專利名稱：使用來自無血清饑餓的分化細(xì)胞的供體細(xì)胞核進(jìn)行克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將來自無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞核移植哺乳動物入與供體細(xì)胞核相同種的去核哺乳動物卵母細(xì)胞的克隆方法。對此細(xì)胞核進(jìn)行程序重調(diào)以指導(dǎo)克隆的胚胎發(fā)育，然后可以將其移植入雌性受體以產(chǎn)生胎兒或后代或者用于產(chǎn)生培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(CICM)。此克隆的胚胎也可與受精的胚胎結(jié)合以產(chǎn)生嵌合胚、胎兒和/或后代。
背景技術(shù)：
已有報道使用有蹄動物的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞進(jìn)行核移植。例如，Collas等在Mol.Reprod.Dev.38264-267(1994)中公開了通過將裂解的供體細(xì)胞顯微注射入去核的成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行牛ICMs的核移植。Collas等公開了將胚在體外培養(yǎng)七天產(chǎn)生的十五個胚細(xì)胞轉(zhuǎn)移入牛受體時使其中四頭懷孕及兩頭生產(chǎn)。并且，Keefer等在Biol.Reprod.，50935-939(1994)中公開了在核移植方法中將牛的ICM細(xì)胞作為供體核產(chǎn)生的胚細(xì)胞移植入牛的受體時，產(chǎn)生了一些可存活的后代。并且，Sims等在美國國家科學(xué)院院報906143-6147(1993)中公開了通過將在體外短期培養(yǎng)的牛ICM細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入去核的成熟卵母細(xì)胞可生產(chǎn)小牛。
也有報道稱移植培養(yǎng)的胎盤細(xì)胞核后可產(chǎn)生能存活的小羊(Campbell等，自然，38064-68(1996))。更進(jìn)一步地，已有報道核移植中牛多能胚細(xì)胞的使用和嵌合胎兒的產(chǎn)生(Stice等，Biol.Reprod，54100-110(1996)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994))。Collas等證明顆粒細(xì)胞(成體細(xì)胞)可用于牛克隆方法以產(chǎn)生胚胎。但是，未能證明胚胎早期(胚泡期)之后的發(fā)育。并且，顆粒細(xì)胞不易培養(yǎng)并僅能從雌性獲得。Collas等未嘗試在培養(yǎng)中繁殖顆粒細(xì)胞或試圖遺傳修飾那些細(xì)胞。Wilmut等(自然，365810-813(1997))從胎兒成纖維細(xì)胞產(chǎn)生核移植綿羊后代，并且從成體綿羊細(xì)胞產(chǎn)生了一個后代。
在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因豬的領(lǐng)域中也存在問題。通過現(xiàn)有方法，將異源DNA引入在胎兒中分化成各種細(xì)胞類型并最終發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物的早期胚或胚細(xì)胞系。但是，產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)基因動物需要許多早期胚，因此該方法是非常低效的。并且，沒有在花費時間和經(jīng)費將胚放入代理雌性體內(nèi)之前篩選轉(zhuǎn)基因胚的簡單及有效的方法。此外，基因?qū)蚣夹g(shù)不易于用早期胚轉(zhuǎn)基因技術(shù)完成。
小鼠中的胚胎干細(xì)胞使研究人員能夠篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并進(jìn)行基因?qū)?。這導(dǎo)致與其它轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比將更多地使用遺傳工程。但是，必需將胚胎干細(xì)胞系和其它胚細(xì)胞系維持在未分化狀態(tài)，這需要飼養(yǎng)層和/或在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子。即使采取了這些預(yù)防措施，這些細(xì)胞仍會經(jīng)常發(fā)生自發(fā)分化并且不能通過現(xiàn)有可獲得的方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。并且，一些胚細(xì)胞系必須以不利于基因?qū)蚍椒ǖ姆绞竭M(jìn)行繁殖。
從早先預(yù)移植的小鼠胚中體外獲得胚胎干(ES)細(xì)胞系的方法為大家所熟知。(見，例如Evans等，自然，29154-156(1981)；Martin，美國國家科學(xué)院院報，787634-7638(1981))。假如由于成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層(Evans等，Id.)或分化抑制源(Smith等，生物學(xué)進(jìn)展，1211-9(1987))存在的話，能使ES細(xì)胞以未分化狀態(tài)傳代。
以前已報道ES細(xì)胞具有許多應(yīng)用。例如，已報道ES細(xì)胞可用作分化的體外模型，特別可用于研究早期發(fā)育調(diào)節(jié)中涉及的基因。當(dāng)將小鼠ES細(xì)胞引入預(yù)移植的小鼠胚時可產(chǎn)生種系嵌合體，從而證明了它們的多能性(Bradley等，自然，309255-256(1984))。
由于ES細(xì)胞將其基因組傳遞到下一代的能力，它們具有通過使用帶有或不帶有所需的遺傳修飾的ES細(xì)胞進(jìn)行家畜動物種系操作的潛在用途。并且，在家畜動物如有蹄動物中，來自如預(yù)移植家畜胚的核可促進(jìn)去核卵母細(xì)胞的發(fā)育(Smith等，Biol.Reprod.，401027-1035(1989)；和Keefer等，Biol.Reprod.，50935-939(1994))。相反，據(jù)報道來自小鼠超過8細(xì)胞階段的胚的核在轉(zhuǎn)移后并不促進(jìn)去核卵母細(xì)胞的發(fā)育(Cheong等，Biol.Reprod.，48958(1993))。因此，來自家畜動物的ES細(xì)胞是非常理想的，因為它們可提供經(jīng)遺傳操作的全能性供體核的潛在來源或用于核移植方法。
一些研究小組已報道了稱為多能性胚細(xì)胞系的分離。例如，Notarianni等在J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260(1991)中報道了來自豬和綿羊胚泡的認(rèn)為穩(wěn)定的全能性細(xì)胞系的建立，該細(xì)胞系表現(xiàn)出一些與從綿羊胚泡免疫外科分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的初級培養(yǎng)物的細(xì)胞相似的形態(tài)學(xué)和生長特性。同時，Notarianni等也在J.Reprod.Fert.Suppl.，4151-56(1990)中公開了來自豬胚泡的推定是全能性胚細(xì)胞系的培養(yǎng)物的維持和分化。Gerfen等在動物生物技術(shù)，6(1)1-14(1995)中公開了從豬胚泡分離胚細(xì)胞系。這些細(xì)胞可在不使用條件培養(yǎng)基的小鼠胚的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層中穩(wěn)定維持，并且據(jù)報道在培養(yǎng)過程中分化成幾種不同的細(xì)胞類型。
并且，Saito等在Roux’s Arch.Dev.Biol.，201134-141(1992)中報道培養(yǎng)的牛胚胎千細(xì)胞樣細(xì)胞可存活三代，但在第四次傳代后死亡。Handyside等在Roux’s Arch.Dev.Biol.，196185-190(1987)中公開了在分離來自小鼠ICMs的小鼠ES細(xì)胞系的條件下培養(yǎng)免疫外科分離的綿羊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。Handyside等報道在這樣的條件下，綿羊ICMs附著、擴(kuò)散并發(fā)育出ES細(xì)胞樣和內(nèi)胚層細(xì)胞樣細(xì)胞的區(qū)域，但在進(jìn)行更長時間的培養(yǎng)后僅有內(nèi)胚層樣細(xì)胞明顯可見。
近來，Cherny等在Theriogenology，41175(1994)中報道了來自稱為多能性牛原生殖細(xì)胞的細(xì)胞系可在長期培養(yǎng)過程中維持。這些細(xì)胞，在培養(yǎng)約7天后，產(chǎn)生堿性磷酸酶(AP)染色為陽性的ES樣集落，表現(xiàn)形成胚狀體的能力，并自發(fā)分化成至少兩種不同的細(xì)胞類型。據(jù)報道這些細(xì)胞還表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子OCT4、OCT6和HES1的mRNA，這確信是專門由ES細(xì)胞表達(dá)的同源異型框基因的模式。
并且，近來Campbell等在自然，38064-68(1996)中報道了將來自在促進(jìn)小鼠中ES細(xì)胞系分離的條件下培養(yǎng)的9天齡綿羊胚的培養(yǎng)的胎盤(ED)細(xì)胞進(jìn)行核移植之后，可產(chǎn)生存活的小羊。作者得出結(jié)論，來自9天齡綿羊胚的ED細(xì)胞在經(jīng)過核移植后是全能性的，并且這種全能性可在培養(yǎng)過程中得到維持。
Van Stekelenburg-Hamers等在Mol.Reprod.Dev.，40444-454(1995)中報道了來自牛胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞的稱為永久細(xì)胞系的分離和特性鑒定。作者在不同條件下分離并培養(yǎng)來自8或9天齡的牛胚泡的ICM以測定哪一種輔助細(xì)胞和培養(yǎng)基在促進(jìn)牛ICM細(xì)胞的附著和生長中最為有效。他們得出結(jié)論培養(yǎng)的ICM細(xì)胞的附著和生長可通過使用STO(小鼠成纖維細(xì)胞)輔助細(xì)胞(代替牛的子宮內(nèi)皮細(xì)胞)和使用補(bǔ)充以活性碳-解吸的血清(而不是標(biāo)準(zhǔn)血清)的培養(yǎng)基得到增強(qiáng)。然而，Van Stekelenburg等報道了他們的細(xì)胞系更類似于上皮細(xì)胞而不是多能性ICM細(xì)胞。
Smith等于1994年10月27日公開的WO 94/24274、Evans等于1990年4月5日公開的WO 90/03432和Wheeler等于1994年11月24日公開的WO 94/26889報道了認(rèn)為可用于獲得轉(zhuǎn)基因動物的動物干細(xì)胞的分離、篩選和繁殖。Evans等也報道了來自豬和牛物種的認(rèn)為對產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物有用的稱為多能性干細(xì)胞的衍生。并且，Wheeler等于1994年11月24日公開的WO 94/26884也公開了認(rèn)為對制備嵌合的和轉(zhuǎn)基因的有蹄動物有用的胚胎干細(xì)胞。
因此，基于前面所述的內(nèi)容，可明顯看出許多小組由于ES細(xì)胞系在克隆或轉(zhuǎn)基因胚的產(chǎn)生和核移植中的潛在應(yīng)用，已嘗試制備ES細(xì)胞系。
盡管，以前文獻(xiàn)已有報道，仍需要克隆哺乳動物的改進(jìn)方法。
發(fā)明目的和概述本發(fā)明的目的是提供用于產(chǎn)生克隆的哺乳動物(如胚胎、胎兒和后代)的新的和改進(jìn)的方法。
本發(fā)明更具體的目的是提供用于克隆哺乳動物的涉及將無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞核移植入相同種去核卵母細(xì)胞的新方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于繁殖具有已證實的遺傳優(yōu)越性或其它理想性狀的成年哺乳動物的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用于產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物(即胚胎、胎兒、后代)的改進(jìn)方法。本發(fā)明還提供通過這種方法產(chǎn)生的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物。
本發(fā)明的更具體的目的是提供通過在使用分化的細(xì)胞或細(xì)胞核形成NT單位之前在分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核內(nèi)插入、去除或修飾目的DNA序列來產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法。本發(fā)明還提供用這種方法產(chǎn)生的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物。
本發(fā)明的另一目的是提供通過將無血清饑餓的、轉(zhuǎn)基因的、分化的細(xì)胞的細(xì)胞核移植入與分化細(xì)胞相同種的去核卵細(xì)胞來產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法。本發(fā)明還提供用這種方法產(chǎn)生的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物。
本發(fā)明的另一目的是提供涉及將無血清饑餓的、分化的細(xì)胞的細(xì)胞核移植入與分化細(xì)胞相同種的去核卵母細(xì)胞來產(chǎn)生哺乳動物CICM細(xì)胞的新方法。
本發(fā)明的另一目的是提供通過將無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞核移植入與分化的細(xì)胞相同種的去核卵母細(xì)胞而產(chǎn)生的CICM細(xì)胞。
本發(fā)明更具體的目的是提供涉及將無血清饑餓的人細(xì)胞如人成體細(xì)胞的細(xì)胞核移植入去核的人卵母細(xì)胞來產(chǎn)生人CICM細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的另一目的是使用這樣的CICM細(xì)胞用于治療或診斷。
本發(fā)明的具體目的是使用這樣的CICM細(xì)胞包括人和有蹄動物的CICM細(xì)胞用于治療或診斷任何其中細(xì)胞、組織或器官移植在治療上或診斷上有益的疾病。這些CICM細(xì)胞可在相同種或雜交種內(nèi)使用。
本發(fā)明的另一目的是使用來源于NT胚胎、胎兒或后代的細(xì)胞或組織包括人和有蹄動物組織用于治療或診斷任何其中細(xì)胞、組織或器官移植在治療上或診斷上有益的疾病或損傷包括帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、糖尿病、肝臟疾病、心臟疾病、軟骨置換、燒傷、血管疾病、尿道疾病以及用于免疫缺陷、骨髓移植、癌癥等其它疾病的治療。這些組織可在相同種或雜交種內(nèi)使用這些組織。
本發(fā)明的另一具體目的是使用按照本發(fā)明產(chǎn)生的CICM細(xì)胞用于產(chǎn)生分化的細(xì)胞、組織或器官。
本發(fā)明更具體的目的是使用按照本發(fā)明產(chǎn)生的人CICM細(xì)胞用于產(chǎn)生分化的人細(xì)胞、組織或器官。
本發(fā)明的另一具體目的是體外使用按照本發(fā)明產(chǎn)生的CICM細(xì)胞例如用于細(xì)胞分化的研究和試驗?zāi)康娜缬糜谒幬镅芯俊?br> 本發(fā)明的另一目的是提供移植療法的改進(jìn)方法，包括從按照本發(fā)明產(chǎn)生的CICM細(xì)胞產(chǎn)生的等基因或同基因細(xì)胞、組織或器官的應(yīng)用。這樣的治療方法包括例如疾病和損傷包括帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、糖尿病、肝臟疾病、心臟疾病、軟骨置換、燒傷、血管疾病、尿道疾病的治療以及免疫缺陷、骨髓移植、癌癥等其它疾病的治療。
本發(fā)明的另一目的是提供通過在使用該分化的細(xì)胞或細(xì)胞核形成NT單位之前在分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾目的DNA序列而產(chǎn)生的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的CICM細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是使用按照本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因或遺傳工程CICM細(xì)胞用于基因治療、尤其用于上述疾病和損傷的治療和/或預(yù)防。
本發(fā)明的另一目的是使用按照本發(fā)明產(chǎn)生的CICM細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因或基因工程的CICM細(xì)胞作為用于核移植的細(xì)胞核供體。
因此，一方面，本發(fā)明提供用于克隆哺乳動物(如胚胎、胎兒、后代)的方法。方法包括(i)在適于核移植(NT)單位形成的條件下，將所需的無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核插入與分化的細(xì)胞或細(xì)胞核相同種的去核哺乳動物卵母細(xì)胞；(ii)活化得到的核移植單位；并且(iii)將所述培養(yǎng)的NT單位移植入宿主哺乳動物以使NT單位發(fā)育成胎兒。
優(yōu)選地，培養(yǎng)活化的核移殖單位直至超過2-細(xì)胞發(fā)育階段。
這些胎兒的細(xì)胞、組織和/或器官可方便地用于細(xì)胞、組織和/或器官移植領(lǐng)域。
本發(fā)明還包括通過在將分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核卵母細(xì)胞之前在分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾目的DNA序列來克隆遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法。
本發(fā)明還提供的是按照上述方法獲得的哺乳動物和那些哺乳動物的后代。
本發(fā)明優(yōu)選地用于克隆有蹄動物。
另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生CICM細(xì)胞的方法。方法包括(i)在適于核移植(NT)單位形成的條件下，將所需的無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核插入與分化的細(xì)胞或細(xì)胞核相同種的去核哺乳動物卵母細(xì)胞；(i)活化得到的核移植單位；并且(iii)培養(yǎng)從所述培養(yǎng)的NT單位獲得的細(xì)胞以獲得CICM細(xì)胞。
優(yōu)選地，培養(yǎng)活化的核移植單位直至超過2-細(xì)胞發(fā)育階段。
CICM細(xì)胞可方便地用于細(xì)胞、組織和器官移植領(lǐng)域。
關(guān)于上述和下文將更明顯的本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和特點，本發(fā)明的特征可通過參考下面本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述和附加的權(quán)利要求得到更清楚地理解。發(fā)明詳述本發(fā)明提供通過核移植或核轉(zhuǎn)移克隆哺乳動物的改進(jìn)方法。本申請中，核轉(zhuǎn)移或核移植或NT可互換使用。
根據(jù)本發(fā)明，將來自無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞核移植入與供體細(xì)胞核相同種的去核哺乳動物卵母細(xì)胞中。對細(xì)胞核進(jìn)行程序重調(diào)以指導(dǎo)克隆的胚胎發(fā)育，然后可將其移植入雌性受體以產(chǎn)生胎兒和后代或用于產(chǎn)生CICM細(xì)胞?？寺〉呐咛ヒ部膳c受精的胚胎結(jié)合以產(chǎn)生嵌合胚胎、胎兒和/或后代。
現(xiàn)有技術(shù)的方法已在克隆方法中使用胚細(xì)胞類型。這包括Campbell等(自然，38064-68，1996)和Stice等(Biol.Reprod.，54100-110，1996)的工作。在這些研究的兩個中，胚細(xì)胞系來自妊娠少于10天的胚胎。在這兩個研究中，細(xì)胞在飼養(yǎng)層上維持以防止克隆方法所用供體細(xì)胞的明顯分化。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明使用胎兒或成體細(xì)胞都有效。
未曾料到帶有胎兒或成體供體細(xì)胞核的克隆胚胎能發(fā)育到高級胚胎和胎兒階段?？茖W(xué)教條曾經(jīng)是只有早期胚胎細(xì)胞類型可指導(dǎo)此類發(fā)育。未曾料到大量克隆胚胎可從胚胎或成體細(xì)胞產(chǎn)生。還有，新的轉(zhuǎn)基因胚胎細(xì)胞系可方便地從轉(zhuǎn)基因克隆胚胎得到這一事實是出乎意料的。
來自羊的成體細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞已有目的地用于生產(chǎn)綿羊后代(Wilmut等，1997)。然而在那一研究中，強(qiáng)調(diào)的是使用靜止期的血清饑餓的細(xì)胞核供體細(xì)胞對于Wilmut克隆方法的成功是重要的。對于本發(fā)明，不存在這樣的對血清饑餓或靜止的要求。相反，使用無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞實現(xiàn)了克隆。而且，根據(jù)本發(fā)明，克隆效率同樣與使用胎兒或成體供體細(xì)胞無關(guān)，而Wilmut等(1997)報道用成體供體細(xì)胞的克隆效率更低。
因此，根據(jù)本發(fā)明，哺乳動物包括有蹄動物的優(yōu)越的基因型的繁殖是可能的。這將允許具有已證實的基因優(yōu)越性或其它理想的性狀的成體動物的繁殖。例如在許多重要有蹄動物種中將加速改進(jìn)。通過本發(fā)明，可以有無數(shù)可以在克隆方法中收獲并利用的胎兒或成體細(xì)胞。這將可能在短時間內(nèi)產(chǎn)生許多相同后代。
還有推測Wilmut等的方法將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)生(見MacQuitty，Nature Biotech.，15294(1997))。但是，沒有理由推測例如來自已轉(zhuǎn)染了外源DNA的成體細(xì)胞的核能在核移植過程中存活。在這一點上，已知通過體外操作改變小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞的特性從而得到它們形成存活嵌合胚的能力。因此，在本發(fā)明之前，轉(zhuǎn)基因動物的克隆沒有得到預(yù)測。
本發(fā)明還可通過對能克隆繁殖的細(xì)胞來源進(jìn)行操作來簡化轉(zhuǎn)基因方法。這排除了將細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)的需要，因此，包括隨機(jī)整合和基因?qū)虻倪z傳修飾更易于實現(xiàn)。此方法還通過將核移植與體外修飾和選擇細(xì)胞的能力結(jié)合變得比以前的轉(zhuǎn)基因胚胎技術(shù)更有效。根據(jù)本發(fā)明，這些細(xì)胞能在無細(xì)胞因子、條件培養(yǎng)基和/或飼養(yǎng)層時克隆繁殖，進(jìn)一步簡化并有利于轉(zhuǎn)基因方法。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明在克隆方法中使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，可產(chǎn)生能發(fā)育成胎兒和后代的轉(zhuǎn)基因胚。并且，這些轉(zhuǎn)基因的克隆胚可用于產(chǎn)生CICM細(xì)胞系或其它胚細(xì)胞系。因此，本發(fā)明排除了為有利于遺傳工程技術(shù)在體外衍生和維持未分化細(xì)胞系的需要。
本發(fā)明還可用于產(chǎn)生可用于例如細(xì)胞、組織和器官移植的CICM細(xì)胞、胎兒或后代。通過從動物取胎兒或成體細(xì)胞并將它用于克隆方法，可以在它們發(fā)育成器官形成中從克隆的胎兒獲得多種細(xì)胞、組織和可能的器官。細(xì)胞、組織和器官也可從克隆的后代分離。這種方法可提供用于許多醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)治療法包括細(xì)胞和基因治療的“材料”來源。如果這些細(xì)胞移植回到細(xì)胞所來自的動物內(nèi)，那么就避免了免疫排斥。而且，由于多種細(xì)胞類型可從這些克隆分離，其它方法系統(tǒng)如造血的嵌合狀態(tài)可用來避免相同種內(nèi)以及種間動物的免疫排斥。
因此，一方面，本發(fā)明提供克隆哺乳動物的方法。一般地，哺乳動物通過包括下列步驟的核移植方法產(chǎn)生(i)獲得所需的無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞作為供體細(xì)胞核的來源；(ii)從與供體細(xì)胞核來源細(xì)胞相同種的哺乳動物獲得卵母細(xì)胞；(iii)將所述的卵母細(xì)胞去核；(iv)例如通過融合或注射將所需的分化細(xì)胞或細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞內(nèi)以形成NT單位；(v)活化得到的NT單位；并且(vi)將所述培養(yǎng)的NT單位移殖入宿主哺乳動物以使NT單位發(fā)育成胎兒。
優(yōu)選地，培養(yǎng)活化的核移植單位直至超過2-細(xì)胞發(fā)育階段。
本發(fā)明還包括通過在將分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核卵母細(xì)胞之前在分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核內(nèi)插入、去除或修飾目的DNA序列來克隆遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的動物的方法。
本發(fā)明還提供的是按照上述方法得到的哺乳動物以及那些哺乳動物的后代。本發(fā)明優(yōu)選地用于克隆有蹄動物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在細(xì)胞、組織和器官移植領(lǐng)域內(nèi)NT胎兒和NT及嵌合后代的應(yīng)用。
另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生CICM細(xì)胞的方法。方法包括(i)在適于核移植單位形成的條件下，將所需的無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核插入與分化的細(xì)胞或細(xì)胞核相同種的去核哺乳動物卵母細(xì)胞；(ii)活化得到的核移植單位；并且(iii)培養(yǎng)從所述培養(yǎng)的NT單位獲得的細(xì)胞以獲得CICM細(xì)胞。
優(yōu)選地，培養(yǎng)活化的核移植單位直至超過2-細(xì)胞發(fā)育階段。
CICM細(xì)胞有利地用于細(xì)胞、組織和器官移植領(lǐng)域或者用于產(chǎn)生胎兒或后代包括轉(zhuǎn)基因胎兒或后代。
如此處所用的，胎兒是從子宮中取出的未出生的幼小的胎生動物。因此，牛的胎兒期是從受孕后35天直到出生。豬的胎兒期是從受孕后30天直到出生。哺乳動物是從出生到死亡的成體。
優(yōu)選地，NT單位培養(yǎng)到至少2～400個細(xì)胞大小，更優(yōu)選地4～128個細(xì)胞，并且最優(yōu)選地至少約50個細(xì)胞大小。
核轉(zhuǎn)移技術(shù)或核移植技術(shù)在文獻(xiàn)中有描述并在發(fā)明背景中引用的許多參考文獻(xiàn)中也有描述。特別見Campbell等，Theriogenology，43181(1995)；Collas等，Mol.Report.Dev.，38264-267(1994)；Keefer等，Biol.Reprod.，50935-939(1994)；Sims等，美國國家科學(xué)院院報，906143-6147(1993)；WO 94/26884；WO 94/24274和WO90/03432，在這里將它們完全引用作為參考。并且，美國專利號為4,944,384和5,057,420的專利也描述了牛的核移植的方法。
分化的是指具有與周圍的結(jié)構(gòu)或原始的細(xì)胞不同的特點或功能的細(xì)胞。分化的哺乳動物細(xì)胞是那些經(jīng)過了早期胚胎階段的細(xì)胞。更具體地，分化的細(xì)胞是那些來自至少已經(jīng)過胎盤階段(牛胚胎發(fā)生的第10天)的細(xì)胞。分化的細(xì)胞可來自外胚層、中胚層或內(nèi)胚層。
哺乳動物細(xì)胞包括人的細(xì)胞可通過眾所周知的方法獲得?？捎糜诒景l(fā)明的哺乳動物細(xì)胞包括例如上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核的細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和其它肌肉細(xì)胞等。并且，用于核移植的哺乳動物細(xì)胞可從不同器官如皮膚、肺、胰臟、肝臟、胃、腸、心臟、生殖器官、膀胱、腎臟、尿道和其它泌尿器官等獲得。這些僅是適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞的例子。適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞，即在本發(fā)明中有用的細(xì)胞可從身體的任何細(xì)胞或器官中獲得。這包括所有的體細(xì)胞或生殖細(xì)胞。
成纖維細(xì)胞是所需的細(xì)胞類型，因為它們可大量地從發(fā)育的胎兒和成體動物獲得。成纖維細(xì)胞有一定程度的分化，因此以前認(rèn)為它們是用于克隆方法中的較差細(xì)胞類型。但重要地是，這些細(xì)胞能在體外以快速的倍增時間輕易繁殖并能夠克隆繁殖以用于基因?qū)ぐ械姆椒ㄖ?。本發(fā)明是新穎的也是因為使用了分化的細(xì)胞類型。本發(fā)明是有優(yōu)點的，因為細(xì)胞易于在體外繁殖、遺傳修飾和篩選。
其它報道的克隆方法(如Wilmut等，1997)依賴于應(yīng)用血清饑餓的細(xì)胞。然而本發(fā)明中，供體細(xì)胞不是在血清饑餓狀態(tài)。根據(jù)Wilmut等(1997)，血清饑餓的細(xì)胞是靜止的，即，退出生長期的。其他方法(化學(xué)的、溫度等)也可產(chǎn)生靜止細(xì)胞。本發(fā)明中所用的供體細(xì)胞不是靜止細(xì)胞。
卵母細(xì)胞的適當(dāng)哺乳動物來源有綿羊、牛、豬、山羊、馬、家兔、豚鼠、小鼠、倉鼠、大鼠、靈長類動物等。卵母細(xì)胞優(yōu)選地從有蹄動物、最優(yōu)選地從牛獲得。
分離卵母細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域眾所周知?；旧?，這包括從哺乳動物如牛的卵巢或生殖道分離卵母細(xì)胞。易于獲得的牛卵母細(xì)胞的來源是屠宰場材料。
為使如遺傳工程、核移植和克隆的技術(shù)成功使用，一般卵母細(xì)胞在用作核移植的受體細(xì)胞之前，及在它們可由精子細(xì)胞受精以發(fā)育成胚之前必須在體外成熟。此過程一般需要從哺乳動物卵巢如在屠宰場獲得的牛卵巢收集未成熟的(前期I)卵母細(xì)胞，并使其在受精或去核之前在成熟培養(yǎng)基中成熟直至卵母細(xì)胞到達(dá)中期II階段，這一般發(fā)生在吸取牛卵母細(xì)胞約18-24小時后。為達(dá)到本發(fā)明的目的，這一時間段稱為“成熟期”。如這里所用到的，為了計算時間段，“吸取”是指從卵巢濾泡中吸取未成熟的卵母細(xì)胞。
并且，在體外已成熟的中期II階段的卵母細(xì)胞已成功地用于核移植技術(shù)中?；旧?，成熟的中期II卵母細(xì)胞已從動情期開始后或注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)或類似激素后35到48小時的非超排卵或超排卵的母?；蛐∧概Ｖ型饪剖占?。
已有報道稱去核和核移植中的卵母細(xì)胞的成熟階段對NT方法的成功是重要的。(見例如，Prather等，分化，48，1-8，1991)。一般地，成功的哺乳動物胚克隆方法用中期II階段的卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞是因為確信在這一階段的卵母細(xì)胞能夠或足以得到“活化”以像處理受精的精子一樣處理引入的核。在家畜中，卵母細(xì)胞活化期一般是在吸取后約16-52小時，優(yōu)選約28-42小時。
例如，可在如Seshagine等，生殖生物學(xué)40，544-606，1989中所描述的HEPE緩沖的倉鼠胚胎培養(yǎng)基(HECM)中洗未成熟的卵母細(xì)胞，然后就將其置于39℃薄層石蠟或硅層下的含有50微升的包含適當(dāng)?shù)拇傩韵偌に厝琰S體生成素(LH)和卵泡刺激激素(FSH)和雌二醇的10％胎牛血清的組織培養(yǎng)基(TCM)199的成熟培養(yǎng)基滴中。
從約10-40小時，以及優(yōu)選約16-18小時的一段固定的成熟時間之后，將卵母細(xì)胞去核。在去核之后，優(yōu)選移動卵母細(xì)胞并且在除去卵立細(xì)胞之前將卵母細(xì)胞置于含有1毫克每毫升的透明質(zhì)酸酶的HECM中。這可通過用很細(xì)孔的吸管重復(fù)吸打或短暫的旋轉(zhuǎn)來完成。然后，篩選裸露的卵母細(xì)胞的極體，并且根據(jù)極體的存在而確定的選的分裂中期的卵母細(xì)胞就用于核移植。隨后去核。
去核可通過已知方法來進(jìn)行，如在美國專利號為4,994,384的專利中所述，在這里引用作為參考。例如，可將中期II的卵母細(xì)胞置于選擇性地每毫升含有7.5微克細(xì)胞松弛素B(CB)的HECM中用于立即去核，或者可置于合適的培養(yǎng)基中，例如胚胎培養(yǎng)基如CRlaa，加10％動情期牛血清，然后晚些去核，優(yōu)選不超過24小時后，以及更優(yōu)選16-18小時。
可用微量移液管去除極體和周圍細(xì)胞質(zhì)來顯微外科地完成去核。篩選鑒定出那些已成功去核的卵母細(xì)胞。此篩選可通過用HECM中每毫升1微克的33342 Hoechst染料染色，然后在紫外線照射下10秒內(nèi)觀察卵母細(xì)胞來進(jìn)行。然后成功去核的卵母細(xì)胞可置于合適的培養(yǎng)基中，如加10％血清的CRlaa。
本發(fā)明中，受體卵母細(xì)胞優(yōu)選在人外成熟開始后約10-40小時的時間內(nèi)去核，更優(yōu)選在體外成熟開始后約16-24小時，并且最優(yōu)選體外成熟開始后約16-18小時。
與去核的卵母細(xì)胞相同種的單個哺乳動物細(xì)胞隨后被轉(zhuǎn)移進(jìn)入用來產(chǎn)生NT單位的去核的卵母細(xì)胞的卵周隙中。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，哺乳動物細(xì)胞和去核的卵母細(xì)胞將被用來產(chǎn)生NT單位。例如，采用電融合融合細(xì)胞。通過提供足以引起質(zhì)膜瞬時擊穿的電脈沖完成電融合。由于膜迅速修復(fù)，質(zhì)膜擊穿非常短暫。因此，如果兩相鄰的膜被誘導(dǎo)擊穿以及它們的脂雙分子層混合修復(fù)之后，兩細(xì)胞間的小通道將開放。由于這些小的開放的熱力學(xué)不穩(wěn)定性，它擴(kuò)大直到兩個細(xì)胞成為一個。將Prather等的美國專利4,997,384作為參考(在此全文引入作為參考)用來進(jìn)一步討論此方法。可用多種電融合介質(zhì)包括如，蔗糖、甘露醇、山梨糖醇和磷酸鹽緩沖溶液。也可應(yīng)用Sendai病毒作為融合劑完成融合(Graham，Wistor Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。
并且，在某些情況下(例如用較小的供體核時)將核直接注射到卵母細(xì)胞中比用電融合來進(jìn)行融合可能更為優(yōu)選。此技術(shù)在Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)中公開，在這里完全引用作為參考。
優(yōu)選地，哺乳動物細(xì)胞和卵母細(xì)胞在卵母細(xì)胞成熟開始后約24小時、在含有融合介質(zhì)(0.25M D-山梨糖醇，100μm乙酸鈣，0.5mM乙酸鎂、1.0g/L BSA(無脂肪酸)pH7.2)的500μM室中，應(yīng)用90-120V的電脈沖、約15微秒進(jìn)行電融合。融合之后，得到的融合的NT單位就置于合適的培養(yǎng)基如Crlaa培養(yǎng)基中直至活化。典型的活化將其后很短時間，典型地少于24小時，優(yōu)選地約2～9小時后完成。
NT單位可通過已知的方法進(jìn)行活化。這些方法包括，例如，在亞生理溫度培養(yǎng)NT單位，實質(zhì)上通過應(yīng)用冷的，或?qū)嶋H上較涼的溫度冷擊NT單位。最方便地可通過在室溫培養(yǎng)NT單位達(dá)到此目的，室溫相對于胚所正常暴露的生理溫度條件是較冷的。
選擇性地，可利用已知的活化試劑完成活化。例如，在受精過程中精子穿入卵母細(xì)胞已表現(xiàn)出活化預(yù)融合卵母細(xì)胞以在核移植獲得更多的可存活的妊娠和多類基因一致的小牛。還有，處理方法如電和化學(xué)休克可用來在融合后活化NT胚胎。合適的卵母細(xì)胞的活化方法是Susk-Parrish等的美國專利號5,496,720的內(nèi)容，在此全文引入作為參考。
另外，活化也可同時或隨后進(jìn)行(i)提高卵母細(xì)胞中二價陽離子的水平，及(ii)降低卵母細(xì)胞中細(xì)胞蛋白的磷酸化作用。這一般可通將二價陽離子導(dǎo)入卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)來進(jìn)行，如，鎂、鍶、欽或鈣，如以離子載體的形式。其他升高二價陽離子水平的方法包括應(yīng)用電休克、用乙醇處理和用捕獲的螯合劑處理。
可采用已知的方法降低磷酸化作用，如，加入激酶抑制劑，如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑如6-二甲氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和鞘氨醇。
選擇性地，可將磷酸酶和磷酸酶2A和磷酸酶2B導(dǎo)入卵母細(xì)胞來抑制細(xì)胞蛋白的磷酸化作用。
一個實施方案中，可采用在融合后約24小時內(nèi)，以及優(yōu)選融合后約2-9小時內(nèi)將融合的NT單位短暫地暴露于含有5μM離子霉素和1mg/mlBSA的TL-HEPES培養(yǎng)基中，隨后在含有30mg/ml BSA的TL-HEPES中洗來完成NT的活化。
活化的NT單位隨后培養(yǎng)在合適的體外培養(yǎng)基中直到CICM細(xì)胞和細(xì)胞集落產(chǎn)生。本領(lǐng)域熟知適合于胚胎培養(yǎng)和成熟的培養(yǎng)基?？捎糜谂Ｅ咛ヅ囵B(yǎng)和維持的已知培養(yǎng)基的實例包括Ham’s F-10加10％胎牛血清(FCS)、組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)加10％胎牛血清、蒂羅德-白蛋白-乳酸鹽-丙酮酸鹽(TALP)、Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、Eagle’s和Whitten’s培養(yǎng)基。用于卵母細(xì)胞收集和成熟的最普通的培養(yǎng)基之一是TCM-199，和補(bǔ)充有1-20％血清包括胎牛血清、新牛小牛血清、動情期母牛血清、小羊血清或公牛血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括含Earl鹽、10％胎牛血清、0.2mM丙酮酸鈉和50μg/ml硫酸慶大霉素的TCM-199培養(yǎng)基。上述中任意一種也可參與與多種細(xì)胞類型如顆粒細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、BRL細(xì)胞和子宮細(xì)胞和STO細(xì)胞的共同培養(yǎng)。
在此引入作為參考的Roenkrans，Jr等的美國專利5,096,822中描述了另一種維持培養(yǎng)基。這種名為CRl的胚胎培養(yǎng)基含有支持胚胎所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。
CRl含有量從1.0mM到10mM的，優(yōu)選1.0mM到5.0mM的L-乳酸半鈣。L-乳酸半鈣是帶有半鈣鹽與其結(jié)合的L-乳酸。L-乳酸半鈣是重要的，因為一個單個成分滿足培養(yǎng)基兩個主要求(i)用于緊密的細(xì)胞骨架排列所必需的鈣需求；和(ii)代謝和電子轉(zhuǎn)運所必需的乳酸需求。L-乳酸半鈣也可作為胚胎生存所必需的培養(yǎng)基的礦物質(zhì)和能量來源。
有利的是，CRl培養(yǎng)基不含血清，如胎牛血清，并且不需要應(yīng)用動物細(xì)胞共培養(yǎng)或者其他生物培養(yǎng)基，即含有動物細(xì)胞如輸卵管細(xì)胞的培養(yǎng)基。生物培養(yǎng)基有時候可能是不利的，因為它們可能含有對胚胎有害的并且難于檢測、鑒定和消除的微生物或者微量因子。
CRl培養(yǎng)基中的主要成分的例子包括L-乳酸半鈣、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鹽和微量無脂肪酸的牛血清白蛋白(sigma A-6003)。另外，可向培養(yǎng)基中加入規(guī)定量的必需和非必需氨基酸。含有氨基酸的CRl以縮寫“CRlaa”而知。
CRl培養(yǎng)基優(yōu)選地含有如下含量的下列成分氯化鈉 -114.7mM氯化鉀 -3.1mM碳酸氫鈉-26.2mML-乳酸半鈣 -5mM不含脂肪酸的BSA -3mg/ml在一個實施方案中，將活化的NT胚胎單位置于含有1.9mM DMAP的CRlaa培養(yǎng)基中約4小時，隨后在HECM中洗并且然后在含有BSA的CRlaa中培養(yǎng)。
例如，可將活化的NT單位轉(zhuǎn)移到含有2.0mM DMAP(Sigma)的CRlaa培養(yǎng)基中并且在環(huán)境條件如約38.5℃，5％CO2下培養(yǎng)適當(dāng)時間如約4-5小時。
之后，優(yōu)選地洗培養(yǎng)的NT單位并隨后置于合適的培養(yǎng)基如含有10％FCS的CRlaa培養(yǎng)中，并且6mg/ml包含在優(yōu)選地含有合適的融合飼養(yǎng)層的孔板。合適的飼養(yǎng)層包括，例如，戊纖維細(xì)胞如來自有蹄動物的成纖維細(xì)胞和子宮上皮細(xì)胞、雞成纖維細(xì)胞、鼠(如小鼠或大鼠)的成纖維細(xì)胞、STO和SI-m220飼養(yǎng)細(xì)胞系，以及BRL細(xì)胞。
在一個實施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞包括小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。合適的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層制備的描述見后面的實施例并且在本領(lǐng)域技術(shù)人員中熟知。
在飼養(yǎng)層(5×105細(xì)胞/ml)上培養(yǎng)NT單位直到NT單位達(dá)到適合于轉(zhuǎn)移到受體雌性的大小，或者適合于獲得可用于生產(chǎn)CICM細(xì)胞或細(xì)胞集落的細(xì)胞的大小。優(yōu)選地，培養(yǎng)這些NT細(xì)胞直至至少約2-400個細(xì)胞，更優(yōu)選地約4-128個細(xì)胞，以及最優(yōu)選地至少約50個細(xì)胞。培養(yǎng)在合適的條件下，即，約38.5℃及5％CO2進(jìn)行，為優(yōu)化生長，典型的約每2-5天、優(yōu)選的約每3天更換培養(yǎng)基。
本發(fā)明中用于胚胎移植和受體動物處理的方法是胚胎移植產(chǎn)業(yè)中所用的標(biāo)準(zhǔn)方法。同步移植對于本發(fā)明的成功是重要的，即NT胚胎的時期與受體雌性動物的動情周期是同步的。優(yōu)點以及如何供養(yǎng)受伯評價見Sieolel，G.E.Jr.(體外受精和胚胎發(fā)育中的“牛胚胎移植方法的鑒定性評論”(1981)L. Mastroianni，Jr和J.D.Biggers編，Plenum出版社，紐約，NY，323頁)，其內(nèi)容在此引用作為參考。
通過本發(fā)明，用來自成體細(xì)胞的胞核的克隆效率可能與用來自胎兒細(xì)胞的胞核的相同。例如，用來自母牛胎兒和成體細(xì)胞的發(fā)育成疊椹胚期和胚泡期胚胎的效率相同的。
本發(fā)明還可用于克隆遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬。如上面所解釋的，本發(fā)明具有優(yōu)點是因為轉(zhuǎn)基因方法可通過對能克隆繁殖的分化的細(xì)胞來源進(jìn)行操作加以簡化。特別地，用作供體核的分化細(xì)胞帶有插入、去除或修飾的所需的DNA序列。然后將那些遺傳改變的、分化的細(xì)胞用于去核卵母細(xì)胞的核移植。
任何已知用于插入、去除或修飾哺乳動物細(xì)胞的目的DNA序列的方法都可用于改變欲用作核供體的分化細(xì)胞。這些方法可去除所有或部分DNA序列，并且DNA序列可以是異源的。所包括的技術(shù)有同源重組，可在細(xì)胞基因組中的一個或多個特定位點插入、去除或修飾DNA的一個或多個序列。
本發(fā)明因此可用于提供帶有所需的基因型的成體豬。帶有確定的遺傳優(yōu)勢或其它所需的性狀的成體豬的增加是特別有用的，包括轉(zhuǎn)基因或遺傳工程動物，和嵌合動物。因此，本發(fā)明可產(chǎn)生單種性別的后代，也可產(chǎn)生肉產(chǎn)量增加、具有復(fù)現(xiàn)的性狀和疾病抗性的豬。并且，來自NT胎兒，包括轉(zhuǎn)基因和/或嵌合胎兒的細(xì)胞和組織可用于治療如下所述的與使用CICM細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的多種疾病的細(xì)胞、組織和器官移植。因此，轉(zhuǎn)基因豬具有作為包括疾病、細(xì)胞和器官的異種移植和生產(chǎn)藥用蛋白的模型的用途。
為產(chǎn)生CICM細(xì)胞和細(xì)胞系，在獲得理想大小的NT單位之后，手工操作從區(qū)域中去除細(xì)胞，然后使用。此過程優(yōu)選地通過以下步驟進(jìn)行取含有NT單位的細(xì)胞團(tuán)，該NT單位典型地包含至少約50個細(xì)胞，洗滌這些細(xì)胞，并將細(xì)胞平板接種于飼養(yǎng)層上，例如擴(kuò)散的成纖維細(xì)胞。典型地，用于獲得干細(xì)胞或細(xì)胞集落的細(xì)胞可從培養(yǎng)的優(yōu)選地有至少50個細(xì)胞大小的NT單位的最靠內(nèi)部分得到。但是，較少或較大數(shù)目細(xì)胞的NT單位或來自NT單位的其它部分的細(xì)胞也可用于獲得ES細(xì)胞和細(xì)胞集落。將細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)纳L培養(yǎng)基，例如，補(bǔ)充以10％FCS和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的α-MEM中的飼養(yǎng)層里。為了有利于生長每當(dāng)需要時可更換培養(yǎng)基，例如大約每2-3天更換一次。
此培養(yǎng)方法導(dǎo)致CICM細(xì)胞或細(xì)胞系的形成。當(dāng)需要時本領(lǐng)域技術(shù)人員可改變培養(yǎng)條件以利于特定的CICM細(xì)胞的生長。并且，可根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的CICM細(xì)胞。即，所說的方法可用于產(chǎn)生引入了一個或多個所需的DNA序列的NT單位，或者產(chǎn)生其中一個或多個內(nèi)源DNA序列的全部或部分已去除或修飾的NT單位。然后那些遺傳工程或轉(zhuǎn)基因NT單位可用于產(chǎn)生遺傳工程或轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞包括人的細(xì)胞。
得到的CICM細(xì)胞和細(xì)胞，優(yōu)選人的CICM細(xì)胞和細(xì)胞系，具有許多治療上和診斷上的用途。其特別的是，這些CICM細(xì)胞可用于細(xì)胞移植治療。人CICM細(xì)胞可用于許多疾病的治療。人NT單位本身也可用于疾病的治療。
考慮到這一點，已知小鼠的胚胎干(ES)細(xì)胞能分化成幾乎任何細(xì)胞類型，例如造血干細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的豬的CICM細(xì)胞應(yīng)具有相似的分化能力。本發(fā)明所述的CICM細(xì)胞可經(jīng)誘導(dǎo)而分化，以根據(jù)已知方法得到所需的細(xì)胞類型。例如，通過在分化培養(yǎng)基中和在供細(xì)胞分化的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞，可誘導(dǎo)試驗的豬CICM細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、尿道細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。導(dǎo)致CICM細(xì)胞分化的培養(yǎng)基和方法為本領(lǐng)域所知，稱為適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件。
例如，Palacios等在美國國家科學(xué)院院報927530-7537(1995)中教授了通過對干細(xì)胞進(jìn)行如下誘導(dǎo)從胚細(xì)胞系中產(chǎn)生造血干細(xì)胞，該誘導(dǎo)方法包括首先將這些細(xì)胞的聚集體培養(yǎng)在缺乏視黃酸的懸浮培養(yǎng)基中，然后再培養(yǎng)于含有視黃酸的相同培養(yǎng)基中，再將細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)移到使細(xì)胞附著的基質(zhì)上。
并且，Pedersen，J.Reprod.Fertil.Dev.，6543-552(1994)是參考了大量文章的綜述文章，所參考的文章公開了胚胎干細(xì)胞在體外分化產(chǎn)生多種分化的細(xì)胞類型包括造血干細(xì)胞、肌肉、心肌、神經(jīng)細(xì)胞等的方法。
并且，Bain等在生物學(xué)進(jìn)展，168342-357(1995)中教授了使胚胎干細(xì)胞在體外分化產(chǎn)生具有神經(jīng)元特性的神經(jīng)細(xì)胞的方法。這些參考文獻(xiàn)是已報道的從胚或干細(xì)胞中獲得分化細(xì)胞的方法的范例。這些參考文獻(xiàn)特別是其中所公開的涉及使胚胎干細(xì)胞分化的方法的內(nèi)容在這里完全引用作為參考。
因此，使用已知的方法和培養(yǎng)基，本領(lǐng)域技術(shù)人員可培養(yǎng)本主題的CICM細(xì)胞，包括遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的CICM細(xì)胞，以獲得所需的分化細(xì)胞類型，例如神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞等。
本主題的CICM細(xì)胞可用于獲得任何所需的分化細(xì)胞類型。這些分化細(xì)胞的治療用途是前所未有的。例如，造血干細(xì)胞可用在需要骨髓移植的醫(yī)學(xué)治療中。此方法可用來治療多種疾病，例如晚期癌癥如卵巢癌和白血病，及調(diào)和免疫系統(tǒng)的疾病如艾滋病。造血干細(xì)胞是可獲得的，例如可通過將癌癥或艾滋病病人的成熟體細(xì)胞如上皮細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合，獲得如上所述的CICM細(xì)胞，并在利于分化的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，直至獲得造血干細(xì)胞。這樣的造血干細(xì)胞可用在包括癌癥和艾滋病的疾病的治療中。
選擇性地，來自神經(jīng)失調(diào)的病人的成年體細(xì)胞可與去核的卵母細(xì)胞融合，從中獲得人的CICM細(xì)胞，并且將這些細(xì)胞培養(yǎng)在分化條件下以產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞系。通過移植這些人神經(jīng)細(xì)胞治療的特定疾病包括例如帕金森病、阿爾茨海默病、ALS和大腦麻痹等。在帕金森病的特殊病例中，已表明移植的胎兒腦神經(jīng)細(xì)胞與周圍的細(xì)胞正常連接并產(chǎn)生多巴胺。這可長期逆轉(zhuǎn)帕金森病的癥狀。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點是提供了適合于移植的等基因或同基因的人的細(xì)胞的主要的無限的供應(yīng)。因此，它將消除與現(xiàn)行的移植方法相關(guān)的重要問題即，由于宿主對移植物或移植對宿主的排斥造成的可能發(fā)生的移植組織的排斥。傳統(tǒng)地，通過給予抗-排斥藥物如環(huán)孢菌素來預(yù)防或降低排斥。然而，這些藥物具有顯著的不良副作用如免疫抑制、致癌性以及非常昂貴。本發(fā)明應(yīng)消除，或者至少大大減少對抗排斥藥物的要求。
其它可用等基因細(xì)胞治療的疾病和病癥包括例如脊髓損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、糖尿病、肝臟疾病即高膽固醇血癥、心臟疾病、軟骨置換、燒傷、足潰瘍、胃腸疾病、血管疾病、腎臟疾病、尿道疾病和老齡相關(guān)疾病和病癥。
此方法可用于置換缺陷基因，如，缺陷的免疫系統(tǒng)基因、囊性纖維化基因，或者導(dǎo)入到起治學(xué)上有益的蛋白質(zhì)如生長因子、淋巴因子、細(xì)胞因子、酶等表達(dá)的基因。例如，可將編碼腦源性生長因子的DNA序列導(dǎo)入人CICM細(xì)胞，這些細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞，并且將這些神經(jīng)細(xì)胞移植到帕金森病人以阻止疾病過程中神經(jīng)細(xì)胞的喪失。
以前，用BDNF轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型原代細(xì)胞系和固定細(xì)胞系是不同的，不是神經(jīng)來源的就是非神經(jīng)(成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)來源的細(xì)胞。例如，已采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用BDNF基因轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞，并將這些細(xì)胞移植進(jìn)入帕金森病的大鼠模型中(Yoshimoto等，腦研究，69125-36，(1995))。
移植32天后，這種來自體內(nèi)的治療降低了大鼠的帕金森癥狀高達(dá)45％。還有，將酪氨酸羥化酶基因置入星形膠質(zhì)細(xì)胞有相似的結(jié)果(Lundberg等，發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)，13939-53(1996)及其中引入的參考)。
然而，這自來自體內(nèi)的系統(tǒng)有問題。特別是，目前所用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)下調(diào)并且轉(zhuǎn)移的基因只是瞬時表達(dá)(Mulligan，的綜述，科學(xué)，26026-932(1993))。而且，這些研究中所用的原代細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞有有限的生命期并且復(fù)制緩慢。這些特性不利地影響了轉(zhuǎn)染的速度并且妨礙穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的篩選。而且，繁殖大量的同源重組技術(shù)中所用的基因?qū)虻脑?xì)胞幾乎是不可能的。相反，應(yīng)用利用分化的細(xì)胞和CICM細(xì)胞的哺乳動物的克隆應(yīng)消除與逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)有關(guān)的難道。
可引入本主題的CICM細(xì)胞的DNA序列包括，例如，那些編碼表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營養(yǎng)性生長因子、胰島素樣的生長因子(I和II)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、AFT-1、細(xì)胞因子(白介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子(α和β)等)、治療用的酶等的DNA序列。
除了細(xì)胞、組織和器官移植中人的NT單位和CICM細(xì)胞的應(yīng)用之外，本發(fā)明還包括人的疾病治療中非人的細(xì)胞的應(yīng)用。因此，任意種的CICM細(xì)胞、NT胎兒和NT及嵌合后代(轉(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因的)可用于細(xì)胞、組織和器官移植是正當(dāng)?shù)娜思膊〉闹委?。一般來說，根據(jù)本發(fā)明的CICM細(xì)胞、胎兒和后代可用于相同種(自體的、同基因的或同種異體移植)或者種與種(異種移植)之間。例如，來自牛NT胎兒的腦細(xì)胞可用于治療帕金森病。
并且，本主題的CICM細(xì)胞也可用作分化，特別是與早期發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的研究的體外模型。并且，用本主題的CICM細(xì)胞分化出的細(xì)胞、組織和器官也可用于藥物研究中。
并且，本主題的CICM細(xì)胞可用作產(chǎn)生其它CICM細(xì)胞和細(xì)胞集落的核供體。
為了更清楚地描述本發(fā)明，提供了下面的實施例。實施例1牛和豬胚胎和成體牛成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物的分離牛和豬成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物從胎兒(牛受孕45天以及豬胎兒35天)獲得。無菌去除頭、肝臟、心臟和消化道，切碎胎兒并在預(yù)保溫的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中于37℃培養(yǎng)30分鐘。將成纖維細(xì)胞接種于組織培養(yǎng)皿中并在含有10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(50μl/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MD)中培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞于37℃濕潤條件下在含5％CO2的空氣中培養(yǎng)并維持。細(xì)胞達(dá)到鋪滿時常規(guī)傳代。
成體成纖維細(xì)胞從奶牛(約五歲齡)的肺和皮膚分離。切碎的肺組織于10℃在胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，GrandIsland，NY)中培養(yǎng)過夜。第二天，組織和任何脫離的細(xì)胞于37℃在預(yù)保溫的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，GrandIsland，NY)中培養(yǎng)1小時并且進(jìn)行三次連續(xù)洗滌和胰蛋白酶培養(yǎng)(1小時)。將成纖維細(xì)胞接種于組織培養(yǎng)皿中并在增補(bǔ)的α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MDC)中培養(yǎng)大約從胚盤期后發(fā)育至動物成年期的一段時間(牛受精后12-15天到10歲-15歲的動物)。此方法也可用于從其他哺乳動物包括小鼠分離成纖維細(xì)胞。將標(biāo)記基因(外來的異源DNA)導(dǎo)入胚胎及成體成纖維細(xì)胞。
對胚胎(牛和豬)和成體(牛)成纖維細(xì)胞進(jìn)行下面的電穿孔操作。標(biāo)準(zhǔn)顯微注射方法也可用于將異源DNA導(dǎo)入成纖維細(xì)胞，然而，由于操作更容易，所以本實施例中采用電穿孔操作。
將含有正在繁殖的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)板置于胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02/EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中培養(yǎng)直至細(xì)胞成為單個細(xì)胞懸浮液。在500xg下旋轉(zhuǎn)沉淀細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)重新懸浮細(xì)胞使每毫升含5×106個細(xì)胞。
報告基因構(gòu)建體包含巨細(xì)胞病毒啟動子和β-半乳糖苷酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶融合基因(β-GEO)。將報告基因和終濃度為50μg/ml的細(xì)胞加到電穿孔小室中。電穿孔脈沖之后，將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移回到生長培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青霉素(100IU/ml)、鏈霉素(50μl/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MFD))中。
電穿孔之后，篩選貼壁的成纖維細(xì)胞用于報告基因的穩(wěn)定整合。將G418(400μg/ml)加入生長培養(yǎng)基中作用15天(范圍3天直到培養(yǎng)的細(xì)胞的生命期末)。這種藥物殺死所有沒有β-GEO基因的細(xì)胞，原因是它們不表達(dá)neo抗性基在。在這段時間末期，出現(xiàn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的集落。每個集落互相之間獨立地繁殖。用X-gal將轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞染色以觀察β-半乳糖苷酶的表達(dá)并且證實為陽性用于應(yīng)用β-GEO基因的PCR擴(kuò)增的整合并且在瓊脂糖凝膠上跑帶。在核移植方法中使用轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞以創(chuàng)建CICM細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因胎兒將來源于牛胚胎成纖維細(xì)胞后個集落的一個細(xì)胞系(CL-1)用作核移植(NT)方法中的供體胞核。上面描述了NT的一般方法。
屠宰場卵母細(xì)胞在體外成熟。這些卵母細(xì)胞被剝?nèi)チ⒓?xì)胞并且在成熟后約18到20小時(hpm)用傾斜的微量加液器去核。在TL-HEPES培養(yǎng)基加Hoechst 33342(3μg/ml；Sigma)中證實去核。然后將單個供體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)置于受體卵母細(xì)胞的卵周隙中。應(yīng)用電融合技術(shù)將牛卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)與供體核(NT單位)融合在一起。在500μm充滿融合培養(yǎng)基的間隙小室中作用于NT單位的一次融合脈沖為120V 15秒。這發(fā)生在成熟后24hpm。將NT單位置于CRlaa培養(yǎng)基中直到26到27hpm。
上面已描述了用于人工活化卵母細(xì)胞的一般方法。NT單位的活化在26和27hpm時開始。簡言之，將NT單位暴露于含有1mg/ml BSA的TL-HEPES中的離子霉素(5μM；CalBiochem，La Jolla，CA)4分鐘并且用含有30mg/ml BSA的TL-HEPES洗5分鐘。在離子霉素處理過程中，也將NT單位置于2mM DMAP(Sigma)中。沖洗之后，將NT單位轉(zhuǎn)移到含有2mMDMAP(Sigma)的CRlaa培養(yǎng)基微滴中并且在38.5℃、5％CO2下培養(yǎng)4到5小時。沖洗胚胎并且然后置于含有小鼠胚胎成纖維細(xì)胞融合飼養(yǎng)層的四孔培養(yǎng)板的CRlaa培養(yǎng)基加10％FCS和6mg/ml BSA中。在38.5℃和5％CO2條件下培養(yǎng)NT單位3天以上。每三天更換一次培養(yǎng)基直到活化后5到8天。此時胚細(xì)胞期NT胚胎可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因CICM(培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán))細(xì)胞系或胎兒。可分離這些NT單位的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并種植在飼養(yǎng)層上。而且，將NT單位轉(zhuǎn)移到受體雌性動物中。在受孕后35-48天中止妊娠。這產(chǎn)生所有檢查的組織中具有β-GEO基因的7個克隆的轉(zhuǎn)基因胎兒。通過超聲波觀察檢測到7個胎兒中有6個具有正常的心跳。而且，胎兒的組織切片未表現(xiàn)顯著異常。此方法一般有助于基因?qū)駽ICM細(xì)胞系和胎兒。
下表總結(jié)了這些實驗的結(jié)果。
*19個系是β-GEO陽性，2個陰性并且一個在PCR檢測前死亡。+妊娠35天的發(fā)育中，一個胎兒死亡，另一個發(fā)育輕度遲緩。妊娠38-45天重新獲得的5個胎兒正常。所有胎兒證實為轉(zhuǎn)基因的?！俚谝粋€后代生于1997年10月。實施例2來源于轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞的嵌合胎兒和后代。轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞系最初來自轉(zhuǎn)基因NT單位(分化細(xì)胞)。
來源于轉(zhuǎn)基因NT胚胎(將CL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移進(jìn)入去核的卵母細(xì)胞)的CICM細(xì)胞系用來產(chǎn)生嵌合胚胎和胎兒。用1-5mg/ml鏈霉蛋白酶或0.05％胰蛋白酶/EDTA結(jié)合機(jī)械解聚方法使轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞集落解聚，以便產(chǎn)生5個或更少的細(xì)胞團(tuán)。通過用30～100％胎牛血清多次沖洗細(xì)胞使胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶活性失活。將這些解聚的細(xì)胞置于含有TL-HEPES培養(yǎng)基的顯微操作板中。也將受精的胚胎置于這些板中并應(yīng)用顯微操作工具來產(chǎn)生嵌合胚胎。將8到10個轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞注射進(jìn)入8-16個細(xì)胞期的受精胚胎中。體外培養(yǎng)這些胚胎到胚泡期并且隨后移植進(jìn)入受體動物中。
總共6個胚泡期嵌合胚胎非外科地移植進(jìn)入兩個受體雌性動物中。懷孕5周后，重新獲得3個胎兒。這三個胎兒的幾個組織包括性腺的生殖細(xì)胞(表示種系嵌合體)的篩選是通過對β-半乳糖苷酶片段的PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的Southern印跡雜交。這三個胎兒中，兩個是來自轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞contribution陽性。這兩個胎兒都有轉(zhuǎn)基因CICMcontribution性腺。
允許10個嵌合胚胎到足日，其中7個產(chǎn)下后代。作耳切跡并從每個小牛分離DNA。PCR擴(kuò)增一，其中一個證實為轉(zhuǎn)基因嵌合后代。轉(zhuǎn)基因NT胚胎來自轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞系。轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞系最初來自轉(zhuǎn)基因NT單位(分化的細(xì)胞)相同的轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞系用于產(chǎn)生NT胚胎。除了用作供體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合的是CICM細(xì)胞而不是成纖維細(xì)胞之外，應(yīng)用了實施例1是所描述的NT方法。用1-5mg/ml鏈霉蛋白酶或者0.05％胰蛋白酶/EDTA結(jié)合機(jī)械的解聚方法使轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞集落解聚以便產(chǎn)生5個或更少的細(xì)胞團(tuán)。其將細(xì)胞移植進(jìn)入去核卵母細(xì)胞之前，通過對細(xì)胞進(jìn)行30-100％胎牛血清的多次沖洗來使胰蛋白酶或鏈霉蛋白酶活性失活。表1中報道了結(jié)果(第三組)。產(chǎn)生了五個胚泡期胚胎。
權(quán)利要求
1.一種克隆哺乳動物的方法，包括(i)在適于核移植(NT)單位形成的條件下，將所需的無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核插入與分化的細(xì)胞或細(xì)胞核相同種的去核哺乳動物卵母細(xì)胞。(ii)活化得到的核移植單位；并且(iii)將所述的培養(yǎng)的NT單位移植入宿主哺乳動物以使NT單位發(fā)育成胎兒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括使胎兒發(fā)育成后代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾目的DNA，從而導(dǎo)致遺傳改變的NT單位的產(chǎn)生。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，進(jìn)一步包括使胎兒發(fā)育成后代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核來自中胚層譜系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核來自外胚層譜系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核來自內(nèi)胚層譜系。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核是成纖維細(xì)胞或細(xì)胞核。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核來自有蹄動物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中有蹄動物選自牛、綿羊、豬、馬、山羊和水牛。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核是成體細(xì)胞或細(xì)胞核。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核是胚胎或胎兒細(xì)胞或細(xì)胞核。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中去核的卵母細(xì)胞在去核前成熟。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中融合的核移植單位通過暴露于離子霉素和6-二甲氨基嘌呤而活化。
15.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中采用顯微注射來插入異源DNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中采用電穿孔來插入異源DNA。
17.按照權(quán)利要求1的方法獲得的胎兒。
18.按照權(quán)利要求2的方法獲得的后代。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的后代的子代。
20.按照權(quán)利要求3的方法獲得的轉(zhuǎn)基因胎兒。
21.按照權(quán)利要求4的方法獲得的轉(zhuǎn)基因后代。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的后代的子代。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括將克隆的NT單位與受精胚胎結(jié)合以產(chǎn)生嵌合胚胎。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，進(jìn)一步包括使胎兒發(fā)育成后代。
25.按照權(quán)利要求23的方法獲得的胎兒。
26.按照權(quán)利要求24的方法獲得的后代。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的哺乳動物的子代。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)所述活化的核移植單位直至超過2-細(xì)胞發(fā)育階段。
29.產(chǎn)生CICM細(xì)胞系的方法，包括(i)在適于核移植(NT)單位形成的條件下，將所需的無血清饑餓的、分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核插入與分化的細(xì)胞或細(xì)胞核相同種的去核哺乳動物卵母細(xì)胞；(ii)活化得到的核移植單位；并且(ii)培養(yǎng)從所述培養(yǎng)的NT單位獲得的細(xì)胞以獲得CICM細(xì)胞系。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中培養(yǎng)所述活化的核移植單位直至超過2-細(xì)胞發(fā)育階段。
31.按照權(quán)利要求29的方法獲得的CICM細(xì)胞系。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中在所述分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、去除或修飾目的DNA，從而導(dǎo)致遺傳改變的NT單位的產(chǎn)生。
33.按照權(quán)利要求32獲得的轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞系。
34.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中誘導(dǎo)得到的CICM細(xì)胞系分化。
35.按照權(quán)利要求34的方法獲得的分化細(xì)胞。
36.按照權(quán)利要求34的方法獲得的人分化細(xì)胞。
37.一種治療方法，包括給予需要細(xì)胞移植治療的病人以根據(jù)權(quán)利要求36所述的等基因分化細(xì)胞。
38.權(quán)利要求37的方法，其中進(jìn)行所述的細(xì)胞移植治療以治療以下疾病或病癥帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟疾病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、AIDS和癌癥。
39.一種治療方法，包括給予需要細(xì)胞移植治療的病人以根據(jù)權(quán)利要求35所述的異基因分化細(xì)胞。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中異基因分化細(xì)胞是牛細(xì)胞。
41.權(quán)利要求39的方法，其中進(jìn)行所述的細(xì)胞移植治療以治療以下疾病或病癥帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟疾病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、AIDS和癌癥。
42.權(quán)利要求37的方法，其中分化的人細(xì)胞是造血細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。
43.權(quán)利要求37的方法，其中療法是用于治療帕金森病并且分化細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。
44.權(quán)利要求37的方法，其中療法是用于治療癌癥并且分化細(xì)胞是造血細(xì)胞。
45.一種治療方法，包括給予需要細(xì)胞移植治療的病人以從根據(jù)權(quán)利要求17所述的胎兒獲得的異基因細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中異基因細(xì)胞是牛細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中進(jìn)行所述的細(xì)胞移植治療以治療以下疾病或病癥帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟疾病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、AIDS和癌癥。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中進(jìn)行所述的細(xì)胞移植療法以治療帕金森病。
49.一種治療方法，包括給予需要細(xì)胞移植治療的病人以從根據(jù)權(quán)利要求18所述的后代獲得的異基因細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中異基因細(xì)胞是牛細(xì)胞。
51.權(quán)利要求49的方法，其中進(jìn)行所述的細(xì)胞移植治療以治療以下疾病或病癥帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、肝臟疾病、耱尿病、心臟疾病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、AIDS和癌癥。
52.一種治療方法，包括給予需要細(xì)胞移植治療的病人以從根據(jù)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)基因胎兒獲得的異基因轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中異基因轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是牛細(xì)胞。
54.權(quán)利要求52的方法，其中進(jìn)行所述的細(xì)胞移植治療以治療以下疾病或病癥帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、肝臟疾病、耱尿病、心臟疾病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、AIDS和癌癥。
55.權(quán)利要求53的方法，其中進(jìn)行所述的細(xì)胞移植療法以治療帕金森病。
56.一種治療方法，包括給予需要細(xì)胞移植治療的病人以從根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因子代獲得的異基因轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中異基因轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是牛細(xì)胞。
58.權(quán)利要求56的方法，其中進(jìn)行所述的細(xì)胞移植治療以治療以下疾病或病癥帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、ALS、脊髓缺陷或損傷、多發(fā)性硬化、肌營養(yǎng)不良、囊性纖維化、肝臟疾病、糖尿病、心臟疾病、軟骨缺陷或損傷、燒傷、足潰瘍、血管疾病、尿道疾病、AIDS和癌癥。
59.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，進(jìn)一步包括將克隆的NT單位與受精胚胎結(jié)合以產(chǎn)生嵌合體。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，進(jìn)一步包括使嵌合的CICM細(xì)胞系發(fā)育成嵌合胚胎。
61.按照權(quán)利要求60獲得的嵌合胚胎。
62.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，進(jìn)一步包括使嵌合胚胎發(fā)育成嵌合胎兒。
63.按照權(quán)利要求62獲得的嵌合胎兒。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，進(jìn)一步包括使嵌合胎兒發(fā)育成嵌合后代。
65.按照權(quán)利要求64獲得的嵌合后代。
66.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中在所述分化的哺乳動物細(xì)胞或細(xì)胞核內(nèi)插入、去除或修飾目的DNA，由此導(dǎo)致遺傳改變的NT單位的產(chǎn)生。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，進(jìn)一步包括使嵌合的CICM細(xì)胞發(fā)育成嵌合胚胎。
68.按照權(quán)利要求67獲得的嵌合胚胎。
69.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，進(jìn)一步包括使嵌合胚胎發(fā)育成嵌合胎兒。
70.按照權(quán)利要求69獲得的嵌合胎兒。
71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，進(jìn)一步包括嵌合胎兒發(fā)育成嵌合后代。
72.按照權(quán)利要求71獲得的嵌合后代。
73.一種克隆哺乳動物的方法，包括(i)在適于核移植(NT)單位形成的條件下，將所需的無血清饑餓的、分化的CICM細(xì)胞或細(xì)胞核插入與分化的細(xì)胞或細(xì)胞核相同種的去核哺乳動物卵母細(xì)胞；(ii)活化得到的核移植單位；并且(iii)將所述的培養(yǎng)的NT單位轉(zhuǎn)移入宿主哺乳動物中以使NT單位發(fā)育成胎兒。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中培養(yǎng)所述活化的核移植單位直至超過2-細(xì)胞發(fā)育階段。
75.根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，進(jìn)一步包括使胎兒發(fā)育成后代。
76.按照權(quán)利要求73的方法獲得的胎兒。
77.按照權(quán)利要求75的方法獲得的后代。
78.從根據(jù)權(quán)利要求18所述的后代獲得的用于器官異種移植的器官。
79.從根據(jù)權(quán)利要求21所述的后代獲得的用于器官異種移植的器官。
80.從根據(jù)權(quán)利要求26所述的后代獲得的用于器官異種移植的器官。
81.從根據(jù)權(quán)利要求72所述的后代獲得的用于器官異種移植的器官。
82.從根據(jù)權(quán)利要求77所述的后代獲得的用于器官異種移植的器官。
83.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中去核的卵母細(xì)胞在體外成熟。
84.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中活化發(fā)生在NT單位形成之后。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法，其中在NT單位形成之后4小時或更晚發(fā)生活化。
86.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將NT單位在不確定培養(yǎng)基中與輔助細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)。
87.一種制備藥物活性蛋白的方法，包括分離由根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因后代表達(dá)的藥物活性蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供涉及將來自無血清饑餓的細(xì)胞的供體分化的細(xì)胞核移植入與供體細(xì)胞相同種的去核卵母細(xì)胞的核移植改進(jìn)方法。得到的核移植單位通過胎兒和后代的產(chǎn)生用于基因型和轉(zhuǎn)基因基因型的繁殖以及等基因CICM細(xì)胞包括人等基因胚胎或干細(xì)胞的產(chǎn)生。由于可對供體細(xì)胞核的分化細(xì)胞來源進(jìn)行遺傳修飾和克隆繁殖,通過本發(fā)明可促進(jìn)遺傳工程或轉(zhuǎn)基因哺乳動物胚胎、胎兒和后代的產(chǎn)生。
文檔編號C12N5/10GK1265599SQ98807691
公開日2000年9月6日 申請日期1998年6月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月3日
發(fā)明者S·L·司蒂斯, J·西柏利, J·M·羅貝爾, P·戈呂克, F·A·彭斯迪萊昂 申請人:馬薩諸塞大學(xué)