專利名稱：真核細(xì)胞和反轉(zhuǎn)錄病毒反義起始元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實現(xiàn)部分得到國立衛(wèi)生研究院授予的補助金R29AI38114和RO1MH47225的政府資助。政府在本發(fā)明中享有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及真核細(xì)胞中基因表達的調(diào)節(jié)。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的天然的反義RNA負(fù)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用的基因元件提供了產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄本的機制。
背景和相關(guān)領(lǐng)域描述啟動真核細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄的一般機理通常涉及幾種因子之間的相互作用，這些因子包括啟動子(啟動元件)、增強子、DNA結(jié)合蛋白和包含RNA聚合酶和伴隨轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。通常，富含AT的區(qū)域TATA基序位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游，它是許多啟動子啟動RNA聚合酶有效和準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄所必需的。在有或沒有TATA盒的啟動子中，啟動元件可使轉(zhuǎn)錄因子取向于RNA聚合酶II。然而，轉(zhuǎn)錄的啟動速率由識別轉(zhuǎn)錄復(fù)合物啟動位點附近的啟動子/增強子元件的一個或多個DNA結(jié)合蛋白來決定。據(jù)推斷，DNA結(jié)合蛋白能影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的啟動或復(fù)合物一旦啟動后延伸的趨勢。
人免疫缺陷病毒(HIV)的5′長末端重復(fù)序列(LTR)是一種原型增強子-啟動子單元，它含有一個標(biāo)準(zhǔn)的TATA盒，一個起始位點(Rittner等人，1995，J.Mol.Biol.248562-580)、許多病毒和細(xì)胞基因中常見的上游元件(例如Sp1和NF-κB)(它們受病毒和細(xì)胞DNA結(jié)合蛋白的影響(例如參見，Jones，1989年，New Biologist 1127-135中綜述))。從HIV雙鏈中間產(chǎn)物以及位于5′LTR中的HIV啟動子，從負(fù)鏈(也稱為“模板”)DNA(見本文的定義部分)轉(zhuǎn)錄出正鏈極性mRNA。然后，mRNA依賴于轉(zhuǎn)錄本翻譯成一個或多個病毒蛋白，它們包括Gag，Pol，Vif，Tat，Vpu，Vpr，Rev，Env和Nef。
HIV啟動子的有效轉(zhuǎn)錄取決于大幅度增加病毒mRNA水平的激活轉(zhuǎn)錄的Tat的存在。在沒有Tat存在時，從負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄出的主要是短的mRNA轉(zhuǎn)錄本。這些短的轉(zhuǎn)錄本終止于順式作用元件(反式激活應(yīng)答區(qū)域)附近(TAR；Selby等人，1989，GenesDev.3547-558)。另外，在Tat不存在時，轉(zhuǎn)錄出的是低基礎(chǔ)水平的病毒mRNA。Tat的功能是通過位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游的TAR來介導(dǎo)的。在轉(zhuǎn)錄本上的TAR區(qū)域折疊成在能量上有利的RNA次級結(jié)構(gòu)或RNA-干(stem)環(huán)結(jié)構(gòu)(見

圖1)，作為Tat的結(jié)合位點。已經(jīng)證實，在Tat不存在時，已經(jīng)啟動了轉(zhuǎn)錄的大部分聚合酶提前從模板上脫離下來。在Tat結(jié)合TAR后，Tat獨立于其它啟動子元件起刺激延伸的作用(Rittner等人，1995，同上)。已經(jīng)報道，起始元件(INR)是哺乳動物細(xì)胞中缺乏TATA盒時使轉(zhuǎn)錄起始有效所必需的(Javahery等人，1994，Mol.Cell Biol.14116-127；Smale和Baltimore，1989，Cell 57103-113)。為何HIV LTR的基礎(chǔ)性(獨立于Tat)轉(zhuǎn)錄在體內(nèi)較低，是否有影響HIV5′LTR的某種阻遏機制存在，這些仍不能確定。
提出的一種可能是，病毒DNA的正鏈含有一個長的開放讀框(ORF)，它位于互補于env基因序列的基因組區(qū)域中，它可能編碼了一個病毒蛋白(Miller，1988，Science2391420-142)。然而，還不清楚這種可能是否能通過(例如)證實有推定蛋白或其各自mRNA而得到確認(rèn)。Michael等人進一步評價了HIV中發(fā)生雙向轉(zhuǎn)錄的可能性(1994，J.Virol.979-87)。發(fā)現(xiàn)HIV 3′LTRU3區(qū)域中的一個弱的負(fù)鏈啟動子負(fù)責(zé)產(chǎn)生負(fù)鏈極性的RNA轉(zhuǎn)錄本。從3′LTR中的弱負(fù)鏈啟動子產(chǎn)生的這種RNA轉(zhuǎn)錄本在HIV生命周期中起何作用(如果有的話)仍有待闡明。
調(diào)節(jié)病毒或細(xì)胞基因表達的通道(無論是涉及轉(zhuǎn)錄還是翻譯)是本發(fā)明的目標(biāo)。更具體地說，調(diào)節(jié)工業(yè)或醫(yī)藥應(yīng)用的重組蛋白的產(chǎn)生是生物技術(shù)工業(yè)的共同目的。以HIV為例，已經(jīng)利用反式激活功能來開發(fā)HIV特異的、靈敏的生物試驗(Felber和Pavlakis，1988，Science 239184-7)，并用來評價藥物對HIV感染和復(fù)制能力的影響(例如參見，Schwartz等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 867200-7203)。已經(jīng)嘗試了幾種方法來反義抑制細(xì)胞或病毒基因表達。例如，反義抑制HIV復(fù)制已經(jīng)在抑制一些病毒功能方面獲得了不同程度的成功。在HIV中反義抑制的靶向部位包括LTR、U5區(qū)域、U3區(qū)域、R區(qū)域、引物結(jié)合位點區(qū)域、AUG起始密碼子區(qū)域、Poly P區(qū)域、RNA剪接位點、前導(dǎo)區(qū)、tat剪接位點、rev剪接位點和帽(cap)部位(例如參見美國專利No.5,580,761，授予Greatbatch等人)。還提出，與TAR干-環(huán)的二級結(jié)構(gòu)反義的合成寡核苷酸可能能破壞TAR干-環(huán)(Vickers等人，1991，Nucleic Acids Res.193359-3368；美國專利No.5,512,438，授予Eckers)，或與tat mRNA反義(美國專利No.5,51,438，授予Eckers)的合成寡核苷酸最終能破壞Tat和TAR結(jié)合所介導(dǎo)的反式激活。
因此，現(xiàn)在已經(jīng)需要并仍繼續(xù)需要在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平上起有效調(diào)節(jié)基因表達作用的反義分子。理想的是，可以采用這種方法來進行反義治療，從而“翻轉(zhuǎn)”哺乳動物細(xì)胞中固有的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的控制機制。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)一種真核細(xì)胞內(nèi)源的在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平調(diào)節(jié)基因表達的天然新機制。本發(fā)明公開的機制是一種天然的反義RNA調(diào)節(jié)系統(tǒng)，該系統(tǒng)的一個關(guān)鍵組分包含反義起始序列(antisense initiator sequence，aINR)。
aINR使RNA聚合酶II的取向能產(chǎn)生一個或多個反義轉(zhuǎn)錄本；即利用正鏈DNA作為模板引發(fā)負(fù)鏈極性RNA轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，aINR啟動產(chǎn)生的天然反義RNA轉(zhuǎn)錄本起結(jié)合互補有義RNA轉(zhuǎn)錄本形成雙鏈體的作用。產(chǎn)生的雙向轉(zhuǎn)錄以及該RNA雙鏈體的形成可通過抑制有義mRNA轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)基因表達。RNA雙鏈體的形成所介導(dǎo)的基因表達調(diào)節(jié)機制是使RNA聚合酶去穩(wěn)定，從而促進有義mRNA轉(zhuǎn)錄的提前終止。因此，該機制可能導(dǎo)致抑制轉(zhuǎn)錄延伸或使負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄出短(小于全長)的mRNA或RNA有義轉(zhuǎn)錄本。
在注意到aINR是雙鏈的同時，aINR的7個堿基共有序列(5′到3′)是G/A G/A A/TN T G G/A，其中第一個核苷酸可以是G或A；第二個核苷酸可以是G或A；第三個核苷酸可以是A或T；第四個核苷酸可以是G、A、T或C；第五個核苷酸可以是T；第六個核苷酸可以是G；第七個核苷酸可以是G或A。在本發(fā)明的另一個實例中，aINR的3′端可包括一個額外的核苷酸，第八個核苷酸，它包括G或A。
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)基因表達的組合物和方法。構(gòu)建一個載體，它含有至少一個aINR拷貝，該aINR在至少一個拷貝的核酸分子(靶基因的編碼鏈)的下游。aINR的下游可以放置一些調(diào)控元件(例如任一方向的CAAT；或相對于aINR共有序列反向的TATA盒)。然后將所得重組載體導(dǎo)入表達待調(diào)節(jié)靶基因的細(xì)胞中。一旦進入細(xì)胞，重組載體的aINR就啟動RNA聚合酶II產(chǎn)生反義RNA轉(zhuǎn)錄本。然后，該反義RNA轉(zhuǎn)錄本通過和靶基因轉(zhuǎn)錄的有義mRNA形成RNA雙鏈體，調(diào)節(jié)靶基因的表達。由于靶基因的轉(zhuǎn)錄受抑制，因此只有很少(如果有的話)的全長有義mRNA轉(zhuǎn)錄本能被翻譯成該靶基因編碼的蛋白。因此，這種調(diào)節(jié)能導(dǎo)致受處理細(xì)胞產(chǎn)生這種蛋白的量減少。
附圖簡述圖1示出了HIV-1 TAR和毗鄰區(qū)域，圖中用箭頭指出了HIV-1反義啟動序列(aINR)(SEQ ID NO2)的位置。
圖2是HIV-1 LTR的示意圖，它顯示了各種調(diào)控元件、雙向轉(zhuǎn)錄、以及HIV aINR產(chǎn)生的反義轉(zhuǎn)錄本可能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的一種或多種機制。
圖3是體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的2％瓊脂糖凝膠，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后在初始反轉(zhuǎn)錄步驟中用生物素化有義引物(組A，泳道1-7)或反義引物(組B，泳道1-7)雜交，然后進行聚合酶鏈反應(yīng)。組A和B的泳道1代表陽性轉(zhuǎn)錄對照(模板+聚合酶)；而泳道2代表陰性轉(zhuǎn)錄對照(模板，沒有聚合酶)。組A的泳道3和4以及組B的泳道3和5代表在HIV aINRRNA存在(分別為10x和5x)時的轉(zhuǎn)錄；而組A和B的泳道6和7代表在HIV反義TARRNA存在(分別為10X和5X)時的轉(zhuǎn)錄。圖中還示出了只有引物(組A泳道5和組B泳道4)以及用作參照的大小標(biāo)記。
圖4示出了HIV的5′LTR、從其衍生的截短的dsDNA模板、以及用于體外轉(zhuǎn)錄然后進行RNA酶保護試驗的探針。
圖5示出了經(jīng)RNA酶保護試驗的體外真核轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的結(jié)果，用8％變性凝膠上的電泳分析RNA保護的片段。泳道1是與生物素化的有義探針雜交的對照RNA酶消化試驗。泳道2-6代表圖4所述的不同大小的模板，這些模板用于體外轉(zhuǎn)錄試驗，和生物素化的有義探針雜交，然后用RNA酶消化；泳道10是與生物素化的反義探針雜交的對照RNA酶消化試驗；泳道11-15代表圖4所述的不同大小的模板，這些模板用于體外轉(zhuǎn)錄試驗，和生物素化反義探針雜交，然后作RNA酶消化。泳道7和9是用作參照的大小標(biāo)記。
圖6代表真核轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物延伸試驗結(jié)果，該結(jié)果通過在8％變性凝膠上電泳然后膜轉(zhuǎn)移和比色檢測分析獲得。泳道1是核抽提物對照(不加入DNA模板進行體外轉(zhuǎn)錄，然后通過引物延伸來分析)；泳道2代表從HIV aINR產(chǎn)生的RNA制得的cDNA，然后雜交和用反義探針(反義RNA的負(fù)對照)延伸；泳道3代表HIV aINR產(chǎn)生的RNA，和有義探針雜交和延伸。
圖7代表在測定HIV aINR產(chǎn)生的反義RNA的試驗中體外真核轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的結(jié)果，該結(jié)果通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，然后作瓊脂糖凝膠電泳分析獲得。
發(fā)明詳述定義出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“反義起始序列”或“aINR”及其“功能性等價物”是指在真核DNA中(如哺乳動物DNA)或采用真核調(diào)控元件的病毒DNA中的一個雙鏈基因元件，(a)當(dāng)其置于順式作用方向上、一DNA分子的下游并和該分子操作性相連時，它調(diào)節(jié)靶基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達；(b)它啟動操作性相連的DNA分子轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈極性(反義)RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本和靶基因產(chǎn)生的有義RNA轉(zhuǎn)錄本特異結(jié)合形成RNA雙鏈體；和(c)它具有G/A G/A A/T N T G G/A的共有序列。
在本發(fā)明的另一個實例中，aINR的3′端可包括一個額外的第8個核苷酸，該核苷酸包括G或A?！绊樖阶饔谩敝窪NA分子的正鏈和aINR的共有序列在同一條鏈上。另外，與SEQ ID NO1公開的aINR共有核苷酸序列相同的核苷酸序列(除了有一個堿基變化或替代外)能基本上(在SEQ ID NO1活性的大約50％至高于100％之間)象SEQ ID NO1那樣起作用，因此它是功能性等價物，因為它基本上能夠在真核細(xì)胞中啟動所需DNA分子的轉(zhuǎn)錄。
出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“操作性相連”是指化學(xué)融合(受到隨后的連接限制)或DNA的合成，這樣，aINR啟動的轉(zhuǎn)錄從合適的方向和在待轉(zhuǎn)錄成功能性反義RNA的DNA分子讀框內(nèi)形成了DNA分子-aINR組合。在構(gòu)建DNA分子-aINR組合時，通常較佳的是將aINR置于DNA分子下游與其天然設(shè)定中的距離大致相同的距離處。然而，如本領(lǐng)域中所知道的，對該距離可作一些變化而不會喪失起始功能。同樣，可在aINR的下游表現(xiàn)出增強aINR啟動的最佳距離處放置額外的包括調(diào)控元件(例如CAAT盒或反向的TATA盒的互補序列)的DNA序列。
出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“基本上由一個核苷酸序列組成”是指本文公開的核苷酸序列，還包括其中除一個堿基變化或替換外其余都相同的核苷酸序列。
出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“個體”或“宿主”是指任何哺乳動物，尤其是人、植物和利用真核轉(zhuǎn)錄機制的病毒。
出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“DNA分子”是指含有調(diào)控序列的雙鏈(ds)核酸序列，該調(diào)控序列涉及靶基因和/或基因序列轉(zhuǎn)錄的啟動和效率，使得該DNA分子被轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈極性RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本的功能是和靶基因產(chǎn)生的有義RNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合形成RNA雙鏈體。
出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“正鏈”或“正鏈極性”指選自靶基因編碼序列的單鏈(ss)DNA分子，或是轉(zhuǎn)錄成與aINR引發(fā)的反義RNA互補的mRNA或RNA的DNA序列鏈。
出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“負(fù)鏈”或“負(fù)鏈極性”指與正鏈互補的單鏈(ss)核酸分子。
出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“互補”指單鏈核苷酸序列具有足夠數(shù)量的配對堿基，它通過隨后發(fā)生的氫鍵鍵合和另一單鏈核苷酸序列特異性(非隨機性)雜交出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“重組表達載體”指一個核酸構(gòu)建物(載體序列)，它包含的aINR和DNA分子操作性相連，從而在合適的宿主中實現(xiàn)aINR的轉(zhuǎn)錄。載體可以包括(但不局限于)質(zhì)粒、噬菌體、病毒載體、病毒樣載體或潛在的基因組插入物(例如參見Mulligan等人，1993，Science 200926-923)。
出于說明書或權(quán)利要求的目的，術(shù)語“調(diào)控元件”指上游啟動子元件基序，其作用是促進結(jié)合RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄啟動、活性和效率的轉(zhuǎn)錄因子。真核調(diào)控元件包括(但不局限于)TATA盒、TATA樣盒(如TTTAA、TTTAAA、TAT、TAATA)、CAAT盒、CAAT樣盒(如CTAATC)、上游刺激因子(USF)、上游序列元件(USE)和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位(例如AP-2、SP1、CRE、PEA-3、NF-IL6等)。
影響真核細(xì)胞中正常生理過程和病理過程中的能力很大程度上取決于真核細(xì)胞中基因表達的調(diào)節(jié)。在分析反轉(zhuǎn)錄病毒和哺乳動物細(xì)胞的表達時，發(fā)現(xiàn)了一個新的基因元件以及該元件調(diào)節(jié)基因表達的機制。然而，該基因元件并不局限于哺乳動物。由于發(fā)現(xiàn)它也存在于反轉(zhuǎn)錄病毒中，因此它可能代表了更通用(即真核細(xì)胞)的控制機制。分離該基因元件并作性質(zhì)分析，結(jié)果揭示它包含一個7個堿基對(bp)的元件，它的作用可能是啟動負(fù)鏈極性RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本通過反義機制直接抑制相對的DNA互補鏈中基因有效轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄起始位點和/或激活劑的總體轉(zhuǎn)錄機制。在另一個實例中，基因元件可以延長至8個堿基對以進一步增強作用。在天然的設(shè)定中，通常元件可選擇要置在正鏈極性啟動子(如TATA盒)和其調(diào)節(jié)的基因的起始編碼區(qū)之間，或在基因的編碼序列中。這種轉(zhuǎn)錄阻遏機制是一種天然的反義RNA調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)的關(guān)鍵組分包括一個被稱為“反義起始序列”的元件。
根據(jù)本發(fā)明的一個實例，用重組DNA技術(shù)將至少一個拷貝的aINR和至少一個拷貝的DNA分子操作性相連并插入表達載體中。然后將重組載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，指導(dǎo)負(fù)鏈極性RNA轉(zhuǎn)錄本的表達，該轉(zhuǎn)錄本直接抑制靶基因在該特定宿主細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄起始位點和/或激活劑的總體轉(zhuǎn)錄機制。本發(fā)明的這種轉(zhuǎn)錄阻遏方法包括將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而使aINR產(chǎn)生的反義轉(zhuǎn)錄本能下調(diào)靶基因在宿主細(xì)胞中的表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，重組載體能導(dǎo)入培養(yǎng)中的宿主細(xì)胞內(nèi)(體外)，或能導(dǎo)入體內(nèi)細(xì)胞中(例如在基因治療應(yīng)用中)。
在參看了下列實施例后顯然能更全面地了解本發(fā)明及其具有的許多優(yōu)點，提供這些實施例是為了幫助了解本發(fā)明的特征，并使本領(lǐng)域技術(shù)人員能制備和使用本發(fā)明的新的反義起始序列。下列實施例的目的是為了描述本發(fā)明，而不應(yīng)被認(rèn)為限制了本發(fā)明的范圍。
實施例1人免疫缺陷病毒中的aINR根據(jù)本發(fā)明，從反轉(zhuǎn)錄病毒DNA鑒別出一種反義起始序列并作了圖譜。如圖1所示，HIV-1 aINR(SEQ ID NO2)位于通常的HIV-1啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點的下游。該HIV-1 aINR位于5′LTR(也在3′LTR)R區(qū)域內(nèi)，更具體地說，在稱為TAR區(qū)的雙鏈DNA區(qū)域內(nèi)。aINR位于通常的有義HIV-1轉(zhuǎn)錄的帽位點和起始位點約21-27核苷酸處，它排列產(chǎn)生方向相反并和已知的HIV-1轉(zhuǎn)錄本TAR區(qū)起始部互補的轉(zhuǎn)錄本。aINR產(chǎn)生的反義轉(zhuǎn)錄物與所有HIV-1有義轉(zhuǎn)錄物的起始部至少25個核苷酸互補，但可能包含長度超過25個核苷酸的互補序列。
RNA轉(zhuǎn)錄本上的TAR區(qū)域和Tat結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活，該激活大大提高了由HIV5′LTR啟動子轉(zhuǎn)錄出的正鏈極性病毒mRNA的水平。功能性Tat蛋白以及TAR序列均是Tat反式激活后觀察到的全長轉(zhuǎn)錄本增加以及HIV-1存活所需要的(Cullen，1992，Microbiol.Reviews 375-394)。如本文所證實的以及圖2所述的，該HIV aINR啟動了與TAR RNA序列部分反義的轉(zhuǎn)錄。HIV aINR DNA含有的序列與包含TAR RNA中Tat蛋白結(jié)合位點的序列的一部分相似(Weeks等人，1990，Science 2491281-85)。HIVaINR能產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本能和HIV-1有義啟動子轉(zhuǎn)錄出的mRNA形成RNA雙鏈體。這種RNA雙鏈體的形成能通過一種或多種機制來調(diào)節(jié)HIV有義初級轉(zhuǎn)錄本的有效合成，進而調(diào)節(jié)HIV-1基因表達，這些機制包括抑制或弱化RNA聚合酶II有效地延伸有義轉(zhuǎn)錄本，影響有義mRNA的穩(wěn)定性或在其胞核內(nèi)加工，以及抑制轉(zhuǎn)錄起始中帽位點的功能(另如圖2所述)。
在體外或體內(nèi)進行試驗觀察轉(zhuǎn)錄，以證實該HIV aINR能引發(fā)反義轉(zhuǎn)錄本，并且產(chǎn)生的反義轉(zhuǎn)錄本能起抑制強噬菌體啟動子轉(zhuǎn)錄的作用。
噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)采用與噬菌體啟動子相連的HIV LTR模板，用該系統(tǒng)來產(chǎn)生反義RNA并證實類似于aINR產(chǎn)生的RNA的反義轉(zhuǎn)錄本能在體外抑制“有義”轉(zhuǎn)錄。合并擴增反應(yīng)(聚合酶鏈反應(yīng)，PCR)片段，產(chǎn)生HIV-1 LTR雙鏈(ds)DNA模板(稱為5′T7HaeIII-3′HindIII-SP6)，使得模板5′端含有T7位點。因此，5′端從HIV-1 SP-1結(jié)合位點延伸至剛好超過TAR區(qū)域，總共長度約為213bp。用聚合酶鏈反應(yīng)另構(gòu)建其它兩個雙鏈DNA模板，并用來在體外分開的反應(yīng)中制備純化的反義RNA其中設(shè)計TAR雙鏈DNA模板(SEQ ID NO3)來制備反義TAR RNA，設(shè)計HIVaINR雙鏈DNA模板(SEQ ID NO4)來制備反義HIVaINR RNA。如下所述用緩沖試劑建立平行的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1.5′T7HaeIII-3′HindIII-SP6模板+T7 RNA聚合酶；2.5′T7HaeIII-3′HindIII-SP6模板(陰性對照)；3.5′T7HaeIII-3′ HindIII-SP6模板+純化的反義TAR RNA(在5′T7HaeIII-3′HindIII-SP6模板中加入10X或5X)+T7 RNA聚合酶；和4.5′T7HaeIII-3′HindIII模板+純化的反義HIVaINR RNA(在5′T7HaeIII-3′HindIII模板中加入10X或5X)+T7 RNA聚合酶。
培育后，用DNA酶I處理每個體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物，除去雙鏈DNA模板，然后用苯酚氯仿抽提，乙醇沉淀，獲得純化的合成的RNA。然后用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析每一反應(yīng)的純化的合成的RNA。如圖3的2％瓊脂糖凝膠所示，對組A泳道1-7代表的反應(yīng)物作如下分析在最初的反轉(zhuǎn)錄步驟中采用“有義”的生物素化的引物(5′SpI-IIB)，然后用5′SpI-IIB引物和3′T7引物(LTR序列，核苷酸442-477)進行聚合酶鏈反應(yīng)。這樣，組A中的泳道將檢測以反義方向排列的負(fù)鏈極性的RNA轉(zhuǎn)錄本。由于T7 RNA聚合酶只能以5′T7 HaeIII-3′HindIIISp6模板有義方向合成RNA轉(zhuǎn)錄本，因此組A泳道合理地顯示出沒有產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物(即只顯示出引物和引物二聚體)。如圖3所示，對組B泳道1-7代表的反應(yīng)物作如下分析在最初的反轉(zhuǎn)錄步驟中采用“反義”的生物素化的引物(3′HindIII-B)，然后用5′R引物和3′HindIII-B引物進行聚合酶鏈反應(yīng)。這樣，組B中的泳道檢測出由T7 RNA聚合酶合成的以有義方向排列的RNA轉(zhuǎn)錄本。組B泳道1顯示出含有5′T7HaeIII-3′HindIII模板+T7RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的RNA轉(zhuǎn)錄本，然后用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析。該泳道合理地顯示出從該反應(yīng)制得的RNA轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物(同時還顯示了引物和引物二聚體)。組B泳道2合理地顯示出在只含有5′T7HaeIII-3′HindIII模板(陰性對照而沒有T7 RNA聚合酶)的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中沒有產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本。組B泳道3(10X)和泳道5(5X)證實了體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中反義HIV aINR RNA轉(zhuǎn)錄本的存在抑制了T7 RNA聚合酶對5′T7HaeIII-3′HindIII模板的體外轉(zhuǎn)錄。類似地，組B泳道6(10X)和泳道7(5X)證實了反義TAR RNA的存在在5′T7HaeIII-3′HindIII模板體外轉(zhuǎn)錄期間抑制了T7RNA聚合酶合成RNA。
總之，該體外轉(zhuǎn)錄試驗表明，從HIV aINR延伸的反義RNA轉(zhuǎn)錄本能抑制有義HIV RNA轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生，甚至能抑制諸如T7噬菌體啟動子的強啟動子產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本。
果蠅屬體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)該真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)采用果蠅胚胎核抽提物來提供轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II；該系統(tǒng)證實了HIV aINR在其自身啟動子下的功能。該體外系統(tǒng)被用作體內(nèi)過程的模型，因為一旦HIV整合到人宿主T細(xì)胞染色體DNA中，它依靠真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II來轉(zhuǎn)錄其基因。
A.RNA酶保護試驗采用能在體外從真核起始子有效轉(zhuǎn)錄的真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(商用的果蠅胚胎核抽提物轉(zhuǎn)錄系統(tǒng))來調(diào)查是否能從HIV aINR引發(fā)真核轉(zhuǎn)錄。如前所述(Ludwig等人，1995，Nucleic Acids Res.233792-93)，用含有特異性HIV-1序列以及噬菌體T7或SP6聚合酶啟動子序列的引物和HIV-LTR模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生四種不同的HIV-1 LTR片段。如圖4所示，用于體外轉(zhuǎn)錄的四種截短的雙鏈DNA模板包括具有兩個Sp1位點和TATA盒的5′HaeIII-PBS(SP6)3′模板；缺少所有Sp1位點并將TATA盒二等分的5′PvuII-PBS(SP6)3′模板；從mRNA帽位點和起始位點起截短48bpTAR區(qū)域的5′(T7)PvuII-ScaI(SP6)3′模板；和不含HIV-1啟動子Sp1位點、也不含TATA盒的5′(T7)R-BssHII(SP6)3′模板。
對每個模板和果蠅核抽提物進行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，基本上采用生產(chǎn)商說明書的條件。然后用DNA酶I處理各個體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物，除去DNA模板，然后苯酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，從合成的RNA中除去DNA酶。然后用RNA酶保護試驗分析每一反應(yīng)的純化的合成的RNA，試驗基本上如試劑盒生產(chǎn)商所述那樣進行，只是采用生物素化的RNA探針進行雜交，然后用RNA酶T1消化。如前所述(Ludwig等人，1995，同上)，用T7 RNA聚合酶(針對有義探針)或SP6 RNA聚合酶(針對反義探針)體外合成生物素化的RNA探針。如圖4所示，生物素化的有義探針含有從帽位點延伸到BssHII位點的HIV-1序列，因此包括了TAR區(qū)域。然后如下所述分析雜交的和保護的片段在8％變性凝膠上電泳，然后進行膜轉(zhuǎn)移和比色檢測(Ludwig等人，1995，同上)。
如圖5泳道10-15所示，在通常的有義方向沒有引發(fā)轉(zhuǎn)錄本，因為RNA酶消化試驗證實反義探針不能雜交，從而保護了有義轉(zhuǎn)錄本。將反義探針加上tRNA的RNA酶消化對照(泳道10)和泳道11-15(反義探針+樣品RNA)作比較。重要的是注意到用于該試驗的果蠅抽提物本身缺少Sp1蛋白。因此，含有SP1位點的所有模板的有義轉(zhuǎn)錄缺少了主要的推動力，從而能在分離物中觀察到反義轉(zhuǎn)錄。所有四個模板的TAR區(qū)DNA均含有HIV aINR。如果從HIV aINR引發(fā)了反義轉(zhuǎn)錄，則轉(zhuǎn)錄本和有義探針之間互補堿基對的預(yù)計的重疊區(qū)域(受雜交保護的RNA的預(yù)計大小)將為26-28個核苷酸，這取決于模板。盡管生物素化的有義探針(泳道1，對照RNA酶消化有義探針+tRNA)有大量的二級結(jié)構(gòu)，檢測到受保護的HIV aINR產(chǎn)生的預(yù)計大小的反義轉(zhuǎn)錄本(見箭頭)，如圖5泳道2-6所示。在該體外轉(zhuǎn)錄試驗中用缺少HIV aINR的雙鏈DNA模板沒有觀察到反義轉(zhuǎn)錄物(結(jié)果未顯示)。通過逐步截短HIV-1 LTR區(qū)域用作體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的模板，作出最小的aINR圖譜。
總之，和RNA酶保護試驗結(jié)合的該體外真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表明，HIV aINR能產(chǎn)生與含TAR區(qū)序列的HIV-1有義RNA轉(zhuǎn)錄本方向相反且互補(如反義)的轉(zhuǎn)錄本。
B.引物延伸用體外真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和5′(T7)PvuII-SacI(SP6)3′HIV-1模板(雙鏈DNA)，通過引物延伸分析任何存在的RNA轉(zhuǎn)錄本(在DNA酶消化、苯酚氯仿抽提和乙醇沉淀之后)。引物延伸用未標(biāo)記的引物進行，但是在AMV反轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的cDNA合成反應(yīng)期間摻入生物素-16-dUTP。如圖6所示，所有泳道中出現(xiàn)的大分子量物質(zhì)均由果蠅核抽提物提供(見泳道1，核抽提物對照，其中體外轉(zhuǎn)錄時沒有加入DNA模板，然后用引物延伸分析)。另外如圖6所示，純化的RNA的引物延伸證實，HIV aINR產(chǎn)生的RNA和有義引物(5′(T7)PvuII)延伸出預(yù)計大小(如泳道3箭頭所示)的cDNA產(chǎn)物；但是和反義引物(3′SacI-SP6)卻不會(泳道2)。
總之，該體外真核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)與分析體外轉(zhuǎn)錄的RNA的引物延伸試驗相結(jié)合，結(jié)果表明HIV aINR甚至能在通常的“有義”HIV-1啟動子元件不存在下起引發(fā)反義轉(zhuǎn)錄本的作用。
體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)特別重要的是要證明該HIV aINR能在體內(nèi)指導(dǎo)產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄本。HIV aINR的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄通過對分離自己經(jīng)轉(zhuǎn)染了pHIV-CAT的人Jurkat T細(xì)胞的RNA作反轉(zhuǎn)錄酶-PCR，并和轉(zhuǎn)染對照比較來分析。質(zhì)粒pHIV-CAT含有HIV-1 LTR U3和R序列，它們在氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因的5′端。在增強細(xì)胞攝取質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑(TransfectamTM，Promega)存在下，進行質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染。在96孔微量滴定板的一個孔中，將3.8×105細(xì)胞和質(zhì)粒DNA(每0.182微升轉(zhuǎn)染劑0.086微克質(zhì)粒DNA)混合，采用基本上如生產(chǎn)商所述的條件培育2小時。對照轉(zhuǎn)染反應(yīng)包括pHIV-CAT加上pSV-βgal加上轉(zhuǎn)染劑(以評價轉(zhuǎn)染效率)、單用轉(zhuǎn)染劑(沒有質(zhì)粒DNA；“模擬轉(zhuǎn)染”)、或沒有接受任何處理。然后將各轉(zhuǎn)染反應(yīng)的的細(xì)胞重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。然后用本領(lǐng)域已知的方法和試劑從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提出RNA。純化分離抽提出的RNA，然后用5′AvaI有義引物(含有HIV-1 LTR增強子元件上游的序列)對樣品RNA作反轉(zhuǎn)錄，然后用5′AvaI有義引物和含有與TAR序列起始區(qū)互補的序列的3′反義引物(SEQID NO9)通過30輪聚合酶鏈反應(yīng)擴增變性(94℃，45秒)、退火(70℃，45秒)和延伸(72℃，2分鐘)。然后用3％瓊脂糖凝膠電泳分析反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物。結(jié)果如圖7所述。
在圖7中，標(biāo)為“m”的泳道代表DNA大小標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。陽性RT-PCR對照(圖7，泳道“+”)代表在反轉(zhuǎn)錄步驟中采用AvaI引物，然后用5′AvaI有義引物和3′反義引物，設(shè)計這些引物來擴增對照反義RNA模板，其合成如前所述(Ludwig等人，1995，同上)。陰性對照反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(圖7，泳道“-”)顯示沒有擴增產(chǎn)物(微弱的條帶代表引物)，這表明純化的RNA樣品沒有DNA(pHIV-CAT)污染。從HIV-1反義轉(zhuǎn)錄本擴增得到的預(yù)計大小為183bp的雙鏈DNA產(chǎn)物是清晰可見的(圖7，顯示了三組，泳道“a”pHIV-CAT和轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pSVgal；泳道＂b＂pHIV-CAT)。標(biāo)為＂s＂的泳道代表在指定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后用PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)和鈣離子載體(T細(xì)胞激活劑)刺激轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞。
不論刺激存在與否，HIV aINR均在人T細(xì)胞內(nèi)體內(nèi)產(chǎn)生HIV-1反義RNA。到目前為止的數(shù)據(jù)(未顯示)提示，HIV aINR在轉(zhuǎn)染的人T細(xì)胞中體內(nèi)產(chǎn)生的反義RNA代表了TAT不存在時從HIV-1 LTR產(chǎn)生的總RNA的顯著的一部分。
實施例2哺乳動物aINR根據(jù)本發(fā)明，在通過產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄本調(diào)節(jié)哺乳動物基因表達的區(qū)域內(nèi)，可能發(fā)現(xiàn)并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了反義起始序列。例如，轉(zhuǎn)錄沉默子包含一個負(fù)調(diào)控元件，它可能在CD4基因(或轉(zhuǎn)基因)的增強子和啟動子之間，或在啟動子和基因之間，從而位于CD4轉(zhuǎn)錄起始位點的下游(是其天然的設(shè)定)(Sawada等人，1994，Cell 77917-29，納入本文作參考)。將該轉(zhuǎn)錄沉默子，CD4沉默子，縮小到位于轉(zhuǎn)錄起始位點下游約2kb處的428bp限制性片段內(nèi)；這樣，轉(zhuǎn)錄沉默子可能在距其阻遏的基因的起始位點至少2kb處起作用。根據(jù)本發(fā)明，在428bp CD4沉默子中至少發(fā)現(xiàn)一個aINR(SEQ ID NO5)位于序列的183-191之間。CD4基因的轉(zhuǎn)錄阻遏機制模型是用HIV LTR觀察到的。例如，CD4基因表達在DN(CD4-，CD8-)胸腺細(xì)胞中受轉(zhuǎn)錄阻遏，但是在DN胸腺細(xì)胞發(fā)展到DP階段(CD4+、CD8+)時受到上調(diào)，這可能是阻遏蛋白/沉默子機制失活的結(jié)果。同樣，看來HIV LTR啟動子的轉(zhuǎn)錄阻遏(可能由HIV aINR介導(dǎo))通過Tat和TAR的結(jié)合而無效(或失活或降低至對轉(zhuǎn)錄阻遏HIV LTR啟動子無效的低基礎(chǔ)水平)。
在另一個實施例以及T細(xì)胞受體γ基因(TCRγ)在TCRαβ+細(xì)胞中的表達受阻遏的報道中，鑒別出一個含有多個轉(zhuǎn)錄沉默子的區(qū)域(Lefranc和Alexandre，1995，Eur.J.Immunol.25617-22，納入本文作參考)。側(cè)接TCRγ基因的該轉(zhuǎn)錄沉默子包含在1.2kbSacI B片段中。數(shù)據(jù)表明，TCRαβ+細(xì)胞中TCRγ基因座的沉默系由轉(zhuǎn)錄活性沉默子介導(dǎo)。根據(jù)本發(fā)明，在1.2kb TCRγ沉默子中發(fā)現(xiàn)了至少一個aINR(SEQ ID NO6)，它位于含有沉默子的B片段序列的核苷酸853-859處。
在另一個實施例中以及T細(xì)胞受體α基因(TCRα)在TCRγδ細(xì)胞中的表達受阻遏的報道中，鑒定出一個含有多個轉(zhuǎn)錄沉默子的區(qū)域(Winoto和Baltimore，1989，Cell59649-55，納入本文作參考)。另外，該報道還提供了以前描述的不依賴于啟動子/增強子的方向和距離、阻遏轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控元件的簡單綜述(“不依賴”通過以不同位置和方向放置含元件的大片段，結(jié)果不影響其立即轉(zhuǎn)錄來確定)。兩個TCRα轉(zhuǎn)錄沉默子各自位于300+bp片段處。例如，根據(jù)本發(fā)明，在309bp TCRα轉(zhuǎn)錄沉默子SIL I中發(fā)現(xiàn)至少一個aINR(SEQ ID NO7)，它在SIL I序列的核苷酸85-92處。
表1描述了各種aINR序列的比較，以及根據(jù)本發(fā)明獲得的共有序列。
表1aINR序列中的堿基位置
N＝A，T，G或C在鑒定出共有的aINR序列后，可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備aINR或含有aINR的核酸序列。例如，可用酶促核酸擴增來從含有aINR的核酸序列擴增aINR，然后純化包含aINR的擴增產(chǎn)物。另一種方法是用核酸合成儀和相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)技術(shù)，其中aINR能通過化學(xué)合成。
實施例3含有aINR的重組載體本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)基因表達的組合物和方法。可以構(gòu)建一個載體，它含有至少一個拷貝的aINR，該aINR在至少一個拷貝的具有待調(diào)節(jié)序列的DNA分子的下游并與其順式操作性相連。在aINR序列的下游鄰近處(如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的)可以放置一個或多個調(diào)控元件(例如CAT盒、TATA盒)，以便和aINR一起在傳遞信號和引發(fā)反義轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄中起作用。然后將所得重組載體導(dǎo)入表達待調(diào)節(jié)靶基因的細(xì)胞中。一旦進入細(xì)胞，重組載體的aINR就引發(fā)產(chǎn)生反義RNA轉(zhuǎn)錄本。然后，該反義RNA轉(zhuǎn)錄本通過和靶基因轉(zhuǎn)錄出的有義mRNA形成RNA雙鏈體來調(diào)節(jié)靶基因的表達。另外，靶基因的雙鏈DNA和反義RNA轉(zhuǎn)錄本之間可能形成三聯(lián)體。由于靶基因的轉(zhuǎn)錄受抑制，因此只有很少(如果有的話)的全長有義mRNA轉(zhuǎn)錄本能被翻譯成該靶基因編碼的蛋白。因此，這種調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致受處理細(xì)胞產(chǎn)生這種蛋白的量減少。
在制備該載體時有幾個考慮因素。
A.基礎(chǔ)構(gòu)建物用于本發(fā)明作為導(dǎo)入宿主細(xì)胞并從其中插入的aINR產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄本的運載體的載體可以選自質(zhì)粒、病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、噬菌體、或作為染色體插入物有待整合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，基礎(chǔ)載體的常見特征將根據(jù)以下這些因素而不同，這些因素包括(但不局限于)后來的重組載體在體外還是在體內(nèi)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以及待調(diào)節(jié)的基因表達是單拷貝或多拷貝基因(例如在這種情況下載體的拷貝數(shù)可考慮作變化)。然而，用于本發(fā)明方法的載體的一些基礎(chǔ)特征包括它具有選擇標(biāo)記用來鑒定已轉(zhuǎn)染了載體的宿主細(xì)胞；它具有限制性位點以便將至少一個拷貝的aINR克隆到至少一個拷貝的DNA分子的下游并和其順式操作性相連，形成重組載體。另外，在某些情況下，可能還需要提供一種能“關(guān)閉”或阻遏aINR的機制，從而使aINR不再產(chǎn)生反義轉(zhuǎn)錄本。
可獲得的并且有用的基礎(chǔ)載體的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們包括(但不局限于)質(zhì)粒pRSVneo，pSV2gpt，pSV2neo和pCMV。特別可用來在體外或體內(nèi)將基因或DNA分子輸送給哺乳動物細(xì)胞的載體是各種病毒載體，其包括(但不局限于)反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、牛痘病毒載體、脊髓灰質(zhì)炎病毒載體以及Sindbis和其它RNA病毒(例如Mulligan，1993，Science260926-932中回顧的病毒)。
例如，用于基因治療應(yīng)用的一種較佳的載體是細(xì)小病毒載體，它能穩(wěn)定地定點整合轉(zhuǎn)移的重組DNA分子。由于AAV和目前已知的任何人類疾病沒有關(guān)系，因此用AAV制成的載體或雜交的細(xì)小病毒載體看來可安全用于(例如)基因治療應(yīng)用(例如參見Chatterjee等人，1992，Science，2581485-1488；美國專利No.5,252,470，授予Srivastava)。在該AAV載體中，ITR(末端反向重復(fù)序列)中的啟動子能驅(qū)動新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因或其它標(biāo)記基因的表達，而aINR驅(qū)動轉(zhuǎn)錄成反義RNA。AAV載體的ITR還提供了一種將載體及其中插入的序列整合到染色體中方法，因為ITR是一種已表明能定點(而不是隨機)插入染色體的序列。另一個較佳的載體是復(fù)制缺陷型腺病毒，它缺失了復(fù)制所需的一個或多個基因(例如E1A-E1B以及E3區(qū)域)。
B.重組載體構(gòu)建采用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法，至少一個拷貝的aINR在至少一個拷貝的DNA分子的下游并與其操作性順式相連，該DNA分子具有涉及靶基因啟動、或延伸、或轉(zhuǎn)錄的序列(待調(diào)節(jié)的系列)。aINR序列的下游鄰近處(如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的)可放置一個或多個調(diào)控元件(例如逆向的CAT盒、TATA盒)，以便和aINR一起在傳遞信號和引發(fā)反義轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄中起作用。aINR和DNA分子均插入并連接入基礎(chǔ)載體中，形成本發(fā)明的重組載體。為了確認(rèn)重組載體的構(gòu)建合適，可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如用限制性酶消化和瓊脂糖凝膠電泳和/或雙脫氧測序分析來分析載體中插入的方向。
本領(lǐng)域技術(shù)人員當(dāng)理解，重組載體中與DNA分子操作性相連的aINR拷貝數(shù)可以依據(jù)試圖調(diào)控的基因表達而變化。例如，在HIV中，為了克服Tat滅活HIV aINR介導(dǎo)的HIV LTR啟動子的轉(zhuǎn)錄阻遏，希望有多拷貝(例如10至50個或更多)的DNA分子-HIV aINR組合。另外，如果待調(diào)控的基因表達是單拷貝或多拷貝的基因、或以相當(dāng)高的效率轉(zhuǎn)錄(即來自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的強啟動子和增強子組合)，則需可能要多拷貝(例如10至50個或更多)的DNA分子-HIV aINR組合。另外，盡管一些aINR看來在一些細(xì)胞類型中引發(fā)轉(zhuǎn)錄，但是aINR可能受到鄰近的以細(xì)胞特異性方式起作用的調(diào)控元件影響，或可能在某些類型細(xì)胞中的作用水平低(例如參見Winoto和Baltimore，1989(同上)所鑒別的轉(zhuǎn)錄沉默子)。因此，在采用特定aINR的單拷貝不能最有效地引發(fā)基因調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞中，可能需要多拷貝的DNA分子-HIV aINR組合，結(jié)合所放置的增強aINR轉(zhuǎn)錄起始活性的調(diào)控元件的功能，以調(diào)節(jié)靶基因的表達。一種變化方案是，通過查看顯示以細(xì)胞特異方式受到調(diào)節(jié)的基因的公開序列，可能鑒定出在該特定細(xì)胞類型中起作用的aINR(通過位置和共有序列)以及合適的調(diào)控元件(通過位置和共有序列)。
本發(fā)明該實例的一個描述是，通過將10-50拷貝的包含DNA分子-HIV aINR組合(以便用于HIV 5′LTR的基因調(diào)控)的序列連接到基礎(chǔ)載體中，構(gòu)建一個重組載體。在一個較佳的實例中，為了提高反義轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的效率，序列包含DNA分子-HIVaINR-調(diào)控元件的組合。SEQ ID NO8中示出了一種典型的DNA分子-HIV aINR-調(diào)控元件的組合。然后將所得重組載體導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞，aINR引發(fā)產(chǎn)生反義RNA轉(zhuǎn)錄本。然后，反義RNA轉(zhuǎn)錄本通過和HIV-1 LTR轉(zhuǎn)錄的有義mRNA形成RNA雙鏈體，來調(diào)節(jié)細(xì)胞中所含HIV-1的HIV-1 LTR的表達。
在HIV aINR和DNA分子結(jié)合用來調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞基因表達的另一個實例中，可包括一種利用如HIV 5′LTR所證實的相同控制機制的機制作為控制HIV aINR產(chǎn)生的反義轉(zhuǎn)錄本介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄阻遏的方法。在該實例中，重組構(gòu)建物含有一個插入物，該插入物包含完整TAR區(qū)域DNA(SEQ ID NO8的核苷酸75至133)中的HIV aINR，該HIV aINR在至少一個拷貝含真核靶基因的DNA分子的下游并與其操作性相連，從該構(gòu)建物可以產(chǎn)生反義序列與真核靶基因轉(zhuǎn)錄出的有義RNA結(jié)合。另外，合適的調(diào)控元件可以位于HIV aINR的下游。這種構(gòu)建物提供了Tat控制機制。當(dāng)含有重組載體的細(xì)胞沒有Tat存在時，HIV aINR產(chǎn)生了反義轉(zhuǎn)錄本，然后該轉(zhuǎn)錄本與靶基因轉(zhuǎn)錄出的有義RNA結(jié)合。在Tat存在時(例如通過隨后導(dǎo)入表達Tat的載體)，通過Tat與TAR的結(jié)合，可以使HIV aINR介導(dǎo)的反義RNA的轉(zhuǎn)錄無效(滅活或降低至對靶基因的轉(zhuǎn)錄阻遏無效的低基礎(chǔ)水平)。pTAT載體已有描述(Koken等人，1994，Gene144243-7；Ho等人，1990，J.Gen.Virol.7197-103)。
C.將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，它們包括(但不局限于)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、微量注射、定向脂質(zhì)體、粒子槍轟擊、電穿孔、電融合和注射。因此，本發(fā)明中一種調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中靶基因表達的方法包含將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，該重組載體包含至少一個拷貝的aINR(最好有下游調(diào)控元件)，該aINR與至少一個拷貝的含靶基因的DNA分子操作性相連，該DNA分子產(chǎn)生反義RNA，其中反義RNA再與靶基因轉(zhuǎn)錄出的有義RNA結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達。
在該實例的另一變化中，包含至少一個拷貝的aINR與至少一個拷貝的DNA分子操作性相連的重組載體或基因物質(zhì)的導(dǎo)入可以是直接注射(通過任何腸胃外途徑，例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi)或通過接觸鼻咽、氣管或腸胃道粘膜表面)到個體內(nèi)(“直接的核酸轉(zhuǎn)移”)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)證實，直接將核酸轉(zhuǎn)移到“接種疫苗的”個體內(nèi)，導(dǎo)致接種個體的細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞和主要器官的組織)表達基因物質(zhì)(例如靜脈內(nèi)注射一種表達質(zhì)粒陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物(Zhu等人，1993，Science261209-211；納入本文作參考))。另外，包含待注射的本發(fā)明重組載體或基因物質(zhì)的組合物還可包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，例如稀釋劑，和/或促進細(xì)胞攝取核酸的化合物(稱為“核酸攝取增強劑”)。
在本發(fā)明該方法的另一個例子中，可從個體取出細(xì)胞用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)程序進行轉(zhuǎn)染或電穿孔，從而導(dǎo)致將重組載體(包含至少一個拷貝的aINR，以及與其操作性相連的至少一個拷貝的DNA分子)導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)。然后可以用本領(lǐng)域中已知的方法(例如通過載體中表達的選擇標(biāo)記)選擇含有重組載體的細(xì)胞，然后將選出的細(xì)胞重新導(dǎo)入個體內(nèi)。
根據(jù)前述內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然能對上述方法、構(gòu)建物和細(xì)胞作各種變化而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明還包括不脫離其精神和實質(zhì)性特點的其它具體形式。因此，本文中的實例和實施例應(yīng)被認(rèn)為在所有方面均是描述性的，而不是限制性的，因此在等價于權(quán)利要求的意義和范圍內(nèi)的所有變化均包括于權(quán)利要求中。
序列表(1)一般信息(i)申請人S(A)姓名Ludwig，Linda B.
(ii)發(fā)明名稱真核和反轉(zhuǎn)錄病毒反義起始元件(iii)序列數(shù)目9(iv)通信地址(A)地址Hodgson，Russ，Andrews，Woods & Goodyear(B)街道1800 One M&T Plaza(C)城市Buffalo(D)州紐約(E)國家美國(F)郵編14203-2391(v)計算機可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤，3.5英寸(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)MS-DOS/Microsoft Windows(D)軟件Wordperfect for Windows(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日1998年5月7日(vii)律師/代理人信息(A)姓名Kadle，Ranjana(B)登記號40，041(C)文獻/案卷號11520.0114(ix)電訊信息(A)電話(716)856-4000(B)電傳(716)849-0349(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度7核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(E)其它信息/注意″X″＝A或G，″Y″＝A或T，和″N″＝A，T，C或G(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有
(iv)序列描述SEQ ID NO1XXYNTGX 7(3)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度8核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有(iv)序列描述SEQ ID NO2GATCTGAG 8(4)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度98核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有(iv)序列描述SEQ ID NO3GGGTCTCTCT GGTTAGACCA GATCTGAGCC TGGGAGCTCT CTGGCTAACT50AGGGAACCCA CTGCTTAAGC CTCAATAACC CTATAGTGAG TCGTATTA 98(5)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度63核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有(iv)序列描述SEQ ID NO4CTGCTTTTTG CCTGTACTGG GTCTCTCTGG TTAGACCAGA TCTCCCTATA50GTGAGTCGTA TTA 63(6)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度8核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有(iv)序列描述SEQ ID NO5AGAGTGGG 8(7)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度7核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有(iv)序列描述SEQ ID NO6AATATGG 7(8)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度8核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有(iv)序列描述SEQ ID NO7AGTCTGGG 8(9)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度153核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有(iv)序列描述SEQ ID NO3GGCGTGGCCT GGGCGGGACT GGGGAGTGGC GAGCCCTCAG ATGCTGCATA 50TAAGCAGCTG CTTTTTGCCT GTACTGGGTC TCTCTGGTTA GACCAGATCT100GAGCCTGGGA GCTCTCTGGC TAACTAGGGA ACCCACTGCT TAAGCCTCAA150TAA 153(10)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度25核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(iii)假設(shè)沒有(iv)序列描述SEQ ID NO9CCAGAGAGAC CCGATACAGG CAAAA 2權(quán)利要求
1.一種分離和純化的核酸分子，它基本上由反義起始序列或其功能等價物組成，其中該反義起始序列基本上由SEQ ID NO1公開的共有序列組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中反義起始序列基本上由選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列組成。
3.一種重組核酸分子，它包括操作性連接(a)至少一個拷貝的權(quán)利要求1所述的反義起始序列；和(b)至少一個拷貝的DNA分子，其中該反義起始序列在DNA分子的下游，并且在相對于DNA分子中待調(diào)節(jié)序列的順式方向上。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組核酸分子，它還包含至少一個位于反義起始序列下游的調(diào)控元件以增強從反義起始序列轉(zhuǎn)錄的啟動。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組核酸分子，它含有基本上由SEQ ID NO8組成的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組核酸分子，其中所述反義起始序列基本上由選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列組成。
7.一種能導(dǎo)入真核細(xì)胞并在其中復(fù)制的重組載體，它包含權(quán)利要求1所述的至少一個拷貝的反義起始序列，該序列在至少一個拷貝的待轉(zhuǎn)錄成反義RNA的DNA分子的下游并和其操作性相連。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，它還包含至少一個位于反義起始序列下游的調(diào)控元件以增強從反義起始序列轉(zhuǎn)錄的啟動。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其中所述反義起始序列基本上由選自SEQID NO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其中所述載體含有一個可選擇的標(biāo)記。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組載體，其中所述載體含有一個可選擇的標(biāo)記。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其中與DNA分子操作性相連的所述反義起始序列用基本上由SEQ ID NO8組成的核苷酸序列表示。
13.一種真核細(xì)胞，它含有權(quán)利要求7所述的重組載體。
14.一種真核細(xì)胞，它含有權(quán)利要求8所述的重組載體。
15.一種真核細(xì)胞，它含有權(quán)利要求9所述的重組載體。
16.一種真核細(xì)胞，它含有權(quán)利要求10所述的重組載體。
17.一種真核細(xì)胞，它含有權(quán)利要求11所述的重組載體。
18.一種真核細(xì)胞，它含有權(quán)利要求12所述的重組載體。
19.一種RNA分子，它從權(quán)利要求12所述的重組載體制得。
20.一種制備反義起始序列的方法，其中所述方法選自用酶促核酸擴增來從含有反義起始序列的核酸序列擴增反義起始序列，隨后純化包含反義起始序列的擴增產(chǎn)物；和用化學(xué)方法合成反義起始序列。
21.一種調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中靶基因表達的方法，該方法包括將權(quán)利要求7所述的重組載體導(dǎo)入表達待調(diào)節(jié)靶基因的細(xì)胞中，其中重組載體的反義起始序列啟動轉(zhuǎn)錄，將操作性相連的DNA分子轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈極性的RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本的功能是結(jié)合待調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)生的有義RNA轉(zhuǎn)錄本，形成RNA雙鏈體，從而阻遏該靶基因的表達。
22.一種調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中靶基因表達的方法，該方法包括將權(quán)利要求8所述的重組載體導(dǎo)入表達待調(diào)節(jié)靶基因的細(xì)胞內(nèi)，其中重組載體的反義起始序列和下游調(diào)控元件啟動轉(zhuǎn)錄，將操作性相連的DNA分子轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈極性RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本的功能是結(jié)合待調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)生的有義RNA轉(zhuǎn)錄本，形成RNA雙鏈體，從而阻遏靶基因的表達。
23.一種調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞中靶基因表達的方法，該方法包括將權(quán)利要求3所述的重組核酸分子導(dǎo)入表達待調(diào)節(jié)靶基因的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，其中重組核酸分子的反義起始序列啟動轉(zhuǎn)錄，將操作性相連的DNA分子轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈極性RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本的功能是結(jié)合待調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)生的有義RNA轉(zhuǎn)錄本，形成RNA雙鏈體，從而阻遏靶基因的表達。
24.一種調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞中靶基因表達的方法，該方法包括將權(quán)利要求4所述的重組核酸分子導(dǎo)入表達待調(diào)節(jié)靶基因的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，其中重組核酸分子的反義起始序列和下游調(diào)控元件啟動轉(zhuǎn)錄，將操作性相連的DNA分子轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈極性RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本的功能是結(jié)合待調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)生的有義RNA轉(zhuǎn)錄本，形成RNA雙鏈體，從而阻遏靶基因的表達。
25.一種調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞中靶基因表達的方法，該方法包括將權(quán)利要求5所述的重組核酸分子導(dǎo)入表達待調(diào)節(jié)靶基因的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，其中重組核酸分子的反義起始序列和下游調(diào)控元件啟動轉(zhuǎn)錄，將操作性相連的DNA分子轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈極性RNA轉(zhuǎn)錄本，該轉(zhuǎn)錄本的功能是結(jié)合待調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)生的有義RNA轉(zhuǎn)錄本，形成RNA雙鏈體，從而阻遏靶基因的表達。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述反義起始序列基本上由選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列組成。
27.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述反義起始序列基本上由選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列組成。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述反義起始序列基本上由選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列組成。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述反義起始序列基本上由選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7的序列組成。
全文摘要
本發(fā)明鑒定出一種基因調(diào)控元件,它是真核細(xì)胞中天然反義RNA負(fù)調(diào)控系統(tǒng)的一部分。當(dāng)命名為反義起始序列的基因調(diào)控元件在DNA分子下游并與其操作性相連時,它能將DNA分子轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈極性的RNA轉(zhuǎn)錄本,該轉(zhuǎn)錄本的功能是與待調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)生的有義RNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合形成RNA雙鏈體。本發(fā)明涉及用于導(dǎo)入真核細(xì)胞的重組載體和用該載體調(diào)節(jié)靶基因表達的方法,該方法包括將該重組載體導(dǎo)入宿主真核細(xì)胞內(nèi)。
文檔編號C12N15/63GK1262687SQ98807028
公開日2000年8月9日 申請日期1998年5月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月9日
發(fā)明者L·B·路德韋 申請人:紐約州立大學(xué)研究基金會