ile Arg Asp Ile Tyr Ser Val Arg Arg Val Met Asn725 730
序列3顯示分離的本發(fā)明多核苷酸序列，含有編碼表現(xiàn)ppGpp合成酶活性的多肽的DNA序列。多肽命名為relA-BacII并從解淀粉芽孢桿菌菌株獲得。
(2)序列3資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2239堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(vi)最初來(lái)源(A)生物體relA-bacII(B)菌株解淀粉芽孢桿菌(ix)特征(A)名字/關(guān)鍵詞CDS(B)位置21..2225(xi)序列描述序列3CATTTAAAAA AGGTGATTCC ATG GCG AAC GAA CAA GTA TTG ACT GCC GAG 50Met Ala Asn Glu Gln Val Leu Thr Ala Glu1 5 10CAA GTA ATA GAT AAA GCG CGC ACT TAT CTG CCG GAG GAG CAG ATT GCG98Gln Val Ile Asp Lys Ala Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Ile Ala15 20 25TTT GTT GAG AAA GCT TAT CTG TAT GCG CAA GAC GCG CAT CGC GAA CAG 145Phe Val Glu Lys Ala Tyr Leu Tyr Ala Gln Asp Ala His Arg Glu Gln30 35 40TAT CGC AAA TCA GGT GAG CCG TAC ATC ATT CAT CCG ATT CAG GTG GCG 194Tyr Arg Lys Ser Gly Glu Pro Tyr Ile Ile His Pro Ile Gln Val Ala45 50 55GGA ATC CTC GTC GAT CTG GAA ATG GAC CCT TCC ACG ATT GCG GGC GGA 242Gly Ile Leu Val Asp Leu Glu Met Asp Pro Ser Thr Ile Ala Gly Gly60 65 70TTT CTG CAT GAC GTG GTC GAG GAC ACG GAT GTC ACC CTC GAT GAC CTG 290Phe Leu His Asp Val Val Glu Asp Thr Asp Val Thr Leu Asp Asp Leu75 80 85 90AAG GAA GCA TTT TCT GAA GAA GTG GCG ATG CTT GTC GAC GGT GTA ACG 338Lys Glu Ala Phe Ser Glu Glu Val Ala Met Leu Val Asp Gly Val Thr95 100 105AAG CTC GGT AAA ATT AAG TAT AAA TCT CAA GAG GAG CAG CAG GCG GAA 386Lys Leu Gly Lys Ile Lys Tyr Lys Ser Gln Glu Glu Gln Gln Ala Glu110 115 120AAC CAT CGA AAA ATG TTT GTC GCT ATG GCT CAG GAT ATC AGA GTC ATA 434Asn His Arg Lys Met Phe Val Ala Met Ala Gln Asp Ile Arg Val Ile125 130 135TTG ATC AAG CTG GCG GAT CGC CTT CAT AAT ATG CGG ACG TTA AAG CAT 482Leu Ile Lys Leu Ala Asp Arg Leu His Asn Met Arg Thr Leu Lys His140 145 150CTT CCG CAG GAA AAG CAG CGG AGA ATT TCA AAT GAG ACG CTG GAA ATC 530Leu Pro Gln Glu Lys Gln Arg Arg Ile Ser Asn Glu Thr Leu Glu Ile155 160 165 170TTC GCT CCG CTG GCC CAT CGG CTC GGG ATT TCT AAG ATC AAA TGG GAG 578Phe Ala Pro Leu Ala His Arg Leu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Trp Glu175 180 185CTT GAA GAC ACC GCT CTC CGT TAT TTG AAT CCT CAG CAA TAT TAC AGA 626Leu Glu Asp Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Asn Pro Gln Gln Tyr Tyr Arg190 195 200ATC GTT AAC CTC ATG AAG AAA AAG CGC GCG GAA CGC GAA CTT TAT GTC 674Ile Val Asn Leu Met Lys Lys Lys Arg Ala Glu Arg Glu Leu Tyr Val205 210 215GAT GAG GTT GTC AAT GAA GTG AAA AAA CGC GTC GAA GAA GTG AAT ATC 722Asp Glu Val Val Asn Glu Val Lys Lys Arg Val Glu Glu Val Asn Ile220 225 230AAA GCG GAC TTT TCA GGC CGT CCG AAG CAC ATC TAC AGC ATT TAC CGC 770Lys Ala Asp Phe Ser Gly Arg Pro Lys His Ile Tyr Ser Ile Tyr Arg235 240 245 250AAG ATG GCG CTG CAA AAT AAA CAG TTT AAT GAA ATA TAT GAT CTG CTC 818Lys Met Ala Leu Gln Asn Lys Gln Phe Asn Glu Ile Tyr Asp Leu Leu255 260 265GCC GTC CGT ATT CTT GTC GGA AGC ATT AAA GAC TGC TAC GCC GTA CTC 866Ala Val Arg Ile Leu Val Gly Ser Ile Lys Asp Cys Tyr Ala Val Leu270 275 280GGC ATT ATT CAT ACG TGC TGG AAG CCG ATG CCG GGC AGA TTC AAA GAT 914Gly Ile Ile His Thr Cys Trp Lys Pro Met Pro Gly Arg Phe Lys Asp285 290 295TAT ATT GCG ATG CCT AAG CCG AAT ATG TAT CAG TCC CTG CAT ACG ACA 962Tyr Ile Ala Met Pro Lys Pro Asn Met Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr300 305 310GTA ATC GGG CCT AAA GGC GAT CCG CTG GAA GTG CAG ATC AGA ACG TTT 1010Val Ile Gly Pro Lys Gly Asp Pro Leu Glu Val Gln Ile Arg Thr Phe315 320 325 330GAG ATG CAT GAG ATC GCT GAA TAC GGG GTG GCT GCA CAC TGG GCA TAT 1058Glu Met His Glu Ile Ala Glu Tyr Gly Val Ala Ala His Trp Ala Tyr335 340 345AAA GAA GGC AAG GCT GCA AAC GAA GAA GCG ACA TTT GAG AAA AAA CTG 1106Lys Glu Gly Lys Ala Ala Asn Glu Glu Ala Thr Phe Glu Lys Lys Leu350 355 360TCC TGG TTC CGC GAA ATT CTG GAA TTC CAA AAC GAA TCT ACC GAT GCG 1154Ser Trp Phe Arg Glu Ile Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Thr Asp Ala365 370 375GAA GAA TTT ATG GAA TCG CTG AAA ATC GAT TTA TTT TCT GAC ATG GTA 1202Glu Glu Phe Met Glu Ser Leu Lys Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Val380 385 390TAC GTA TTT ACG CCA AAA GGC GAT GTC ATT GAA CTG CCG TCA GGC TCT 1250Tyr Val Phe Thr Pro Lys Gly Asp Val Ile Glu Leu Pro Ser Gly Ser395 400 405 410GTA CCG ATT GAT TTT TCC TAC AGG ATT CAC TCC GAG ATC GGC AAC AAA 1298Val Pro Ile Asp Phe Ser Tyr Arg Ile His Ser Glu Ile Gly Asn Lys415 420 425ACC ATC GGA GCG AAA GTG AAC GGG AAA ATG GTG ACG CTT GAC CAT AAG 1346Thr Ile Gly Ala Lys Val Asn Gly Lys Met Val Thr Leu Asp His Lys430 435 440CTC CGG ACG GGC GAC ATT GTC GAA ATC GTG ACG TCC AAG CAT TCA TAC 1394Leu Arg Thr Gly Asp Ile Val Glu Ile Val Thr Ser Lys His Ser Tyr445 450 455GAT CCG AGT CAA GAC TGG ATC AAA CTC GCA CAG ACG TCA CAG GCG AAA 1442Asp Pro Ser Gln Asp Trp Ile Lys Leu Ala Gln Thr Ser Gln Ala Lys460 465 470CAC AAA ATC CGC CAA TTC TTC AAG AAA CAG CGC CGT GAA GAA AAT GTC 1490His Lys Ile Arg Gln Phe Phe Lys Lys Gln Arg Arg Glu Glu Asn Val475 480 485 490GAA AAA GGC CGT GAG CTG GTC GAA AAA GAA ATT AAA AAT CTT GAT TTT 1538Glu Lys Gly Arg Glu Leu Val Glu Lys Glu Ile Lys Asn Leu Asp Phe495 500 505GAA GTG AAG GAA GTT TTA ACG CTC GAA AAC CTT CAA AAG GTT GCC GAC 1586Glu Val Lys Glu Val Leu Thr Leu Glu Asn Leu Gln Lys Val Ala Asp510 515 520AAG TTC AAT TTC TCA AAT GAA GAG GAT ATG TAC GCG GCG GTC GGG TAT 1634Lys Phe Asn Phe Ser Asn Glu Glu Asp Met Tyr Ala Ala Val Gly Tyr525 530 535AAC GGG ATT ACC GCT TTG CAG GTG GCA AAC AGG CTC ACC GAA AAA GAA 1682Asn Gly Ile Thr Ala Leu Gln Val Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Glu540 545 550CGG AAG CTG CGT GAT CAG GAA GAG CAG GAA AAA ATC GTT CAG GAA GTC 1730Arg Lys Leu Arg Asp Gln Glu Glu Gln Glu Lys Ile Val Gln Glu Val555 560 565 570ACT TCC GAG CCG AAA CAG TAT CCG CAA GGG AGA AAA CGG GAA GCG GGT 1778Thr Ser Glu Pro Lys Gln Tyr Pro Gln Gly Arg Lys Arg Glu Ala Gly575 580 585GTG CGC GTG AAA GGC ATC GAC AAC CTT CTC GTC CGT CTG TCG AAA TGC 1826Val Arg Val Lys Gly Ile Asp Asn Leu Leu Val Arg Leu Ser Lys Cys590 595 600TGC AAC CCG GTG CCA GGC GAT CAT ATT GTC GGT TTT ATT ACA AAA GGG 1874Cys Asn Pro Val Pro Gly Asp His Ile Val Gly Phe Ile Thr Lys Gly605 610 615CGC GGT GTA TCC GTT CAC CGT GAT GAC TGT CCG AAC GTA AAA ACG AAT 1922Arg Gly Val Ser Val His Arg Asp Asp Cys Pro Asn Val Lys Thr Asn620 625 630GAA GCG CAG GAA CGA TTG ATC CCT GTT GAA TGG GAG CAT GAA TCA CAA 1970Glu Ala Gln Glu Arg Leu Ile Pro Val Glu Trp Glu His Glu Ser Gln635 640 645 650GTT CAA AGA CGC AAA GAA TAT AAC GTT GAG ATT GAG ATT CTG GGG TAT 2018Val Gln Arg Arg Lys Glu Tyr Asn Val Glu Ile Glu Ile Leu Gly Tyr655 660 665GAC CGT CTC GGG CTG TTA AAT GAA GTG CTT CAG GCC GTA AAC GAA ACG 2066Asp Arg Leu Gly Leu Leu Asn Glu Val Leu Gln Ala Val Asn Glu Thr670 675 680AAA ACC AAC ATC TCG TCT GTC TCG GGC AAA TCC GAC CGC AAT AAA GTC 2114Lys Thr Asn Ile Ser Ser Val Ser Gly Lys Ser Asp Arg Asn Lys Val685 690 695GCT ACG ATT CAT ATG GCG ATT TTT ATT CAA AAC ATC AAT CAT CTG CAC 2162Ala Thr Ile His Met Ala Ile Phe Ile Gln Asn Ile Asn His Leu His700 705 710AAA GTG GTC GAG CGG ATT AAG CAG ATC AGA GAC ATA TAT TCA GTC CGC 2210Lys Val Val Glu Arg Ile Lys Gln Ile Arg Asp Ile Tyr Ser Val Arg715 720 725 730CGG GTA ATG AAC TAA AAGGAGCTTG CTAT 2239Arg Val Met Asn *735序列4顯示本發(fā)明relA-BacII多肽的氨基酸序列(2)序列4資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度735氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列4Met Ala Asn Glu Gln Val Leu Thr Ala Glu Gln Val Ile Asp Lys Ala1 5 10 15Arg Thr Tyr Leu Pro Glu Glu Gln Ile Ala Phe Val Glu Lys Ala Tyr20 25 30Leu Tyr Ala Gln Asp Ala His Arg Glu Gln Tyr Arg Lys Ser Gly Glu35 40 45Pro Tyr Ile Ile His Pro Ile Gln Val Ala Gly Ile Leu Val Asp Leu50 55 60Glu Met Asp Pro Ser Thr Ile Ala Gly Gly Phe Leu His Asp Val Val65 70 75 80Glu Asp Thr Asp Val Thr Leu Asp Asp Leu Lys Glu Ala Phe Ser Glu85 90 95Glu Val Ala Met Leu Val Asp Gly Val Thr Lys Leu Gly Lys Ile Lys100 105 110Tyr Lys Ser Gln Glu Glu Gln Gln Ala Glu Asn His Arg Lys Met Phe115 120 125Val Ala Met Ala Gln Asp Ile Arg Val Ile Leu Ile Lys Leu Ala Asp130 135 140Arg Leu His Asn Met Arg Thr Leu Lys His Leu Pro Gln Glu Lys Gln145 150 155 160Arg Arg Ile Ser Asn Glu Thr Leu Glu Ile Phe Ala Pro Leu Ala His165 170 175Arg Leu Gly Ile Ser Lys Ile Lys Trp Glu Leu Glu Asp Thr Ala Leu180 185 190Arg Tyr Leu Asn Pro Gln Gln Tyr Tyr Arg Ile Val Asn Leu Met Lys195 200 205Lys Lys Arg Ala Glu Arg Glu Leu Tyr Val Asp Glu Val Val Asn Glu210 215 220Val Lys Lys Arg Val Glu Glu Val Asn Ile Lys Ala Asp Phe Ser Gly225 230 235 240Arg Pro Lys His Ile Tyr Ser Ile Tyr Arg Lys Met Ala Leu Gln Asn245 250 255Lys Gln Phe Asn Glu Ile Tyr Asp Leu Leu Ala Val Arg Ile Leu Val260 265 270Gly Ser Ile Lys Asp Cys Tyr Ala Val Leu Gly Ile Ile His Thr Cys275 280 285Trp Lys Pro Met Pro Gly Arg Phe Lys Asp Tyr Ile Ala Met Pro Lys290 295 300Pro Asn Met Tyr Gln Ser Leu His Thr Thr Val Ile Gly Pro Lys Gly305 310 315 320Asp Pro Leu Glu Val Gln Ile Arg Thr Phe Glu Met His Glu Ile Ala325 330 335Glu Tyr Gly Val Ala Ala His Trp Ala Tyr Lys Glu Gly Lys Ala Ala340 345 350Asn Glu Glu Ala Thr Phe Glu Lys Lys Leu Ser Trp Phe Arg Glu Ile355 360 365Leu Glu Phe Gln Asn Glu Ser Thr Asp Ala Glu Glu Phe Met Glu Ser370 375 380Leu Lys Ile Asp Leu Phe Ser Asp Met Val Tyr Val Phe Thr Pro Lys385 390 395 400Gly Asp Val Ile Glu Leu Pro Ser Gly Ser Val Pro Ile Asp Phe Ser405 410 415Tyr Arg Ile His Ser Glu Ile Gly Asn Lys Thr Ile Gly Ala Lys Val420 425 430Asn Gly Lys Met Val Thr Leu Asp His Lys Leu Arg Thr Gly Asp Ile435 440 445Val Glu Ile Val Thr Ser Lys His Ser Tyr Asp Pro Ser Gln Asp Trp450 455 460Ile Lys Leu Ala Gln Thr Ser Gln Ala Lys His Lys Ile Arg Gln Phe465 470 475 480Phe Lys Lys Gln Arg Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys Gly Arg Glu Leu485 490 495Val Glu Lys Glu Ile Lys Asn Leu Asp Phe Glu Val Lys Glu Val Leu500 505 510Thr Leu Glu Asn Leu Gln Lys Val Ala Asp Lys Phe Asn Phe Ser Asn515 520 525Glu Glu Asp Met Tyr Ala Ala Val Gly Tyr Asn Gly Ile Thr Ala Leu530 535 540Gln Val Ala Asn Arg Leu Thr Glu Lys Glu Arg Lys Leu Arg Asp Gln545 550 555 560Glu Glu Gln Glu Lys Ile Val Gln Glu Val Thr Ser Glu Pro Lys Gln565 570 575Tyr Pro Gln Gly Arg Lys Arg Glu Ala Gly Val Arg Val Lys Gly Ile580 585 590Asp Asn Leu Leu Val Arg Leu Ser Lys Cys Cys Asn Pro Val Pro Gly595 600 605Asp His Ile Val Gly Phe Ile Thr Lys Gly Arg Gly Val Ser Val His610 615 620Arg Asp Asp Cys Pro Asn Val Lys Thr Asn Glu Ala Gln Glu Arg Leu625 630 635 640Ile Pro Val Glu Trp Glu His Glu Ser Gln Val Gln Arg Arg Lys Glu645 650 655Tyr Asn Val Glu Ile Glu Ile Leu Gly Tyr Asp Arg Leu Gly Leu Leu660 665 670Asn Glu Val Leu Gln Ala Val Asn Glu Thr Lys Thr Asn Ile Ser Ser675 680 685Val Ser Gly Lys Ser Asp Arg Asn Lys Val Ala Thr Ile His Met Ala690 695 700Ile Phe Ile Gln Asn Ile Asn His Leu His Lys Val Val Glu Arg Ile705 710 715 720Lys Gln Ile Arg Asp Ile Tyr Ser Val Arg Arg Val Met Asn *725 730 73權(quán)利要求
1.選自下列組中的分離的多核苷酸分子(a)編碼具ppGpp合成酶活性的多肽并含有序列1所示核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物種同系物；(c)編碼具ppGpp合成酶活性的至少與序列2從氨基酸殘基1至氨基酸殘基734的氨基酸序列70％相同的多肽的多核苷酸分子；(d)與(a)，(b)或(c)互補(bǔ)的分子；以及(e)(a)，(b)，(c)或(d)的簡(jiǎn)并核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子，其中多核苷酸分子編碼具ppGpp合成酶活性的多肽并含有序列3所示從核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸序列。
3.含有下列可操作連接元件的表達(dá)載體一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；一段選自下列組中的DNA片段(a)編碼具ppGpp合成酶活性的多肽并含有序列1所示從核苷酸21至核苷酸2225的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物種同系物；(c)編碼具ppGpp合成酶活性的至少與序列2從氨基酸殘基1至氨基酸殘基734的氨基酸序列70％相同的多核苷酸分子；以及(d)(a)，(b)，或(c)的簡(jiǎn)并核苷酸序列；以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。
4.引入了權(quán)利要求3的表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中上述細(xì)胞表達(dá)由DNA片段編碼的多肽。
5.選自下列組中的具有ppGpp合成酶活性的分離的多肽a)含有序列2所示從殘基1至殘基734的氨基酸序列的多肽分子；以及b)與序列2從氨基酸殘基1至氨基酸殘基734的氨基酸至少70％相同的多肽分子。
6.含有權(quán)利要求5的純化的多肽的組合物。
7.生產(chǎn)具ppGpp合成酶活性的多肽的一種方法，包括培養(yǎng)引入了權(quán)利要求3表達(dá)載體的細(xì)胞，其中上述細(xì)胞表達(dá)由DNA片段編碼的多肽；以及回收該多肽。
8.用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善至少一種感興趣蛋白的產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)，其中表達(dá)系統(tǒng)含有比野生型表達(dá)更少量的權(quán)利要求5的多肽的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
9.權(quán)利要求8的表達(dá)系統(tǒng)，其中上述芽孢桿菌菌種是枯草芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，Bacillus clausii，或特別地是地衣芽孢桿菌。
10.權(quán)利要求8-9中任一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，其中上述感興趣蛋白質(zhì)是使用一種表達(dá)載體重組產(chǎn)生的。
11.權(quán)利要求8-10中任一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，其中上述感興趣蛋白質(zhì)是一種同源蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求8-10中任一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，其中上述感興趣蛋白質(zhì)是一種異源蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求10-12中任一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，其中上述蛋白質(zhì)是一種外蛋白質(zhì)并是使用表達(dá)載體表達(dá)的。
14.權(quán)利要求8-13中任一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，其中上述感興趣蛋白質(zhì)，優(yōu)選地是一種外蛋白，是一種蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支鏈淀粉酶，纖維素酶，葡糖異構(gòu)酶，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，CGT酶(環(huán)化糊精葡糖酸轉(zhuǎn)移酶)，植酸酶，葡糖氧化酶，葡糖基轉(zhuǎn)移酶，漆酶，木聚糖酶，細(xì)菌蛋白質(zhì)毒素，微生物表面蛋白質(zhì)，病毒蛋白質(zhì)，藥物。
15.權(quán)利要求8-14中任一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，其中上述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌是芽孢桿菌屬的菌株。
16.權(quán)利要求15的表達(dá)系統(tǒng)，其中上述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，Bacillus Clausii，或地衣芽孢桿菌。
17.在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善生產(chǎn)至少一種感興趣蛋白質(zhì)的方法，該方法包括i)培養(yǎng)權(quán)利要求8到16中任一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)；以及ii)從產(chǎn)生的培養(yǎng)肉湯或表達(dá)系統(tǒng)純化上述感興趣蛋白質(zhì)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中的培養(yǎng)是通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵完成的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來(lái)自芽孢桿菌的新ppGpp合成酶以及涉及使用上述新ppGpp合成酶的用于在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中改善感興趣蛋白改進(jìn)的產(chǎn)生的表達(dá)系統(tǒng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的ppGpp合成酶的量比野生型系統(tǒng)中的表達(dá)量少。
文檔編號(hào)C12R1/125GK1260832SQ9880637
公開(kāi)日2000年7月19日 申請(qǐng)日期1998年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月20日
發(fā)明者詹斯·T·安德森, 斯坦尼斯拉斯·D·埃利希 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司