專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)小麥真菌病原體的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種特異性引物在聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定中對(duì)于小麥真菌病原體檢測(cè)的應(yīng)用。這些引物的應(yīng)用使真菌病原體特定分離株的檢測(cè)以及植物種群中疾病發(fā)展的監(jiān)測(cè)成為可能。
確實(shí)需要發(fā)展能在感染過(guò)程早期對(duì)病原體真菌的特定種進(jìn)行鑒定的技術(shù)。通過(guò)病癥在作物群叢中變得明顯之前鑒定病原體的特定種，農(nóng)業(yè)工作者能估計(jì)病原體在作物品種中進(jìn)一步發(fā)展的可能作用，如果作物中病原體已被鑒定，并且如果認(rèn)為這種應(yīng)用是必要的，能選擇一種合適的殺真菌劑。
本發(fā)明涉及植物病原真菌不同致病型的鑒定方法。本發(fā)明提供了顯示不同真菌致病型間變異性的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)DNA序列。這些DNA序列在本發(fā)明的方法中是有用的，因?yàn)槟苡盟鼈冄苌铮糜诨诰酆厦告湻磻?yīng)(PCR)的診斷性試驗(yàn)。在特定真菌致病型提供DNA模板的PCR反應(yīng)中，這些引物產(chǎn)生獨(dú)特的片段，從而能用來(lái)在病癥發(fā)作之前鑒定特定致病型在宿主植物材料中的存在或不存在。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了關(guān)于病原體早熟禾鐮孢(Fusarium poae)、燕麥鐮孢(Fusarium avenaceum)和Microdochiumnivale的ITS1和ITS2 DNA序列。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了關(guān)于鐮孢屬的種和Microdochium nivale的檢測(cè)的ITS衍生的診斷性引物。
本發(fā)明提供了估計(jì)特定作物品種-病原體菌株關(guān)系中的潛在損害的可能性，以及審慎地使用可獲得的多種殺真菌劑庫(kù)的可能性。此外，本發(fā)明能用來(lái)提供關(guān)于特定病原體種在擴(kuò)大的地理區(qū)域中發(fā)育與擴(kuò)散的詳細(xì)信息。本發(fā)明提供了一種特別適用于具有長(zhǎng)潛伏期的疾病的檢測(cè)方法。
也提供了在本發(fā)明的實(shí)行中有用的試劑盒。這些試劑盒在真菌病原體鐮孢屬的種和Microdochium nivale的鑒定中特別有用。
本發(fā)明提供了可用于鑒定植物病原真菌不同致病型的獨(dú)特的DNA序列。特別地，這些DNA序列能在基于PCR的分析中作為引物用于真菌致病型的鑒定。本發(fā)明的DNA序列包括特定真菌病原體核糖體RNA基因區(qū)的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列，以及來(lái)源于這些區(qū)能鑒定特定病原體的引物。這些來(lái)源于一種病原體種或?qū)俚牟煌虏⌒偷腎TSDNA序列，隨該種或?qū)俚牟煌蓡T而不同，能用來(lái)鑒定特定的成員。
生物醫(yī)學(xué)研究人員應(yīng)用基于PCR的技術(shù)已經(jīng)有一段時(shí)間，并且適度成功地檢測(cè)了被感染的動(dòng)物組織中的病原體。然而只是最近，才將該技術(shù)用于檢測(cè)植物病原體。應(yīng)用對(duì)病原體線(xiàn)粒體基因組特異的序列的PCR，檢測(cè)了感染的小麥中Gaumannomyces graminis的存在(Schlesser等人，1991；應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Applied and Environ.Microbiol.)57553-556)，而隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(即RAPD)標(biāo)記能區(qū)別Gremeniella abietina的大量種，其為針葉樹(shù)scleroderris canker的病因。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,585,238(在此完全引入作為參考)描述了來(lái)源于殼針孢屬(Septoria)、假尾孢屬(Pseudocercosporella)和球腔菌屬(Mycosphaerella)菌株核糖體RNA基因區(qū)ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技術(shù)鑒定這些真菌分離株中的應(yīng)用。此外，WO 95/29260(在此完全引入作為參考)描述了來(lái)源于鐮孢屬(Fusarium)菌株核糖體RNA基因區(qū)ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技術(shù)鑒定這些真菌分離株中的應(yīng)用。此外，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?7810779.5(在此完全引入作為參考)描述了來(lái)源于尾孢屬(Cercospora)、長(zhǎng)蠕孢屬(Helminthosporium)、球梗孢屬(Kabatiella)和柄銹菌屬(Puccinia)菌株核糖體RNA基因區(qū)ITS序列的引物，及其在利用基于PCR的技術(shù)鑒定這些真菌分離株中的應(yīng)用。
核糖體基因由于其高拷貝數(shù)而適于用作分子探針靶。盡管成熟rRNA序列之間高度保守，但非轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列通常不保守，因而適于作為靶序列用于近代進(jìn)化趨異的檢測(cè)。真菌rRNA基因以單位組成，其每一個(gè)編碼18S(小亞單位)、5.8S和28S(大亞單位)的三種成熟亞單位。這些亞單位被大約300bp的兩種內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2隔開(kāi)(White等人，1990；于《PCR方案》；Innes等人編；315-322頁(yè))。此外，這些轉(zhuǎn)錄單位被非轉(zhuǎn)錄間隔序列(NTS)隔開(kāi)。ITS和NTS序列尤其適用于不同真菌病原體的特定致病型的檢測(cè)。
本發(fā)明的DNA序列來(lái)源于不同植物病原體核糖體RNA基因區(qū)的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列。來(lái)源于一種病原體種或?qū)賰?nèi)不同致病型的ITSDNA序列隨該種或?qū)俚牟煌蓡T而不同。一旦測(cè)定了一種病原體的ITS序列，即能將這些序列與其它ITS序列相對(duì)比。這樣，可由ITS序列衍生引物。即，能根據(jù)含有真菌致病型間最大序列差異的ITS序列內(nèi)的區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)引物。這些序列和基于這些序列的引物能用來(lái)鑒定特定的病原體。
特別的目的DNA序列包括早熟禾鐮孢、Microdochium nivale和燕麥鐮孢的ITS DNA序列。這些ITS DNA序列分別在SEQ ID NO22-24中公開(kāi)。由這些ITS序列衍生的典型寡核苷酸引物的序列在SEQ IDNO7-18中公開(kāi)。這些序列在目的致病型的基于PCR的鑒定中得到應(yīng)用。
本發(fā)明包括含有一種內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的分離的DNA分子，該內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列選自早熟禾鐮孢的ITS1、早熟禾鐮孢的ITS2、Microdochium nivale的ITS1、Microdochium nivale的ITS2、燕麥鐮孢的ITS1和燕麥鐮孢的ITS2。更優(yōu)選的是這樣的分離的DNA分子，其中早熟禾鐮孢的IST1包含SEQ ID NO22的核苷酸31-180，早熟禾鐮孢的IST2包含SEQ ID NO22的核苷酸338-489，Microdochium nivale的ITS1包含SEQ ID NO23的核苷酸31-175，Microdochium nivale的ITS2包含SEQ ID NO23的核苷酸333-499，燕麥鐮孢的ITS1包含SEQ IDNO24的核苷酸31-181，燕麥鐮孢的ITS2包含SEQ ID NO24的核苷酸339-504。
在PCR分析中應(yīng)用本發(fā)明的引物序列的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。例如，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,683,195和4,683,202，以及Schlesser等人(1991)應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)57553-556。參見(jiàn)，Nazar等人(1991；生理與分子植物病理學(xué)(Physiol.and Molec.Plant Pathol.)391-11)，其利用PCR擴(kuò)增研究黑白輪枝孢(Verticillium albo-atrum)與大麗花輪枝孢(Verticillium dehliae)ITS區(qū)之間的差異，并因此區(qū)分這兩個(gè)種；以及Johanson和Jeger(1993；霉菌學(xué)研究(Mycol.Res.)97670-674)，他們利用相似的技術(shù)區(qū)分香蕉病原體Mycosphaerella fijiensis與Mycospharella musicola。
通過(guò)本領(lǐng)域所知的方法能從真菌病原體中克隆本發(fā)明的ITS DNA序列。通常，從真菌分離株中分離DNA的方法是已知的。見(jiàn)，Raeder和Broda(1985)應(yīng)用微生物學(xué)信件(Letters in AppliedMicrobiology)217-20；Lee等人(1990)真菌遺傳學(xué)通訊(FungalGenetics Newsletter)3523-24；以及Lee和Taylor(1990)于《PCR方案方法與應(yīng)用指南》，Innes等人(編)；282-287頁(yè)。
此外，通過(guò)PCR擴(kuò)增能測(cè)定目的ITS序列。在一種例舉的實(shí)施方案中，根據(jù)White等人(1990；于《PCR方案》；編Innes等人；315-322頁(yè))設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整ITS區(qū)的引物，并將擴(kuò)增的ITS序列亞克隆到pCR II克隆載體中。亞克隆的序列包括左側(cè)ITS(ITS1)、右側(cè)ITS(ITS2)以及位于中央的5.8S rRNA基因。對(duì)鐮孢屬的幾個(gè)種包括早熟禾鐮孢和燕麥鐮孢以及Microdochium nivale均進(jìn)行這一過(guò)程。
在每一病原體組內(nèi)比較測(cè)定的ITS序列，以定位可用于PCR檢測(cè)的差異，用來(lái)區(qū)別不同種和/或株。SEQ ID NO19-24中顯示測(cè)定的ITSDNA序列，

圖1中顯示其比較性序列對(duì)比。根據(jù)差異的鑒定，合成了大量引物并在PCR擴(kuò)增中檢驗(yàn)。用于PCR擴(kuò)增試驗(yàn)的模板最初是純化的病原體DNA，隨后是從感染的宿主植物組織中分離的DNA。因此，有可能鑒定診斷性的引物對(duì)，即，其鑒定一種特定的病原體種或株而不是相同病原體的另一個(gè)種或株。也針對(duì)種間的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了引物，以開(kāi)發(fā)屬特異性引物以及能鑒定引起特定疾病的任一幾種真菌病原體的引物。例如，開(kāi)發(fā)了引物來(lái)檢測(cè)由多種真菌病原體包括鐮孢屬的種和Microdochium nivale引起的鐮孢屬的疾病。
優(yōu)選的引物組合能夠區(qū)別感染的宿主組織即以前已感染了一種特定病原體種或株的宿主組織中的不同種或株。本發(fā)明為鐮孢屬的種和Microdochium nivale提供了符合該標(biāo)準(zhǔn)的大量引物組合。本發(fā)明的引物是根據(jù)真菌ITS區(qū)之間的序列差異而設(shè)計(jì)的。序列間最少為一個(gè)堿基對(duì)的差異使辨別性引物的設(shè)計(jì)成為可能。針對(duì)特定真菌DNA ITS區(qū)設(shè)計(jì)的引物能與針對(duì)核糖體DNA編碼區(qū)內(nèi)保守序列制備的引物結(jié)合使用，以擴(kuò)增種特異的PCR片段，一般而言，引物應(yīng)具有約60℃到約70℃的理論解鏈溫度，以達(dá)到良好的敏感度，并且在引物組合之間應(yīng)沒(méi)有明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)和3’重疊。引物一般與ITS1或ITS2的至少約5-10個(gè)連續(xù)核苷酸堿基、優(yōu)選地與ITSl或ITS2的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸堿基具有序列同一性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引物長(zhǎng)度大約為5-30個(gè)核苷酸堿基。
在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的是一種用于真菌病原體鑒定的寡核苷酸引物，其中該寡核苷酸引物選自SEQ ID NO7-15。
本發(fā)明的另一種實(shí)施方案是一對(duì)寡核苷酸引物，其用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA序列的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中至少該引物之一是根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸引物。優(yōu)選的是一對(duì)寡核苷酸引物，其中該引物對(duì)選自根據(jù)權(quán)利要求8-12的寡核苷酸引物。
本發(fā)明涉及用于真菌病原體檢測(cè)的方法，其包括下列步驟(a)從感染了一種病原體的植物葉中分離DNA；(b)使用至少一種根據(jù)權(quán)利要求4的引物對(duì)該DNA施行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增；以及(c)通過(guò)顯示該聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物檢測(cè)該真菌病原體。
優(yōu)選的是用于真菌病原體檢測(cè)的所述方法，其中該真菌病原體選自早熟禾鐮孢和Microdochium nivale。
本發(fā)明進(jìn)一步包括一種用于真菌病原體檢測(cè)的方法，其包括下列步驟(a)從感染了一種病原體的植物葉中分離DNA；(b)用該DNA作為模板在應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求5的一對(duì)引物的聚合酶鏈反應(yīng)中擴(kuò)增該病原體的一部分內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列；以及
(c)通過(guò)顯示內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的擴(kuò)增部分檢測(cè)該真菌病原體。
優(yōu)選的是用于真菌病原體檢測(cè)的所述方法，其中該真菌病原體選自早熟禾鐮孢和Microdochium nivale。
本發(fā)明使之易于制備含有實(shí)行該方法所必需成分的“試劑盒”。這種試劑盒可包含一種被區(qū)室化的載體，其被密封于一種或多種容器如試管或小瓶中。其中一種容器可含有未標(biāo)記的或可檢測(cè)地標(biāo)記的DNA引物。標(biāo)記的DNA引物可以以?xún)龈傻男问酱嬖诨蛘呷绫匦钑r(shí)可存在于適當(dāng)緩沖液中。一種或多種容器可含有在PCR反應(yīng)中使用的一種或多種酶或試劑。這些酶可以單獨(dú)或混合地以?xún)龈尚问酱嬖?，或者存在于適當(dāng)緩沖液中。
最后，該試劑盒可含有實(shí)行本發(fā)明的技術(shù)所必需的所有附加成分，如緩沖液、抽提試劑、酶、移液管、平板、核酸、核苷三磷酸、濾紙、凝膠材料、轉(zhuǎn)移材料、放射自顯影用品，等等。
在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的是一種用于檢測(cè)真菌病原體的診斷試劑盒，其包含用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA序列進(jìn)行基于擴(kuò)增的檢測(cè)的引物對(duì)，其中至少該引物之一是根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸引物。
下列實(shí)施例顯示典型的實(shí)驗(yàn)方案，這些方案能用于ITS序列的分離、合適引物序列的篩選、對(duì)引物的選擇性和診斷性效能的檢驗(yàn)，以及這些引物對(duì)于疾病和真菌分離株檢測(cè)的應(yīng)用。提供這些實(shí)施例是作為說(shuō)明而不是作為限制。
附圖描述圖1/3、2/3、3/3黃色鐮孢(Fusarium culmorum)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、早熟禾鐮孢、Microdochium nivale和串珠鐮孢(Fusarium moniliforme)的ITS區(qū)的序列對(duì)比。
序列表中的序列簡(jiǎn)述SEQ ID NO1寡核苷酸引物ITS1。
SEQ ID NO2寡核苷酸引物ITS2。
SEQ ID NO3寡核苷酸引物ITS3。
SEQ ID NO4寡核苷酸引物ITS4。
SEQ ID NO5M13通用-20引物。
SEQ ID NO6實(shí)施例2中使用的反向引物。
SEQ ID NO7寡核苷酸引物JB605。
SEQ ID NO8寡核苷酸引物JB606。
SEQ ID NO9寡核苷酸引物JB607。
SEQ ID NO10 寡核苷酸引物JB609。
SEQ ID NO11 寡核苷酸引物JB610。
SEQ ID NO12 寡核苷酸引物JB611。
SEQ ID NO13 寡核苷酸引物JB612。
SEQ ID NO14 寡核苷酸引物JB613。
SEQ ID NO15 寡核苷酸引物JB614。
SEQ ID NO16 寡核苷酸引物JB578。
SEQ ID NO17 寡核苷酸引物JB571。
SEQ ID NO18 寡核苷酸引物JB572。
SEQ ID NO19 從黃色鐮孢分離株R-5106、R-5126和R-5146中PCR擴(kuò)增的ITS區(qū)的共有DNA序列，從5’到3’方向包含小亞單位rRNA基因的3’末端、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、5.8S rRNA基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2和大亞單位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO20從禾谷鐮孢分離株R-8417、R-8422和R-8546中PCR擴(kuò)增的ITS區(qū)的共有DNA序列，從5’到3’方向包含小亞單位rRNA基因的3’末端、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、5.8S rRNA基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2和大亞單位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO21從串珠鐮孢分離株4551中PCR擴(kuò)增的ITS區(qū)的DNA序列，從5’到3’方向包含小亞單位rRNA基因的3’末端、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、5.8S rRNA基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2和大亞單位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO22 從早熟禾鐮孢分離株T-427、T-534和T-756中PCR擴(kuò)增的ITS區(qū)的共有DNA序列，從5’到3’方向包含小亞單位rRNA基因的3’末端、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、5.8S rRNA基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2和大亞單位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO23 從Microdochium nivale分離株72、520和18222中PCR擴(kuò)增的ITS區(qū)的共有DNA序列，從5’到3’方向包含小亞單位rRNA基因的3’末端、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、5.8S rRNA基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2和大亞單位rRNA基因的5’末端。
SEQ ID NO24 從燕麥禾鐮孢分離株64452和R-4045中PCR擴(kuò)增的ITS區(qū)的共有DNA序列，從5’到3’方向包含小亞單位rRNA基因的3’末端、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、5.8S rRNA基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2和大亞單位rRNA基因的5’末端。
實(shí)施例在此所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，并由下列作者描述J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY(1989)及T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，《基因融合實(shí)驗(yàn)》(Experiments with Gene Fusions)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY(1984)以及Ausubel，F(xiàn).M.等人，《分子生物學(xué)常用方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。
實(shí)驗(yàn)例1真菌分離株和基因組真菌DNA提取參見(jiàn)表1關(guān)于所用真菌分離株及其來(lái)源的列表。在用源自PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)物的菌絲體片段接種的150ml馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)真菌。將培養(yǎng)物在定軌搖床上28℃溫育7-11天。離心沉淀菌絲體，然后在液氮中研磨，并用Lee和Taylor的方案(1990；于《PCR方案方法與應(yīng)用指南；編Innes等人；282-287頁(yè)》)提取總基因組DNA。
表1所試驗(yàn)分離株的來(lái)源
表1(續(xù))<
1Novartis作物保護(hù)有限公司，Basel，瑞士2美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland，美國(guó)3Paul Nelson博士，Penn State University，美國(guó)4Loral Castor博士，Novartis Seeds Research，Bloodmington，Illinois，美國(guó)5Peter Ueng博士，USDA，Beltsville，Maryland，美國(guó)6Novartis作物保護(hù)公司，Research Triangle Park，NC，美國(guó)實(shí)施例2內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的分離使用50pmol引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；SEQID NO1)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；SEQ IDNO4)，從分離自禾谷鐮孢分離株R-8417、R-8422和R-8546、黃色鐮孢分離株R-5106、R-5126和R-5146、串珠鐮孢分離株#4551、早熟禾鐮孢分離株T-0427、T-0534和T-0756、M.nivale分離株520、72和18222以及燕麥鐮孢分離株64452和R-4045的10ng基因組DNA中分別經(jīng)PCR擴(kuò)增大約550bp長(zhǎng)的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)片段。如實(shí)施例4所述進(jìn)行PCR。用Promega的Wizard DNA Clean-up試劑盒(Madison，WI)純化PCR產(chǎn)物。應(yīng)用Applied Biosystems(Foster City，CA)自動(dòng)化測(cè)序儀與引物IST1(SEQ ID NO1)、ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’；SEQ ID NO2)、ITS4(SEQ ID NO4)和M13通用-20(5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’；SEQ ID NO5)和反向(5’-AACAGCTATGACCATG-3’；SEQ ID NO6)引物，通過(guò)雙脫氧法測(cè)定ITS區(qū)的DNA序列。White等人(1990；于《PCR方案》；編Innes等人；315-322頁(yè))詳述了ITS引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4。用應(yīng)用PCR2.1克隆載體的Invitrogen公司(San Diego，CA)TA克隆試劑盒(貨號(hào)K2000-01)，克隆由擴(kuò)增串珠鐮孢分離株#4551，早熟禾鐮孢分離株T-0427、T-0534和T-0756以及M.nivale分離株520、72和18222所獲得的PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3從小麥中提取DNA用大塊浸解法從小麥中提取DNA。大塊浸解法用來(lái)從田間幾種自然感染的小麥穗或莖中分離DNA，以對(duì)高流通量分析優(yōu)化田間取樣法。
大塊浸解法(1)將適量的小麥穗或莖置于Bioreba(Reinach，瑞士)耐用塑料袋(目錄#490100)中。稱(chēng)重植物組織，塑料袋與葉減去皮重(塑料袋的重量)。
(2)每一重量(g)小麥組織中加入等體積(ml)的Muller提取緩沖液(0.01％w/v吐溫80；0.04M Tris-Cl，pH7.7；0.15M NaCl；0.1％w/vBSA-Pentex組分V；0.01％w/v疊氮鈉；200mM EDTA)。用設(shè)置為70的Bioreba Homex勻漿器浸軟組織。研磨葉子直到組織成纖維狀。(3)如果使用的話(huà)，合并多個(gè)袋中的提取物，并充分地渦旋振蕩。將提取液等分于置于冰上的eppendorf管中。
(a)將100μl濃縮的提取物煮沸5分鐘。
(b)將煮沸的提取物置于冰上。
(c)通過(guò)將100μl煮沸、濃縮的提取物加入90μl無(wú)菌蒸餾水中進(jìn)行1∶10稀釋。
(d)將稀釋的提取物貯存于冰上待用。
實(shí)施例4聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增應(yīng)用Perkin-Elmer/Cetus(Norwalk CT；貨號(hào)N808-0009)的GeneAmp試劑盒進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，其中使用50mM KCl、2.5mMMgCl2、10mM Tris-HCl，pH8.3，其中含有200μM每種dTTP、dATP、dCTP和dGTP、50pmol每種引物，2.5單位Taq聚合酶和10ng基因組DNA或1μl 1∶10稀釋的植物提取物，終體積50μl。在Perkin-Elmer/Cetus9600型熱循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)，94℃15秒、50-70℃15秒和72℃45秒，30-40次循環(huán)。通過(guò)將10μl每種PCR樣品加樣于1.0％瓊脂糖凝膠中并電泳來(lái)分析產(chǎn)物。
實(shí)施例5寡核苷酸的合成與純化通過(guò)如整合DNA技術(shù)(Coralville，IA)或Midland Certified ReagentCompany(Midland，Texas)合成寡核苷酸(引物)。
實(shí)施例6種特異性引物的選擇圖1顯示黃色鐮孢、禾谷鐮孢、早熟禾鐮孢、M.nivale和串珠鐮孢ITS區(qū)的序列對(duì)比。根據(jù)對(duì)比序列的分析按照實(shí)施例5合成如以下表2所示的寡核苷酸引物。針對(duì)含有真菌種間最大序列差異的區(qū)設(shè)計(jì)引物。也針對(duì)種間高度保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，以試圖開(kāi)發(fā)屬特異性引物。此外，為了與對(duì)ITS區(qū)特異的引物聯(lián)合試驗(yàn)，合成公開(kāi)的核糖體基因特異的引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4(White等人，1990；于《PCR方案》；編Innes等人，315-322頁(yè))。WO 95/29260的針對(duì)鐮孢屬的種的引物也與新設(shè)計(jì)的引物結(jié)合應(yīng)用，以檢驗(yàn)新的特異性。
表2為真菌檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物引物模板引物引物序列Fusarium spp.1JB605 5’CCAAACCATGTGAACTTACC3’(SEQ ID NO7)M.nivale JB606 5’GGGACTACCTAAACTCTGTT3’(SEQ ID NO8)M.nivale JB607 5’AGGGATCATTACCGAGTTT3’(SEQ ID NO9)M.nivale JB609 5’TCCGGCTTGCAGAAGCGAG3’(SEQ ID NO10)M.nivale JB610 5’GAAGGGTGCGGTTTATGGCT3’(SEQ ID NO11)M.nivale JB611 5’GCCACCGCCGGTGGAC3’(SEQ ID NO12)M.nivale JB612 5’GGTGCTGTCTCTCGGGAC3’(SEQ ID NO13)M.nivale JB613 5’AGTCAATCTGAATCAAACTAAG3’(SEQ ID NO14)M.nivale JB614 5’CTAAACTCTGTTAATTTTTGTCAA3’(SEQ ID NO15)鐮孢屬的種2JB578 5’CCGCGACGATTACCAG3’(SEQ ID NO16)禾谷鐮孢+黃色鐮孢3JB571 5’TAACGATATGTAAATTACTACGCT3’(SEQ ID NO17)禾谷鐮孢+黃色鐮孢3JB572 5’AAGTTGGGGTTTAACGGC3’(SEQ ID NO18)18SrDNA ITS1 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’(SEQ ID NO1)5.8SrDNAITS2 5’GCTGCGTTCTTCATCGATGC3’(SEQ ID NO2)5.8SrDNAITS3 5’GCATCGATGAAGAACGCAGC3’(SEQ ID NO3)25SrDNA ITS4 5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’(SEQ ID NO4)1鐮孢屬的種包括禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢、早熟禾鐮孢和串珠鐮孢。2鐮孢屬的種包括禾谷鐮孢、黃色鐮孢、早熟禾鐮孢、串珠鐮孢和粉紅鐮孢。3只對(duì)禾谷鐮孢、黃色鐮孢和M.nivale試驗(yàn)了引物組合。
實(shí)施例7對(duì)于純化真菌基因組DNA特異的引物的測(cè)定按照實(shí)施例4使用不同引物組合(表3)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增單一的特異片段。由依每種目的真菌株18S和25S核糖體DNA亞單位間的ITS區(qū)設(shè)計(jì)的引物產(chǎn)生特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
表3ITS衍生的診斷性PCR引物引物特異性 5’引物3’引物擴(kuò)增片段的近似大小M.nivaleJB612(SEQ ID NO13) ITS4(SEQ ID NO4) 472bpM.nivaleJB613(SEQ ID NO14) JB610(SEQ ID NO11)337bpM.nivaleJB614(SEQ ID NO15) JB610(SEQ ID NO11)355bpM.nivaleJB613(SEQ ID NO14) ITS4(SEQ ID NO4) 413bpM.nivaleJB614(SEQ ID NO15) ITS4(SEQ ID NO4) 431bpM.nivaleJB611(SEQ ID NO12) JB609(SEQ ID NO10)346bpM.nivaleJB611(SEQ ID NO12) ITS4(SEQ ID NO4) 450bpM.nivaleITS1(SEQ ID NO1)JB609(SEQ ID NO10)452bpM.nivaleITS1(SEQ ID NO1)JB610(SEQ ID NO11)480bpM.nivaleJB605(SEQ ID NO7) JB610(SEQ ID NO11)433bpM.nivaleJB606(SEQ ID NO8) JB610(SEQ ID NO11)362bpM.nivaleJB607(SEQ ID NO9) JB610(SEQ ID NO11)460bp鐮孢屬的種1+M.niv JB605(SEQ ID NO7) ITS4(SEQ ID NO4) 509bp鐮孢屬的種2JB605(SEQ ID NO7) JB578(SEQ ID NO16)417bp禾谷鐮孢+黃色鐮孢3IB605(SEQ ID NO7) JB572(SEQ ID NO18)440bp禾谷鐮孢+黃色鐮孢3IB605(SEQ ID NO7) JB571(SEQ ID NO17)400bp1鐮孢屬的種包括禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢、早熟禾鐮孢和串珠鐮孢。2鐮孢屬的種包括禾谷鐮孢、黃色鐮孢、早熟禾鐮孢、串珠鐮孢和粉紅鐮孢。3只對(duì)禾谷鐮孢、黃色鐮孢和M.nivale試驗(yàn)了引物組合。
實(shí)施例8對(duì)于感染真菌的植物組織特異的引物以及與其它谷類(lèi)真菌病原體的交叉反應(yīng)性的測(cè)定如實(shí)施例3所述從健康小麥穗并從接種了M.nivale、禾谷鐮孢、黃色鐮孢或燕麥鐮孢的小麥穗中分離總基因組DNA。如實(shí)施例4所述進(jìn)行PCR，對(duì)小麥組織的DNA檢驗(yàn)如表3所列的引物組合。如實(shí)施例1所述獲得純化的真菌基因組DNA，并如實(shí)施例4所述應(yīng)用診斷性引物對(duì)其進(jìn)行PCR試驗(yàn)。對(duì)其它真菌DNA種和分離株檢驗(yàn)診斷性引物與之交叉反應(yīng)的能力。代表性試驗(yàn)的結(jié)果如下M.nivale特異的引物組合JB612(SEQ ID NO13)和ITS4(SEQID NO4)能從表1所列所有M.nivale分離株的DNA中和M.nivale感染的小麥組織中擴(kuò)增出472bp的片段。該引物組合不能從健康小麥組織中也不能從純化的禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢、早熟禾鐮孢或串珠鐮孢基因組DNA中擴(kuò)增出診斷片段。該引物組合也不能從自下列常見(jiàn)谷類(lèi)病原體分離的純化基因組DNA中擴(kuò)增出診斷片段P.herpotrichoides R-和W-致病型、C.cereale、D.sorokiniana、草本枝孢、大豆殼針孢、小麥殼針孢、落花生尾孢、穎枯殼針孢、立枯絲核菌和S.avenae f.sp.triticea。用M.nivale特異的引物組合JB613(SEQ IDNO14)和JB610(SEQ ID NO11)獲得相似的診斷結(jié)果。
引物組合JB613(SEQ ID NO14)和ITS4(SEQ ID NO4)從M.nivale分離株#520的DNA和感染M.nivale的小麥中擴(kuò)增出413bp的片段，而引物組合JB614(SEQ ID NO15)和ITS4(SEQ ID NO4)擴(kuò)增出431 bp的片段。這些引物組合不能從健康小麥組織中也不能從禾谷鐮孢分離株#R-8422和黃色鐮孢分離株#R-5391的DNA中擴(kuò)增出任何片段。
表3所列的其它M.nivale特異的引物組合能從M.nivale分離株#520的DNA中而不能從禾谷鐮孢分離株#R-8422或黃色鐮孢分離株#R-5391的DNA中擴(kuò)增出PCR片段。
引物組合JB605(SEQ ID NO7)和ITS4(SEQ ID NO4)從表1所列所有M.nivale分離株的DNA中擴(kuò)增出509bp的片段。該引物組合也從表1所列全部禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢、早熟禾鐮孢和串珠鐮孢分離株的DNA中擴(kuò)增509bp的片段。該引物組合不能從自下列谷類(lèi)病原體分離的純化基因組DNA中擴(kuò)增出診斷片段P.herpotrichoidesR-和W-致病型、C.cereale、D.sorokiniana、草本枝孢、大豆殼針孢、小麥殼針孢、落花生尾孢、穎枯殼針孢、立枯絲核菌和S.avenae f.sp.triticea。引物組合JB605(SEQ ID NO7)和ITS4(SEQ ID NO4)也能從感染了鐮孢屬的種的小麥中而不能從健康小麥中擴(kuò)增出診斷片段。
引物組合JB605(SEQ ID NO7)和JB571(SEQ ID NO17)、JB605(SEQ ID NO7)和JB572(SEQ ID NO18)以及JB605(SEQID NO7)和JB578(SEQ ID NO16)從禾谷鐮孢分離株#R-8422和黃色鐮孢分離株#R-5391的DNA中分別擴(kuò)增400bp、440bp和417bp的片段，而不能從M.nivale分離株#520的DNA中擴(kuò)增。此外，引物組合JB605(SEQ ID NO7)和JB578(SEQ ID NO16)能從表1所列全部禾谷鐮孢、串珠鐮孢、粉紅鐮孢、早熟禾鐮孢和黃色鐮孢分離株中擴(kuò)增出診斷片段；然而，該引物組合不能從表1所列任何燕麥鐮孢分離株或M.nivale分離株中擴(kuò)增。引物組合JB605(SEQ ID NO7)和JB571(SEQID NO17)、JB605(SEQ ID NO7)和JB572(SEQ ID NO18)以及JB605(SEQ ID NO7)和JB578(SEQ ID NO16)不能從健康小麥或自下列谷類(lèi)病原體分離的純化基因組DNA中擴(kuò)增出診斷片段P.herpotrichoides R-和W-致病型、C.cereale、D.sorokiniana、草本枝孢、大豆殼針孢、小麥殼針孢、落花生尾孢、穎枯殼針孢、立枯絲核菌和S.avenae f.sp.triticea。
盡管已參照特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)當(dāng)理解，多種變化、修改和進(jìn)一步的實(shí)施方案是可能的，因此，所有這些變化、修改和實(shí)施方案都被看作落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Beck，James J.(ii)發(fā)明名稱(chēng)應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)小麥真菌病原體的檢測(cè)(iii)序列數(shù)目24(iv)聯(lián)系地址(A)收件人Novartis公司專(zhuān)利部(B)街道3054 Cornwallis Road(C)城市Research Triangle Park(D)州NC(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼20779-2257(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型磁盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version 1.30(vi)當(dāng)前申請(qǐng)信息(A)申請(qǐng)?zhí)?B)遞交日期(C)分類(lèi)(viii)律師/代理機(jī)構(gòu)信息(A)名稱(chēng)Meigs，J.Timothy(B)登記號(hào)38,241(C)文獻(xiàn)/案卷號(hào)CGC 1944(ix)通訊信息(A)電話(huà)(919)541-8587(B)傳真(91)541-8689(2)SEQ.ID.NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物ITS1”(xi)SEQ.ID.NO.1的序列描述TCCGTAGGTG AACCTGCGG 19(2)SEQ.ID.NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物ITS2”(xi)SEQ.ID.NO.2的序列描述GCTGCGTTCT TCATCGATGC 20(2)SEQ.ID.NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸
(A)描述/desc＝“引物ITS 3”(xi)SEQ.ID.NO.3的序列描述GCATCGATGA AGAACGCAGC 20(2)SEQ.ID.NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物ITS｀4”(xi)SEQ.ID.NO.4的序列描述TCCTCCGCTT ATTGATATGC 20(2)SEQ.ID.NO.5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“M13通用-20引物”(xi)SEQ.ID.NO.5的序列描述GTAAAACGAC GGCCAGT 17(2)SEQ.ID.NO.6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)
(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“用于實(shí)施例2的逆轉(zhuǎn)錄引物”(xi)SEQ.ID.NO.6的序列描述AACAGCTATG ACCATG 16(2)SEQ.ID.NO.7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB605”(xi)SEQ.ID.NO.7的序列描述CCAAACCATG TGAACTTACC 20(2)SEQ.ID.NO.8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB606”(xi)SEQ.ID.NO.8的序列描述GGACTACCTA AACTCTGTT 19(2)SEQ.ID.NO.9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB607”(xi)SEQ.ID.NO.9的序列描述AGGGATCATT ACCGAGTTT 19(2)SEQ.ID.NO.10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB609”(xi)SEQ.ID.NO.10的序列描述TCCGGCTTGC AGAAGCGAG 19(2)SEQ.ID.NO.11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB610”(xi)SEQ.ID.NO.11的序列描述GAAGGGTGCG GTTTATGGCT 20(2)SEQ.ID.NO.12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB611”(xi)SEQ.ID.NO.12的序列描述GCCACCGCCG GTGGAC 16(2)SEQ.ID.NO.13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物612”(xi)SEQ.ID.NO.13的序列描述GGTGCTGTCT CTCGGGAC18(2)SEQ.ID.NO.14的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB613”(xi)SEQ.ID.NO.14的序列描述AGTCAATCTG AATCAAACTA AG 22(2)SEQ.ID.NO.15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB614”(xi)SEQ.ID.NO.15的序列描述CTAAACTCTG TTAATTTTTG TCAA 24(2)SEQ.ID.NO.16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB578”(xi)SEQ.ID.NO.16的序列描述
CCGCGACGAT TACCAG 16(2)SEQ.ID.NO.17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB571”(xi)SEQ.ID.NO.17的序列描述TAACGATATG TAAATTACTA CGCT 24(2)SEQ.ID.NO.18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型其它核酸(A)描述/desc＝“引物JB572”(xi)SEQ.ID.NO.18的序列描述AAGTTGGGGT TTAACGGC18(2)SEQ.ID.NO.19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度504個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(A)描述/desc＝“引物ITS1”(vi)初始來(lái)源(A)生物黃色鐮孢(C)單獨(dú)分離株R-5106，R-5126和R-5146(共有序列)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..12(D)其他信息/注＝“rRNA基因小亞基的3’端”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置13..161(D)其他信息/注＝“ITS1”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置162..318(D)其他信息/注＝“5.8 S rRNA基因”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置319..472(D)其他信息/注＝“ITS2”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置473..504(D)其他信息/注＝“rRNA基因大亞基的5’端”(xi)SEQ.ID.NO.19的序列描述GAGGGATCAT TACCGAGTTT ACTRACTCCC AAACCCCTGT GAACDTACCT TATGTTGCCT60
CGGCGGATCA GCCCGCGCCC CGTAAAAAGG GACGGCCCGC CGCAGGAACC CTAAACTCTG120TTTTTAGTGG AACTTCTGAG TATAAAAAAC AAATAAATCA AAACTTTCAA CAACGGATCT180CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC AAAATGCGAT AAGTAATGTG AATTGCAGAA240TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCG CCAGTATTCT GGCGGGCATG300CCTGTTCGAG CGTCATTTCA ACCCTCAAGC CCAGCTTGGT GTTGGGAGCT GCAGTCCTGC360TGCACTCCCC AAATACATTG GCGGTCACGT CGRAGCTTCC ATAGCGTAGT AATTTACATA420TCGTTACTGG TAATCGTCGC GGCYACGCCG TTAAACCCCA ACTTCTGAAT GTTGACCTCG480GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAA 504(2)SEQ.ID.NO.20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度503個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)初始來(lái)源(A)生物禾谷鐮孢(C)單獨(dú)分離株R-8417，R-8422和R-8546(共有序列)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..9(D)其他信息/注＝“rRNA基因小亞基的3’端”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置10..155(D)其他信息/注＝“ITS1”(ix)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置156..312(D)其他信息/注＝“5.8 S rRNA基因”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置313..466(D)其他信息/注＝“ITS2”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置467..503(D)其他信息/注＝“rRNA基因大亞基的5’端”(xi)SEQ.ID.NO.20的序列描述GGATCATTAC CGAGTTTACW SACTCCCAAA CCCCTGTGAA CATACCTTAT GTTGCCTCGG 60CGGATCAGCC CGCGCCCCGA AAGGGACGGC CCGCCGCAGG AACCCTAAAC TCTGTTTTTA 120GTGGAACTTC TGAGTATAAA AAACAAATAA ATCAAAACTT TCAACAACGG ATCTCTTGGT 180KCTGGCATCG ATGAAGAACG CASCRAAATG CGATAAGTAA TGTGWATTGC AGAATTCAGT 240GAATCAWCGA ATCTTTGAAC GCWSATTGCK MCCRCCAGTA TTCTGGCGGG CATGCCTGTT 300CGAGCGTCAT TTCAACCCTC AAGCCCAGVT TGGTGTKGGG GARYTGCAGK CCTRYTKCAC 360TCCCCAAATA ARTTGGCGGT CACGTCGAAC TTCCATAGCG TAGTAAGTTA CACATCGTTA 420CTGGTAATCG TCGCGGCTAC GCCGTTAAAC CCCAACTTCT GAATGTTGAC CTCGGATCAG 480GTAGGAATAC CCGCTGAAGG TAA 503(2)SEQ.ID.NO.21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度545個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)初始來(lái)源(A)生物串珠鐮孢(C)單獨(dú)分離株4551(vi)直接來(lái)源(B)克隆pCRFMON1(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..30(D)其他信息/注＝“rRNA基因小亞基的3’端”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置31..178(D)其他信息/注＝“ITS1”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置179..335(D)其他信息/注＝“5.8 S rRNA基因”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置336..488(D)其他信息/注＝“ITS2”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置489..545(D)其他信息/注＝“rRNA基因大亞基的5’端”(xi)SEQ.ID.NO.21的序列描述TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTTTAC AACTCCCAAA CCCCTGTGAA 60CATACCTTAT GTTGCCTCGG CGGATCAGCC CGCGCCCCGT AAAAAGGGAC GGCCCGCCGC120AGGAACCCTA AACTCTGTTT TTAGTGGAAC TTCTGAGTAT AAAAAACAAA TAAATCAAAA180CTTTCAACAA CGGATCTCTT GGTTCTGGCA TCGATGAAGA ACGCAGCAAA ATGCGATAAG240TAATGTGAAT TGCAGAATTC AGTGAATCAT CGAATCTTTG AACGCACATT GCGCCCGCCA300GTATTCTGGC GGGCATGCCT GTTCGAGCGT CATTTCAACC CTCAAGCCCA GCTTGGTGTT360GGGAGCTGCA GTCCTGCTGC ACTCCCCAAA TACATTGGCG GTCACGTCGA GCTTCCATAG420CGTAGTAATT TACACATCGT TACTGGTAAT CGTCGCGGCC ACGCCGTTAA ACCCCAACTT480CTGAATGTTG ACCTCGGATC AGGTAGGAAT ACCCGCTGAA CTTAAGCATA TCAATAAGCG540GAGGA545(2)SEQ.ID.NO.22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度546個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)初始來(lái)源(A)生物早熟禾鐮孢(C)單獨(dú)分離株T-427，T-534和T-756(共有序列)(vi)直接來(lái)源(B)克隆pCRFpoaeT427(1-2)，pCRFpoaeT534(2-2)和pCRFpoaeT756(3-1)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..30
(D)其他信息/注＝“rRNA基因小亞基的3’端”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置31..180(D)其他信息/注＝“ITS 1”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置181..337(D)其他信息/注＝“5.8 S rRNA基因”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置338..489(D)其他信息/注＝“ITS 2”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置490..546(D)其他信息/注＝“rRNA基因大亞基的5’端”(xi)SEQ.ID.NO.22的序列描述TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTTTAC AACTCCCAAA CCCCTGTGAA 60CATACCTTTA TGTTGCCTCG GCGGATCAGC CCGCGCCCCG TAAAACGGGA CGGCCCGCCG120CAGGAAACCC TAAACTCTGT TTTTAGTGGA ACTTCTGAGT ATAAAAAACA AATAAATCAA180AACTTTCAAC AACGGATCTC TTGGTTCTGG CATCGATGAA GAACGCAGCA AAATGCGATA240AGTAATGTGA ATTGCAGAAT TCAGTGAATC ATCGAATCTT TGAACGCACA TTGCGCCCGC300CAGTATTCTG GCGGGCATGC CTGTTCGAGC GTCATTTCAA CCCTCAAGCC CAGCTTGGTG360TTGGGATCTG TGTGCAAACA CAGTCCCCAA ATTGATTGGC GGTCACGTCG AGCTTCCATA420GCGTAGTAAT TTACACATCG TTACTGGTAA TCGTCGCGGC CACGCCGTTA AACCCCAACT480TCTGAATGTT GACCTCGGAT CAGTAGGAAA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT ATCAATAAGC540GGAGGA 546(2)SEQ.ID.NO.23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度556個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)初始來(lái)源(A)生物Microdochium nivale(C)單獨(dú)分離株72,520和18222(共有序列)(vi)直接來(lái)源(B)克隆pCRMniv72(5-2)，pCRMniv520(4-2)和pCRM18222(6-2)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1..30(D)其他信息/注＝“rRNA基因小亞基的3’端”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置31..175(D)其他信息/注＝“ITS1”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置176..332(D)其他信息/注＝“5.8 S rRNA基因”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置333..499(D)其他信息/注＝“ITS2”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置500..556(D)其他信息/注＝“rRNA基因大亞基的5’端”(xi)SEQ.ID.NO.23的序列描述TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CTGAGTTTTT AACTCTCCAA ACCATGTGAA 60CTTACCACTG TTGCCTCGGT GGATGGTGCT GTCTCTCGGG ACGGTGCCAC CGCCGGTGGA120CTACCTAAAC TCTGTTAATT TTTGTCAATC TGAATCAAAC TAAGAAATAA GTTAAA CTT180TCAACAACGG ATCTCTTGGT TCTGGCATCG ATGAAGAACG CAGCGAAATG CGATAAGTAA240TGTGAATTGC AGAATTCAGT GAATCATCGA ATCTTTGAAC GCACATTGCG CCCATTAGTA300TTCTAGTGGG CATGCCTGTT CGAGCGTCAT TTCAACCCTT AAGCCTAGCT TAGTGTTGGG360AGACTGCCTA ATACGCAGCT CCTCAAAACC AGTGGCGGAG TCGGTTCGTG CTCTGAGCGT420AGTAATTTTT TATCTCGCTT CTGCAAGCCG GACTGGCAAC AGCCATAAAC CGCACCCTTC480GGGGGCACTT TTTAATGGTT GACCTCGGAT CAGGTAGGAA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT540ATCAATAAGC GGAGGA556(2)SEQ.ID.NO.24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度561個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組)(vi)初始來(lái)源
(A)生物燕麥鐮孢(C)單獨(dú)分離株64452和R-4045(共有序列)(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞miscc_fature(B)位置1..30(D)其他信息/注＝“rRNA基因小亞基的3’端”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置31..181(D)其他信息/注＝“ITS’1”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_fature(B)位置182..338(D)其他信息/注＝“5.8 S rRNA基因”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_fature(B)位置339..504(D)其他信息/注＝“ITS2”(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置505..561(D)其他信息/注＝“rRNA基因大亞基的5’端”(xi)SEQ.ID.NO.24的序列描述TCCGTAGGTG AACCTGCGGA GGGATCATTA CCGAGTTTAC AACTCCCAAA CCCCTGTGAA 60CATACCTTAA TGTTGCCTCG GCGGATCAGC CCGCGCCCYG TAAAACGGGA CGGCCCGCCA120GAGGACCCAA ACTCTAATGT TTCTTATTGT AACTTCTGAG TAAAACAAAC AAATAAATCA180AAACTTTCAA CAACGGATCT CTTGGTTCTG GCATCGATGA AGAACGCAGC AAAATGCGAT240AAGTAATGTG AATTGCAGAA TTCAGTGAAT CATCGAATCT TTGAACGCAC ATTGCGCCCG300CTGGTATTCC GGCGGGCATG CCTGTTCGAG CGTCTTTCA ACCCTCAAGC CCCCGGGTTT 360GGTGTTGGGG ATCGGCTCTG CCTTMYGGCG GTGCCGCCCC CGAAATACAT TGGCGGTCTC420GCTGCAGCCT CCATTGCGTA GTAGCTAACA CCTCGCAACT GGAACGCGGC GCGGCCATGC480CGTAAAACCC CAACTTCTGA ATGTTGACCT CGGATCAGGT AGGAATACCC GCTGAACTTA540AGCATATCAA TAAGCGGAGG A 56權(quán)利要求
1.一種含有內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的分離的DNA分子，該內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列選自早熟禾鐮孢的ITS1、早熟禾鐮孢的ITS2、Microdochium nivale的ITS1、Microdochium nivale的ITS2、燕麥鐮孢的ITS1和燕麥鐮孢的ITS2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中早熟禾鐮孢的IST1包含SEQ ID NO22的核苷酸31-180，早熟禾鐮孢的IST2包含SEQ IDNO22的核苷酸338-489，Microdochium nivale的ITS1包含SEQ IDNO23的核苷酸31-175，Microdochium nivale的ITS2包含SEQ ID NO23的核苷酸333-499，燕麥鐮孢的ITS1包含SEQ ID NO24的核苷酸31-181，燕麥鐮孢的ITS2包含SEQ ID NO24的核苷酸339-504。
3.一種寡核苷酸引物，其用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中該引物與權(quán)利要求2的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的至少約5-10個(gè)連續(xù)核苷酸具有序列同一性。
4.一種寡核苷酸引物，其用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA序列的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中該引物與權(quán)利要求2的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸具有序列同一性。
5.一對(duì)寡核苷酸引物，其用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA序列的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中至少該對(duì)引物之一是權(quán)利要求4的寡核苷酸引物。
6.一種用于真菌病原體鑒定的寡核苷酸引物，其中該寡核苷酸引物選自SEQ ID NO7-15。
7.一對(duì)寡核苷酸引物，其用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA序列的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中至少該對(duì)引物之一是權(quán)利要求6的寡核苷酸引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的寡核苷酸引物對(duì)，其中該引物對(duì)選自下列引物對(duì)SEQ ID NO13和SEQ ID NO4；SEQ ID NO14和SEQ ID NO11；SEQ ID NO15和SEQ ID NO11；SEQ ID NO14和SEQ ID NO4；SEQ ID NO15和SEQ ID NO4；SEQ ID NO12和SEQ ID NO10；SEQ ID NO12和SEQ ID NO4；SEQ ID NO1和SEQ ID NO10；SEQ ID NO1和SEQ ID NO11；SEQ ID NO7和SEQ ID NO11；SEQ ID NO8和SEQ ID NO11；SEQ ID NO9和SEQ ID NO11；SEQ ID NO7和SEQ ID NO4；SEQ ID NO7和SEQ ID NO16；SEQ ID NO7和SEQ ID NO18；以及SEQ ID NO7和SEQ ID NO17。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的寡核苷酸引物對(duì)，其中該引物對(duì)用于檢測(cè)Microdochium nivale，并且該引物對(duì)選自下列引物對(duì)SEQ ID NO13和SEQ ID NO4；SEQ ID NO14和SEQ ID NO11；SEQ ID NO15和SEQ ID NO11；SEQ ID NO14和SEQ ID NO4；SEQ ID NO15和SEQ ID NO4；SEQ ID NO12和SEQ ID NO10；SEQ ID NO12和SEQ ID NO4；SEQ ID NO1和SEQ ID NO10；SEQ ID NO1和SEQ ID NO11；SEQ ID NO7和SEQ ID NO11；SEQ ID NO8和SEQ ID NO11；以及SEQ ID NO9和SEQ ID NO11。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的寡核苷酸引物對(duì)，其中該引物對(duì)用于檢測(cè)Microdochium nivale、禾谷鐮孢、黃色鐮孢、燕麥鐮孢、早熟禾鐮孢和串珠鐮孢，并且該引物對(duì)包含SEQ ID NO7和SEQ ID NO4。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的寡核苷酸引物對(duì)，其中該引物對(duì)用于檢測(cè)禾谷鐮孢、串珠鐮孢、粉紅鐮孢、早熟禾鐮孢和黃色鐮孢，并且該引物對(duì)包含SEQ ID NO7和SEQ ID NO16。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的寡核苷酸引物對(duì)，其中該引物對(duì)用于檢測(cè)禾谷鐮孢和黃色鐮孢，并且該引物對(duì)選自下列引物對(duì)SEQ ID NO7和SEQ ID NO18；以及SEQ ID NO7和SEQ ID NO17。
13.一種用于真菌病原體檢測(cè)的方法，其包括下列步驟(a)從感染了一種病原體的植物葉中分離DNA；(b)使用至少一種根據(jù)權(quán)利要求4的引物對(duì)該DNA施行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增；以及(c)通過(guò)顯示該聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增的產(chǎn)物檢測(cè)該真菌病原體。
14.權(quán)利要求13的方法，其中該真菌病原體選自早熟禾鐮孢和Microdochium nivale。
15.一種用于真菌病原體檢測(cè)的方法，其包括下列步驟(a) 從感染了一種病原體的植物葉中分離DNA；(b) 用該DNA作為模板在應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求5的一對(duì)引物的聚合酶鏈反應(yīng)中擴(kuò)增該病原體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的一部分；以及(c) 通過(guò)顯示內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的擴(kuò)增部分檢測(cè)該真菌病原體。
16.權(quán)利要求15的方法，其中該真菌病原體選自早熟禾鐮孢和Microdochium nivale。
17.一種用于檢測(cè)真菌病原體的診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求4的引物。
18.一種用于檢測(cè)真菌病原體的診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求5的引物對(duì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中該內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列選自早熟禾鐮孢的ITS1和ITS2。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的分離的DNA分子，其中早熟禾鐮孢的ITS1包含SEQ ID NO22的核苷酸31-180，而早熟禾鐮孢的IST2包含SEQ IDNO22的核苷酸338-489。
21.一種寡核苷酸引物，其用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA序列的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中該引物與權(quán)利要求20的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸具有序列同一性。
22.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中該內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列選自Microdochium nivale的ITS1和ITS2。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的分離的DNA分子，其中Microdochium nivale的ITS1包含SEQ ID NO23的核苷酸31-175，而Microdochium nivale的ITS2包含SEQ ID NO23的核苷酸333-499。
24.一種寡核苷酸引物，其用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA序列的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中該引物與權(quán)利要求23的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸具有序列同一性。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中該內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列選自燕麥鐮孢的ITS1和ITS2。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的分離的DNA分子，其中燕麥鐮孢的ITS1包含SEQ ID NO24的核苷酸31-181，燕麥鐮孢的ITS2包含SEQ ID NO24的核苷酸339-504。
27.一種寡核苷酸引物，其用于對(duì)真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA序列的基于擴(kuò)增的檢測(cè)，其中該引物與權(quán)利要求26的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸具有序列同一性。
全文摘要
對(duì)于小麥真菌病原體的不同種和株,包括鐮孢屬的種和Microdochium nivale,描述了源自核糖體RNA基因區(qū)的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)DNA序列。源自這些序列內(nèi)的特異性引物經(jīng)確定認(rèn)為可用于利用基于PCR的技術(shù)對(duì)真菌分離株的鑒定。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1265159SQ98807632
公開(kāi)日2000年8月30日 申請(qǐng)日期1998年7月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月4日
發(fā)明者J·J·貝克 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司