專利名稱：基因工程浮萍的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)化浮萍的方法和組合物，具體涉及利用彈道轟擊和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
浮萍是單子葉植物浮萍科(Lemnaceae)僅有的成員。4個(gè)屬和34個(gè)種均是小的、自由漂浮的淡水植物，其地理范圍跨越整個(gè)地球。Landolt，Biosystematic Investigation on the Family of DuckweedsThefamily of Lemnaceae-A Monograph Study.Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich(1986)。盡管是已知的形態(tài)最小的植物，但大多數(shù)浮萍物種具有大得多的植物的所有組織和器官，包括根、莖、花、種子和葉。已經(jīng)廣泛研究了浮萍物種，有大量文獻(xiàn)詳細(xì)說明它們的生態(tài)學(xué)、分類學(xué)、生活周期、代謝、病蟲害易感性、生殖生物學(xué)、遺傳結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)。Hillman，Bot.Review 27，221(1971)；Landolt，Biosystematic Investigation on the Family of DuckweedsThe family ofLemnaceae-A Monograph Study.Geobatanischen Institut ETH，StiftungRubel，Zurich(1986)。
浮萍的生長習(xí)性對于微生物培養(yǎng)方法是理想的。這種植物容易通過新葉的營養(yǎng)出芽而快速增殖，其肉眼可見的方式與酵母中的無性繁殖相似。浮萍通過從分生細(xì)胞營養(yǎng)出芽而增殖。所述分生組織區(qū)小，發(fā)現(xiàn)在葉的下表面上。分生組織細(xì)胞位于兩個(gè)袋中，葉中脈每端各一個(gè)袋。這個(gè)小的中脈區(qū)也是根起源和產(chǎn)生莖的位點(diǎn)，它將每片葉連接至其母葉。分生組織袋受一個(gè)組織瓣的保護(hù)。交替從這些袋中出芽。倍增時(shí)間隨物種而變，短至20-24小時(shí)。Landolt，Ber.Schweiz.Bot.Ges.67，271(1957)；Chang等，Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24，19(1977)；Datko和Mudd.，Plant Physiol.65，16(1980)；Venkataraman等，Z.Pflanzenphysiol.62，316(1970)。
浮萍的密集培養(yǎng)導(dǎo)致每單位時(shí)間最高速率的生物量的積累(Landolt和Kandeler，The family of Lemnaceae-A Monographic Study.第2卷Phytochmistry，Physiology，Application，Bibliography，Veroffentlichungen des Geobatanischen Institutes ETH，Stiftung Rubel，Zurich(1986)，干重積累范圍為鮮重的6-10％(Tillerg等，Physiol.Plant.46，5，(1979)；Landolt，Ber.Schweiz.Bot.Ges.67，271(1957)；Stomp，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。已經(jīng)報(bào)道，在不同條件下生長的一些浮萍物種的蛋白含量范圍為15-45％干重(Chang等，Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24，19(1977)；Chang和Chui，Z.Pflanzenphysiol.89，91(1978)；Porath等，Aquatic Botany 7，272(1 979)；Appenroth等，Biochem.Physiol.Pflanz.177，251 (1982))。采用這些數(shù)值，每升培養(yǎng)基的浮萍蛋白生產(chǎn)水萍與酵母基因表達(dá)系統(tǒng)的數(shù)量級相同。迄今為止，尚未對于特定浮萍品系的最大生長和最大蛋白含量進(jìn)行培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的系統(tǒng)優(yōu)化。
浮萍的有性繁殖受培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的控制，包括光周期和培養(yǎng)密度。對于某些物種，花的誘導(dǎo)是常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法。植物通常自花授粉，在實(shí)驗(yàn)室中，可以通過溫和振蕩培養(yǎng)物完成自交。通過該方法，已經(jīng)法開發(fā)了Lemma gibba自交系。已經(jīng)鑒定了自發(fā)突變(Slovin和Cohen，Plant Physiol.86，522(1988))，已經(jīng)用化學(xué)誘變和γ射線誘變(采用EMS或NMU)，產(chǎn)生具有特定特征的突變體。L.gobba的遠(yuǎn)交是很慢的，但可以通過受控的人工授粉來進(jìn)行。浮萍的基因組大小為0.25-1.63pg DNA/2C不等，染色體數(shù)范圍為20-80條，在整個(gè)浮萍屬平均約為40條(Landolt，Biosystematic Investigation on the Family ofDuckweedsThe family of Lemnaceae-A Monograph Study.Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich(1986))。估計(jì)倍性水平范圍為2-12(出處同上)。已經(jīng)用次級產(chǎn)物-同工酶和DNA序列，研究了浮萍屬內(nèi)的遺傳多樣性。McClure和Alston，Nature 4916，311(1964)；McClure和Alston，Amer.J.Bot.53，849(1966)；Vasseur等，Pl.Syst.Evol.177，139(1991)；Crawford和Landolt，Syst.Bot.10，389(1993)。
因此，上述特性使得浮萍成為開發(fā)有效的基于植物的基因表達(dá)系統(tǒng)的理想選擇。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于有效轉(zhuǎn)化浮萍的方法和組合物。所述方法涉及使用彈道轟擊、農(nóng)桿菌或電穿孔來穩(wěn)定地將目的核苷酸序列引入轉(zhuǎn)化的浮萍植株中并將其表達(dá)。以該方式，可以將任何目的基因或核酸引入浮萍植株中。也提供轉(zhuǎn)化的浮萍細(xì)胞、組織、植株和種子。
作為第一方面，本發(fā)明提供用目的核苷酸序列轉(zhuǎn)化浮萍的方法，其中所述核苷酸序列包含至少一種含基因的的表達(dá)盒，所述基因提供對選擇劑的抗性，所述方法包括以下步驟(a)提供浮萍組織靶，所述浮萍組織的細(xì)胞包括細(xì)胞壁；和(b)以足以刺入細(xì)胞壁的速度將所述核苷酸序列發(fā)射入浮萍組織靶，并在該組織的細(xì)胞中留存所述核苷酸序列，由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的組織，其中所述核苷酸序列由微彈攜帶；并且其中通過將所述微彈發(fā)射到該組織，將所述核苷酸序列發(fā)射到該組織。
作為第二方面，本發(fā)明提供用目的核苷酸序列轉(zhuǎn)化浮萍的方法，該方法包括以下步驟(a)將浮萍植物組織用農(nóng)桿菌接種，所述農(nóng)桿菌包含一個(gè)包含所述核苷酸序列的載體，其中所述核苷酸序列包含至少一個(gè)表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有提供對選擇劑抗性的基因；和(b)將該組織與該農(nóng)桿菌共同培育，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的組織。
作為第三方面，本發(fā)明提供通過電穿孔轉(zhuǎn)化浮萍的方法。
作為第四方面本發(fā)明通過上述方法提供轉(zhuǎn)化的浮萍植株和轉(zhuǎn)化的浮萍組織培養(yǎng)物。
作為第五方面，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化的浮萍植株和采用轉(zhuǎn)化的浮萍植株生產(chǎn)重組蛋白或肽的方法。
浮萍提供理想的基于植物的基因表達(dá)系統(tǒng)。浮萍基因表達(dá)系統(tǒng)提供可用于許多研究和商業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。對于植物分子生物學(xué)研究，總體上說，可以以酵母那樣的實(shí)驗(yàn)室便利操作的分化的植物系統(tǒng)，提供分析所分離基因的發(fā)育和生理學(xué)作用的非?？焖俚南到y(tǒng)。為此，植物分子生物學(xué)家使用諸如煙草和擬南芥屬(Abrabidopsis)的模型植物。這些植物需要用于生長的溫室或大田設(shè)備(對于植物分子生物學(xué)家通常難以獲得)。替代的基因表達(dá)系統(tǒng)基于微生物或細(xì)胞培養(yǎng)物，其中喪失了組織和發(fā)育調(diào)節(jié)的基因表達(dá)效應(yīng)。異源基因表達(dá)系統(tǒng)也需要在插入之前重新構(gòu)建目的基因，這是昂貴并且費(fèi)時(shí)的方法。浮萍系統(tǒng)克服了這兩個(gè)問題，并且在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中非常易于生長和維持。如果希望收獲所表達(dá)的蛋白或肽(或藉此產(chǎn)生的分子)，可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的技術(shù)(諸如機(jī)械研磨或裂解細(xì)胞)來完成這一點(diǎn)。
對于工業(yè)生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白，基于浮萍的系統(tǒng)具有優(yōu)于現(xiàn)有微生物或細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物蛋白生產(chǎn)領(lǐng)域中，植株表達(dá)出與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相似的翻譯后加工，克服了與微生物細(xì)胞生產(chǎn)哺乳動(dòng)物蛋白有關(guān)的一個(gè)主要問題。浮萍的生產(chǎn)也較哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物便宜得多。其它人已經(jīng)表明(Hiatt，Nature 334，469(1990))，植物系統(tǒng)具有裝配多亞基蛋白的能力，這是微生物系統(tǒng)通常缺乏的能力。植物生產(chǎn)治療蛋白也限制了來自在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物系統(tǒng)中生產(chǎn)的污染物質(zhì)(包括動(dòng)物病毒)的風(fēng)險(xiǎn)。污染物是治療蛋白生產(chǎn)中主要關(guān)心的問題。與例如大豆和煙草的其它建議的植物生產(chǎn)系統(tǒng)不同，浮萍可以在發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器中生長，使得非常易于將該系統(tǒng)整合進(jìn)入現(xiàn)有的蛋白生產(chǎn)工業(yè)結(jié)構(gòu)之中。
作為較低成本的工業(yè)用酶和小分子的生產(chǎn)平臺，浮萍提供的優(yōu)點(diǎn)在于，生產(chǎn)易于擴(kuò)大至幾乎任何量，因?yàn)樗梢圆捎酶缓瑺I養(yǎng)物的廢水在大田條件下生長。在廢水中生長的基因工程浮萍系統(tǒng)可以產(chǎn)生有價(jià)值的產(chǎn)物，而同時(shí)凈化廢水用于重新使用。這種系統(tǒng)將凈資本的損失(排放廢水的治理)轉(zhuǎn)為具有積極的經(jīng)濟(jì)平衡的化學(xué)生產(chǎn)系統(tǒng)或酶生產(chǎn)系統(tǒng)。浮萍優(yōu)于大田作物中化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)在于，生產(chǎn)不需要因世界日益增加的人口而提高食品產(chǎn)量所需的耕地或灌溉用水。
在以下本發(fā)明的描述中更詳細(xì)地公開本發(fā)明的這些方面和其它方面。
附圖簡述

圖1顯示了未轉(zhuǎn)化的浮萍DNA和D系的的轉(zhuǎn)化浮萍DNA的DNA雜交產(chǎn)生的放射自顯影照片，有一個(gè)來自pBI121的含GUS基因的放射標(biāo)記的3.2kb片段。道1)分離的未消化的pBI121 DNA。預(yù)期的主帶為12.8kb。較低分子量的條帶可能代表超螺旋質(zhì)粒。道2)HindIII消化的pBI121 DNA。該消化使該質(zhì)粒線性化，顯示出預(yù)期的12.8kb的條帶。較低分子量的條帶表明不完全的消化。道3)用HindIII和EcoRI消化的pBI121 DNA。消化是不完全的，但產(chǎn)生預(yù)期的條帶12.8kb(不完全消化物的左邊)、約9kb的條帶和弱的超螺旋條帶。在這種曝光中3.2kb條帶不產(chǎn)生可見的雜交。道4)來自未轉(zhuǎn)化浮萍的DNA，相當(dāng)于產(chǎn)生預(yù)期的9kb和3.2kb的條帶、1拷貝雙重消化的pBI121 DNA。道5)未轉(zhuǎn)化的浮萍DNA。道6)來自轉(zhuǎn)化浮萍D系的未消化的DNA。道7)來自轉(zhuǎn)化浮萍D系的HindIII消化的DNA。道8)來自轉(zhuǎn)化浮萍D系的HindIII和EcoRI消化的DNA。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化浮萍的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法利用彈道轟擊或農(nóng)桿菌，來穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化所述浮萍細(xì)胞。或者，所述方法使用電穿孔來轉(zhuǎn)化浮萍。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法和轉(zhuǎn)化植物可用作具有許多酵母的優(yōu)點(diǎn)的基于植物的基因表達(dá)系統(tǒng)。
就本發(fā)明人所知，先前沒有穩(wěn)定的浮萍基因轉(zhuǎn)移的報(bào)道，也沒有轉(zhuǎn)化浮萍植株再生的報(bào)道。在本發(fā)明的研究中，使用兩種策略來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因浮萍植株(1)通過將外源DNA直接轉(zhuǎn)移和插入分生葉細(xì)胞中，然后無性繁殖并自交，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因浮萍(一種植物到植物系統(tǒng))，和(2)轉(zhuǎn)化未分化的愈傷組織細(xì)胞，然后選擇增生的愈傷組織，并進(jìn)行葉再生(一種愈傷組織到植物的系統(tǒng))。Chang研究小組(Chang和Chui，Bot.Bull.Academia Sinica 17，106(1976)；Chang和Chui，Z.Pflanzenphysiol.Bd.89.S，91(1978))和Frick(Frick，J.Plant Physiology137，397(1991))早先已經(jīng)分別報(bào)道了從L.gibba和L.minor產(chǎn)生愈傷組織的有限的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。本研究已經(jīng)通過開發(fā)再生葉和組構(gòu)化的愈傷組織系統(tǒng)，顯著擴(kuò)展了該領(lǐng)域的工作。
最好是，本發(fā)明利用兩種系統(tǒng)之一穩(wěn)定轉(zhuǎn)化浮萍采用微彈攻擊的彈道轉(zhuǎn)化或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。盡管因?yàn)楦∑际菃巫尤~植物，預(yù)期它們難以被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，但我們意外地發(fā)現(xiàn)可以用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化浮萍。按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的浮萍植株也可以通過電穿孔產(chǎn)生。參見例如Dekeyser等，Plant Cell 2，591(1990))；D’Halluin等，Plant Cell 4，1495(1992)；D’Halluin等的美國專利第5,712,135號。電穿孔的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，包括人造染色體在內(nèi)的大片段DNA可以通過該方法轉(zhuǎn)化入浮萍?？梢园凑毡景l(fā)明轉(zhuǎn)換任何合適的浮萍細(xì)胞或組織類型。例如，可以將核酸引入組織培養(yǎng)物的浮萍細(xì)胞中。或者，浮萍植株小及其水生生長習(xí)性允許將核酸引入完整胚、葉、根或其它組構(gòu)化組織(諸如分生組織)的浮萍細(xì)胞中。作為另一種選擇方法，可以將核酸引入浮萍愈傷組織中。
最好是，通過要求保護(hù)的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化浮萍植株表現(xiàn)出正常的形態(tài)，并且通過有性繁殖是可育的。最好是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株含有單拷貝的所轉(zhuǎn)移的核酸，所述所轉(zhuǎn)移的核酸中沒有顯著的重排。也優(yōu)選的浮萍植株是，其中所轉(zhuǎn)移的核酸以低拷貝數(shù)存在(即每個(gè)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的該核酸不多于5個(gè)拷貝，或者不多于3個(gè)拷貝，作為另一選擇方法，少于3個(gè)拷貝)。
本文所用的術(shù)語“浮萍”是指浮萍科的成員。已知有如下4個(gè)屬和34個(gè)種的浮萍浮萍屬(Lemna)(L.aequinoctialis，L.disperma，L.ecuadoriensis，L.gibba，L.japonica，青萍(L.minor)，L.miniscula，L.obscura，L.perpusilla，L.tenera，L.trisulca，L.turionifera，L.valdiviana)；紫萍屬(Spirodela)(S.intermedia，紫萍(S.polyrrhiza)，S.punctata)；無根萍屬(Wolffia)(Wa.angusta，無根萍(Wa.arrhiza)，Wa.australina，Wa.borealis，Wa.brasiliensis，Wa.columbiana，Wa.elongata，Wa.globosa，Wa.microscopica，Wa.neglecta)和Wloffiella(Wl.caudata，Wl.denticulata，Wl.gladiata，Wl.hyalina，Wl.lingulata，Wl.repunda，Wl.rotunda和Wl.neotropica)。浮萍科的任何其它屬或種(如果存在)也是本發(fā)明的方面。優(yōu)選Lemna gibba、青萍和Lemna miniscula，最優(yōu)選青萍和Lemna mibiscula?？梢圆捎肔andolt (BiosystematicInvestigation on the Family of DuckweedsThe Family of Lemnaceae-A.Monograph Study.Geobatanischen Institue ETH，Stiftung Rubel，Zurich(1986))所述的分類方案將浮萍屬物種分類。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯看出的，既然已經(jīng)提供了浮萍的有效轉(zhuǎn)化，則可以將任何目的核酸用于本發(fā)明方法中。例如，可以工程改造浮萍植株，以表達(dá)抗病性和抗蟲基因、提供營養(yǎng)價(jià)值的基因、抗真菌、抗細(xì)菌或抗病毒基因等?；蛘?，可以采用按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)化浮萍，表達(dá)治療(例如獸醫(yī)用或醫(yī)用)或免疫原性(例如用于疫苗接種)肽和蛋白。
同樣，該方法可以用來轉(zhuǎn)移任何控制基因表達(dá)的核酸。例如，待轉(zhuǎn)移的核酸可以編碼反義寡核苷酸?；蛘?，可以用一種或多種基因轉(zhuǎn)化浮萍，以復(fù)制用于化學(xué)合成的酶途徑(例如用于塑料合成)或其它工業(yè)生產(chǎn)(例如角蛋白酶)。所述核酸可以源自浮萍或另一生物體(即異源的).此外，可以從原核細(xì)胞或真核細(xì)胞(例如細(xì)菌、真菌、酵母、病毒、植物、哺乳動(dòng)物)獲得目的核酸，或可以全合成或部分合成該核酸序列。在特優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸編碼分泌蛋白或肽。
優(yōu)選在轉(zhuǎn)化浮萍中待表達(dá)的轉(zhuǎn)移核酸編碼蛋白激素、生長因子或細(xì)胞因子，更優(yōu)選的是，編碼胰島素、生長激素(特別是人生長激素)和α-干擾素?；蛘?，也優(yōu)選該核酸表達(dá)β-葡糖腦苷脂酶。
也優(yōu)選的核酸編碼一些肽或蛋白，所述肽或蛋白因成本或邏輯的限制或這兩種原因，用現(xiàn)有的基因表達(dá)系統(tǒng)不能有效地工業(yè)生產(chǎn)。例如，某些蛋白不能在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中表達(dá)，因?yàn)樵摰鞍赘蓴_細(xì)胞的生存力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白裝配。這類蛋白包括(但不限于)成視網(wǎng)膜瘤蛋白、p53、制管張素和leptin。本發(fā)明可以有利地用來生產(chǎn)哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)蛋白；已知高等植物和哺乳動(dòng)物之間的進(jìn)化距離大，所以這些蛋白不可能干擾浮萍的調(diào)節(jié)過程。轉(zhuǎn)基因浮萍也可以用來生產(chǎn)大量的蛋白，諸如血清白蛋白(特別是人血清白蛋白)、血紅蛋白和膠原蛋白，這些大量的蛋白挑戰(zhàn)現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)能力。
最后，如以下更詳細(xì)描述的，可以將高等植物系統(tǒng)工程改造，以比哺乳動(dòng)物系統(tǒng)更容易得多地產(chǎn)生(例如合成、表達(dá)、裝配)生物活性多體蛋白(例如單克隆抗體、血紅蛋白、p450氧化酶和膠原蛋白等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，術(shù)語“生物活性的”包括與天然蛋白相比其生物活性被改變(例如被抑制的或增強(qiáng)的)的多體蛋白，只要該蛋白具有足夠的目的活性，以用于工業(yè)生產(chǎn)或化學(xué)加工中?；蜃鳛橹委焺⒁呙缁蛟\斷試劑。
用于在浮萍中生產(chǎn)生物活性多體蛋白的一個(gè)典型方法，使用含有編碼所有多肽亞基的基因的表達(dá)載體。參見例如During等(1990)PlantMocular Biology 15281；van Engelen等(1994)Plant Molecular Biology261701。然后，使用任何已知的方法(例如基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)將該載體引入浮萍細(xì)胞。該方法產(chǎn)生表達(dá)裝配該多肽蛋白所需的所有多肽的克隆細(xì)胞系。作為一個(gè)替代方法，制備編碼每種多肽亞基的獨(dú)立的載體構(gòu)成物。使用每個(gè)這些載體，產(chǎn)生單獨(dú)的僅表達(dá)其中一個(gè)必需多肽的轉(zhuǎn)基因植物的克隆系。然后，使這些基因組植物雜交，創(chuàng)造在單個(gè)植株中表達(dá)所有必需多肽的子代。參見Hiatt等，(1989)Nature34276；Hiatt等的美國專利第5,202,422號和第5,639,947號。該方法的一個(gè)變化形式是制備單個(gè)的基因構(gòu)成物，將來自這些構(gòu)成物的DNA混合在一起，然后，采用彈道轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，最好采用彈道轟擊，將該DNA混合物傳遞入植物細(xì)胞中。作為再一變化形式，某些或所有所述載體可以編碼多于一個(gè)的該多體蛋白的亞基(即雜交浮萍克隆數(shù)少于該多體蛋白亞基數(shù))。最后，在某些情況下，可能最好在一種轉(zhuǎn)化的浮萍植株中產(chǎn)生少于多體蛋白的全部亞基，或甚至產(chǎn)生單一的蛋白，例如用于工業(yè)生產(chǎn)或化學(xué)生產(chǎn)或用于診斷、治療或疫苗目的。A.表達(dá)盒按照本發(fā)明，待轉(zhuǎn)移的核酸包含于表達(dá)盒內(nèi)。該表達(dá)盒包含一個(gè)連接至目的核酸或基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。這種表達(dá)盒提供有多個(gè)限制性位點(diǎn)，用于插入在調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下控制的一個(gè)或多個(gè)目的基因(例如一個(gè)目的基因，兩個(gè)目的基因等)。最好是，該表達(dá)盒編碼單個(gè)目的基因。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，待轉(zhuǎn)移的核酸含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的表達(dá)盒，每個(gè)表達(dá)盒編碼至少一個(gè)目的基因(最好是一個(gè)目的基因)。
該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(例如啟動(dòng)子)對于該宿主可以是天然的或同源的或?yàn)橥鈦淼幕虍愒吹摹Ｍ鈦淼氖侵冈谝朐撧D(zhuǎn)錄起始區(qū)的野生型宿主中沒有發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。本文使用的“嵌合基因”包括操作性地連接至對于該編碼序列為異源的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的編碼序列。
本領(lǐng)域已知的任何合適的啟動(dòng)子均可以按照本發(fā)明使用(包括細(xì)菌、酵母、真菌、昆蟲、哺乳動(dòng)物和植物的啟動(dòng)子)。優(yōu)選植物啟動(dòng)子，最優(yōu)選浮萍的啟動(dòng)子。典型的啟動(dòng)子包括但不限于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、冠癭堿合成酶啟動(dòng)子(例如nos、mas、ocs等)、遍在蛋白啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、核酮糖二磷酸(RubP)羧化酶小亞基啟動(dòng)子和醇脫氫酶啟動(dòng)子。浮萍的RubP羧化酶小亞基啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。Silverthrone等，(1990)Plant Mol.Biol.1549。來自感染植物(最好是浮萍)的病毒的其它啟動(dòng)子也是合適的，包括但不限于從以下病毒分離出的啟動(dòng)子芋花葉病毒、小球藻病毒(例如小球藻腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子；Mitra等，(1994)Plant Molecular Biology 2685)、番茄斑萎病毒、煙草脆裂病毒、煙草壞死病毒、煙草環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒、黃瓜花葉病毒、花生stump病毒、亞麻花葉病毒等。
最后，可以選擇啟動(dòng)子，以給出所需水平的調(diào)節(jié)。例如，在某些情況下，可能最好使用賦予組成型表達(dá)的啟動(dòng)子(例如遍在蛋白啟動(dòng)子、RubP羧化酶基因家族啟動(dòng)子和肌動(dòng)蛋白基因家族啟動(dòng)子)?；蛘撸谄渌闆r下，可能最好使用對特定環(huán)境刺激(例如熱激基因啟動(dòng)子、干旱誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子、病原體誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子、傷口誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子和光/暗誘導(dǎo)型基因啟動(dòng)子)或植物生產(chǎn)調(diào)節(jié)劑(例如來自由脫落酸、生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)應(yīng)答時(shí)被激活的啟動(dòng)子。作為再一選擇方法，可以選擇給出組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子(例如根、葉和花特異性啟動(dòng)子)。
轉(zhuǎn)錄盒以5’-3’轉(zhuǎn)錄方向包括一個(gè)轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)、一個(gè)目的核苷酸序列和一個(gè)在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。本領(lǐng)域已知的任何合適的終止序列均可以按照本發(fā)明使用。終止區(qū)對于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以是天然的，可以對于目的核苷酸序列是天然的，或可以得自另一來源。方便的終止區(qū)可得自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，諸如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶的終止區(qū)。也參見Guerineau等，Mol.Gen.Genet.262，141(1991)；Proudfoot，Cell 64，671(1991)；Sanfacon等，Genes Dev.5，141(1991)；Mogen等，Plant Cell 2，1261(1990)；Munroe等，Gene 91，151(1990)；Ballas等，Nucleic Acids Res.17，7891(1989)；和Joshi等，Nucleic Acids Res.15，9627(1987)。其它典型的終止序列是豌豆RubP羧化酶小亞基終止序列和花椰菜花葉病毒35S終止序列。其它合適的終止序列對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
或者，可以在本領(lǐng)域已知的任何其它合適的表達(dá)盒上提供目的基因。合適時(shí)，為在轉(zhuǎn)化的植物中增強(qiáng)表達(dá)，可以優(yōu)化所述基因。當(dāng)在本發(fā)明中使用哺乳動(dòng)物、酵母或細(xì)菌或雙子葉植物基因時(shí)，可以采用單子葉植物或浮萍的優(yōu)選密碼子合成這些基因，以增強(qiáng)表達(dá)。在本領(lǐng)域中可得到合成植物優(yōu)選基因的方法。參見例如美國專利第5,380,831號；第5,436,391號；和Murray等，Nucleic Acids Res.17，477(1989)；這些文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
該表達(dá)盒可以還含有5’前導(dǎo)序列。這類前導(dǎo)序列可以作用以增強(qiáng)翻譯。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦炎心肌炎病毒5’非編碼區(qū)；Elroy-Stein等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，86，6126(1989))；馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒；Alloson等，Virology，154，9(1986))；人類免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP；Macajak和Sarnow，Nature353，90(1991))；來自亞麻花葉病毒的包膜蛋白mRNA的非翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA 4；Jobling和Gehrke，Nature 325，622(1987))；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV；Gallie，MOLECULAR BIOLOGY OF RNA，237-56(1989))；和玉米缺綠病斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)序列(MCMV；Lommel等，Virology 81，382(1991))。也參見Della-Cippa等，Plant Physiology84，965(1987)。已知增強(qiáng)翻譯的其它方法也可以利用，例如內(nèi)含子等。
可以將目的外源核酸另外與編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的一種核酸序列操作性地連接，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽將所編碼的目的肽或蛋白的表達(dá)導(dǎo)向特定的細(xì)胞區(qū)室。將高級植物細(xì)胞中蛋白積累導(dǎo)向葉綠體、線粒體、液泡、核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(用于分泌到細(xì)胞外)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域已知的。最好是，該轉(zhuǎn)運(yùn)肽將由外源核酸表達(dá)的蛋白導(dǎo)向葉綠體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。對于分泌蛋白的正確加工，需要將蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。將蛋白表達(dá)導(dǎo)向葉綠體(例如采用來自RubP羧化酶小亞基基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽)，已經(jīng)表明導(dǎo)致在該細(xì)胞器中非常高濃度的重組蛋白的積累。已經(jīng)克隆了編碼RubP羧化酶轉(zhuǎn)運(yùn)肽的浮萍核酸。Stiekma等，(1983)Nucl.Acids Res.118051-61；也參見例如Herrera-Estrella等的美國專利第5,717,084號和第5,728,925號。已經(jīng)用豌豆RubP羧化酶小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，在植物中表達(dá)哺乳動(dòng)物基因并將其定向。Herrera-Estrella等的美國專利第5,717,084號和5,728,925號。或者，可以用哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)肽將重組蛋白表達(dá)導(dǎo)向例如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。已經(jīng)證明，植物細(xì)胞識別哺乳動(dòng)物導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。Hiatt等的美國專利第5,202,422號和第5,639,947號。
該表達(dá)盒可以含有一個(gè)以上的待轉(zhuǎn)移并在轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)的基因或核酸序列。因此，每種核酸序列將與5’和3’調(diào)節(jié)序列操作性地連接。或者，可以提供多個(gè)表達(dá)盒。
一般而言，該表達(dá)盒將獎(jiǎng)包含一個(gè)用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因用來選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。選擇標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因以及賦予對除草劑化合物抗性的基因。除草劑抗性基因一般編碼經(jīng)修飾的對該除草劑不敏感的靶蛋白，或編碼將在植物中在該除草劑作用之前將其降解或解毒的酶。參見DeBlock等，EMBO J.6，2513(1987)；DeBlock等，Plant Physiol.91，691(1989)；Fromm等，BioTechnology 8，833(1990)；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2，603(1990)。例如，采用編碼突變靶酶5’-烯醇丙酮酰(enolpyuvyl)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因，已經(jīng)獲得的對glyphosphate或磺酰脲除草劑的抗性。采用編碼將相應(yīng)除草劑解毒的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶、腈水解酶或2，4-二氯苯氧基乙酸單加氧酶的細(xì)菌基因，已經(jīng)獲得了對草銨膦(glufosinate ammonium)、溴苯腈(boromoxynil)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的抗性。
對于本發(fā)明的目的，選擇標(biāo)記基因包括但不限于編碼以下的基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(Fraley等，CRC Critical Reviews in PlantScience 4，1(1986))；氨基氰水合酶(Maier-Greiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4250(1991))；天冬氨酸激酶；二氫吡啶二羧酸合酶(Perl等，BioTechnology 11，715(1993))；bar基因(Toki等，Plant Physiol.100，1503(1992)；Meagher等，Crop Sci.36，1367(1996))；色氨酸脫羧酶(Goddijn等，Plant Mol.Biol.22，907(1993))；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NEO；Southern等，J.Mol.Appl.Gen.1，327(1982))；潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT或HYG；Shimizu等，Mol.Cell.Biol.6，1074(1986))；二氫葉酸還原酶(DHFR；Kwok等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol，4552(1986))；膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(DeBlock等，EMBO J.6，2513(1987))；2，2-二氯丙酸脫鹵素酶(Buchanan-Wollatron等，J.Cell.Biochem.13D，330(1989))；乙酰羥酸合酶(Anderson等的美國專利第4,761,373號；Haughn等，Mol.Gen.Genet.221，266(1988))；5-烯醇丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA；Comai等，Nature 317，741(1985))；鹵代芳基腈水解酶(Stalker等的WO 87/04181)；乙酰輔酶A羧化酶(Parker等，Plant Physiol.92，1220(1990))；二氫蝶酸合酶(silI；Guerineau等，Plant Mol.Biol.15，127(1990))；和32kDa光合系統(tǒng)II多肽(psbA；Hirschberg等，Science 222，1346(1983))。
也包括編碼的對以下物質(zhì)抗性的基因氯霉素(Herrera-Estrella等，EMBO J.2，987(1983))；氨甲蝶呤(Herrera-Estrella等，Nature 303，209(1983)；Meijer等，Plant Mol.Biol.16，807(1991))；潮霉素(Waldron等，Plant Mol.Biol.5，103(1985)；Zhijian等，Plant Science 108，219(1995)；Meijer等，Plant Mol.Bio.16，807(1991))；鏈霉素(Jones等，Mol.Gen.Genet.210，86(1987))；壯觀霉素(Bretagne-Sagnard等，TransgenicRes.5，131(1996))；博來霉素(Hille等，Plant Mol.Biol.7，171(1986))；氨磺酰(Guerineau等，Plant Mol.Bio.15，127(1990)；溴苯腈(Stalker等，Science 242，419(1988))；2，4-D(Streber等，Bio/Technology 7，811(1989))；膦絲菌素(DeBlock等，EMBO.J.6，2513(1987))；壯觀霉素(Bretagne-Sagnard和Chupeau，Transgenic Research 5，131(1996))。
bar基因賦予對草銨膦型除草劑的除草劑抗性，所述除草劑諸如膦絲菌素(PPT)或雙丙氨膦等。如上所述，可以用于載體構(gòu)成物中的其它選擇標(biāo)記包括但不限于也賦予雙丙氨膦和膦絲菌素抗性的pat基因、賦予咪唑啉酮抗性的ALS基因、賦予潮霉素抗性的HPH或HYG基因、賦予草甘膦抗性的EPSP合酶基因、賦予對Hc-毒素抗性的Hml基因和本領(lǐng)域常規(guī)使用和已知的其它選擇劑。一般參見Yarranton，Curr.Opin.Biotech.3，506(1992)；Chistopherson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，6314(1992)；Yao等，Cell 71，63(1992)；Reznikoff，Mol.Microbiol.6，2419(1992)；BARKLEY等，THE OPERON 177-220(1980)；Hu等，Cell 48，555(1987)；Brown等，Cell 49，603(1987)；Figge等，Cell 52，713(1988)；Deuschle等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，5400(1989)；Fuerst等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，2549(1989)；Deuschle等，Science 248，480(1990)；Labow等，Mol.Cell.Biol.10，3343(1990)；Zambretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，3952(1992)；Baim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，5072(1991)；Wyborski等，Nuc.Acids Res.19，4647(1991)；Hillenand-Wissman，Topics in Mol And Struc.Biol.10，143(1989)；Degenkolb等，Antimicrob.Agents Chemother.35，1591(1991)；Kleinschnidt等，Biochemistry 27，1094(1988)；Gatz等，Plant J.2，397(1992)；Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，5547(1992)；Oliva等，Antimicrob.Agents Chemother.36，913(1992)；HLAVKA等，HANDBOOK OF EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY 78(1985)；和Gill等，Nature 334，721(1988)。這類說明書通過引用結(jié)合到本文中。
以上列出的選擇標(biāo)記基因不意味著為限制性的。任何選擇標(biāo)記基因均可以用于本發(fā)明中。
合適時(shí)，可以合成選擇標(biāo)記基因和其它待轉(zhuǎn)移的目的基因和核酸，以優(yōu)化在浮萍中的表達(dá)。也就是說，可以修飾所述基因的編碼序列，以增強(qiáng)在浮萍中的表達(dá)。設(shè)計(jì)合成的核酸，以在轉(zhuǎn)化組織和植物中較高水平地表達(dá)。優(yōu)化的選擇標(biāo)記基因的使用可能導(dǎo)致較高的轉(zhuǎn)化效率。
本領(lǐng)域中可得到基因合成優(yōu)化的方法?？梢詢?yōu)化核苷酸序列，以在浮萍中表達(dá)，或者可以將其修飾，以優(yōu)化在單子葉植物中的表達(dá)。可以根據(jù)在浮萍中表達(dá)的蛋白中的最高頻率的密碼子，確定植物的優(yōu)選密碼子。人們認(rèn)識到，已經(jīng)優(yōu)化用于浮萍和其它單子葉植物中表達(dá)的基因可以用于本發(fā)明方法中。參見例如EP 0 359 472、EP 0385962、WO 91/16432；Perlak等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，3324(1991)和Murray等，Nuc.Acids Res.17，477(1989)等，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。人們還認(rèn)識到，可以優(yōu)化或合成該基因序列的全部或部分。換句話說，也可以采用全優(yōu)化的或部分優(yōu)化的序列。
已知其它序列修飾增強(qiáng)在細(xì)胞宿主中的表達(dá)。這些序列修飾包括消除編碼假的多腺苷酸化信號的序列、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列和其它這類充分特征鑒定的、可能對基因表達(dá)有害的序列?？梢詫⒃撔蛄械腉-C含量調(diào)節(jié)至給定細(xì)胞宿主的平均水平，該水平根據(jù)在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算?？赡軙r(shí)，修飾該序列，以避免預(yù)定的發(fā)夾二級mRNA結(jié)構(gòu)。B.靶組織和愈傷組織本發(fā)明的方法可用來轉(zhuǎn)化浮萍植株的細(xì)胞，最好是葉細(xì)胞和分生細(xì)胞。這類細(xì)胞也包括來源于浮萍植株的任何組織的愈傷組織。用于起始愈傷組織的組織最好是分生組織?；蛘?，該愈傷組織可以來源于任何其它葉細(xì)胞，或主要來源于能夠形成愈傷組織的任何其它浮萍組織。換句話說，能夠進(jìn)行后續(xù)克隆繁殖的任何組織，無論它是通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生進(jìn)行克隆繁殖，均可以用來按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化浮萍。本文所用的術(shù)語“器官發(fā)生”是指由分生中心(meristematic center)順序發(fā)育葉和根的過程。本文所用的術(shù)語“胚胎發(fā)生”是指葉和根一起以協(xié)同方式(不是順序地)發(fā)育，無論它來自體細(xì)胞還是來自配子。
該方法也可以用來轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸液。這類細(xì)胞懸液可以由任何浮萍組織形成。
所述浮萍產(chǎn)生三類愈傷組織(a)致密的半組構(gòu)化(organized)的愈傷組織(命名為I型)；(b)脆性的白色未分化愈傷組織(命名為II型)；和(c)綠色的分化的愈傷組織(命名為III型)。在組織培養(yǎng)中，愈傷組織僅以兩種方式再生植株通過胚胎和通過苗形成(在浮萍中，葉是苗)。愈傷組織誘導(dǎo)的方法是本領(lǐng)域已知的，對于每個(gè)浮萍物種和所需類型的愈傷組織，可以優(yōu)化待使用的具體條件，如在以下實(shí)施例中證明的。最好使用I型或III型愈傷組織，更優(yōu)選使用I型愈傷組織，以按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化浮萍。
通過在含有植物生長調(diào)節(jié)劑(即細(xì)胞分裂素和生長素)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)浮萍組織，可以誘導(dǎo)愈傷組織。優(yōu)選用于從浮萍組織誘導(dǎo)愈傷組織的生長素包括2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和萘乙酸(NAA)。優(yōu)選的生長素濃度為1-30μM，更優(yōu)選為5-20μM，再更優(yōu)選為5-10μM。優(yōu)選的細(xì)胞分裂素是芐基腺嘌呤(BA)或噻苯隆(TDZ)。優(yōu)選的細(xì)胞分裂素的濃度為0.1-10μM，更優(yōu)選為0.5-5μM，再更優(yōu)選為0.5-1μM。在其它更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過在含有BA或TDZ之一和或者2，4-D或NAA之一的培養(yǎng)基中培養(yǎng)浮萍組織，誘導(dǎo)愈傷組織。一般而言，低濃度的生長素或“弱”生長素(例如吲哚乙酸)促進(jìn)葉的增殖，而非愈傷組織的形成，而高濃度的生長素或“強(qiáng)”生長素(例如2，4-D)促進(jìn)愈傷組織形成。優(yōu)選的愈傷組織形成基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括N6培養(yǎng)基(Chu等，Scientia Sinica 18，659(1975))和Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15，473(1962))，更優(yōu)選Murashige和Skoog培養(yǎng)基。一般而言，愈傷組織誘導(dǎo)的頻率是可變的。在這些物種中，培養(yǎng)2-3周時(shí)肉眼看不到愈傷組織，在愈傷組織的大小足以用于轉(zhuǎn)化之前，可能需要4-8周的培養(yǎng)。愈傷組織的誘導(dǎo)最好進(jìn)行1-10周，更優(yōu)選進(jìn)行2-8周，再更優(yōu)選進(jìn)行3-5周。對于愈傷組織的生長，優(yōu)選的培養(yǎng)基如同用于愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，但生長素的濃度降低。C.通過彈道攻擊轉(zhuǎn)化浮萍本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是用目的核苷酸序列轉(zhuǎn)化浮萍，其中該核苷酸序列含有至少一個(gè)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒攜帶一種賦予對選擇劑抗性的基因。該核苷酸序列由微彈攜帶。就本發(fā)明人所知，先前沒有報(bào)道，通過彈道轉(zhuǎn)化產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，該彈道轉(zhuǎn)化法包括以下步驟(a)提供作為靶的浮萍組織；(b)以足以穿刺該組織內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞壁并將該核苷酸序列沉積在該組織細(xì)胞內(nèi)的速率，將攜帶該核苷酸序列的微彈發(fā)射到該浮萍組織，藉此提供轉(zhuǎn)化的組織。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，該方法還包括用選擇劑培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的組織，如下所述。在再一可選擇的實(shí)施方案中，進(jìn)行選擇步驟后，進(jìn)行從該轉(zhuǎn)化組織再生轉(zhuǎn)化浮萍的步驟。如下所述，該技術(shù)可以用作為單獨(dú)的沉淀(濕或凍干)的核苷酸序列實(shí)施，以取代含有該核苷酸序列的水溶液。
任何彈道細(xì)胞轉(zhuǎn)化裝置均可以用于實(shí)施本發(fā)明。Sandford等(Particulate Science and Technology 5，27(1988))、Klein等(Nature 327，70(1987))和在EP 0 270 356中公開了典型的裝置。這類裝置已經(jīng)用來轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞(Klein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，4305(1988))、大豆愈傷組織(Christou等，Plant Physiol.87，671(1988)、McCabe等，BioTechnology 6，923(1988))、酵母線粒體(Johnston等，Science 240，1538(1988))和衣藻屬(Chlamydomonas)葉綠體(Boynton等，Science240，1534(1988))。
在本文提出的研究中，使用DuPont生產(chǎn)的市售氦基因槍(PDS-100/He)?；蛘撸梢岳萌鏚lein等描述配置的裝置(Nature 70，327(1987))。該裝置包括一個(gè)轟擊室，該轟擊室被高度可調(diào)的終止板(stopping plate)分為兩個(gè)獨(dú)立的區(qū)室，加速室安裝于轟擊室的上面。宏觀彈因槍粉電荷而被沿著加速室發(fā)射到終止板。終止板中有一形成的鏜孔(bore hole)，其直徑小于微彈的直徑。宏觀彈(macroprojectile)攜帶微彈，將宏觀彈瞄準(zhǔn)鏜孔，并對著鏜孔射出。當(dāng)宏觀彈被終止板終止時(shí)，微彈通過鏜孔發(fā)射。將靶組織定位在轟擊室中，使得通過鏜孔發(fā)射的微彈透過靶組織細(xì)胞的細(xì)胞壁，并將其上攜帶的目的核苷酸序列沉積在靶組織細(xì)胞中。轟擊室在使用之前部分抽空，以防止大氣摩擦力減慢微彈。該室僅被部分抽空，使得靶組織在轟擊期間不被干燥。約400至約800毫米汞的真空是合適的。
在可選擇的實(shí)施方案中，不用微彈而達(dá)到彈道轉(zhuǎn)化。例如，可以由宏觀彈攜帶含有作為沉淀的目的核苷酸序列的水溶液(例如通過將水溶液直接置于宏觀彈的板接觸端，而不用微彈，其中通過表面張力保持水溶液)。將該溶液單獨(dú)發(fā)射到植物組織靶上(例如通過將宏觀彈以上述相同方式沿加速管發(fā)射)。其它方法包括將該核酸沉淀本身(“濕”沉淀)或冷凍干燥的核苷酸沉淀直接置于宏觀彈的板接觸端，而不用微彈。在沒有微彈時(shí)，據(jù)信該核苷酸序列必須或者以大于由微彈攜帶所需的速度發(fā)射到組織靶上，或者使得該核苷酸序列移動(dòng)較短的距離而到達(dá)靶組織(或這兩者)。
目前最好是在微彈上攜帶該核苷酸序列。已知該粒子的速度和該粒子必須移動(dòng)的距離，所以可以由具有足夠密度和粘結(jié)性的任何材料形成微彈，以發(fā)射透過細(xì)胞壁，用于制造微彈的材料的非限制性實(shí)例包括金屬、玻璃、二氧化硅、冰、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和碳化合物(例如石墨、鉆石)。目前優(yōu)選金屬粒子。合適金屬的非限制性實(shí)例包括鎢、金和銥。粒子的大小應(yīng)該足夠小，以避免過度破壞它們在靶組織中接觸到的細(xì)胞，而粒子的大小應(yīng)該足夠大，以提供透過靶組織中目的細(xì)胞所需的慣性。直徑范圍為約0.5微米至約3微米的粒子是合適的。粒子不必是球形，因?yàn)榱Ｗ颖砻娌灰?guī)則可以增加其DNA的容納量。
可以通過沉淀將該核苷酸序列固定在該粒子上。所用的精確的沉淀參數(shù)如本領(lǐng)域已知的，將根據(jù)諸如所用的粒子加速方法而變化。載體粒子可以可任選地用諸如聚賴氨酸的包囊劑包被，以提高固定其上的核苷酸序列的穩(wěn)定性，如在EP 0 270 356(第8欄)中所述。
在彈道轟擊靶組織后，如以下E小節(jié)所述可以選擇轉(zhuǎn)化子和再生轉(zhuǎn)化的浮萍植株。D.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌，最好用根癌農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化浮萍。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移利用根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌將DNA轉(zhuǎn)移入植物染色體中的天然能力。農(nóng)桿菌是一種植物病原體，它將分別在根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒中稱為T-DNA的區(qū)內(nèi)編碼的一組基因轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞中。Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的典型結(jié)果是稱為根癌的腫瘤生長，其中T-DNA穩(wěn)定整合入宿主染色體中。Ri質(zhì)粒整合入宿主染色體DNA，產(chǎn)生稱為“發(fā)根病”的疾病。通過在T-DNA中取出該基因，而不喪失DNA轉(zhuǎn)移和整合，可以除去在宿主植物中引起疾病的能力。將待轉(zhuǎn)移的DNA連接至限定整合的T-DNA終點(diǎn)的邊界序列。
利用工程改造的農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移，已經(jīng)成為許多雙子葉作物的常規(guī)技術(shù)。然而，在使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物中，特別是在谷類植物中，已經(jīng)經(jīng)歷了相當(dāng)大的困難。就本發(fā)明人所知，迄今沒有報(bào)道利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍。
盡管以下的討論集中于使用根癌農(nóng)桿菌以達(dá)到浮萍中的基因轉(zhuǎn)移，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，這一討論同樣適用于毛根農(nóng)桿菌。與根癌農(nóng)桿菌的開發(fā)相似，已經(jīng)開發(fā)了用毛根農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，并且已經(jīng)成功地用來轉(zhuǎn)化例如亞麻、龍葵(Solanum nigrum L.)和白楊。Ryals等的美國專利第5,777,200號。如Burgess等的美國專利第5,773,693號所述，最好使用解除武裝的根癌農(nóng)桿菌菌株(如下所述)，然而，可以使用野生型毛根農(nóng)桿菌。一個(gè)說明性的毛根農(nóng)桿菌的菌株是菌株15834。
修飾用于本發(fā)明方法中的農(nóng)桿菌菌株，以使其含有一種或多種目的基因、或在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中待表達(dá)的核酸。將待轉(zhuǎn)移的核酸加入T區(qū)，其側(cè)翼為T-DNA邊界序列。本領(lǐng)域已知多種農(nóng)桿菌菌株，特別是用于雙子葉植物轉(zhuǎn)化的菌株。這種農(nóng)桿菌可以用于本發(fā)明方法中。參見例如Hooykass，Plant Mol.Biol.13，327(1989)；Smith等，Crop Science35，301(1995)；Chilton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，3119(1993)；Mollony等，Monograph Theor.Appl.Genet NY 19，148(1993)；Ishida等，Nature Biotechnol.14，745(1996)；和Komari等，The Plant Journal10，165(1996)，這些文獻(xiàn)的說明書通過引用結(jié)合到本文中。
除T區(qū)外，Ti(或Ri)質(zhì)粒還含有一個(gè)vir區(qū)。vir區(qū)對于有效的轉(zhuǎn)化的重要的，并且看來是物種特異性的。已經(jīng)開發(fā)了雙載體系統(tǒng)，其中受操作的解除武裝、攜帶外源DNA的T-DNA和vir功能存在于不同的質(zhì)粒上。以該方式，在一個(gè)在大腸桿菌中復(fù)制的小質(zhì)粒中，構(gòu)建包含外源DNA(待轉(zhuǎn)移的核酸)的修飾的T-DNA區(qū)。該質(zhì)粒以三親本交配接合轉(zhuǎn)移或通過電穿孔，轉(zhuǎn)移入含有毒性基因序列的匹配質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌中。vir功能以反式供應(yīng)，以將T-DNA轉(zhuǎn)移入植物基因組中。這類雙載體可用來實(shí)施本發(fā)明。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，C58衍生載體用來轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。或者在其它實(shí)施方案中，使用超雙載體。參見例如美國專利第5,591,615號和EP 0 604 662，它們通過引用結(jié)合到本文中。已經(jīng)構(gòu)建了這種超雙載體，它含有來源于Ti質(zhì)粒pTiBo542的超毒性區(qū)的DNA區(qū)(Jin等，J.Bacteriol.169，4417(1987))，所述Ti質(zhì)粒是表現(xiàn)出極其高轉(zhuǎn)化效率的超毒性根癌農(nóng)桿菌A281中含有的(Hood等，Biotechnol.2，702(1984)；Hood等，J.Bacteriol.168，1283(1986)；Komari等，J.Bacteriol.166，88(1986)；Jin等，J.Bacteriol.169，4417(1987)；Komari，Plant Sicence 60，223(1987)；ATCC保藏號為37394。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的典型超雙載體包括pTOK162(日本專利申請(Kokai)第4-222527號、EP 504,869、EP 604,662和美國專利第5,591,616號，這些文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)和pTOK233(Komari，Plant Cell Reports 9，303(1990)；Ishida等，Nature Biotechnology 14，745(1996)；這些文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。可以用以上文獻(xiàn)中提出的方法構(gòu)建其它超雙載體。超雙載體pTOK162能夠在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中復(fù)制。另外，該載體含有來自pTiBo542侵入?yún)^(qū)(virulenceregion)的virB、virC和virG基因。該質(zhì)粒也含有一個(gè)抗生素抗性基因、一個(gè)選擇標(biāo)記基因和待轉(zhuǎn)化入該植物的目的核酸。待插入浮萍基因組的核酸位于T區(qū)兩個(gè)邊界序列之間?？梢詷?gòu)建具有pTOK162上述特征的本發(fā)明的超雙載體。構(gòu)建所述超雙載體和用于本發(fā)明的其它載體的T區(qū)，以具有插入待傳遞的基因的限制性位點(diǎn)。或者，通過利用體內(nèi)同源重組，可以將待轉(zhuǎn)化的DNA插入該載體的T-DNA區(qū)。參見Herrera-Esterella等，EMBO J.2，987(1983)；Horch等，Science 223，496(1984)。這種同源重組依賴于這樣一個(gè)事實(shí)該超雙載體具有一個(gè)與pBR322或其它相似質(zhì)粒一個(gè)區(qū)同源的區(qū)。因此，當(dāng)兩種質(zhì)粒在一起時(shí)，所需基因通過同源區(qū)的遺傳重組，插入該超雙載體。
任何適用于轉(zhuǎn)化浮萍的載體均可以按照本發(fā)明使用。例如，可以由缺乏vir區(qū)的雙載體攜帶異源目的核酸序列和側(cè)翼的T-DNA。然后，在解除武裝的Ti質(zhì)粒或在第二雙質(zhì)粒上提供vir區(qū)。作為另一選擇方法，通過新T-DNA取代原始Ti質(zhì)粒T-DNA的雙重組事件，可以將異源核酸序列和T-DNA邊界序列置于Ti質(zhì)粒的T-DNA位點(diǎn)。vir區(qū)可以由該Ti質(zhì)粒供應(yīng)，或在一個(gè)雙質(zhì)粒上供應(yīng)。作為再一選擇方法，可以如Schilperoort等的美國專利第4,940,838號所述，將異源核酸序列和側(cè)翼的T-DNA整合入細(xì)菌染色體中，vir區(qū)則可以在一個(gè)Ti質(zhì)粒或一個(gè)雙質(zhì)粒上供應(yīng)。
本發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法可以被認(rèn)為包括幾個(gè)步驟?；静襟E包括感染步驟和協(xié)同培養(yǎng)步驟。在某些實(shí)施方案中，在這些步驟后進(jìn)行一個(gè)選擇步驟，在其它實(shí)施方案中，在這些步驟后進(jìn)行一個(gè)選擇和一個(gè)再生步驟。
在感染步驟之前，可以包括一個(gè)可選的預(yù)培養(yǎng)步驟。該預(yù)培養(yǎng)步驟包括在感染步驟之前，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)愈傷組織、葉或其它靶組織。預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間可以為約1-21天不等，最好為7-14天。發(fā)現(xiàn)這種預(yù)培養(yǎng)步驟防止玉米培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化。參見例如EP 0 672 752。
在感染步驟中，使待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞暴露于農(nóng)桿菌。將細(xì)胞與農(nóng)桿菌接觸，通常在液體培養(yǎng)基中接觸。如上所述，該農(nóng)桿菌已被修飾以含有一個(gè)目的基因或核酸。將該核酸插入該載體的T-DNA區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于本發(fā)明的一般分子生物學(xué)技術(shù)。參見例如SAMBROOKL等，MOLECULAR CLONGINGA LABORATORYMANUAL(1989)。
含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌最好在農(nóng)桿菌主平板上維持，于約-80℃冷凍貯存。主平板可以用來接種瓊脂平板，以獲得農(nóng)桿菌，然后將農(nóng)桿菌懸浮于培養(yǎng)基中，用于感染過程。或者，在轉(zhuǎn)化之前，來自主平板的細(xì)菌可以用來接種液體培養(yǎng)物，該液體培養(yǎng)物在轉(zhuǎn)化之前生長至對數(shù)期。
用于感染步驟和協(xié)同培養(yǎng)步驟的農(nóng)桿菌的濃度，可以影響轉(zhuǎn)化效率。同樣，非常高濃度的農(nóng)桿菌可能損害待轉(zhuǎn)化組織，并導(dǎo)致愈傷組織應(yīng)答降低。因此，用于本發(fā)明方法中的農(nóng)桿菌的濃度，可以根據(jù)所用的農(nóng)桿菌菌株、待轉(zhuǎn)化的組織、待轉(zhuǎn)化的浮萍物種等而變化。為了優(yōu)化具體浮萍物種或組織的轉(zhuǎn)化方案，可以用不同濃度的農(nóng)桿菌接種待轉(zhuǎn)化的組織。同樣，可以評估各種農(nóng)桿菌濃度的標(biāo)記基因表達(dá)的水平和轉(zhuǎn)化效率。盡管農(nóng)桿菌的濃度可以變化，但一般使用的濃度范圍為約1×103cfu/ml至約1×1010cfu/ml，范圍優(yōu)選為1×103cfu/ml至約1×109cfu/ml，再更優(yōu)選利用約1×108cfu/ml至約1×109cfu/ml。
一般將待轉(zhuǎn)化組織加入液體接觸相的農(nóng)桿菌懸液中，該懸液含有優(yōu)化轉(zhuǎn)化效率的濃度的農(nóng)桿菌。該接觸相促進(jìn)使待轉(zhuǎn)化組織與農(nóng)桿菌懸液的最大接觸。一般在協(xié)同培養(yǎng)步驟之前，讓感染進(jìn)行1-30分鐘，優(yōu)選進(jìn)行1-20分鐘，更優(yōu)選進(jìn)行2-10分鐘，再更優(yōu)選進(jìn)行3-5分鐘。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，可以優(yōu)選所述條件，以達(dá)到最高水平的農(nóng)桿菌感染和轉(zhuǎn)化。例如，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，在感染和協(xié)同培養(yǎng)步驟期間，使細(xì)胞經(jīng)受滲透壓(例如0.6M甘露醇)。另外，為了提高轉(zhuǎn)化效率，可以在含有生長素(諸如IAA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織，以促進(jìn)細(xì)胞增殖(即，人們認(rèn)為農(nóng)桿菌在有絲分裂期間整合入基因組中)。作為再一選擇方法，可以使用組織創(chuàng)傷、真空壓力或在含有乙酰丁香酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以提高轉(zhuǎn)化效率。
在協(xié)同培養(yǎng)步驟中，將該轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與農(nóng)桿菌協(xié)同培養(yǎng)。通常，協(xié)同培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行。可以使用任何合適的培養(yǎng)基，諸如含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt，Can.J.Bot.50，199(1972))。最佳協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間隨具體的組織而變化。葉與農(nóng)桿菌協(xié)同培養(yǎng)約2-7天，優(yōu)選2-5天，更優(yōu)選3-5天，更優(yōu)選4天。相比之下，愈傷組織與農(nóng)桿菌協(xié)同培養(yǎng)0.5-4天，更優(yōu)選1-3天，更優(yōu)選2天。可以在黑暗中或在減弱的光照條件下進(jìn)行協(xié)同培養(yǎng)，以提高轉(zhuǎn)化效率。另外，如以上接種步驟所述，可以在含有IAA或乙酰丁香酮的培養(yǎng)基上進(jìn)行協(xié)同培養(yǎng)，以提高轉(zhuǎn)化效率。最后，在細(xì)胞分裂素存在下進(jìn)行協(xié)同培養(yǎng)步驟，細(xì)胞分裂素用來增強(qiáng)細(xì)胞增殖。
在協(xié)同培養(yǎng)步驟后，可以使轉(zhuǎn)化的組織經(jīng)過可選的靜息和去污染步驟。對于靜息/去污染步驟，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有能夠抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素的第二培養(yǎng)基上。在缺乏任何選擇壓力的情況下進(jìn)行該靜息期，以允許含有該異源核酸的轉(zhuǎn)化細(xì)胞恢復(fù)和增殖。加入抗生素以抑制農(nóng)桿菌的生長。這類抑制農(nóng)桿菌的抗生素是本領(lǐng)域已知的，包括頭孢噻肟、timetin、萬古霉素、羧芐青霉素等?？股氐臐舛葘⒏鶕?jù)每種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)而變化。例如，在固體培養(yǎng)基中，羧芐青霉素的濃度范圍為約50mg/l至約250mg/l，優(yōu)選約75mg/l至源200mg/l，更優(yōu)選約100-125mg/l。單子葉植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，對于特定的轉(zhuǎn)化方案可以優(yōu)化抗生素的濃度，而不用過多的試驗(yàn)。
優(yōu)選讓靜息期培養(yǎng)物在黑暗或在減弱的光下靜息，最好在減弱的光下靜息。本領(lǐng)域已知的任何培養(yǎng)基均可以用于靜息期。靜息/去污染步驟進(jìn)行的時(shí)間可以是抑制農(nóng)桿菌生長并在選擇之前提高轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)目所需的時(shí)間長度。通常，在選擇步驟之前，靜息/去污染步驟進(jìn)行1-6周，優(yōu)選2-4周，更優(yōu)選2-3周。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇時(shí)間在協(xié)同培養(yǎng)后的3周內(nèi)開始。某些農(nóng)桿菌菌株的抗生素抗性強(qiáng)于其它菌株。對于抗性較低的菌株，通常通過每5天等將新的去污染培養(yǎng)基加入愈傷組織中，進(jìn)行去污染。對于抗性較強(qiáng)的菌株，可以每隔一天將較強(qiáng)的抗生素(例如萬古霉素)加入愈傷組織中。
在協(xié)同培養(yǎng)步驟或靜息/去污染步驟后，可以按以下E小節(jié)中所述選擇轉(zhuǎn)化子并再生浮萍植株。E.轉(zhuǎn)化子的選擇和轉(zhuǎn)化浮萍植株的再生按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化浮萍組織或愈傷組織，例如通過彈道轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化來進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每種方法分別在C和D小節(jié)中更詳細(xì)地描述。轉(zhuǎn)化步驟后，將轉(zhuǎn)化組織暴露于選擇壓力，以選擇那些接受來自表達(dá)盒引入的異源核酸并正在表達(dá)該核酸編碼的多肽的細(xì)胞。根據(jù)含有至少一個(gè)選擇標(biāo)記插入片段的細(xì)胞的優(yōu)先生長，選擇用來選擇轉(zhuǎn)化子的試劑，所述選擇標(biāo)記插入片段位于表達(dá)盒內(nèi)并通過彈道轟擊或農(nóng)桿菌傳遞。
一般而言，進(jìn)行選擇轉(zhuǎn)化子(來自任何組織類型或愈傷組織)的條件是本文公開的方法的最重要的方面。轉(zhuǎn)化過程使細(xì)胞經(jīng)受脅迫，而選擇過程甚至對轉(zhuǎn)化子有毒。通常，針對這種顧慮，轉(zhuǎn)化組織最初經(jīng)受弱選擇，利用低濃度的選擇劑和減弱的光(例如1-5μmol/m2·sec，通過提高該選擇劑的濃度和/或提高光強(qiáng)，以應(yīng)用的選擇梯度逐漸增加)。如果該組織看上去經(jīng)受脅迫，則可以完全解除選擇壓力一段時(shí)間，然后重新施加選擇壓力。另外，可以給予轉(zhuǎn)化的組織一段“靜息”時(shí)間，如以上在D小節(jié)中所述，然后再真正施加任何選擇壓力。選擇培養(yǎng)基一般含有一種簡單的糖，諸如1％-3％的蔗糖，使得細(xì)胞不進(jìn)行光合作用。另外，最初在減弱的光條件下進(jìn)行選擇，或甚至在完全黑暗中進(jìn)行選擇，以便將細(xì)胞的代謝活性保持在相對低的水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，對于每種浮萍物種或品系和對于待轉(zhuǎn)化的組織類型，可以優(yōu)化進(jìn)行選擇的具體條件，而不用過多的試驗(yàn)。
對于選擇步驟沒有具體的時(shí)間限制。一般而言，進(jìn)行選擇的時(shí)間長度足以殺傷非轉(zhuǎn)化子，并允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞以類似于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的速率進(jìn)行增殖，以在再生步驟之前產(chǎn)生足夠的愈傷組織(callul)塊。因此，對于以較慢速率增殖的細(xì)胞，選擇的時(shí)間較長。例如，I型浮萍愈傷組織增殖相對緩慢，在再生之前進(jìn)行8-10周的選擇。
從轉(zhuǎn)化細(xì)胞和愈傷組織再生某些植株的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Kamo等，Bot.Gaz.146，37(1985)；West等，The Plant Cell 5，1361(1993)；和Duncan等，Planta 165，322(1985)。對于再生浮萍，推薦幾種這些方法的改進(jìn)方法。用I型和III型愈傷組織，可以最可靠地獲得轉(zhuǎn)化和選擇后的葉再生。例如，可以根據(jù)淡黃色愈傷組織表面上出現(xiàn)的綠色中心(形成葉的位點(diǎn))，鑒別I型愈傷組織的再生。通常，在支持愈傷組織增殖的相同培養(yǎng)基條件下不發(fā)生浮萍的再生。最好使用貧乏的固體培養(yǎng)基(lean solid medium)(例如水-瓊脂或半強(qiáng)度Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(含有0.5％蔗糖和0.8％瓊脂))。然而，通常需要在全強(qiáng)度培養(yǎng)基上間斷地短期培養(yǎng)再生浮萍愈傷組織，以維持再生細(xì)胞中的營養(yǎng)平衡。在某些情況下，對于緩慢再生的品系或物種，在葉再生之前，該方法可能必須重復(fù)數(shù)次。通常，不在葉再生培養(yǎng)基中加入植物生長調(diào)節(jié)劑(因?yàn)樗鼈円种迫~的形成)，然而，諸如BA和硫酸腺嘌呤的細(xì)胞分裂素，對于某些物種而言可以提高葉的再生。愈傷組織培養(yǎng)物在延長的愈傷組織培養(yǎng)期間不喪失其再生葉的能力。
在再生過程中，本領(lǐng)域已知的任何方法均可以用來證實(shí)再生的植株事實(shí)上是用所轉(zhuǎn)移的目的核酸轉(zhuǎn)化的。例如，組織化學(xué)染色、ELISA測定、DNA雜交、RNA雜交、蛋白質(zhì)雜交、PCR等可以用來檢測愈傷組織和再生植株中所轉(zhuǎn)移的核酸或蛋白。
由于已經(jīng)證明浮萍可以用彈道轟擊和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，因此可以使用對本文所述通用方法的改變方法，以提高效率，或以轉(zhuǎn)化對轉(zhuǎn)化可能表現(xiàn)出一定抗拒的品系。影響轉(zhuǎn)化效率的因素包括浮萍的物種、感染的組織、組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成、選擇標(biāo)記基因、任何上述步驟的時(shí)間長度、載體的種類和光/黑暗條件。具體對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌的濃度和菌株也必須考慮。因此，可以改變這些因素和其它因素，以確定任何特定浮萍物種或品系的最佳轉(zhuǎn)化方案。人們會認(rèn)識到，不是每個(gè)物種和品系都對轉(zhuǎn)化條件有同樣反應(yīng)，對于本文公開的方案可能需要略微不同的修改。然而，通過改變每個(gè)變量，對于任何浮萍系均可以得到最佳方案。
提供以下實(shí)施例是為了進(jìn)行說明，而不是為了限制。實(shí)施例中所用的“hr”是指小時(shí)，“sec”是指秒，“g”是指克，“mg”是指毫克，“1”是指升，“1”是指毫升，“mmol”是指毫摩爾，“mM”是指毫摩爾濃度，“μM”是指微摩爾濃度，“m”是指米，“mm”是指毫米，“BA”是指芐基腺嘌呤，“2，4-D”是指2，4-二氯苯氧基乙酸，“NAA”是指萘乙酸，而“IAA”是指吲哚乙酸。
實(shí)施例組織培養(yǎng)該小節(jié)提出涉及浮萍愈傷組織制備方法的實(shí)驗(yàn)。許多實(shí)施例使用Lemna gibba G3作為浮萍品系，是用來優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)的品系(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制，(2)植物生長調(diào)節(jié)劑的類型和濃度，和(3)轉(zhuǎn)移方案。隨著對愈傷組織形成的了解的增加，這適用于其它浮萍物種。浮萍產(chǎn)生三種類型的愈傷組織(a)致密的半組構(gòu)化愈傷組織(命名為I型)；(b)脆性的白色未分化的愈傷組織(命名為II型)；和(c)綠色的分化的愈傷組織(命名為III型)。在組織培養(yǎng)中，愈傷組織僅以兩種方式再生植株通過胚胎和通過苗形成(在浮萍中，葉是苗)。以下提出的數(shù)據(jù)證明可以從所有已知的愈傷組織再生葉的途徑，再生轉(zhuǎn)化的浮萍植株。
實(shí)施例1對于生長素2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和細(xì)胞分裂素芐基腺嘌呤(BA)的18種組合，測試其對浮萍物種Lemna gibba G3中愈傷組織誘導(dǎo)的作用。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有3％蔗糖的液體Hoagland培養(yǎng)基(Hoagland和Snyder，Proc.Amer.Soc.Hort.Sci.30，288(1933))中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，制備18等份含有3％蔗糖、0.15％ Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的100ml Murashige和Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其2，4-D的濃度為10、20和50μM，而BA的濃度為0、0.01、0.1、1.0、2.0和10.0μM。所有培養(yǎng)基的pH均調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，將每100ml注入4個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用3個(gè)2，4-D濃度×6個(gè)BA濃度的全階乘實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(總共18種處理)，每種處理有4個(gè)重復(fù)測定，每個(gè)重復(fù)測定1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將72個(gè)平板于23℃培養(yǎng)27天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。27天后，將浮萍組織轉(zhuǎn)移至相同類型的新鮮培養(yǎng)基，再于相同的溫度和光培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)35天。
以愈傷組織誘導(dǎo)頻率(制備任何愈傷組織的葉數(shù)/總?cè)~數(shù))測量的結(jié)果顯示出培養(yǎng)62天后三種類型的愈傷組織增生。(1)致密的白色-黃色愈傷組織鑒定并命名為“I型”。低頻率的葉，即約5％增生該類型的愈傷組織。(2)脆性的白色愈傷組織鑒定并命名為“II型”。20-40％的葉增生該類型的愈傷組織。(3)以其細(xì)胞組構(gòu)化程度歸類的綠色的愈傷組織鑒定并命名為“III型”。所有增生的50％以上的葉在培養(yǎng)期間產(chǎn)生該愈傷組織類型。所有三種類型的愈傷組織均證明，在所有18種2，4-D和BA的組合下以不同的頻率增生。愈傷組織增生在20-50μM的范圍廣泛的2，4-D濃度和0.01-0.1μM的BA濃度內(nèi)最強(qiáng)烈。
實(shí)施例2測試生長素2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和細(xì)胞分裂素芐基腺嘌呤(BA)的40種濃度，以更優(yōu)化該生長素和細(xì)胞分裂素濃度，以由Lemnagibba G3的浮萍葉誘導(dǎo)愈傷組織。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有3％蔗糖的液體Hoagland培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，制備40等份含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的100ml Murashige和Skoog培養(yǎng)基，其2，4-D的濃度為20、30、40、50、60、70、80、100μM，而BA的濃度為0.01、0.05、0.1、0.5和1.0μM。所有培養(yǎng)基的pH均調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，將每100ml注入4個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用8個(gè)2，4-D濃度×5個(gè)BA濃度的全階乘實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(總共40種處理)，每種處理有4個(gè)重復(fù)測定，每個(gè)重復(fù)測定1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將平板于23℃培養(yǎng)27天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。27天后，將浮萍組織轉(zhuǎn)移至相同類型的新鮮培養(yǎng)基，再于相同的溫度和光培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)35天。
培養(yǎng)63天后得到的結(jié)果表明，已經(jīng)增生出三種類型的愈傷組織(1)I型愈傷組織，(2)II型愈傷組織，和(3)III型愈傷組織。數(shù)值頻率數(shù)據(jù)(制備任何愈傷組織的葉數(shù)/總?cè)~數(shù))的回歸分析(二次反應(yīng)曲面)揭示出對于不同類型的愈傷組織誘導(dǎo)的葉反應(yīng)。II型和III型愈傷組織類型的頻率顯著受2，4-D和BA濃度的影響，然而，I型愈傷組織的頻率僅顯著受2，4-D的影響。沒有具體的2，4-D或BA的濃度證明為最佳的，在范圍廣泛的兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度下都發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)。約50％的葉產(chǎn)生III型愈傷組織，約25％的葉產(chǎn)生II型愈傷組織，而低于5％的葉產(chǎn)生I型愈傷組織。
實(shí)施例3測試生長素麥草畏和細(xì)胞分裂素芐基腺嘌呤(BA)的40種組合，以比較麥草畏相對于2，4-D對于浮萍種Lemna gibba G3的愈傷組織誘導(dǎo)的相對效力。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有3％蔗糖的液體Hoagland培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，制備40等份含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的100ml Murashige和Skoog培養(yǎng)基，其麥草畏的濃度為10、20、30、40、50、60、80、100μM，而BA的濃度為0.01、0.05、0.1、0.5和1.0μM。所有培養(yǎng)基的pH均調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，將每100ml注入4個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用8個(gè)麥草畏濃度×5個(gè)BA濃度的全階乘實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(總共40種處理)，每種處理有4個(gè)重復(fù)測定，每個(gè)重復(fù)測定1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將平板于23℃培養(yǎng)27天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。28天后，將浮萍組織轉(zhuǎn)移至相同類型的新鮮培養(yǎng)基，再于相同的溫度和光培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)45天。
培養(yǎng)73天后，觀察到三種類型的愈傷組織增生(1)I型愈傷組織，(2)II型愈傷組織，和(3)III型愈傷組織?？傊?，愈傷組織的增生差，并在10和20μM的麥草畏濃度上發(fā)生；高于30μM，不發(fā)生愈傷組織的增生。II型和III型愈傷組織類型對麥草畏反應(yīng)而增生；極少I型愈傷組織增生。
實(shí)施例4使用兩種濃度的2，4-D結(jié)合BA，以確定是否維持愈傷組織的生長，以及是否由以Lemna gibba G3觀察到的三種類型建立愈傷組織系。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt，Can.J.Bot.50，199(1972))中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，制備含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、0.01μM BA的400ml Murashige和Skoog培養(yǎng)基，其2，4-D的濃度為10和40μM。所有培養(yǎng)基的pH均調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，將每200ml等份注入8個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用2種處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每種處理有4個(gè)重復(fù)測定，每個(gè)重復(fù)測定1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將這些平板于23℃培養(yǎng)27天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。4周后，將浮萍組織轉(zhuǎn)移至相同類型的新鮮培養(yǎng)基，再于相同的溫度和光培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4周。
培養(yǎng)8周后，觀察到三種類型的愈傷組織增生(1)I型愈傷組織，(2)II型愈傷組織，和(3)III型愈傷組織。將所有三種愈傷組織類型均轉(zhuǎn)移至與它們已經(jīng)在其上培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成相同的新鮮培養(yǎng)基上，在相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)4周以進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)2個(gè)月以上后，在10μM 2，4-D和0.01μM BA上的I型和III型愈傷組織建立了健康的增殖愈傷組織培養(yǎng)物。II型愈傷組織沒有增生。盡管以4周的傳代培養(yǎng)時(shí)間表可以維持愈傷組織的增生，但在傳代培養(yǎng)期間的第三周和第四周期間，注意到愈傷組織衰退。
實(shí)施例5用Lemna gibba G3測試維持愈傷組織增生的傳代培養(yǎng)時(shí)間表。在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，制備含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、30μM 2，4-D和0.02μM BA的500mlMurashige和Skoog培養(yǎng)基，將pH均調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，注入20個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用2種處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每種處理有2個(gè)重復(fù)測定，每個(gè)重復(fù)測定5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將這些平板于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。2周后，將一半平板(10個(gè)平板)上的浮萍組織轉(zhuǎn)移至相同組成的新鮮培養(yǎng)基，再于同未轉(zhuǎn)移組織相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。4周后，評估該組織的愈傷組織增生。三種類型的愈傷組織增生I型愈傷組織、II型愈傷組織和III型愈傷組織。與沒有轉(zhuǎn)移培養(yǎng)4周的浮萍組織相比，在2周時(shí)轉(zhuǎn)移的浮萍組織之間沒有觀察到愈傷組織類型或增生的差異。
從原始葉傳代培養(yǎng)I型和III型愈傷組織，并在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、10μM 2，4-D和0.01μMBA的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。將增生愈傷組織以2周的間隔繼續(xù)傳代培養(yǎng)至組成相同的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移之間較長的間隔導(dǎo)致2-3周之間愈傷組織健康狀況的突然衰退。當(dāng)維持2周傳代培養(yǎng)時(shí)間表時(shí)，愈傷組織繼續(xù)增生，而不喪失活力。
實(shí)施例6測試兩種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基-Murashige和Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及Nitsch和Nitsch基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Science 163，85(1969))，以比較其對于Lemna gibba G3愈傷組織誘導(dǎo)的相對效率。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，制備每種含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、30μM 2，4-D和0.01μM BA的500ml的Murashige和Skoog培養(yǎng)基以及Nitsch和Nitsch培養(yǎng)基，將pH均調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，每種培養(yǎng)基用來注入20個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用2種處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每種處理有2個(gè)重復(fù)測定，每個(gè)重復(fù)測定5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將這些平板于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。2周后，將浮萍組織轉(zhuǎn)移至相同組成的新鮮培養(yǎng)基，再于相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
4周后，評估所有平板上組織的愈傷組織增生。Nitsch和Nitsch培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉不能增生顯著量的愈傷組織。該培養(yǎng)基上的浮萍組織是蒼白的并且已經(jīng)變黃。Murashige和Skoog培養(yǎng)基上培養(yǎng)的浮萍葉增生出通常的三種類型的愈傷組織I型、II型和III型愈傷組織。
從原始葉傳代培養(yǎng)I型和III型愈傷組織，并在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、10μM 2，4-D和0.01μMBA的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。將增生愈傷組織以2周的間隔繼續(xù)傳代培養(yǎng)至組成相同的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移之間較長的間隔導(dǎo)致2-3周之間愈傷組織健康狀況的突然衰退。愈傷組織繼續(xù)增生，而不喪失活力。
實(shí)施例7測試三種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基-Murashige和Skoog培養(yǎng)基、Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基和Gamborg B5培養(yǎng)基(Gamborg等，InVitro 12，473(1976))，以比較其對于Lemna gibba G3愈傷組織誘導(dǎo)和生長的相對效力。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，制備每種含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、30μM 2，4-D和0.02μM BA的500ml的三種培養(yǎng)基，將pH均調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，將每個(gè)部分注入20個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用3種處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每種處理有2個(gè)重復(fù)測定，每個(gè)重復(fù)測定5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將這些平板于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。2周后，將浮萍組織轉(zhuǎn)移至相同組成的新鮮培養(yǎng)基，再于相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
4周后，評估所有平板上組織的愈傷組織增生。Gamborg B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉蒼白，并且存在黃色衰退的葉。沒有發(fā)生可察覺的愈傷組織增生。Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉為深綠色，增生出異常的葉，沒有發(fā)生可察覺的愈傷組織增生。Murashige和Skoog培養(yǎng)基上培養(yǎng)的浮萍葉增生出通常的三種類型的愈傷組織I型、II型和III型愈傷組織。
從原始葉傳代培養(yǎng)I型和III型愈傷組織，并在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、10μM 2，4-D和0.01μMBA的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。將增生愈傷組織以2周的間隔繼續(xù)傳代培養(yǎng)至組成相同的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移之間較長的間隔導(dǎo)致2-3周之間愈傷組織健康狀況的突然衰退。愈傷組織繼續(xù)增生，而不喪失活力。
實(shí)施例8用四種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基-Murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS)、Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(SH)、Nitsch和Nitsch培養(yǎng)基(NN)和Gamborg B5培養(yǎng)基(B5)，以比較其支持Lemna gibba G3 II型愈傷組織在液體培養(yǎng)基中增生的效力。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，制備含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、30μM 2，4-D和0.02μMBA的500ml Murashige和Skoog培養(yǎng)基，將pH均調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，并注入20個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將20個(gè)平板于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。2周后，將浮萍組織轉(zhuǎn)移至組成相同的新鮮培養(yǎng)基，再于相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
4周后，用II型愈傷組織接種用于愈傷組織懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。對于懸浮愈傷組織的建立，制備每種含有3％蔗糖、10μM 2，4-D和0.01μM BA的100ml的四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基MS、SH、NN和B5。將培養(yǎng)基的pH均調(diào)至5.8，將4個(gè)25ml的等份置于125ml燒瓶中，將所有16個(gè)燒瓶的培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌18分鐘。冷卻后，每個(gè)燒瓶用1-2小片II型脆性白色愈傷組織接種。將燒瓶用鋁箔包裹，于23℃培養(yǎng)2周，同時(shí)在黑暗中以100rpm恒定振蕩。
2周后，評估燒瓶的愈傷組織增生。用Murashige和Skoog培養(yǎng)基和Nitsch和Nitsch培養(yǎng)基，注意到微量的生長。將燒瓶再培養(yǎng)2周，不更換培養(yǎng)基，注意到?jīng)]有進(jìn)一步的愈傷組織增生。
實(shí)施例9用廣泛代表浮萍科的跨15個(gè)種的32個(gè)浮萍品系，以確定用Lemnagibba G3開發(fā)的用于愈傷組織誘導(dǎo)的方法和培養(yǎng)基，是否外推至整個(gè)科。表I列出了所測試的品系。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，使用6種基礎(chǔ)培養(yǎng)基Murashige和Skoog、Schenk和Hildebrandt(Schenk和Hildebrandt，Can.J.Bot.50，199(1972))、Nitsch和Nitsch、N6(Chu等，ScientiaSinica 18，659(1975))、Gamborg B5和Hoagland的培養(yǎng)基。使用已知引發(fā)L.gibba G3愈傷組織增生的兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的組合30μM2，4-D和0.02μM BA、以及5μM 2，4-D和2μM BA。對于每個(gè)品系，制備含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的200ml每種基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將這200ml分為2個(gè)100ml的等份，用每等份制備兩種植物生產(chǎn)調(diào)節(jié)劑濃度。將所有培養(yǎng)基的pH均調(diào)至5.8，培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，并且每個(gè)100ml的等份注入4個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
對于每個(gè)測試的浮萍品系，使用6種培養(yǎng)基×2種植物生長調(diào)節(jié)劑的組合、12種處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)測定1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿6片葉。對于浮萍屬、(Spirodela)和(Wolfiella)種的較大的葉，將6個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上，以誘導(dǎo)愈傷組織。對于無根萍屬內(nèi)的品系，小葉從技術(shù)上講不能將單獨(dú)的葉置于平板，將小叢的葉用作實(shí)驗(yàn)單位。將平板于23℃培養(yǎng)4-5周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。此時(shí)，評價(jià)這些葉的一般健康狀況(通過顏色(綠色至黃色)和增生活力來判斷)和三種類型愈傷組織起始的頻率I型、II型和III型。
結(jié)果表明不同浮萍種對愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的反應(yīng)性的變化。一般而言，浮萍屬和無根萍屬內(nèi)的種和品系的反應(yīng)性最強(qiáng)。Lemna gibba的所有5個(gè)品系均顯示出在含有5μM 2，4-D和2μM BA的MS、B5和N6培養(yǎng)基上不同程度的愈傷組織誘導(dǎo)。青萍的兩個(gè)品系遵循相同的型式，相對于Lemna gibba品系愈傷組織誘導(dǎo)程度更大。Lemnaminiscula的兩個(gè)品系表現(xiàn)出高頻率的愈傷組織誘導(dǎo)，白色愈傷組織的增生與青萍或Lemna gibba有些不同。Lemna aequinoctialis在最高生長素濃度下顯示出卷葉和膨脹(swelling)，但沒有觀察到真正的愈傷組織培養(yǎng)物的增生，表明所用的生長素濃度不夠高。Lemma valdiviana未顯示愈傷組織誘導(dǎo)。在無根萍屬的種中，無根萍在含有5μM 2，4-D和2μM BA的B5培養(yǎng)基上顯示出少量愈傷組織增生。Woffiabrasiliensis和Wollfia columbinana在補(bǔ)充5μM 2，4-D和2μM BA的Hoaglands培養(yǎng)基上顯示出愈傷組織的誘導(dǎo)。無根萍屬的其余種Wolffiaaustralinana沒有顯示出愈傷組織誘導(dǎo)，盡管葉表現(xiàn)出膨脹和略微異常的生長。Wolffiella和紫萍屬的種沒有顯示出愈傷組織誘導(dǎo)。紫萍屬種的葉在較高濃度的2，4-D上不存活，而在較低濃度下生長不好。該型式的反應(yīng)與以下解釋一致紫萍屬對生長素比浮萍屬和無根萍屬的種更敏感，并且較低的生長素濃度應(yīng)該用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，以誘導(dǎo)愈傷組織形成。
表I屬 種 品系名稱 來源的國家Spirodela polyrrhiza7970 美國4240 中國8652 中國8683 肯尼亞Spirodela punctata 7488 美國7776 澳大利亞Spirodela intermedia7178Wolffia arrhiza 7246 南非9006 日本W(wǎng)olffia austrliana7267 塔斯馬尼亞7317 澳大利亞Wolffia brasiliensis 7397 委內(nèi)瑞拉7581 委內(nèi)瑞拉8919 委內(nèi)瑞拉Wolffia columbiana7153 美國7918 美國Wolffella lingulata 8742 阿根廷9137 巴西Wolffella neotropica7279 巴西8848 巴西Wolffella oblongata 8031 美國8751 阿根廷Lemna aequinoctialis7758 美國Lemna gibba G3美國6861 意大利77848405 法國8678 喀什米爾Lemna minor 8744 阿爾巴尼亞8627 丹麥Lemna miniscula 6600 加利福尼亞6747 加利福尼亞Lemna valdiviana8821 阿根廷8829 阿根廷實(shí)施例10對4種生長素-萘乙酸(NAA)、2，4-D、吲哚乙酸(IBA)和麥草畏，測試它們在SH、MS和N6三種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上由L.gibbaG3葉誘導(dǎo)愈傷組織形成的能力。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，測試3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基Murashige和Skoog、Schenk和Hildebrandt和N6。使用芐基腺嘌呤作為細(xì)胞分裂素，其濃度為1μM。生長素的濃度隨生長素的類型而變。對于相對強(qiáng)的生長素-2，4-D和麥草畏，濃度為0、1、5、10和20μM。對于弱的生長素NAA和IBA，濃度為0、5、10、20和50μM。對于每種培養(yǎng)基的劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，制備含有BA的2升基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并將pH調(diào)至5.8。將體積等分為20個(gè)100ml的等份。向每個(gè)這些等份，加入適量的生長素，并將培養(yǎng)基調(diào)至0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂。將培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，并且每個(gè)100ml的等份注入4個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用3種培養(yǎng)基×4種生長素×5個(gè)濃度組合的60種處理的隨機(jī)劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)重復(fù)2次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將平板于23℃培養(yǎng)5周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。5周后，測量由每種原始葉產(chǎn)生的浮萍組織的鮮重，并且目視檢查這些組織群體的誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)和產(chǎn)生的愈傷組織類型。
在結(jié)果中見到許多傾向。首先，低生長素濃度和弱生長素促進(jìn)葉的增生。這種增生大于生長素不存在時(shí)觀察到的增生。當(dāng)葉增生時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)的頻率低。在高生長素濃度下或用較強(qiáng)的生長素，觀察到葉卷曲并且增生大大降低。愈傷組織的形成與葉卷曲有關(guān)。生長素類型的排名(從最大卷曲至最小卷曲)如下2，4-D、麥草畏、NAA和IBA。B6和MS均支持愈傷組織形成，而SH不支持愈傷組織形成。N6支持的增殖大于MS。在N6上需要比MS培養(yǎng)基更高濃度的生長素，以引發(fā)愈傷組織形成。對于致密的I型愈傷組織的誘導(dǎo)，2，4-D、麥草畏和NAA在MS培養(yǎng)基上均表現(xiàn)出某種程度的愈傷組織誘導(dǎo)，在N6培養(yǎng)基上，僅2，4-D和麥草畏產(chǎn)生愈傷組織。在含有10μM NAA的MS培養(yǎng)基上觀察到最大程度的愈傷組織誘導(dǎo)。
實(shí)施例11對4種細(xì)胞分裂素芐基腺嘌呤(BA)、細(xì)胞分裂素(kinetin)、噻苯隆(TDZ)和2-iP，測試它們在SH、MS和N6三種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上由L.gibba G3葉誘導(dǎo)愈傷組織形成的能力。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。為了誘導(dǎo)愈傷組織，測試3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基Murashige和Skoog、Schenk和Hildebrandt和N6。使用2，4-D作為生長素，其濃度為20μM。所用的細(xì)胞分裂素的濃度為0、0.05、0.1、0.5、1和5μM。對于每種培養(yǎng)基的劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，制備含有2，4-D的2400ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并將pH調(diào)至5.8。將體積等分為24個(gè)100ml的等份。向每個(gè)這些等份，加入適量的細(xì)胞分裂素，并將培養(yǎng)基調(diào)至0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂。將培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻，并且每個(gè)100ml的等份注入4個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿中。
使用3種培養(yǎng)基×4種細(xì)胞分裂素×6個(gè)濃度組合的72種處理的隨機(jī)劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)重復(fù)2次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿5片葉。為了誘導(dǎo)愈傷組織，將5個(gè)單獨(dú)的浮萍葉背軸面向下置于每個(gè)培養(yǎng)基平板上。將平板于23℃培養(yǎng)5周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。5周后，測量由每種原始葉產(chǎn)生的浮萍組織的鮮重，并且目視檢查這些組織群體的誘導(dǎo)的愈傷組織數(shù)和產(chǎn)生的愈傷組織類型。
在結(jié)果中見到許多傾向。在所有處理中，由于20μM 2，4-D的濃度太高，所以沒有發(fā)生葉的增生。在所有處理中葉卷曲均明顯。MS和N6顯示出愈傷組織誘導(dǎo)，而MS明顯更出色。在SH培養(yǎng)基上沒有發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)。在范圍廣泛的濃度下，TDZ在MS培養(yǎng)基上產(chǎn)生最大頻率的愈傷組織誘導(dǎo)。在I型和II型愈傷組織誘導(dǎo)之間存在消長關(guān)系。當(dāng)I型愈傷組織誘導(dǎo)高時(shí)，II型愈傷組織的誘導(dǎo)低。
實(shí)施例12因?yàn)榍嗥嫉钠废?744和8627比L.gibbba品系表現(xiàn)出更大的愈傷組織誘導(dǎo)和更快的愈傷組織增生(參見實(shí)施例9和表I)，所以對于青萍進(jìn)行了培養(yǎng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化。所測試的用于愈傷組誘導(dǎo)的變量包括a)篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成，b)生長素類型和濃度的篩選，和c)細(xì)胞分裂素的類型和濃度篩選。
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選中，測試三種培養(yǎng)基Schenk和Hildebrandt、Murashige和Skoog以及Frick開發(fā)的F培養(yǎng)基(Frick，(1991)J.Plant Physiol.137397-401)。用于這些實(shí)驗(yàn)的原種葉在使用之前，在補(bǔ)充24μM 2.4-D和2μM 2iP的F培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周。按實(shí)施例8制備愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。分離葉，切除根，在置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基之前，將迫使一半葉通過濾過器(按照Frick的方法)，將一半葉整個(gè)放置。這些葉在實(shí)施例8中給出的條件下培養(yǎng)6周，此時(shí)評價(jià)培養(yǎng)物愈傷組織誘導(dǎo)的存在與否、愈傷組織增生的程度和愈傷組織的基本形態(tài)。
Murashige和Skoog培養(yǎng)基表現(xiàn)出對青萍的愈傷組織誘導(dǎo)最好。Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基不能產(chǎn)生愈傷組織，而在F培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)最小。在放置之前迫使葉通過篩網(wǎng)，對愈傷組織誘導(dǎo)沒有作用。
在生長素類型和濃度的實(shí)驗(yàn)中，測試了2，4-D、NAA、IBA和麥草畏四種生長素，每種生長素四種濃度2、5、10和20μM，測試它們由青萍品系8744和8627誘導(dǎo)愈傷組織形成的能力。所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS，培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)方案是基本上按照實(shí)施例10的培養(yǎng)基和方案。將該實(shí)驗(yàn)中所用的葉在置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基之前，在3種不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2周1)無植物生長調(diào)節(jié)劑的SH培養(yǎng)基，2)含有24μM 2，4-D和2μM 2-iP的F培養(yǎng)基，和3)含有24μM 2，4-D和2μM 2-iP的SH培養(yǎng)基。分離葉，切除根，然后置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。這些葉在實(shí)施例8中給出的條件下培養(yǎng)6周，此時(shí)評價(jià)培養(yǎng)物愈傷組織誘導(dǎo)的存在與否、愈傷組織增生的程度和存在的愈傷組織的基本形態(tài)。
在誘導(dǎo)生長素或者是NAA或者是IBA的任何處理中，均未觀察到愈傷組織誘導(dǎo)。對于品系8744，在或者5μM或者10μM濃度的2，4-D處理中，觀察到大量的愈傷組織誘導(dǎo)，5μM 2，4-D產(chǎn)生的誘導(dǎo)最好。在最高的麥草畏濃度20μM下，也觀察到愈傷組織誘導(dǎo)。對于青萍品系8627，在2，4-D和麥草畏上也觀察的愈傷組織誘導(dǎo)，但是濃度較低。對于2，4-D，最大量的愈傷組織誘導(dǎo)在1和5μM下觀察到，5μM下產(chǎn)生的誘導(dǎo)最好。麥草畏對于愈傷組織誘導(dǎo)的有用的濃度是5和10μM。愈傷組織的形成僅來自先前在無植物生產(chǎn)調(diào)節(jié)劑的Shenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉，與愈傷組織誘導(dǎo)處理無關(guān)。
在細(xì)胞分裂素類型和濃度的實(shí)驗(yàn)中，測試了BA、細(xì)胞分裂素、2-iP和噻苯隆四種細(xì)胞分裂素，每種測試5種濃度0.05、0.1、0.5、1和5μM，測試它們由青萍品系8744和8627誘導(dǎo)愈傷組織形成的能力。所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是MS，培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)方案是基本上按照實(shí)施例11的培養(yǎng)基和方案。將該實(shí)驗(yàn)中所用的葉在置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基之前，在3種不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2周1)無植物生長調(diào)節(jié)劑的SH培養(yǎng)基，2)含有24μM 2，4-D和2μM 2-iP的F培養(yǎng)基，和3)含有24μM 2，4-D和2μM 2-iP的SH培養(yǎng)基。分離葉，切除根，然后置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。這些葉在實(shí)施例8中給出的條件下培養(yǎng)6周，此時(shí)評價(jià)培養(yǎng)物愈傷組織誘導(dǎo)的存在與否、愈傷組織增生的程度和愈傷組織的基本形態(tài)。
對于品系8744，用或者0.5μM或者1μM的或者2-iP或者噻苯隆，觀察到大量的愈傷組織誘導(dǎo)。只有在放置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基之前在F培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉，才觀察到愈傷組織誘導(dǎo)。對于青萍品系8627，用或者2-iP或者噻苯隆觀察到愈傷組織誘導(dǎo)，但其濃度較低，為或者0.1μM或者0.5μM。在該品系中，用0.5μM和1μM的BA，也觀察到愈傷組織誘導(dǎo)。
實(shí)施例13用青萍的品系8627和8744，測試基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成對愈傷組織增生和長期建立的作用。
測試MS、F培養(yǎng)基和半強(qiáng)度SH三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成維持健康的愈傷組織生長的能力。所有培養(yǎng)基均含有3％蔗糖，并用0.4％Didco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％Gelrite凝膠化。MS培養(yǎng)基補(bǔ)充1μM 2.4-D、2μM BA；半強(qiáng)度SH培養(yǎng)基補(bǔ)充1μM BA；而F培養(yǎng)基補(bǔ)充9μM 2，4-D和1μM 2-iP。在如實(shí)施例12中的先前的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上來自增生的品系8744和品系8627的愈傷組織培養(yǎng)物，均用于該實(shí)驗(yàn)。將愈傷組織培養(yǎng)2周的傳代培養(yǎng)時(shí)期，并記錄其生長、顏色和一般健康狀況。
對于青萍品系8744，補(bǔ)充1μM BA的半強(qiáng)度SH證明對于維持愈傷組織生長和健康狀況最好，產(chǎn)生的愈傷組織顯示出多個(gè)區(qū)的組構(gòu)化和異常的葉再生。在該培養(yǎng)基上也存在顏色由綠色至淡黃色的多個(gè)區(qū)域。在MS或F培養(yǎng)基上培養(yǎng)愈傷組織，導(dǎo)致非常快的增生，鮮重每6天增加1倍。在這兩種培養(yǎng)基上增生的愈傷組織表現(xiàn)出相當(dāng)少的組構(gòu)化和葉再生。對于品系8627，基礎(chǔ)培養(yǎng)基幾乎沒有影響，在所有3種培養(yǎng)基上愈傷組織的增生同樣好。關(guān)于品系8744，當(dāng)在補(bǔ)充1μM的半強(qiáng)度SH培養(yǎng)基上生長時(shí)，愈傷組織表現(xiàn)出更多的組構(gòu)化。
實(shí)施例14因?yàn)榍嗥急萀emna gibbba表現(xiàn)出更大的愈傷組織誘導(dǎo)，對另外三種青萍品系進(jìn)行另一篩選(它們的葉生長速率和蛋白含量均優(yōu)越)，以確定用于由青萍品系8744和8627誘導(dǎo)愈傷組織的方案否可外推至這些新的品系。所述品系命名為青萍品系7501、8626和8745。
按照前述實(shí)施例中開發(fā)的愈傷組織誘導(dǎo)系統(tǒng)補(bǔ)充3％蔗糖、5μM 2.4-D和2μM BA并用0.4％Didco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％Gelrite凝膠化的Murashige和Skoog基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用于愈傷組織誘導(dǎo)。在置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基之前，在缺乏植株生長調(diào)節(jié)劑并補(bǔ)充1％蔗糖的的液體SH培養(yǎng)基上培養(yǎng)葉。將葉置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并記錄5周后愈傷組織誘導(dǎo)的相對頻率和愈傷組織增生的相對速率。
對于品系8626和8745，在5周誘導(dǎo)期間沒有發(fā)生愈傷組織誘導(dǎo)，然而，后續(xù)的培養(yǎng)確實(shí)產(chǎn)生低頻率的愈傷組織增生。來自品系8626和8745的愈傷組織的形態(tài)和顏色，與由8744和8627增生的愈傷組織相當(dāng)相似，并且當(dāng)轉(zhuǎn)移至愈傷組織維持培養(yǎng)基時(shí)增生相當(dāng)好。品系7501顯示出低頻率的愈傷組織誘導(dǎo)，在形態(tài)方面愈傷組織與由品系8626和8745產(chǎn)生的愈傷組織的相似。
實(shí)施例15因?yàn)樵诘谝淮魏Y選中，Lemna minuscula表現(xiàn)出相當(dāng)大的愈傷組織誘導(dǎo)(參見實(shí)施例9)，所以用Lemna minuscula品系6600和6747重復(fù)愈傷組織誘導(dǎo)。制備愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并按實(shí)施例14中所述培養(yǎng)葉。
Lemna minuscula品系6600和6747均顯示出非常高頻率的愈傷組織誘導(dǎo)，事實(shí)上從每片葉均增生愈傷組織。在這些品系中愈傷組織起始快速，在平板接種后2-3周第一次觀察到愈傷組織。愈傷組織的顏色為蒼白色，增殖比由青萍品系8744或8626產(chǎn)生的愈傷組織慢(參見實(shí)施例14)。
實(shí)施例16根據(jù)前述實(shí)施例中所述的研究，用于浮萍屬中愈傷組織誘導(dǎo)和生產(chǎn)的優(yōu)選方法如下。
通過在合適培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并在特定的發(fā)育階段操縱植物生長調(diào)節(jié)劑類型和濃度，以促進(jìn)愈傷組織形成、生長和再生為完全分化的植株，完成了由浮萍植株進(jìn)行的愈傷組織誘導(dǎo)、生長和葉再生。通常，對于浮萍屬內(nèi)的種，用于愈傷組織誘導(dǎo)的優(yōu)選培養(yǎng)基是N6和MS，更優(yōu)選MS。在一種生長素和一種細(xì)胞分裂素存在下培養(yǎng)葉，優(yōu)選的生長素是NAA和2，4-D，優(yōu)選的細(xì)胞分裂素是BA和TDZ。這些植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度的變化范圍寬。對于生長素，優(yōu)選的濃度為5-20μM，最優(yōu)選5-10μM，對于細(xì)胞分裂素，優(yōu)選的濃度為0.5-5μM，最優(yōu)選0.5-1μM。在含有兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上將葉培養(yǎng)3-5周的誘導(dǎo)時(shí)間，在此期間愈傷組織增生。
對于愈傷組織的生長，優(yōu)選的培養(yǎng)基如用于愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，但所述生長素的濃度降低。對于生長素，優(yōu)選的濃度為1-5μM，對于細(xì)胞分裂素，優(yōu)選的濃度為0.5-1μM。對于愈傷組織誘導(dǎo)，傳代培養(yǎng)時(shí)間也從愈傷組織誘導(dǎo)的4-5周減少至長期愈傷組織生長的2周?？梢栽诨蛘哂铆傊?、Gelrite、或這兩者的組合(優(yōu)選的組合為0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％Gelrite)凝膠化的固體培養(yǎng)基或者在液體培養(yǎng)基上維持愈傷組織的生長。采用該方法，可以在無限時(shí)期內(nèi)將愈傷組織培養(yǎng)物維持在健康狀態(tài)。
實(shí)施例17無根萍屬內(nèi)的品系對誘導(dǎo)愈傷組織的植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度反應(yīng)方式與浮萍屬內(nèi)品系的反應(yīng)方式相似。因此，選擇無根萍屬品系，進(jìn)一步研究其增生愈傷組織的能力。
對于7246、8853、9000、9006四個(gè)無根萍品系和7393、7581、7591和8319四個(gè)Wolffia brasiliensis品系，測試其對植株生長調(diào)節(jié)劑反應(yīng)增生愈傷組織的能力。所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是補(bǔ)充3％蔗糖、5μM 2，4-D、BA和細(xì)胞分裂素(kinetin)各5μM和65μM苯基硼酸的MS。平板接種培養(yǎng)物，并在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5周，然后記錄愈傷組織的增生。
在5周培養(yǎng)期間，由任何測試的品系均未獲得愈傷組織增生。然而，愈傷組織誘導(dǎo)前的形態(tài)容易出現(xiàn)在幾個(gè)品系中，包括無根萍8853、9000、9006和Wolffia brasiliensis 7581。這些品系的葉增厚明顯，這是在愈傷組織形成明顯之前在葉中常常觀察到的一種反應(yīng)，表明所用的生長素濃度不足以支持愈傷組織增生。
轉(zhuǎn)化該小節(jié)包括涉及用于實(shí)際的基因轉(zhuǎn)移方法的實(shí)驗(yàn)。有三個(gè)部分(1)用基因槍轉(zhuǎn)化葉，(2)用浮萍葉進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，和(3)用浮萍愈傷組織進(jìn)行的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。葉轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)用來優(yōu)化影響實(shí)際基因轉(zhuǎn)移的參數(shù)(a)細(xì)菌的生長，(b)乙酰丁香酮的包含，(c)細(xì)菌濃度，(d)重新懸浮細(xì)菌的溶液和滲透壓休克的作用，(e)用于葉和愈傷組織的協(xié)同培養(yǎng)培養(yǎng)基，(f)接種的時(shí)間長短，(g)葉和愈傷組織的協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間，和(h)協(xié)同培養(yǎng)期間的光條件。用葉開發(fā)的方案適用于轉(zhuǎn)化采用優(yōu)化組織培養(yǎng)步驟獲得的愈傷組織培養(yǎng)物。正是采用這種轉(zhuǎn)化的愈傷組織，來進(jìn)行選擇，然后通過再生以獲得轉(zhuǎn)化的葉?；驑尳閷?dǎo)的轉(zhuǎn)化實(shí)施例18使Lemna gibba G3的葉經(jīng)過微載體轟擊，以測試其表達(dá)外源基因構(gòu)成物的能力。
對于葉的增生，制備60ml補(bǔ)充3％蔗糖和0.8％瓊脂的高鹽培養(yǎng)基(De Fossard，TISSUE CULTURE FOR PLANT PROPAGATORS 132-52(1976))，將其pH調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，用來倒6個(gè)60mm×15mm培養(yǎng)皿。每個(gè)培養(yǎng)皿接種一片葉。于23℃將葉培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。
對于轟擊，制備1.6μm金微載體，按照生產(chǎn)商(Bio-Rad)的基因槍方案，在該微載體上沉淀來自質(zhì)粒pRT99的DNA。質(zhì)粒pRT99(Topfer等，Nucleic Acid Res.16，8725(1988))編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和β-葡糖醛酸酶基因(GUS；Jefferson等，EMBO J.6，3901(1987))，這兩種基因均在CaMV35S啟動(dòng)子的控制之下。
將浮萍葉背軸面向上，用DNA包被的微載體以四個(gè)氦壓力水平轟擊800、600和400 lbs/平方英寸。轟擊后24小時(shí)，按照Stomp的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載于GUSPROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)作為底物，進(jìn)行GUS活性的組織化學(xué)染色。GUS陽性染色中心的頻率與用于轟擊的壓力成正比，在800psi處理中發(fā)現(xiàn)最大數(shù)目的表達(dá)GUS的細(xì)胞，頻率范圍為4-20個(gè)染色細(xì)胞/葉。在所有處理中，轟擊導(dǎo)致一半以上的葉破壞。
實(shí)施例19使Lemna gibba G3的葉經(jīng)過微彈轟擊，以測試微載體大小對外源基因表達(dá)頻率的影響。
對于葉的增生，制備200ml補(bǔ)充3％蔗糖和0.8％瓊脂的高鹽培養(yǎng)基，將其pH調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，用來倒20個(gè)60mm×15mm培養(yǎng)皿。每個(gè)培養(yǎng)皿接種一片葉。所有葉均于23℃培養(yǎng)2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。在400、800和1200psi 3個(gè)氦壓力下，用DuPont制造的PDS-100/He基因槍，測試1.0和1.6μm兩種微載體大小。制備金微載體，按照生產(chǎn)商(Bio-Rad)提供的方法，在該微載體上沉淀pRT99 DNA。
轟擊后24小時(shí)，按照Stomp的組織化學(xué)染色方法(Histochemicallocalization of beta-glucoronidase，載于GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編碼1991))，分析轟擊的浮萍葉的GUS表達(dá)。在用1.6μm微載體和800psi氦壓力下，發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)頻率最大。GUS陽性事件的數(shù)目范圍為每片葉1-21個(gè)。
實(shí)施例20由通過彈道轟擊轉(zhuǎn)化的浮萍愈傷組織，再生轉(zhuǎn)基因浮萍植株。如以下實(shí)施例42中所述，培養(yǎng)I型愈傷組織培養(yǎng)物。通常，在MS培養(yǎng)基(實(shí)施例42中所述的MS培養(yǎng)基)上的轟擊面上，均勻鋪上20-30個(gè)直徑約2-4mm的浮萍愈傷組織塊。使用實(shí)施例18和實(shí)施例19所述的金粒子(直徑為1.6μM)和轟擊(800psi的氦壓力)。用于轟擊的DNA由一種表達(dá)質(zhì)粒組成，該表達(dá)質(zhì)粒含有目的基因(例如GUS、另一標(biāo)記基因、編碼哺乳動(dòng)物蛋白的一種基因或編碼細(xì)菌、真菌、植物或哺乳動(dòng)物酶的一種基因)和編碼一種選擇標(biāo)記基因的基因(例如nptII(卡那霉素抗性)、hptII(潮霉素抗性)、sh ble(zoecin抗性)和bar(膦絲菌素抗性))以及基因表達(dá)所必需的其它序列(例如啟動(dòng)子序列、終止序列)。在800 lbs/平方英寸下轟擊后，愈傷組織在黑暗中培養(yǎng)2周(或如果需要，使用較長時(shí)間)，然后在3-5μmol/m2·sec的光強(qiáng)下培養(yǎng)4-6周。每2周將愈傷組織轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上，轟擊2-4周后，向培養(yǎng)基加入選擇劑。抗性愈傷組織的選擇繼續(xù)進(jìn)行8-16周，直至產(chǎn)生完全抗性的愈傷組織。按實(shí)施例42中所述，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因葉和植株的再生。用浮萍葉以農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)施例21采用兩種不同的協(xié)同培養(yǎng)的培養(yǎng)基-Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基和Murashige和Skoog培養(yǎng)基，用Lemna gibba G3的浮萍葉測試浮萍對根癌農(nóng)桿菌的敏感性。
使用根癌農(nóng)桿菌菌株AT656和無毒力的根癌農(nóng)桿菌菌株A136，接種浮萍葉。菌株AT656由菌株EHA105(Hood等，Transgenic Res.2，208(1993))構(gòu)建，菌株AT656在解除武裝的pTiBo542質(zhì)粒上含有pTiBo542 vir區(qū)。在雙質(zhì)粒pCNL56(Li等，Pl.Mol.Biol.20B，1037(1992))攜帶該T-DNA。該雙質(zhì)粒衍生自pBIN19并經(jīng)修飾，攜帶在胭脂堿合成酶啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶終止子控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和在mas2’-CaMV35S啟動(dòng)子和章魚堿合成酶終止子控制下的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因(Janssen和Gardner，Plant Mol.Biol.14，61(1989))。GUS編碼區(qū)在該基因的編碼序列內(nèi)含有一個(gè)內(nèi)含子，以防止GUS的細(xì)菌表達(dá)(Vancanneyt等，Mol.Gen.Genet.220，245(1990))。菌株A136衍生自廣泛宿主范圍的菌株C58。當(dāng)C58在高于30℃的溫度下生長時(shí)，喪失其Ti質(zhì)粒，變?yōu)闊o毒力的A136。這兩種菌株AT656和A136于28℃在AB基本培養(yǎng)基(Chilton等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA71，3672(1974))上生長過夜，該基本培養(yǎng)基用1.6％瓊脂固化，并補(bǔ)充100μM乙酰丁香酮。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有3％蔗糖的液體Hoagland培養(yǎng)基中于23℃生長2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備500ml含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。也制備含有3％蔗糖和0.6％瓊脂的Murashige和Skoog培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。向這兩種培養(yǎng)基中，加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，使最終的培養(yǎng)基濃度為20mg/L。每種冷卻的培養(yǎng)基倒20個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。對于每種細(xì)菌菌株，在使用之前至少1小時(shí)，將來自一個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿的細(xì)菌在100ml以下溶液(Hiei等，The Plant J.6，271(1994))中重新懸浮Gamborg B5鹽、Murashige和Skoog維生素、甘氨酸(8mg/L)、天冬氨酸(266mg/L)、精氨酸(174mg/L)、谷氨酰胺(876mg/L)、酪蛋白氨基酸(500mg/L)、蔗糖(6.85％)、葡萄糖(3.6％)和乙酰丁香酮(20mg/L)。制備該溶液，將pH調(diào)至5.8，在加入細(xì)菌之前過濾除菌。
使用2種細(xì)菌菌株×2種協(xié)同培養(yǎng)培養(yǎng)基的全階乘實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(總共4種處理)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)5次，每次重復(fù)有2個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20片葉。對于接種，將浮萍葉浮于細(xì)菌溶液中數(shù)分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的或者Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基或者M(jìn)urashige和Skoog培養(yǎng)基上。將葉于23℃下培養(yǎng)4天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。然后將葉轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上，該新鮮培養(yǎng)基除缺乏乙酰丁香酮并且向該培養(yǎng)基中加入500mg/L替卡西林-克拉維酸和50mh/L硫酸卡那霉素外，組成相同。
用按照Stomp等的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載于GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))的GUS活性的組織化學(xué)染色，證實(shí)葉中的基因轉(zhuǎn)移。進(jìn)行接種A136的葉的染色，作為測試細(xì)菌接種的葉的內(nèi)源GUS活性的對照。在接種后10天進(jìn)行的染色表明，在A136接種的對照中無GUS染色，而在接種AT656的葉中染色頻率高，與用于協(xié)同培養(yǎng)的哪種基礎(chǔ)培養(yǎng)基-MS或SH無關(guān)。觀察到轉(zhuǎn)化頻率高于原始接種葉的70％，表明在這些葉中某處有GUS陽性細(xì)胞。
實(shí)施例22采用Lemna gibba G3的葉，測定創(chuàng)傷對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)頻率的影響。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃生長2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備1升含有3％蔗糖、0.6％瓊脂、20μM 2，4-D、2μM BA和20mg/L乙酰丁香酮的Murashige和Skoog培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，最終的培養(yǎng)基濃度為20mg/L。由該冷卻的培養(yǎng)基倒40個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。
對于接種，使用根癌農(nóng)桿菌菌株AT656，將其于28℃在含有50mg/L硫酸卡那霉素和20mg/L乙酰丁香酮的AB基本培養(yǎng)基(Chilton等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71，3672(1974))上生長過夜。按實(shí)施例21中所述，重新懸浮來自一個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿的細(xì)菌，用于接種。
使用2種創(chuàng)傷處理×2種細(xì)菌接種的全階乘實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(總共4種處理)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)5次，每次重復(fù)有2個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20片葉。對于創(chuàng)傷處理，從SH培養(yǎng)基上取出數(shù)叢浮萍葉，置于潮濕的無菌濾紙上。將各叢浮萍葉分為單片葉，將葉背軸面向上，以兩種方式之一對葉制造創(chuàng)傷1)橫向跨葉中心切割，由此切口從左至右通過相鄰的分生組織區(qū)，或2)在中心的二邊切割，由此切口縱向通過每個(gè)分生組織區(qū)。對于細(xì)菌處理，將兩類創(chuàng)傷的葉浮于1)重新懸浮的AT656中或2)無細(xì)菌的重新懸浮流體中。對于接種，將葉保持飄浮10-30分鐘。
對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的含有3％蔗糖、20μM2，4-D、2μM BA和100μM乙酰丁香酮和0.6％瓊脂的Murashige和Skoog培養(yǎng)基上。將葉于23℃下培養(yǎng)4天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。按照Stomp等的方法(Histochemicallocalization of beta-glucoronidase，載于GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，將葉亞樣品染色檢測GUS 。接種后4天協(xié)同培養(yǎng)的葉的染色表明，創(chuàng)傷的方向不影響葉的GUS染色頻率，其平均值為約70％。用無細(xì)菌的細(xì)菌重懸浮溶液接種的創(chuàng)傷的葉，即對照，沒有顯示出GUS染色。分生組織區(qū)內(nèi)染色的葉數(shù)平均約為40％。
實(shí)施例23采用Lemna gibba G3的葉，測定創(chuàng)傷葉在細(xì)菌懸浮培養(yǎng)基中接種的時(shí)間對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)頻率的影響。
在實(shí)驗(yàn)之前，在125ml燒瓶中的25ml培養(yǎng)基中，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Hoagland培養(yǎng)基中于23℃生長至葉密度約為120片葉，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備1500ml含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，最終的培養(yǎng)基濃度為20mg/L。由該冷卻的培養(yǎng)基倒60個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。
使用具有4種接種時(shí)間處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)3次，每次重復(fù)有5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿25片葉。對于接種，使用根癌農(nóng)桿菌菌株AT656，將其于28℃在含有50mg/L硫酸卡那霉素和20mg/L乙酰丁香酮的AB基本培養(yǎng)基上生長過夜。按實(shí)施例21中所述，重新懸浮來自一個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿的細(xì)菌，用于接種。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)制造創(chuàng)傷，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)菌懸液，溫育15、30、45或60分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協(xié)同培養(yǎng)基上。將所有60個(gè)平板均于23℃下培養(yǎng)6天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。在4天時(shí)間內(nèi)進(jìn)行3次重復(fù)。在協(xié)同培養(yǎng)后2、3和6天，取來自每個(gè)接種時(shí)間(15、30、45或60分鐘)的協(xié)同培養(yǎng)葉的亞樣品。按照Stomp等的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載于GUSPROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，將亞樣品葉染色檢測GUS表達(dá)。在表II中給出了結(jié)果。
表II協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間 接種時(shí)間 重復(fù)次數(shù) 總?cè)~數(shù) 染色數(shù)2天 15 127 2730 127 2745 128 2660 128 263天 15 230 2930 228 2845 225 2460 227 266天 15 327 2430 326 2245 323 2160 330 28盡管在2天時(shí)創(chuàng)傷的莖端上明顯有GUS染色，但分生組織區(qū)內(nèi)的染色在協(xié)同培養(yǎng)2天時(shí)不明顯。在3天的協(xié)同培養(yǎng)時(shí)分生組織染色最大，至協(xié)同培養(yǎng)6天時(shí)下降。浮萍葉在細(xì)菌重懸浮溶液中的接種時(shí)間確實(shí)對協(xié)同培養(yǎng)后總的GUS表達(dá)頻率無顯著影響。
實(shí)施例24采用Lemna gibba G3的葉，測定農(nóng)桿菌菌株和外源基因構(gòu)成物對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)頻率的影響。
使用兩種根癌農(nóng)桿菌菌株AT656和C58sZ707pBI121。C58sZ707pBI121是一種解除武裝的廣泛宿主范圍的、其中已經(jīng)轉(zhuǎn)移了pBI121的C58菌株(Hepburn等，J.Gen.Microbiol.131，2961(1985))。雙質(zhì)粒pBI121衍生自pBIN19，其T-DNA編碼在胭脂堿合成酶啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶終止子控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和在CaMV35S啟動(dòng)子和章魚堿合成酶終止子控制下的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因。將AT656在含有50mg/L硫酸卡那霉素的AB基本培養(yǎng)基上劃線接種，將C58sZ707pBI121在含有500mg/L鏈霉素、50mg/L壯觀霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的AB基本培養(yǎng)基上劃線接種。這兩種細(xì)菌菌株均于28℃下培養(yǎng)過夜。
在實(shí)驗(yàn)之前，使浮萍葉在含有1％蔗糖的液體Hoagland培養(yǎng)基中于23℃生長4周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備500ml含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，最終的培養(yǎng)基濃度為20mg/L。由該冷卻的培養(yǎng)基倒20個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。
使用2種細(xì)菌菌株處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)2次，每次重復(fù)有5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿25片葉。按實(shí)施例21所述，每個(gè)菌種都重新懸浮來自一個(gè)AB平板的細(xì)菌，用于接種。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)制造創(chuàng)傷，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)菌懸液，溫育15-30分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協(xié)同培養(yǎng)基上。將所有20個(gè)平板均于23℃下培養(yǎng)6天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。在協(xié)同培養(yǎng)后6天時(shí)，取葉的亞樣品，并染色檢測GUS表達(dá)。用AT656，在取樣的13個(gè)浮萍葉叢中的12個(gè)顯示出GUS染色，然而在分生組織區(qū)中沒有觀察到染色。用C58sZ707pBI121，所有的浮萍葉叢均顯示出廣泛的染色。
對于所有其余葉，在轉(zhuǎn)移至含有硫酸那霉素的新鮮培養(yǎng)基后，繼續(xù)培養(yǎng)1周。對于協(xié)同培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)移，制備含有1％蔗糖和0.6％瓊脂的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。將替卡西林克拉維酸和硫酸卡那霉素兩種抗生素以過濾除菌溶液，加入冷卻的培養(yǎng)基中，最終的培養(yǎng)基濃度分別為500mg/L和2mg/L。用冷卻的培養(yǎng)基倒60個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。
1周后，記錄葉在卡那霉素上的生長和GUS表達(dá)。增生的葉表現(xiàn)出對卡那霉素的3類反應(yīng)(1)由原始的與細(xì)菌菌株AT656協(xié)同培養(yǎng)產(chǎn)生的葉的約20％，在卡那霉素存在下表現(xiàn)出旺盛的生長，而由原始的與細(xì)菌菌株C58sZ707pBI121協(xié)同培養(yǎng)產(chǎn)生的葉的約30％，在卡那霉素存在下表現(xiàn)出旺盛的生長，(2)另一組葉明顯地沒有增生，葉綠素褪色并趨于死亡，(3)中間一組葉在卡那霉素存在下表現(xiàn)出一些增生，但葉半褪色，表明對卡那霉素敏感。GUS染色的結(jié)果表明，在原始的協(xié)同培養(yǎng)葉中，活性酶仍以高頻率存在。
實(shí)施例25采用Lemna gibba G3的葉，測定農(nóng)桿菌菌株、外源基因構(gòu)成物和葉的預(yù)處理對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)頻率的影響。
使用兩種根癌農(nóng)桿菌菌株AT656和EHA101pJR1。EHA101pJR1是一種二元根癌農(nóng)桿菌菌株，它含有一種解除武裝的pTiBo542質(zhì)粒和一種小雙質(zhì)粒，pTiBo542質(zhì)粒含有野生型菌株Bo542的超毒性區(qū)，而所述小雙質(zhì)粒具有在醇脫氫酶1增強(qiáng)的CaMV35S啟動(dòng)子控制下的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因基因和如在AT656中構(gòu)建的一個(gè)β-葡糖醛酸酶基因。將這兩種菌株在含有50mg/L卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上劃線接種，并于28℃培養(yǎng)過夜。
使浮萍葉在含有1％蔗糖、含有或不含有10μM吲哚乙酸(IAA)的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中生長，該濃度的吲哚乙酸足以提高增生速率。使葉在125ml燒瓶中25ml等份的培養(yǎng)基中于23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備500ml含有1％蔗糖、0.8％瓊脂、20mg/L乙酰丁香酮以及含有或不含有10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液以及乙酰丁香酮和吲哚乙酸的溶液，至合適的終濃度。由該冷卻的培養(yǎng)基倒20個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。
使用2種細(xì)菌菌株處理×2種葉生長培養(yǎng)基的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)5次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20片葉。按實(shí)施例21所述，分別重新懸浮每種菌株的細(xì)菌，用于接種。為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)制造創(chuàng)傷，然后轉(zhuǎn)移至或者AT656或者EHA101pJR1d細(xì)菌懸液，溫育10-15分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉背軸面向下轉(zhuǎn)移至如上所述含有1％蔗糖、0.8％瓊脂和100μM乙酰丁香酮以及含有或不含有10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基。
將葉于23℃下協(xié)同培養(yǎng)4天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。將來自4種處理中每種的兩個(gè)平板的葉染色以檢查GUS表達(dá)。表III顯示了GUS染色的結(jié)果。
表III培養(yǎng)基菌株 總?cè)~數(shù)總?cè)旧珨?shù)SHAT65661 12SHEHA101pJR1 62 4SH+IAAAT65666 32SH+IAAEHA101pJR1 68 2無論IAA存在與否，與EHA101pJR1協(xié)同培養(yǎng)的葉中顯示GUS表達(dá)的葉頻率低得多。用含有IAA的培養(yǎng)基檢測IAA在溫育培養(yǎng)基中的作用，得到48％的協(xié)同培養(yǎng)葉顯示出GUS表達(dá)，相比之下在無IAA的培養(yǎng)基上協(xié)同培養(yǎng)葉的20％顯示出GUS表達(dá)。
實(shí)施例26采用Lemna gibba G3的葉與細(xì)菌菌株AT656協(xié)同培養(yǎng)5個(gè)不同的時(shí)間12.5、18.5、40.5、82和112小時(shí)，以測定協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)的影響。
使浮萍葉在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃生長2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備750ml含有1％蔗糖、0.8％瓊脂、10μM吲哚乙酸和20mg/L乙酰丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。加入過濾除菌的乙酰丁香酮和吲哚乙酸的溶液，至最終的培養(yǎng)基濃度。由該冷卻的培養(yǎng)基倒30個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用細(xì)菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用5種培養(yǎng)時(shí)間處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)6次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿60片葉。按實(shí)施例21所述重新懸浮細(xì)菌，用于接種。為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)制造創(chuàng)傷。然后將葉轉(zhuǎn)移至細(xì)菌重懸浮溶液，溫育約10-15分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉背軸面向下轉(zhuǎn)移至如上所述的固體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基。協(xié)同培養(yǎng)這些葉，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。
在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，從每個(gè)培養(yǎng)皿(6個(gè)樣品)取出10片葉，進(jìn)行GUS表達(dá)的組織化學(xué)染色。表III給出了GUS染色的結(jié)果表IV時(shí)間(hr) 總?cè)~數(shù) 總?cè)旧珨?shù)12.5 61018.5 61040610827524112 6725協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間對具有GUS表達(dá)的葉頻率具有顯著作用。在40小時(shí)之前，檢測不到GUS表達(dá)。至3.5天(82小時(shí))時(shí)，容易檢測到GUS表達(dá)。較長時(shí)間的協(xié)同培養(yǎng)不顯著提高在浮萍葉中GUS表達(dá)的頻率、強(qiáng)度或組織相關(guān)模式。結(jié)論是，3.5-4天是在浮萍葉中得到最大基因轉(zhuǎn)移頻率的最短協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間。
實(shí)施例27使用在AB基本培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和甘露醇谷氨酰胺Luria液體培養(yǎng)基這三種不同的細(xì)菌培養(yǎng)基上生長的菌株AT656的細(xì)菌，來協(xié)同培養(yǎng)Lemna gibba G3的葉，Lemna gibba G3的葉在協(xié)同培養(yǎng)之前已經(jīng)用或不用吲哚乙酸、在光中和黑暗中進(jìn)行了生長，以測定這些處理對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)的影響。
在125ml燒瓶中，使Lemna gibba G3的葉在25ml等份的含有1％蔗糖和含有或不含有10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃生長2周，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備900ml含有1％蔗糖、0.8％瓊脂、含有或不含有10μM吲哚乙酸以及20mg/L乙酰丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。加入過濾除菌的乙酰丁香酮和吲哚乙酸的溶液，至合適的最終培養(yǎng)基濃度。由所述冷卻的培養(yǎng)基倒36個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。制備三種細(xì)菌培養(yǎng)基1)含有1.6％瓊脂的AB基本培養(yǎng)基(AB)、含有1.6％瓊脂的Difco。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)和含有1.6％瓊脂的甘露醇谷氨酰胺(Roberts和Kerr，Physiol.Plant Path.4，81(1974)Luria液體培養(yǎng)基(MGL；Miller，EXPERIMENTS IN MOLECULAR GENETICS433(1972))，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的硫酸卡那霉素和乙酰丁香酮的溶液，分別至50mg/L和20mg/L的最終培養(yǎng)基濃度。在這三種培養(yǎng)基上用AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用3種細(xì)菌培養(yǎng)基×2種植物培養(yǎng)基×2種光條件處理的全階乘實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(總共12種處理)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)3次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20-25片葉。按實(shí)施例21所述，分別重新懸浮每種培養(yǎng)基的細(xì)菌，用于接種。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)制造創(chuàng)傷。然后將葉轉(zhuǎn)移至細(xì)菌重懸浮溶液，溫育約10-15分鐘。接種后，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的固體Schenk和Hildebrandt協(xié)同培養(yǎng)基上。協(xié)同培養(yǎng)這些葉4天，光周期為16hr光/8hr黑暗、光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec進(jìn)行光處理，或者置于完全黑暗中進(jìn)行黑暗處理。協(xié)同培養(yǎng)后，按照Stomp等的方法(Histochemicallocalization of beta-glucoronidase，載于GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，將所有葉染色以分析GUS表達(dá)。表V給出了GUS染色的結(jié)果表V細(xì)菌 植物 光或 總?cè)~數(shù) 總?cè)旧珨?shù) 染色的培養(yǎng)基培養(yǎng)基黑暗 分生組織數(shù)DPA SHD63 60 5PDA SHL67 66 8MGL SHD66 65 7MGL SHL70 65 9ABSHD58 58 7ABSHL62 60 6DPA SH+IAAD61 61 14PDA SH+IAAL68 63 14MGL SH+IAAD62 61 11MGL SH+IAAL46 39 2ABSH+IAAD62 61 6ABSH+IAAL58 53 3細(xì)菌培養(yǎng)基對協(xié)同培養(yǎng)4天后GUS表達(dá)頻率有顯著的作用。AB培養(yǎng)基產(chǎn)生的GUS表達(dá)頻率最低，而PDA產(chǎn)生的GUS表達(dá)頻率最高。在培養(yǎng)之前使葉在吲哚乙酸上生長，提高了協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)的頻率。在未用吲哚乙酸進(jìn)行生長的葉的處理中，在協(xié)同培養(yǎng)期間存在光不顯著影響協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)的頻率，然而，在所用的葉在吲哚乙酸存在下生長的處理中，在黑暗中協(xié)同培養(yǎng)確實(shí)提高GUS表達(dá)的頻率。在含有吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上生長的所有浮萍葉中，來自PDA和MGL的平均頻率得到在分生組織中約17％的GUS表達(dá)頻率。
實(shí)施例28檢查6種協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間和在協(xié)同培養(yǎng)期間存在或缺乏光對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)的影響。
使Lemna gibba G3的葉在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上于23℃生長17天，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備150ml含有1％蔗糖、1％瓊脂、10μM吲哚乙酸和20mg/L乙酰丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮和吲哚乙酸的溶液，至最終培養(yǎng)基濃度。所述培養(yǎng)基用來倒6個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有50mg/L硫酸卡那霉素和200mg/L乙酰丁香酮的AB基本培養(yǎng)基上用根癌農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于23℃生長過夜。
使用6種協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)6次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿30片葉。按實(shí)施例21所述，重新懸浮來自一個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)菌，用于接種。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)制造創(chuàng)傷。然后將葉轉(zhuǎn)移至細(xì)菌重懸浮溶液溫育10分鐘。為了協(xié)同培養(yǎng)，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協(xié)同培養(yǎng)基上。以鋁箔包裹三個(gè)平板，以實(shí)現(xiàn)全黑暗，將平板于23℃培養(yǎng)6種時(shí)間13、23、36、49、73.5和93小時(shí)，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。協(xié)同培養(yǎng)合適的時(shí)間后，從6個(gè)平板(3個(gè)樣品黑暗和3個(gè)樣品光照)中的每個(gè)取5片葉，并按照Stomp等的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載于GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))進(jìn)行染色以分析GUS表達(dá)。
結(jié)果表明，至協(xié)同培養(yǎng)后23小時(shí)時(shí)，GUS表達(dá)變?yōu)槊黠@，僅在莖的受損端檢測到表達(dá)。至36小時(shí)時(shí)，在創(chuàng)傷周圍和莖受損端的細(xì)胞中檢測到染色?？傮w來說染色更強(qiáng)，然而在黑暗中培養(yǎng)的葉中染色強(qiáng)度的水平更高。至49小時(shí)時(shí)，在黑暗與光處理中，染色強(qiáng)度和染色模式的差異明顯。在黑暗中培養(yǎng)的葉染色更強(qiáng)，然而，在光處理和黑暗處理之間，顯示GUS表達(dá)的葉頻率和表達(dá)GUS的分生組織區(qū)的頻率的差異不顯著。至73.5小時(shí)時(shí)，在黑暗處理和光處理之間，染色模式和染色頻率沒有顯著差異，只是在黑暗處理中受傷組織的染色更普遍。至93小時(shí)(約4天)時(shí)，檢測到表達(dá)GUS的分生組織區(qū)數(shù)更多，黑暗處理一定優(yōu)于光處理。在受傷細(xì)胞中仍存在強(qiáng)染色。
實(shí)施例29使用Lemna gibba G3的葉，以測定細(xì)菌重懸浮溶液、這些溶液的滲透勢和葉創(chuàng)傷對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)頻率的影響。
使葉在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備1800ml含有1％蔗糖、0.8％未洗滌的瓊脂和20mg/L乙酰丁香酮的Schenk和Hilderbrandt(SH)培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。向高壓滅菌的冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的熱不穩(wěn)定的乙酰丁香酮溶液。所述冷卻的培養(yǎng)基用來倒72個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的AB基本培養(yǎng)基上用農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用12種細(xì)菌重懸浮溶液×2種創(chuàng)傷處理的全階乘實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(總共24種處理)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)3次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20片葉。對于2種不同的細(xì)菌重懸浮溶液1)Gamborg B5鹽、Murashige和Skoog維生素、甘氨酸(8mg/L)、天冬氨酸(266mg/L)、精氨酸(174mg/L)、谷氨酰胺(876mg/L)、酪蛋白氨基酸(500mg/L)、蔗糖(6.85％)、葡萄糖(3.6％)和乙酰丁香酮(20mg/L)，和2)含有1％蔗糖的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，每種溶液各具有5種不同的甘露醇濃度0、0.2、0.4、0.6和0.8M；測試這2種溶液的10種組合的基因轉(zhuǎn)移的效力。另外，測試其它兩種溶液3) Gamborg B5鹽、Murashige和Skoog維生素、甘氨酸(8mg/L)、天冬氨酸(266mg/L)、精氨酸(174mg/L)、谷氨酰胺(876mg/L)、酪蛋白氨基酸(500mg/L)和乙酰丁香酮(20mg/L)，和4)含有蔗糖(6.85％)、葡萄糖(3.6％)和乙酰丁香酮(20mg/L)的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基。所有細(xì)菌重懸浮溶液在使用之前均過濾除菌。在使用之前至少1小時(shí)，將來自一個(gè)AB平板的細(xì)菌重懸浮于100ml 12種重懸浮溶液中的每一種中。
測試在接種之前受傷葉的重要性。對于或者受傷或者未受傷的葉，從叢中分離出單片葉。對于受傷葉，將葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)刺傷。未受傷的葉在分離為單片葉后未接受進(jìn)一步的處理。
對于接種，將120片葉，即60片受傷葉和60片未受傷葉，浮于12種細(xì)菌重懸浮溶液的每一種上10分鐘，受傷葉與未受傷葉分別接種。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的固體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上。所有處理均在黑暗中協(xié)同培養(yǎng)4天。協(xié)同培養(yǎng)4天后，隨機(jī)挑出每種處理的2個(gè)平板，染色分析GUS表達(dá)。
結(jié)果表明，無論是何種培養(yǎng)基，0.6M甘露醇均產(chǎn)生協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)的最高頻率。較簡單的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基的配方效果很好，使用Gamborg B5鹽的更復(fù)雜的培養(yǎng)基配方效果也很好。創(chuàng)傷產(chǎn)生顯示GUS表達(dá)的葉頻率的可測量、但統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著的提高，不提高分生組織區(qū)中染色的頻率。
實(shí)施例30使用Lemna gibba G3的葉，以測定接種期間細(xì)菌濃度對協(xié)同培養(yǎng)后GUS表達(dá)的影響。
在使用之前，在125ml燒瓶中，使浮萍葉在25ml等份含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備750ml含有1％蔗糖、1％瓊脂、20mg/L乙酰丁香酮和10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。加入過濾除菌的乙酰丁香酮和吲哚乙酸的溶液，以獲得最終的培養(yǎng)基濃度。用所述冷卻的培養(yǎng)基倒30個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有1.6％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的半強(qiáng)度馬鈴薯葡萄糖瓊脂-甘露醇谷氨酰胺Luria肉湯培養(yǎng)基上，用農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用10種細(xì)菌濃度處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)3次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20片葉。按實(shí)施例21所述重新懸浮來自一個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)菌，用于接種。該細(xì)菌溶液構(gòu)成“未稀釋的”樣品，并作為連續(xù)稀釋制備以下稀釋液的起始溶液1/3、10-1、1/33、10-2、1/333、10-3、1/3333、10-4和10-5。1/3稀釋液的OD540nm為1.006，這相當(dāng)于1.6×109細(xì)菌/ml。
為了接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，并用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)制造創(chuàng)傷。然后轉(zhuǎn)移至10種不同的細(xì)菌重懸浮溶液濃度中的每一種，溫育約10-15分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉背軸面向下轉(zhuǎn)移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協(xié)同培養(yǎng)基。將葉子23℃在黑暗中協(xié)同培養(yǎng)4天。協(xié)同培養(yǎng)后，按照Stomp等的方法(Histochemical localization of beta-glucoronidase，載于GUSPROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))對所有葉進(jìn)行染色以分析GUS表達(dá)。
結(jié)果表明，在所有細(xì)菌濃度中，GUS表達(dá)頻率變化為10倍。在測試的最高細(xì)菌濃度下觀察到最高的GUS表達(dá)頻率。在高于10-3的稀釋度下，沒有檢測到GUS表達(dá)。
實(shí)施例31使用Lemna gibba G3的葉，以采用優(yōu)化的轉(zhuǎn)化方案測試4種協(xié)同培養(yǎng)基對GUS表達(dá)的影響。
使葉在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中于23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，使用4種培養(yǎng)基1)含有20μM2，4-D和0.1μM BA的Murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS)(MS1)，2)含有20μM 2，4-D和1μM BA的MS培養(yǎng)基(MS2)，3)含有1μM 2，4-D和2μM BA的MS培養(yǎng)基(MS3)，和4)Schenk和Hilderbrandt培養(yǎng)基(SH)。對于每種培養(yǎng)基，制備100ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、含適當(dāng)植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向每種冷卻的培養(yǎng)基中加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。用每種培養(yǎng)基倒4個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用細(xì)菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用4種培養(yǎng)基處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)4次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20片葉。對于接種，在使用之前1小時(shí)，將來自一個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)菌重懸浮于100ml過濾除菌的含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮的pH5.6 SH培養(yǎng)基中。為了接種，從叢中分離出單片葉，將其浮于重懸浮的細(xì)菌中8-10分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉背軸面向下轉(zhuǎn)移至如上所述的協(xié)同培養(yǎng)基(MS1、MS2、MS3、SH)上。將葉于23℃在黑暗中協(xié)同培養(yǎng)4天。協(xié)同培養(yǎng)后，對所有葉進(jìn)行染色以分析GUS表達(dá)。
在所有處理中，顯示GUS表達(dá)的葉頻率范圍為80-90％。協(xié)同培養(yǎng)基對該頻率沒有顯著影響。GUS染色的強(qiáng)度由弱至強(qiáng)。染色與根尖、莖、莖受損端和傷口、分生組織區(qū)和葉緣相聯(lián)系。
實(shí)施例32通過操作接種前的葉細(xì)胞分裂速率、農(nóng)桿菌生長的培養(yǎng)基、協(xié)同培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化，完成用農(nóng)桿菌的葉轉(zhuǎn)化，所述協(xié)同培養(yǎng)參數(shù)包括諸如乙酰丁香酮的次級代謝物、農(nóng)桿菌的濃度、接種流體的重量摩爾滲透壓濃度、協(xié)同培養(yǎng)時(shí)期的長短和協(xié)同培養(yǎng)時(shí)期的光強(qiáng)。
根據(jù)前述實(shí)施例中所述的研究，葉轉(zhuǎn)化和選擇的優(yōu)選方法如下。通常，使葉在含有提高葉增生速率的生長素的培養(yǎng)基上生長，所述生長素優(yōu)選NAA、IBA和IAA，優(yōu)選濃度范圍為0.2-1μM。使農(nóng)桿菌在無豐富營養(yǎng)補(bǔ)充物且包含諸如乙酰丁香酮的次級代謝物的培養(yǎng)基上生長，優(yōu)選的培養(yǎng)基是馬鈴薯葡萄糖瓊脂和甘露醇谷氨酰胺Luria肉湯。用接種流體的組合物測定轉(zhuǎn)化頻率，優(yōu)選的流體是補(bǔ)充0.6M甘露醇和100μM乙酰丁香酮的MS或SH基礎(chǔ)鹽。農(nóng)桿菌懸浮于該接種流體中的濃度，也影響轉(zhuǎn)化頻率，優(yōu)選的濃度約為1×109細(xì)菌/ml。接種時(shí)間可以變化，優(yōu)選的時(shí)間范圍為2-20分鐘。協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間也影響轉(zhuǎn)化頻率，優(yōu)選的時(shí)間為3-4天。在光或黑暗條件下進(jìn)行協(xié)同培養(yǎng)，優(yōu)選在黑暗(例如減弱的光)中進(jìn)行。
轉(zhuǎn)化葉的生長也取決于優(yōu)選的條件。MS和SH是優(yōu)選的培養(yǎng)基。用合適的高濃度(通常為100-500mg/L)的合適抗生素、感染組織的頻繁轉(zhuǎn)移、每2-4天轉(zhuǎn)移至含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基的優(yōu)選方法，進(jìn)行葉的感染農(nóng)桿菌的去污染。對于3-6周的初始靜息/恢復(fù)期，最好是在低光強(qiáng)下培養(yǎng)，優(yōu)選光強(qiáng)范圍為1-5μmol/m2·sec。
在可變的時(shí)間，最好是在接種后1-3周，可以開始根據(jù)在選擇劑的存在下生長進(jìn)行選擇。也優(yōu)選在降低的光水平和低選擇劑濃度下的初次選擇，光水平為1-5μmol/m2·sec，根據(jù)特定選擇劑的毒性研究確定適于選擇劑的低濃度范圍。對于硫酸卡那霉素，通常的范圍為2-10mg/L 。
實(shí)施例33用以Lemna gibba G3開發(fā)的轉(zhuǎn)化方案，對來自10個(gè)浮萍種內(nèi)的品系的葉Lemna trisulca 7315、青萍7101、Lemna japonica 7427、Lemna turionifera 6601、Lemna gibba G3、Lemna valdiviana 7002、Lemna aequnicitalis 7001、Lemna miniscula 6711、Lemna obscura7325和Spirodela punctata 7273，測試其在協(xié)同培養(yǎng)后得到GUS表達(dá)的能力。
在125ml燒瓶中，使Lemna gibba G3以外的所有浮萍品系在25ml等份含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上生長。使Lemna gibba G3在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上生長。所有浮萍培養(yǎng)物均于23℃下培養(yǎng)，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備400ml含有1％蔗糖、0.9％瓊脂和20mg/L乙酰丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基中加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，以獲得最終的培養(yǎng)基濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒10個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在與半強(qiáng)度甘露醇谷氨酰胺Luria肉湯培養(yǎng)基的半強(qiáng)度馬鈴薯葡萄糖瓊脂(這兩種培養(yǎng)基均含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素)上，用根癌農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用10種浮萍品系處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)1次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20-25片葉。按實(shí)施例21所述，重懸浮來自一個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)菌。
對于接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，用無菌解剖刀在分生組織內(nèi)制造創(chuàng)傷，將葉轉(zhuǎn)移至細(xì)菌懸浮液，溫育約10分鐘。為了協(xié)同培養(yǎng)，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的Schenk和Hildebrandt協(xié)同培養(yǎng)基上，于23℃在黑暗中培養(yǎng)4天。
協(xié)同培養(yǎng)后，將葉染色以分析GUS表達(dá)。在測試的10個(gè)品系中，8個(gè)品系顯示出GUS表達(dá)，其模式與L.gibba G3的模式相同，頻率范圍為14-80％。
實(shí)施例34采用以L.gibba G3開發(fā)的轉(zhuǎn)化方案，對來自浮萍科4個(gè)屬的20個(gè)浮萍品系，測試其在與農(nóng)桿菌菌株AT656協(xié)同培養(yǎng)后得到GUS表達(dá)的能力。這20個(gè)品系是Wolffiella lingulata品系8742和9137、Wl.neotropica品系7279和8848、Wl.oblongata品系8031和8751、無根萍品系7246和9006、Wa.australiana 7317、Wa.brasiliensis品系7397、7581和8919、Wa.columbiana品系7121和7918、Spirodela intermedia 7178、紫萍品系7960和8652、S.punctata品系7488和7776以及L.gibba G3。
在實(shí)驗(yàn)之前，所有品系均在含有1％蔗糖的pH5.6 Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上生長2周。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備1500ml含有1％蔗糖、0.8％瓊脂和20mg/L乙酰丁香酮的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌30分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基中加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，以獲得最終的培養(yǎng)基濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒60個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用細(xì)菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。為了接種，在使用前至少1小時(shí)，將來自一個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)菌重懸浮于在使用前過濾除菌、含有0.6M甘露醇、20mg/L乙酰丁香酮pH5.6的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中。
使用20種浮萍品系處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)3次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20片葉。對于接種，從叢中分離出紫萍屬和Wolfiella品系和L.gibba G3的單片葉。對于無根萍屬品系，葉以叢進(jìn)行接種，因?yàn)樗鼈兊某叽缧?，使得單片葉分離困難。為了進(jìn)行接種，將每個(gè)浮萍品系的葉浮于細(xì)菌懸浮溶液中2-5分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉從細(xì)菌溶液轉(zhuǎn)移至如上所述的固體Schenk和Hildebrandt協(xié)同培養(yǎng)基上。對于紫萍屬和Wolfiella品系和L.gibbaG3，將20片單獨(dú)的葉轉(zhuǎn)移至3個(gè)重復(fù)培養(yǎng)皿的每個(gè)中；對于無根萍屬品系，將20叢小葉轉(zhuǎn)移至3個(gè)重復(fù)平板的每個(gè)上。所有品系均于23℃在黑暗中協(xié)同培養(yǎng)4天。
協(xié)同培養(yǎng)后，將來自每個(gè)品系的2個(gè)平板染色以分析GUS表達(dá)。染色結(jié)果表明，除一個(gè)種外的所有測試種和這些種內(nèi)的大多數(shù)浮萍品系，在協(xié)同培養(yǎng)4天后均得到某些GUS表達(dá)。在測試的4個(gè)無根萍屬種中，全部顯示出不同頻率的GUS表達(dá)。Wolffia brasiliensis的3個(gè)品系表現(xiàn)出最高頻率的GUS表達(dá)，范圍為50-75％。在Wolfiella屬內(nèi)的6個(gè)品系中，GUS表達(dá)的頻率較低，范圍為5-12％。3個(gè)紫萍屬種的2個(gè)種得到10％和35％的GUS表達(dá)；第三個(gè)沒有顯示出GUS表達(dá)。用作陽性對照的Lemna gibba G3的GUS表達(dá)頻率約為50％。用愈傷組織培養(yǎng)物進(jìn)行農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)施例35用以L.gibba G3葉開發(fā)的優(yōu)化轉(zhuǎn)化方案，由Lemna gibba G3葉產(chǎn)生的I型愈傷組織用來測試其產(chǎn)生GUS表達(dá)的能力，并測試真空滲濾的作用。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、5μM 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和2μM芐基腺嘌呤(BA)的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基培養(yǎng)葉，產(chǎn)生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導(dǎo)和所有后續(xù)培養(yǎng)均于23℃下進(jìn)行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導(dǎo)4周后，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上，直至增生足夠的愈傷組織用于實(shí)驗(yàn)。
對于協(xié)同培養(yǎng)，制備400ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的最終培養(yǎng)基濃度。將冷卻的培養(yǎng)基用來倒16個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用2種真空滲濾處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)4次，每次重復(fù)有2個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿10個(gè)愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時(shí)，將細(xì)菌重懸浮于含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中。用和不用真空滲濾進(jìn)行細(xì)菌接種。不用真空滲濾時(shí)，將小塊的I型愈傷組織置于細(xì)菌溶液中10分鐘，然后吸干并轉(zhuǎn)移至如上所述的MS協(xié)同培養(yǎng)基。用真空滲濾時(shí)，將愈傷組織置于細(xì)菌溶液中，施加10英寸汞的真空10分鐘，然后將愈傷組織吸干并轉(zhuǎn)移至MS協(xié)同培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)皿在黑暗中于23℃進(jìn)行協(xié)同培養(yǎng)。
協(xié)同培養(yǎng)4、6和9天后，分別對約40、20和20塊愈傷組織染色以分析GUS表達(dá)。結(jié)果表明，愈傷組織塊顯示GUS表達(dá)的頻率不隨真空滲濾處理而變化，該頻率也不隨協(xié)同培養(yǎng)的時(shí)間而變化。在所有時(shí)間點(diǎn)不用真空滲濾時(shí)，GUS染色范圍為25-78％，用真空滲濾時(shí)，該頻率范圍為25-74％。GUS染色的強(qiáng)度從深藍(lán)色變?yōu)闇\藍(lán)色，與處理無關(guān)。
實(shí)施例36測試4種不同的協(xié)同培養(yǎng)基對與農(nóng)桿菌菌株AT656協(xié)同培養(yǎng)后I型愈傷組織的GUS表達(dá)頻率的影響。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基培養(yǎng)Lemna gibba G3的葉，產(chǎn)生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導(dǎo)和所有后續(xù)培養(yǎng)均于23℃下進(jìn)行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導(dǎo)4周后，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上，直至增生足夠的愈傷組織用于實(shí)驗(yàn)。
對于協(xié)同培養(yǎng)，測試4種培養(yǎng)基含有20μM 2，4-D和0.1μM BA的Murashige和Skook培養(yǎng)基(MS)(MS1)、含有20μM 2，4-D和1μMBA的MS培養(yǎng)基(MS2)、含有1μM 2，4-D和2μM BA的MS培養(yǎng)基(MS2)和無植物生長調(diào)節(jié)劑的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(SH)。制備50ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂的每種培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻，向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將所述培養(yǎng)基用來倒24個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用4種協(xié)同培養(yǎng)基處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)2次，每次重復(fù)有1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20個(gè)愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時(shí)，將來自一個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)菌重懸浮于含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮pH5.6的過濾除菌的SH培養(yǎng)基中。對于接種，I型愈傷組織塊置于細(xì)菌溶液中8分鐘，吸干，然后轉(zhuǎn)移至4種不同的協(xié)同培養(yǎng)基上。所有平板均在黑暗中于23℃進(jìn)行協(xié)同培養(yǎng)4天。協(xié)同培養(yǎng)后，按照Stomp等的方法(Histochemical localization ofbeta-glucoronidase，載于GUS PROTOCOLS 103-114(S.R.Gallagher編輯1991))，將所有愈傷組織染色以分析GUS表達(dá)。
協(xié)同培養(yǎng)基對顯示出GUS表達(dá)的愈傷組織塊頻率沒有顯著影響。在所有處理中，GUS表達(dá)頻率的范圍為70-85％。GUS表達(dá)的強(qiáng)度有變化，染色范圍由深藍(lán)色至淺藍(lán)色。
實(shí)施例37測試2天和4天這兩種不同的協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間對與農(nóng)桿菌菌株AT656協(xié)同培養(yǎng)后I型愈傷組織的GUS表達(dá)頻率的影響。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基培養(yǎng)Lemna gibba G3的葉，產(chǎn)生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導(dǎo)和所有后續(xù)培養(yǎng)均于23℃下進(jìn)行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導(dǎo)4周后，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上，直至增生足夠的愈傷組織用于實(shí)驗(yàn)。
對于協(xié)同培養(yǎng)，制備400ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基(MS)，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養(yǎng)基用來倒16個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用2種協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)2次，每次重復(fù)有4個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿10個(gè)愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時(shí)，將細(xì)菌重懸浮于含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中。對于接種，I型愈傷組織塊置于細(xì)菌溶液中。對于協(xié)同培養(yǎng)，將愈傷組織塊吸干，然后轉(zhuǎn)移至如上所述的MS協(xié)同培養(yǎng)基。所有平板均在黑暗中于23℃協(xié)同培養(yǎng)或者2天或者4天。協(xié)同培養(yǎng)或者2天或者4天后，將所有愈傷組織染色以分析GUS表達(dá)。
結(jié)果表明，GUS表達(dá)的頻率不隨協(xié)同培養(yǎng)時(shí)間而變化。在所有處理中，GUS表達(dá)頻率的范圍為50-70％。GUS染色的強(qiáng)度的范圍由深藍(lán)色至淺藍(lán)色。然而，在協(xié)同培養(yǎng)4天后，存在嚴(yán)重的細(xì)菌過度生長，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌覆蓋物抑制GUS染色。
實(shí)施例38用不同的基因構(gòu)成物，以用另一種農(nóng)桿菌菌株C58sZ707pBI121測試I型愈傷組織協(xié)同培養(yǎng)方案的效力。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基培養(yǎng)Lemna gibba G3的葉，產(chǎn)生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導(dǎo)和所有后續(xù)培養(yǎng)均于23℃下進(jìn)行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導(dǎo)4周后，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上，直至增生足夠的愈傷組織用于實(shí)驗(yàn)。
對于協(xié)同培養(yǎng)，制備400ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基(MS)，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養(yǎng)基用來倒16個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮、500mg/L硫酸鏈霉素、50mg/L壯觀霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農(nóng)桿菌菌株C58sZ707pBI121劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用1種細(xì)菌菌株處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)4次，每次重復(fù)有4個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿10個(gè)愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時(shí)，將來自一個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)菌重懸浮于含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中。對于接種，I型愈傷組織塊置于細(xì)菌溶液中8-10分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將愈傷組織塊吸干，然后轉(zhuǎn)移至如上所述的MS協(xié)同培養(yǎng)基。所有平板均在黑暗中于23℃協(xié)同培養(yǎng)2天。協(xié)同培養(yǎng)后，從每個(gè)重復(fù)的一個(gè)平板選擇2個(gè)愈傷組織塊(總共8塊)，將其染色以分析GUS表達(dá)。
所有愈傷組織塊均顯示出GUS表達(dá)，范圍由深藍(lán)色至淺藍(lán)色。前2周將其余的愈傷組織從MS協(xié)同培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至含有500mg/L頭孢噻肟的相同MS培養(yǎng)基，此后將這些愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有頭孢噻肟和羧芐青霉素各500mg/L的相同MS培養(yǎng)基，以根除組織的細(xì)菌污染物。將所有愈傷組織以2周的間隔，轉(zhuǎn)移至含有頭孢噻肟和羧芐青霉素的新鮮MS培養(yǎng)基。每次轉(zhuǎn)移時(shí)，將愈傷組織塊的亞樣品染色以分析GUS表達(dá)。GUS表達(dá)的頻率略有下降，但仍很高，70-95％的愈傷組織塊表現(xiàn)出某些GUS表達(dá)。目視檢查抗生素培養(yǎng)基上的愈傷組織，表明培養(yǎng)4周后沒有顯示出細(xì)菌污染物。
實(shí)施例39測試II型愈傷組織和III型愈傷組織在農(nóng)桿菌菌株AT656存在下協(xié)同培養(yǎng)后得到GUS表達(dá)的能力。
通過于23℃在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、30μM 2，4-D和0.02μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基培養(yǎng)Lemna gibba G3的葉，產(chǎn)生兩種愈傷組織類型，培養(yǎng)的光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。4周后，從原始葉分離出II型愈傷組織和III型愈傷組織，并將其轉(zhuǎn)移至含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、10μM 2，4-D和0.01μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基，用于在相同的溫度和光條件下維持愈傷組織。將愈傷組織每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上，直至增生足夠的愈傷組織用于實(shí)驗(yàn)。
在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備200ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、10μM 2，4-D和0.02μM BA的Murashige和Skook培養(yǎng)基(MS)，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養(yǎng)基用來倒8個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。
使用2種愈傷組織類型處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。接種40塊綠色愈傷組織，均勻轉(zhuǎn)移至4個(gè)培養(yǎng)皿，也接種9塊白色愈傷組織，均勻轉(zhuǎn)移至4個(gè)培養(yǎng)皿。為了接種，在使用前至少1小時(shí)，將細(xì)菌重懸浮于含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中。對于接種，將綠色愈傷組織塊和白色愈傷組織塊浸入細(xì)菌溶液中2-5分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將愈傷組織塊吸干，然后以塊轉(zhuǎn)移至如上所述的MS協(xié)同培養(yǎng)基上。所有愈傷組織均在黑暗中于23℃協(xié)同培養(yǎng)2天。
協(xié)同培養(yǎng)后，隨機(jī)挑出所有白色愈傷組織和每個(gè)平板的3個(gè)綠色愈傷組織塊，將其染色以分析GUS表達(dá)。在9個(gè)白色愈傷組織塊中，7塊表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的GUS表達(dá)。在12塊綠色愈傷組織中，6塊表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的GUS表達(dá)。
實(shí)施例40將從Lemna gibba的兩個(gè)不同的快速生長品系(品系6861和7784)和青萍的一個(gè)品系建立的I型愈傷組織與AT656協(xié)同培養(yǎng)，以測定用Lemna gibba G3所建立的方法的轉(zhuǎn)化頻率。
在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農(nóng)桿菌菌株AT656劃線接種，并于28℃生長過夜。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備200ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、10μM 2，4-D和0.02μM BA的Murashige和Skook培養(yǎng)基(MS)，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養(yǎng)基用來倒8個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。
為了接種，在接種前至少1小時(shí)，將細(xì)菌重懸浮于含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中。對于接種，將來自3個(gè)不同浮萍品系和來自L.gibba G3(陽性對照)的約10-15塊I型愈傷組織浸入細(xì)菌溶液中2-5分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將愈傷組織塊吸干，然后以塊轉(zhuǎn)移至如上所述的MS協(xié)同培養(yǎng)基的兩個(gè)平板(對于每個(gè)浮萍品系)。所有愈傷組織均在黑暗中于23℃協(xié)同培養(yǎng)2天。
協(xié)同培養(yǎng)后，隨機(jī)挑出2個(gè)Lemna gibba品系的所有愈傷組織塊和來自青萍品系的3塊愈傷組織，將其染色以分析GUS表達(dá)。在協(xié)同培養(yǎng)后2周，所有愈傷組織塊均顯示出GUS染色細(xì)胞的多個(gè)小點(diǎn)，這與成功轉(zhuǎn)化一致。用葉的選擇實(shí)施例41用Lemna gibba G3的葉，測試三種協(xié)同培養(yǎng)基對表達(dá)GUS并在卡那霉素選擇培養(yǎng)基上生長的葉的拯救的影響。
使用前，將葉在含有1％蔗糖和10μM吲哚乙酸的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)菌菌株AT656于28℃在含有20mg/L乙酰丁香酮和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上生長過夜。使用3種固體培養(yǎng)基用于協(xié)同培養(yǎng)1)含有1％蔗糖、1％瓊脂、20mg/L乙酰丁香酮和10μM吲哚乙酸的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基(SH)，2)含有3％蔗糖、1％瓊脂、20mg/L乙酰丁香酮和50μM 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的Murashige和Skook培養(yǎng)基(MS)，和3)含有3％蔗糖、1％瓊脂、20mg/L乙酰丁香酮、5μM 2，4-D、10μM萘乙酸、10μM赤霉酸和2μM芐基腺嘌呤的Murashige和Skook培養(yǎng)基。制備所述培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6(SH)或5.8(兩種MS類型)，高壓滅菌，冷卻，加入作為過濾除菌溶液的熱不穩(wěn)定組分乙酰丁香酮、吲哚乙酸和赤霉酸，將所述培養(yǎng)基注入100mm×15mm培養(yǎng)皿。每種培養(yǎng)基制備20個(gè)培養(yǎng)皿(500ml)。
使用3種協(xié)同培養(yǎng)基處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)4次，每次重復(fù)有5個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20片葉。為了接種，按實(shí)施例21所述，重懸浮來自一個(gè)培養(yǎng)皿的細(xì)菌。
對于接種，從叢中分離出單片葉，將每片葉背軸面向上，并用無菌解剖刀在分生組織區(qū)內(nèi)制造創(chuàng)傷。將葉轉(zhuǎn)移至細(xì)菌懸浮溶液中，溫育10分鐘。對于協(xié)同培養(yǎng)，將葉轉(zhuǎn)移至如上所述的三種協(xié)同培養(yǎng)基上。將所有平板在黑暗中于23℃協(xié)同培養(yǎng)5.5天。
協(xié)同培養(yǎng)5.5天后，將每種培養(yǎng)基2個(gè)平板的葉染色，以分析GUS表達(dá)。結(jié)果表明，GUS表達(dá)在很大程度上存在于在Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基協(xié)同培養(yǎng)的葉上。將來自每種培養(yǎng)基的其它18個(gè)平板(18個(gè)平板×3種培養(yǎng)基＝54個(gè)平板)的其余葉，轉(zhuǎn)移至組成相同、但無乙酰丁香酮、含有500mg/L替卡西林-克拉維酸的固體和液體培養(yǎng)基。將來自3個(gè)平板的葉轉(zhuǎn)移到含有25ml液體培養(yǎng)基的3個(gè)燒瓶中，并于23℃生長，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。將15個(gè)固體培養(yǎng)基平板上的葉分為2組1)將來自10個(gè)原始平板的葉轉(zhuǎn)移至12個(gè)新平板上，并在黑暗中溫育(12個(gè)平板)，2)將來自5個(gè)原始平板的葉轉(zhuǎn)移至6個(gè)新平板，并在低于5μmol/m2·sec的減弱光條件下培養(yǎng)。
生長11天后，取葉的亞樣品，染色以分析GUS表達(dá)。結(jié)果表明，仍存在GUS表達(dá)，該表達(dá)與光處理或培養(yǎng)基處理無關(guān)。無論是何種培養(yǎng)基，在減弱光下培養(yǎng)的所有葉均顯示出最高強(qiáng)度的GUS表達(dá)。在黑暗中培養(yǎng)的葉顯示出中等水平的GUS表達(dá)，在光下培養(yǎng)的葉顯示出非常低的水平。在Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉表現(xiàn)出最高頻率的GUS陽性組織，然而，GUS表達(dá)與新擴(kuò)增的葉無關(guān)。
在配制用于誘導(dǎo)愈傷組織的Murashige和Skook培養(yǎng)基上，染色模式限于單個(gè)細(xì)胞和非常小的區(qū)域。含有2，4-D、NAA、GA3和BA的MS培養(yǎng)基上葉表現(xiàn)出比在僅含有2，4-D的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉的染色強(qiáng)。在黑暗中，在含有調(diào)節(jié)以誘導(dǎo)愈傷組織的植物生長調(diào)節(jié)劑的兩種基于MS的培養(yǎng)基上，不發(fā)生愈傷組織形成，但在減弱光下，在含有2，4-D、NAA、GA3和BA的MS培養(yǎng)基上已經(jīng)開始形成愈傷組織。根據(jù)這些結(jié)果，從實(shí)驗(yàn)中停止使用Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上的葉。將在黑暗中MS培養(yǎng)基的所有剩余葉轉(zhuǎn)移至減弱光條件下，繼續(xù)培養(yǎng)。將所有組織保持在相同培養(yǎng)基制劑上，但轉(zhuǎn)移至含有替卡西林克拉維酸的新鮮培養(yǎng)基上，并在減弱光條件下繼續(xù)培養(yǎng)約5周。
協(xié)同培養(yǎng)后7周，將所有其余組織再次轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上，并在該新鮮培養(yǎng)基中加入或者10mg/L(約25％的組織)或者2mg/L(約75％的其余組織)的硫酸卡那霉素。1周后，將來自兩種卡那霉素處理的組織亞樣品染色，以分析GUS表達(dá)。存在三種類型的染色1)與原始協(xié)同培養(yǎng)的葉相關(guān)的染色，2)與I型愈傷組織相關(guān)的染色，和3)與III型愈傷組織相關(guān)的染色。愈傷組織染色頻率不高，估評每100個(gè)協(xié)同培養(yǎng)的葉中5-8片葉產(chǎn)生卡那霉素抗性培養(yǎng)物。在減弱光下，再繼續(xù)培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)所述組織5周。
12周后，所有其余組織均來自含有2，4-D、NAA、GA3和BA的MS培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物。將組織轉(zhuǎn)移至含有1μM 2，4-D、2μMBA、0.15g/L Gelrite、0.4g/L Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、500mg/L替卡西林-克拉維酸和10mg/L硫酸卡那霉素的Murashige和Skook培養(yǎng)基。將熱不穩(wěn)定的組分過濾除菌，并加入高壓滅菌的冷卻的培養(yǎng)基中。將由每片原始協(xié)同培養(yǎng)的葉增生的健康組織轉(zhuǎn)移至單個(gè)培養(yǎng)皿中。將所有組織于23℃下培養(yǎng)，從減弱的光強(qiáng)變?yōu)榧s40μmol/m2·sec的全光強(qiáng)，光周期為16hr光/8hr黑暗。此時(shí)，將組織的小亞樣品染色，以分析GUS表達(dá)，結(jié)果顯示出與III型愈傷組織相關(guān)的低GUS染色頻率。2周后，目視觀察明顯看出，向全光的轉(zhuǎn)移已經(jīng)增強(qiáng)了卡那霉素抗性愈傷組織與卡那霉素敏感性愈傷組織的分離。通過將所有活組織轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上，將愈傷組織在卡那霉素上的生長再繼續(xù)進(jìn)行4周(總共16周)。
在協(xié)同培養(yǎng)后16周和20周之間，建立了卡那霉素抗性愈傷組織系。通過在光下10mg/L卡那霉素上生長，特征鑒定這些致密的I型愈傷組織和III型愈傷組織培養(yǎng)物。由360個(gè)原始協(xié)同培養(yǎng)葉，增生了8個(gè)卡那霉素抗性愈傷組織系。由于研制出這8個(gè)系，將該愈傷組織的亞樣品轉(zhuǎn)移至含有0.5％蔗糖的半強(qiáng)度Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基上，以再生葉。在這8個(gè)系中，在缺乏卡那霉素的情況下，有3個(gè)再生的葉，在卡那霉素存在下不發(fā)生葉的再生。染色時(shí)，這些葉中沒有一個(gè)顯示出GUS表達(dá)。愈傷組織培養(yǎng)物的選擇和轉(zhuǎn)化葉的再生
實(shí)施例42測試I型愈傷組織在農(nóng)桿菌菌株C58sZ707pBI121存在下協(xié)同培養(yǎng)后得到GUS表達(dá)和硫酸卡那霉素抗性培養(yǎng)物的能力。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基培養(yǎng)Lemna gibba G3的葉，產(chǎn)生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導(dǎo)和所有后續(xù)培養(yǎng)均于23℃下進(jìn)行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導(dǎo)4周后，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上，直至增生足夠的愈傷組織用于實(shí)驗(yàn)。
對于協(xié)同培養(yǎng)，制備400ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基(MS)，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。將冷卻的培養(yǎng)基用來倒20個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮、500mg/L鏈霉素、50mg/L壯觀霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農(nóng)桿菌菌株C58sZ707pBI121劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用1種細(xì)菌菌株處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)1次，每次重復(fù)有20個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿約10個(gè)愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時(shí)，將細(xì)菌重懸浮于含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮pH5.6的過濾除菌的Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中。為了接種，I型愈傷組織塊置于細(xì)菌溶液中。對于協(xié)同培養(yǎng)，將愈傷組織塊吸干，然后轉(zhuǎn)移至如上所述的MS協(xié)同培養(yǎng)基。所有愈傷組織塊均在黑暗中于23℃協(xié)同培養(yǎng)2天。協(xié)同培養(yǎng)后，將一個(gè)愈傷組織塊亞樣品進(jìn)行組織化學(xué)染色以分析GUS表達(dá)。結(jié)果顯示出不同強(qiáng)度的高頻率的GUS表達(dá)。
將約200個(gè)其余愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至去污染培養(yǎng)基。為了進(jìn)行去污染，制備500ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體MS培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的含頭孢噻肟的溶液，至500mg/L的最終培養(yǎng)基濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒20個(gè)平板。將每個(gè)平皿約10個(gè)愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至20個(gè)去污染培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。所有培養(yǎng)皿均在黑暗中于23℃培養(yǎng)。每周將愈傷組織塊傳代培養(yǎng)至相同的新鮮培養(yǎng)基上，在相同條件下培養(yǎng)愈傷組織。第5周時(shí)，將愈傷組織的小亞樣品染色，以分析GUS表達(dá)。存在高頻率和不同強(qiáng)度的表達(dá)。
第5周時(shí)，將其余愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上。為了進(jìn)行選擇，制備500ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、補(bǔ)充1μM 2，4-D和2μM BA的MS，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的含頭孢噻肟、羧芐青霉素和硫酸卡那霉素的溶液，分別至500、500和2mg/L的最終培養(yǎng)基濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒20個(gè)培養(yǎng)皿。將約9-10個(gè)愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基的20個(gè)培養(yǎng)皿。所有愈傷組織均于23℃培養(yǎng)，光周期為16hr光/8hr黑暗，減弱的光強(qiáng)約為3-5μmol/m2·sec。培養(yǎng)1周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至相同的培養(yǎng)基上，只是卡那霉素濃度增加至10mg/L。在相同培養(yǎng)條件下再繼續(xù)愈傷組織培養(yǎng)1周，傳代培養(yǎng)至相同組成的新鮮培養(yǎng)基上一次。在該2周的卡那霉素選擇期結(jié)束時(shí)，約25％的原始愈傷組織塊顯示出健康的愈傷組織生長，其余的生長下降。
第7周時(shí)，將其中最健康的64個(gè)愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至固體MS，該固體MS含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D、2μM BA、羧芐青霉素和頭孢噻肟各500mg/L、以及10、20、40和80mg/L四種不同濃度的硫酸卡那霉素，制備160ml的所述培養(yǎng)基，其pH調(diào)至5.6，高壓滅菌并冷卻。加入過濾除菌的所述熱不穩(wěn)定抗生素的溶液至合適的濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒16個(gè)60mm×15mm培養(yǎng)皿。將約4個(gè)愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至每個(gè)平板上，制備具有每種卡那霉素濃度的4個(gè)平板(每個(gè)卡那霉素濃度16個(gè)愈傷組織塊)。在減弱的光下于23℃繼續(xù)培養(yǎng)。以每周1次的間隔，將4個(gè)平板，即每種卡那霉素濃度一個(gè)平板，轉(zhuǎn)移至40μmol/m2·sec的較高光強(qiáng)下。第9周時(shí)，無論是何種光條件，將所有愈傷組織轉(zhuǎn)移至組成與先前的傳代培養(yǎng)相同的新鮮培養(yǎng)基。至第12周時(shí)，將所有愈傷組織置于40μmol/m2·sec的較高光強(qiáng)下。再繼續(xù)進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)4周(至第16周)，以2周的間隔傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基。
第16周時(shí)，將其余健康愈傷組織的小亞樣品染色以分析GUS表達(dá)。所有健康的愈傷組織塊均顯示出GUS表達(dá)，整個(gè)愈傷組織塊顯示出均勻的染色，表明表達(dá)GUS的愈傷組織與非表達(dá)的愈傷組織分離。至此大多數(shù)愈傷組織死亡，但超過10％的愈傷組織顯示出不同程度的健康愈傷組織增生。鑒定出A、B和C三個(gè)愈傷組織系，將其轉(zhuǎn)移至促進(jìn)葉再生的培養(yǎng)基上。在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)一步傳代培養(yǎng)生長中的愈傷組織塊時(shí)，又鑒定出6個(gè)愈傷組織系D-I，將其轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上。在含有10mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)9個(gè)系中的8個(gè)系。例外是D系，它在40mg/L卡那霉素上生長良好。在后續(xù)的傳代培養(yǎng)時(shí)，A、B、D、F、H和I運(yùn)6個(gè)愈傷組織系繼續(xù)生長。
鑒定的9個(gè)系中的2個(gè)系繼續(xù)再生葉，染色時(shí)它們?yōu)镚US表達(dá)陽性，并且在存在或缺乏卡那霉素時(shí)容易增生。為了再生，由100ml蒸餾水與0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％Gelrite制備水瓊脂(water agar)，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌18分鐘。用該培養(yǎng)基倒10個(gè)60mm×15mm培養(yǎng)皿。將來自A、D、F、H和I系的小塊愈傷組織轉(zhuǎn)移至每種培養(yǎng)基的2個(gè)培養(yǎng)皿上。將愈傷組織于23℃培養(yǎng)，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)為40μmol/m2·sec。在水瓊脂上繼續(xù)進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)6周，以2周的間隔傳代培養(yǎng)至新鮮的水瓊脂上。至第6周時(shí)，來自所有系的愈傷組織均轉(zhuǎn)為黃色和褐色。在第6周結(jié)束時(shí)，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至或者固體或者液體、含有0.5％蔗糖和0.8％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(僅固體培養(yǎng)基用)的半強(qiáng)度Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基。4-6周后，愈傷組織已經(jīng)形成綠色的結(jié)節(jié)，這些結(jié)節(jié)分化為厚的葉樣結(jié)構(gòu)。由于葉可以脫離愈傷組織塊，因此將它們轉(zhuǎn)移至含有1％蔗糖的全強(qiáng)度Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，于23℃下培養(yǎng)，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)為40μmol/m2·sec。這些葉在液體SH培養(yǎng)基上無限增生。這些葉在含有或不含有卡那霉素的SH培養(yǎng)基上增生同樣好。在卡那霉素存在下未觀察到葉的褪色。定期取葉亞樣品，染色以分析GUS表達(dá)。所有的葉均顯示出GUS表達(dá)。
為了證實(shí)轉(zhuǎn)化，對從A系和D系分離的DNA進(jìn)行DNA雜交分析。采用Doyle和Doyle的CTAB法(Amer.J.of Botany 75，1238(1988))，從未轉(zhuǎn)化的L.gibba G3和從轉(zhuǎn)化的A系和D系制備浮萍DNA制備物。用限制性酶EcoR1和Hind III分別消化以及用這兩種酶一起消化分離的DNA，在0.7％瓊脂糖凝膠上電泳分離片段。按照Sambrook的方法將該凝膠印跡至尼龍膜上。SAMBROOK等，MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL(1989)。對于探針，用Sambrook的堿SDS法(同上)，分離來自pBI121的質(zhì)粒DNA。用限制性酶EcoR1和Hind III消化12.8kb的質(zhì)粒DNA，產(chǎn)生包含β-葡糖醛酸酶基因的3.2kb片段和含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的一個(gè)約9kb片段。從瓊脂糖凝膠上分離這兩個(gè)片段，采用Prime-a-Gene試劑盒(Promega)，通過隨機(jī)引物進(jìn)行放射標(biāo)記。采用這些探針，將攜帶未轉(zhuǎn)化浮萍DNA和或者來自轉(zhuǎn)化系A(chǔ)或者來自轉(zhuǎn)化系D的DNA的印跡，進(jìn)行雜交。在雜交箱中，于65℃過夜進(jìn)行雜交反應(yīng)。在0.1X SSC、0.1％SDS的嚴(yán)格條件下洗滌膜。然后將印跡與BIOMAX MS膠片(Kodak)接觸，并于-70℃放射自顯影曝光2天。
雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，GUS和NPTII雜交DNA存在于浮萍A系和D系中，但在來自未轉(zhuǎn)化浮萍的DNA中不存在(圖1顯示D系的結(jié)果)。轉(zhuǎn)化浮萍DNA的雙重消化于預(yù)期的分子量處產(chǎn)生雜交。單消化表明，雜交與預(yù)料之外分子量的DNA片段相關(guān)，表明，該雜交DNA不來自細(xì)菌，而是整合入植物DNA中。用標(biāo)記的毒性區(qū)探針探測相同的印跡顯示缺乏雜交，表明所述陽性GUS和NPTII信號來自植物，而非來自細(xì)菌。
實(shí)施例43測試I型愈傷組織在農(nóng)桿菌菌株C58sZ707pBI121存在下協(xié)同培養(yǎng)后得到GUS表達(dá)和硫酸卡那霉素抗性培養(yǎng)物的能力。
通過在含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、5μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基培養(yǎng)Lemna gibba G3的葉，產(chǎn)生I型愈傷組織。愈傷組織的誘導(dǎo)和所有后續(xù)培養(yǎng)均于23℃下進(jìn)行，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)約為40μmol/m2·sec。愈傷組織誘導(dǎo)4周后，在含有濃度減至1μM的2，4-D的相同培養(yǎng)基上，分別培養(yǎng)I型愈傷組織塊。將愈傷組織每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上，直至增生足夠的愈傷組織用于實(shí)驗(yàn)。
對于協(xié)同培養(yǎng)，制備750ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體Murashige和Skook培養(yǎng)基(MS)，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至20mg/L的終濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒30個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在含有20mg/L乙酰丁香酮、500mg/L鏈霉素、50mg/L壯觀霉素和50mg/L硫酸卡那霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上，用農(nóng)桿菌菌株C58sZ707pBI121劃線接種，并于28℃生長過夜。
使用1種細(xì)菌菌株處理的隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)1次，每次重復(fù)有30個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿約5個(gè)愈傷組織塊。為了接種，在使用前至少1小時(shí)，將細(xì)菌重懸浮于含有0.6M甘露醇和20mg/L乙酰丁香酮pH5.8的過濾除菌的MS培養(yǎng)基中。為了接種，將I型愈傷組織塊置于細(xì)菌溶液中。對于協(xié)同培養(yǎng)，將愈傷組織塊吸干，然后轉(zhuǎn)移至如上所述的MS協(xié)同培養(yǎng)基。所有愈傷組織塊均在黑暗中于23℃協(xié)同培養(yǎng)2天。協(xié)同培養(yǎng)后，將一個(gè)愈傷組織塊亞樣品進(jìn)行組織化學(xué)染色以分析GUS表達(dá)。結(jié)果顯示出高頻率的GUS表達(dá)。
將約150個(gè)其余愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至去污染培養(yǎng)基。為了進(jìn)行去污染，制備750ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體MS培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的含頭孢噻肟和羧芐青霉素的溶液，每種至500mg/L的最終培養(yǎng)基濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒30個(gè)平板。將約5個(gè)愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至30個(gè)去污染培養(yǎng)基培養(yǎng)皿的每個(gè)平板上。愈傷組織在黑暗中于23℃培養(yǎng)。每周將愈傷組織塊傳代培養(yǎng)至相同的新鮮培養(yǎng)基上，在相同條件下培養(yǎng)愈傷組織。
第5周時(shí)，開始選擇卡那霉素抗性愈傷組織系。為了進(jìn)行選擇，制備750ml含有3％蔗糖、0.15％Gelrite、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、1μM 2，4-D和2μM BA的固體MS培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.8，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。加入過濾除菌的含頭孢噻肟、羧芐青霉素和卡那霉素的溶液，分別至500mg/L、500mg/L和2mg/L的最終培養(yǎng)基濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒30個(gè)平板。將約5個(gè)愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至30個(gè)去污染培養(yǎng)基培養(yǎng)皿的每個(gè)平板上。愈傷組織在黑暗中于23℃培養(yǎng)。
第6周和第7周時(shí)，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有濃度增至10mg/L的卡那霉素的相同新鮮培養(yǎng)基上。于23℃在黑暗中繼續(xù)培養(yǎng)。第8周開始時(shí)，提高卡那霉素濃度。制備組成與先前的傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成相同的Murashige和Skook培養(yǎng)基，一半的培養(yǎng)基含有10mg/L的卡那霉素，而另一半含有40mg/L的卡那霉素。將約一半的其余愈傷組織轉(zhuǎn)移至每種卡那霉素濃度上。也改變培養(yǎng)的光條件。所有愈傷組織均于23℃培養(yǎng)，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)為約3-5μmol/m2·sec。愈傷組織在這些培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下維持2周。在減弱光的水平下2周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有或者10mg/L或者40mg/L卡那霉素的組成相同的新鮮培養(yǎng)基上，將光強(qiáng)升至40μmol/m2·sec。以2周傳代培養(yǎng)制度，將愈傷組織在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下維持。
至第12周時(shí)，約10％的愈傷組織保持健康和生長。在余下的15個(gè)增生愈傷組織系中，一半在10mg/L卡那霉素上生長，其余一半在40mg/L上生長。對6個(gè)系的愈傷組織小亞樣品進(jìn)行組織化學(xué)染色，表明在愈傷組織的數(shù)個(gè)區(qū)中有GUS表達(dá)。
按照實(shí)施例42的步驟進(jìn)行葉再生。當(dāng)在存在或缺乏硫酸卡那霉素的情況下生長時(shí)，葉的增生正常，沒有觀察到葉的褪色。葉也顯示出強(qiáng)的GUS組織化學(xué)染色。DNA雜交分析表明存在預(yù)期片段大小的GUS基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的DNA序列，而不存在來自vir區(qū)的DNA序列。按實(shí)施例42所述，進(jìn)行合適的限制性酶分析，結(jié)果與外源基因整合入植物基因組中的發(fā)現(xiàn)一致。
實(shí)施例44根據(jù)前述實(shí)施例，優(yōu)選以下方法，用于用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化浮萍愈傷組織，然后進(jìn)行選擇和再生轉(zhuǎn)化植株。整體來說，青萍具有特別有活力愈傷組織系統(tǒng)，這使得易于由該物種再生植株。
通常，愈傷組織轉(zhuǎn)化、選擇和葉再生依賴于一個(gè)建立的很好的愈傷組織系統(tǒng)和許多對于該方法每個(gè)步驟優(yōu)化的參數(shù)。按實(shí)施例16中所述，維持旺盛生長的愈傷組織培養(yǎng)物。按實(shí)施例32中所述，培養(yǎng)(在含有合適抗生素和100μM乙酰丁香酮的馬鈴薯葡萄糖瓊脂上)和重懸浮農(nóng)桿菌，只是優(yōu)選的重懸浮培養(yǎng)基是MS，而非SH。通過將愈傷組織塊浸入重懸浮的細(xì)菌溶液中最少3-5分鐘，接種愈傷組織塊，將其吸干以去除過多的流體，將其植于由MS組成的協(xié)同培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了為促進(jìn)愈傷組織生長而優(yōu)化的生長素和細(xì)胞分裂素和100μM乙酰丁香酮。接種的愈傷組織在黑暗中培養(yǎng)2天。
協(xié)同培養(yǎng)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有抗生素的新鮮培養(yǎng)基上，以給培養(yǎng)物去除感染的農(nóng)桿菌的污染。優(yōu)選的培養(yǎng)基是含有3％蔗糖、1μM 2，4-D、2μM BA、用0.15％Gelrite和0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂凝膠化以及抗生素的MS。愈傷組織在3-5μmol/m2·sec的減弱光下培養(yǎng)。每2-5天，最好是每3天，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至組成相同的新鮮培養(yǎng)基上?？偟幕謴?fù)期持續(xù)2-3周，3-6次傳代培養(yǎng)。
在恢復(fù)期后進(jìn)行愈傷組織選擇。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充1μM2，4-D、2μM BA、3％蔗糖、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、0.15％Gelrite和10mg/L硫酸卡那霉素的MS培養(yǎng)基上。愈傷組織在3-5μmol/m2·sec的減弱光下培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)移至組成相同的新鮮培養(yǎng)基上。愈傷組織以該方式維持4-6周。然后愈傷組織在40μmol/m2·sec的全光下在相同培養(yǎng)基上培養(yǎng)。當(dāng)愈傷組織在選擇劑上表現(xiàn)出旺盛的生長，則認(rèn)為選擇是完全的。
將在選擇劑存在下在愈傷組織維持培養(yǎng)基顯示出旺盛生長的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基上，以形成器官和產(chǎn)生植株。一般而言，浮萍在貧乏的培養(yǎng)基上再生。對于青萍，該培養(yǎng)基是含有1％蔗糖的半強(qiáng)度SH培養(yǎng)基；對于L.gibba，該培養(yǎng)基是水瓊脂。通常，選擇劑不存在于再生培養(yǎng)基中。愈傷組織在全光下在再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-4周直至出現(xiàn)葉。將完全器官發(fā)生的葉轉(zhuǎn)移至含有1-3％蔗糖、無植物生長調(diào)節(jié)劑的液體SH培養(yǎng)基中，在全光下培養(yǎng)，以進(jìn)一步進(jìn)行克隆增殖。
實(shí)施例45測試光強(qiáng)和硫酸卡那霉素濃度對青萍愈傷組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化頻率的影響。
在愈傷組織誘導(dǎo)之前，在含有1％蔗糖的液體Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基中培養(yǎng)青萍的葉，光周期為16hr光/8hr黑暗，光強(qiáng)為約40μmol/m2·sec。用青萍品系8744的葉，按實(shí)施例14中所述完成愈傷組織的誘導(dǎo)。在協(xié)同培養(yǎng)之前，愈傷組織在含有3％蔗糖、1μM 2，4-D、2μM BA、0.4％ Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％ Gelrite的MS培養(yǎng)基上維持13周。在此13周的協(xié)同培養(yǎng)期間，將愈傷組織每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基上。
帶有來自如實(shí)施例21中所述的菌株AT656的含T-DNA雙質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株C58sz707，在含有50mg/L硫酸卡那霉素、50mg/L壯觀霉素和500mg/L鏈霉素的PDA上于28℃培養(yǎng)2天。對于協(xié)同培養(yǎng)，制備含有3％蔗糖、1μM 2，4-D、2μM BA、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％Gelrite的固體MS培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘并冷卻。向冷卻的培養(yǎng)基加入過濾除菌的乙酰丁香酮溶液，至100μM的終濃度。用冷卻的培養(yǎng)基倒8個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。
在接種之前至少1小時(shí)，將農(nóng)桿菌重懸浮于過濾除菌的含有0.6M甘露醇和100mg/L乙酰丁香酮的pH5.6 MS培養(yǎng)基中，以用于接種。為了接種，將約160塊I型愈傷組織浸入細(xì)菌溶液中2-5分鐘，每批20塊愈傷組織。對于協(xié)同培養(yǎng)，將愈傷組織塊吸干，然后作為塊轉(zhuǎn)移至協(xié)同培養(yǎng)基，每個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿20個(gè)愈傷組織塊。所有接種的愈傷組織均在23℃于黑暗中培養(yǎng)2天。
對于選擇，制備200ml含有1μM 2，4-D、1μM BA、3％蔗糖、500mg/L羧芐青霉素、500mg/L頭孢噻肟、10mg/L硫酸卡那霉素、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％Gelrite的MS培養(yǎng)基，將pH調(diào)至5.6，于121℃高壓滅菌20分鐘，倒8個(gè)100mm×15mm培養(yǎng)皿。在倒平板之前，將抗生素作為過濾除菌的溶液加入冷卻的高壓滅菌的培養(yǎng)基中。將協(xié)同培養(yǎng)的愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿20個(gè)愈傷組織塊。在低于5μmol/m2·sec的減弱光下培養(yǎng)80個(gè)愈傷組織塊(4個(gè)平板)，將其它80個(gè)愈傷組織塊(4個(gè)平板)轉(zhuǎn)移至40μmol/m2·sec的較高光強(qiáng)下。每周將愈傷組織傳代培養(yǎng)至新鮮的含抗生素的培養(yǎng)基上，進(jìn)行3周。第4周時(shí)，將來自每種光處理的一半(40個(gè)愈傷組織塊)愈傷組織轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中，卡那霉素濃度從10mg/L升至40mg/L。將其余40個(gè)愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至維持10mg/L原始卡那霉素濃度的新鮮培養(yǎng)基。在相同的減弱光或全光條件下和低或高卡那霉素濃度下的培養(yǎng)，再繼續(xù)進(jìn)行2周，每周進(jìn)行傳代培養(yǎng)。接種后6周時(shí)，將所有樣品轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基，并在全光強(qiáng)下培養(yǎng)。從此時(shí)開始，以2周的間隔進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
在卡那霉素上培養(yǎng)12周后，將旺盛生長的愈傷組織轉(zhuǎn)移至新鮮的再生培養(yǎng)基上。葉再生培養(yǎng)基由含有1％蔗糖、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％Gelrite的半強(qiáng)度Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基組成。每2周將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至組成相同的新鮮培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基后3-6周，從愈傷組織塊再生出葉。
由該實(shí)驗(yàn)再生出兩個(gè)轉(zhuǎn)化的克隆葉系。這兩個(gè)系均顯示出GUS組織化學(xué)染色，用甲基傘形酮-葡糖醛酸(MUG)作為底物，在溶液測定(soluble assay)中，具有不同水平的GUS酶活性(可提取蛋白的0.31％和0.14％)，用ELISA測定測量，具有可檢測水平的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。DNA雜交分析證實(shí)在高分子量DNA中存在外源DNA序列，該高分子量DNA用合適的限制性酶消化時(shí)，產(chǎn)生預(yù)期的片段大小。用代表原始農(nóng)桿菌毒性區(qū)的DNA序列重新探測剝離的印跡(strippedblot)，不能得到可檢測的雜交。
實(shí)施例46用來自品系8627的青萍愈傷組織培養(yǎng)物，測試青萍基因型對轉(zhuǎn)化葉拯救頻率的影響。
按實(shí)施例45所述，進(jìn)行接種之前的愈傷組織維持、用于接種的細(xì)菌菌株、細(xì)菌生長、細(xì)菌重懸浮、愈傷組織接種步驟和在黑暗中協(xié)同培養(yǎng)2天。
對于卡那霉素選擇，在協(xié)同培養(yǎng)后，將180個(gè)愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至含有1μM 2，4-D、2μM BA、500mg/L羧芐青霉素、500mg/L頭孢噻肟和10mg/L硫酸卡那霉素的MS培養(yǎng)基。所有愈傷組織均在低于5μmol/m2·sec的減弱光水平下培養(yǎng)。接種后第2周時(shí)，一半的愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至新鮮的選擇培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中，卡那霉素濃度從10mg/L升至40mg/L，將其余一半愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至含有10mg/L硫酸卡那霉素的新鮮選擇培養(yǎng)基。繼續(xù)每周進(jìn)行傳代培養(yǎng)至接種后第5周，此時(shí)，每2周進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
為了再生轉(zhuǎn)化葉，將在卡那霉素上生長旺盛、且于12周后用組織化學(xué)染色顯示出GUS表達(dá)的愈傷組織系，轉(zhuǎn)移至含有半強(qiáng)度Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基的葉再生培養(yǎng)基，所述半強(qiáng)度Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基含有1％蔗糖、0.4％Difco細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂和0.15％Gelrite。3-4周后，在再生培養(yǎng)基上再生出葉。再生的葉在含有1％蔗糖的SH培養(yǎng)基上維持。
在該實(shí)驗(yàn)中再生出3個(gè)轉(zhuǎn)化的克隆葉系。所有3個(gè)系均顯示出GUS組織化學(xué)染色，通過MUG測定測量，顯示出可變水平的GUS活性(可提取蛋白的0.2-0.3％)，而在ELISA測定中測量，顯示出可檢測水平的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。用DNA雜交分析證實(shí)，外源DNA序列轉(zhuǎn)化并整合入浮萍DNA中。
實(shí)施例47也測試培養(yǎng)基組成對由青萍愈傷組織培養(yǎng)物再生葉的影響。測試了7種培養(yǎng)基配方(1)水瓊脂，(2)含有100μM硫酸腺嘌呤的水瓊脂，(3)含有10μM BA的水瓊脂，(4)含有10μM BA和1μM IBA的水瓊脂，(5)半強(qiáng)度SH，(6)含有10μM BA的半強(qiáng)度SH，和(7)含有10μMBA和1μM IBA的半強(qiáng)度SH。該實(shí)驗(yàn)使用來自按實(shí)施例12的先前愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中增生的品系8744和品系8627的愈傷組織培養(yǎng)物。愈傷組織在7種不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周，持續(xù)觀察葉的發(fā)育。
僅在半強(qiáng)度SH處理上得到葉再生。當(dāng)半強(qiáng)度SH僅補(bǔ)充10μMBA時(shí)，愈傷組織的生長比植于無植物生長調(diào)節(jié)劑的半強(qiáng)度SH上的愈傷組織生長快，然而，再生的時(shí)間比在半強(qiáng)度SH上的時(shí)間長。將IBA加入培養(yǎng)基中，對愈傷組織再生葉的時(shí)間和能力沒有影響。
實(shí)施例48用人類β-血紅蛋白基因構(gòu)成物和一種P450氧化酶構(gòu)成物，測試用于哺乳動(dòng)物基因表達(dá)的浮萍系統(tǒng)的效率。
使用兩種農(nóng)桿菌菌株，接種青萍品系8627的I型愈傷組織。對于β-血紅蛋白轉(zhuǎn)化，使用攜帶pGV3850、pTVK291、pSLD343種質(zhì)粒的菌株C58 C1。pTKV291含有來自pTiBo542的超毒性G基因。pSLD34是一種農(nóng)桿菌雙質(zhì)粒，衍生自pBIN19，包含CaMV35S啟動(dòng)子控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和由超級mac啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人類β-血紅蛋白基因。
對于P450氧化酶轉(zhuǎn)化，使用攜帶pGV3850、pTVK291和pSLD34三種質(zhì)粒的菌株C58 C1。所述T-DNA載于雙質(zhì)粒pSLD35上，該質(zhì)粒與pSLD34結(jié)構(gòu)類似，除了pSLD35不具有β-血紅蛋白基因，卻具有編碼人P450氧化酶、氧化還原酶和細(xì)胞色素B5三種蛋白的DNA序列。每個(gè)基因都由一個(gè)超級mac啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。pSLD35質(zhì)粒包含潮霉素和卡那霉素選擇標(biāo)記基因。
使用具有2種細(xì)菌菌株×2種早期選擇期間的光強(qiáng)×2種選擇期間的卡那霉素濃度的基本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(總共8種處理)的7個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)設(shè)計(jì)重復(fù)3次，每次重復(fù)有2個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿10個(gè)愈傷組織塊。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用由青萍品系8627和8744和Lemna gibba品系G3產(chǎn)生的愈傷組織培養(yǎng)物。按實(shí)施例45所述，進(jìn)行接種之前的愈傷組織維持、用于接種的細(xì)菌菌株、細(xì)菌生長、細(xì)菌重懸浮、愈傷組織接種步驟和在黑暗中協(xié)同培養(yǎng)2天，只是在接種之前，細(xì)菌在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L慶大霉素、100mg/L羧芐青霉素和100μM乙酰丁香酮的PDA上生長。
對于卡那霉素選擇，在協(xié)同培養(yǎng)后，將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至含有1μM 2，4-D、2μM BA、500mg/L羧芐青霉素、500mg/L頭孢噻肟和10mg/L和40mg/L兩種濃度的卡那霉素的MS培養(yǎng)基。在培養(yǎng)期間，將愈傷組織培養(yǎng)物再分為，在每種卡那霉素濃度上，一半的愈傷組織塊在減弱光下培養(yǎng)，而另一半在全光下培養(yǎng)。在協(xié)同培養(yǎng)后前4周內(nèi)，以1周間隔，將愈傷組織傳代培養(yǎng)至組成相同的新鮮培養(yǎng)基。第5周時(shí)，所有培養(yǎng)物均在全光強(qiáng)下再培養(yǎng)6周，每2周傳代培養(yǎng)至新鮮培養(yǎng)基。
按實(shí)施例42和實(shí)施例47中所述，用適于由L.gibba G3或青萍品系再生葉的培養(yǎng)基，完成葉再生。3-4周后，在再生培養(yǎng)基上再生出葉。再生的葉在含有1％蔗糖的SH培養(yǎng)基上維持。
在所有實(shí)驗(yàn)中，拯救了超過20％的轉(zhuǎn)化克隆葉系。與40mg/L相反，用10mg/L卡那霉素作為選擇濃度，發(fā)現(xiàn)更多的系。在選擇期間減弱的光強(qiáng)證明是有利的。所有系均顯示出在卡那霉素上的旺盛的愈傷組織生長，通過ELISA實(shí)驗(yàn)測定，具有可檢測水平和可變水平的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶蛋白。通過本領(lǐng)域已知的方法，例如分別用DNA雜交、RNA雜交和蛋白雜交，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的浮萍植株中檢測出存在P450氧化酶和β-血紅蛋白DNA、RNA和/或蛋白。
本說明書中提及的所有出版物和專利申請均代表本發(fā)明所涉及領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有出版物和專利申請均通過引用結(jié)合到本文中，其程度與單個(gè)出版物或?qū)＠暾埦唧w和單獨(dú)地表示結(jié)合到本文中中的程度相同。
盡管為了清楚除地理解，通過說明和實(shí)施例在某些細(xì)節(jié)中描述了前述的發(fā)明，但很明顯，可以在所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)實(shí)施某些改變和修改。
權(quán)利要求
1.用目的核苷酸序列轉(zhuǎn)化浮萍的方法，其中所述核苷酸序列包含至少一個(gè)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含一個(gè)賦予對選擇劑抗性的基因，所述方法包括以下步驟(a)提供浮萍組織靶，所述浮萍組織的細(xì)胞包括細(xì)胞壁；和(b)以足以穿透細(xì)胞壁并將所述核苷酸序列沉積在所述組織的細(xì)胞內(nèi)的速度，將所述核苷酸序列發(fā)射至所述浮萍組織靶，藉此產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的組織，其中所述核苷酸序列由微彈攜帶；并且其中通過將所述微彈發(fā)射至所述組織，而將所述核苷酸發(fā)射至所述組織。
2.按照權(quán)利要求1的方法，還包括用所述選擇劑培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的組織的步驟。
3.按照權(quán)利要求2的方法，還包括再生轉(zhuǎn)化的浮萍植株的步驟。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述組織是愈傷組織。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述組織是分生組織。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述組織是葉組織。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述浮萍組織選自Spirodela、Wolffia、Wolfiella和浮萍屬。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述浮萍組織選自青萍、Lemnaminiscula和Lemna gibba的一個(gè)物種。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述微彈包括金屬粒子。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述微彈包括直徑為約0.5微米至約3微米的金屬粒子。
11.按照權(quán)利要求1的方法，其中提供許多微彈，每個(gè)微彈均具有固定其中的所述核苷酸序列，并且每個(gè)微彈均被發(fā)射至植物組織靶上。
12.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷酸序列編碼選自以下的一種蛋白或肽胰島素、生長激素、α-干擾素、β-葡萄糖腦苷脂酶、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、leptin和血清白蛋白。
13.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述核苷酸序列編碼一種多體蛋白的至少一個(gè)蛋白或肽亞基。
14.用目的核苷酸序列轉(zhuǎn)化浮萍的方法，所述方法包括以下步驟(a)用包含一種載體的農(nóng)桿菌接種浮萍植物組織，所述載體包含所述核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含至少一個(gè)表達(dá)盒，而所述表達(dá)盒包含一種賦予對選擇劑抗性的基因；和(b)將所述組織與農(nóng)桿菌協(xié)同培養(yǎng)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的組織。
15.按照權(quán)利要求14的方法，還包括在包含足以抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化組織的步驟。
16.按照權(quán)利要求14的方法，還包括在包含所述選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化組織的步驟。
17.按照權(quán)利要求16的方法，還包括從所述轉(zhuǎn)化組織再生轉(zhuǎn)化浮萍植株的步驟。
18.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述組織是愈傷組織。
19.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述組織是分生組織。
20.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述組織是葉組織。
21.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述浮萍組織選自Spirodela、Wolffia、Wolfiella和浮萍屬。
22.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述浮萍組織選自浮萍屬。
23.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述浮萍組織選自青萍、Lemna miniscula和Lemna gibba的一個(gè)物種。
24.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述農(nóng)桿菌是根癌農(nóng)桿菌。
25.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述農(nóng)桿菌是毛根農(nóng)桿菌。
26.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述載體是超級雙載體。
27.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述載體是C58衍生載體。
28.按照權(quán)利要求14的方法，其中賦予對選擇劑抗性的所述基因選自neo、bar、pat、ALS、HPH、HYG、EPSP和Hml。
29.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述核苷酸序列包含兩個(gè)目的基因。
30.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述核苷酸序列編碼選自以下的一種蛋白或肽胰島素、生長激素、α-干擾素、β-葡萄糖腦苷脂酶、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、leptin和血清白蛋白。
31.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述核苷酸序列編碼選自以下的一種多體蛋白的至少一個(gè)蛋白或肽亞基血紅蛋白、膠原蛋白、P450氧化酶和單克隆抗體。
32.用目的核苷酸序列轉(zhuǎn)化浮萍細(xì)胞的方法，其中所述核苷酸序列包括至少一個(gè)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含賦予對選擇劑抗性的一種基因，所述方法包括通過電穿孔將所述核苷酸序列引入浮萍細(xì)胞的步驟。
33.按照權(quán)利要求3的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的浮萍組織培養(yǎng)物。
34.按照權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的浮萍組織培養(yǎng)物。
35.按照權(quán)利要求3的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的浮萍植株。
36.按照權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的浮萍植株。
37.按照權(quán)利要求32的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的浮萍植株。
38.轉(zhuǎn)化的浮萍植株，包含摻入其基因組中的一種異源目的核酸。
39.按照權(quán)利要求38的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述目的核酸的側(cè)翼為摻入其基因組中的T-DNA邊界序列。
40.按照權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述浮萍植株包含少于5個(gè)拷貝的所述異源目的核酸。
41.按照權(quán)利要求39或39的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述浮萍植株選自Spirodela、Wolffia、Wolfiella和浮萍屬。
42.按照權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述其中所述浮萍植株選自浮萍屬。
43.按照權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述浮萍植株選自青萍、Lemna miniscula和Lemna gibba的一個(gè)物種。
44.按照權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述所述核酸包含至少一個(gè)表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含一種賦予對選擇劑抗性的基因。
45.按照權(quán)利要求44的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述賦予對選擇劑抗性的所述基因選自neo、bar、pat、ALS、HPH、HYG、EPSP和Hml。
46.按照權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述核酸包含兩個(gè)目的基因。
47.按照權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述核酸編碼選自以下的一種蛋白或肽胰島素、生長激素、α-干擾素、β-葡萄糖腦苷脂酶、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、leptin和血清白蛋白。
48.按照權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)化的浮萍植株，其中所述核酸編碼選自以下的一種多體蛋白的至少一個(gè)蛋白或肽亞基血紅蛋白、膠原蛋白、P450氧化酶和單克隆抗體。
49.生產(chǎn)重組蛋白或肽的方法，包括以下步驟(a)培養(yǎng)表達(dá)至少一種異源蛋白或肽的轉(zhuǎn)化浮萍植株；和(b)從浮萍培養(yǎng)物中收集至少一種蛋白或肽。
50.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述轉(zhuǎn)化浮萍植株在廢水中生長。
51.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述轉(zhuǎn)化浮萍植株表達(dá)并裝配一種多體蛋白的所有亞基。
52.按照權(quán)利要求51的方法，其中所述多體蛋白選自膠原蛋白、血紅蛋白、P450氧化酶和單克隆抗體。
53.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述轉(zhuǎn)化浮萍植株在生物反應(yīng)器容器中生長。
54.按照權(quán)利要求49的方法，其中生產(chǎn)一種重組蛋白或肽。
55.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述至少一種異源蛋白或肽是一種治療蛋白或肽。
56.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述至少一種蛋白或肽選自胰島素、生長激素、α-干擾素、β-葡萄糖腦苷脂酶、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白、p53蛋白、制管張素、leptin和血清白蛋白。
57.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述至少一種異源蛋白或肽是一種酶。
60.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述至少一種異源蛋白或肽從所述轉(zhuǎn)化浮萍植株分泌。
58.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述浮萍植株選自Spirodela、Wolffia、Wolfiella和浮萍屬。
59.按照權(quán)利要求49的方法，其中所述浮萍植株選自青萍、Lemna miniscula和Lemna gibba的一個(gè)物種。
全文摘要
提供用于有效轉(zhuǎn)化浮萍的方法和組合物。最好是所述方法包括通過或者彈道轟擊或農(nóng)桿菌進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。以該方式,可以將任何目的基因或核酸引入浮萍植株并在其中表達(dá)。亦提供轉(zhuǎn)化的浮萍植株、細(xì)胞、組織。亦公開了轉(zhuǎn)化的浮萍植物組織培養(yǎng)物和由轉(zhuǎn)化的浮萍植株生產(chǎn)重組蛋白和肽的方法。
文檔編號C12P21/00GK1272762SQ98806897
公開日2000年11月8日 申請日期1998年8月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月12日
發(fā)明者A·M·斯托普, N·拉漢達(dá)里 申請人:北卡羅萊納州立大學(xué)