專利名稱：用于制備氨芐青霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備氨芐青霉素的方法，其中用苯基甘氨酸衍生物使6-氨基青霉烷酸(6-APA)進(jìn)行酶酰化反應(yīng)，反應(yīng)混合物中所含6-APA與氨芐青霉素的總濃度大于250mM，溶液中6-APA的濃度被保持在低于300mM的水平且所用?；瘎┡c6-APA的摩爾比小于2.5。
WO-A-92/01061中描述了以高濃度的酰化劑與b-內(nèi)酰胺衍生物通過b-內(nèi)酰胺環(huán)、例如6-APA的酶?；饔脕碇苽鋌-內(nèi)酰胺衍生物、包括氨芐青霉素的方法。將b-內(nèi)酰胺環(huán)的濃度保持在相對(duì)較低的水平。從這些實(shí)例中可以推斷以高摩爾比的?；瘎┡cb-內(nèi)酰胺環(huán)可以實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化率，而以低摩爾比的酰化劑與b-內(nèi)酰胺環(huán)則可以達(dá)到顯著低的轉(zhuǎn)化率。使用高摩爾比的?；瘎┡cb-內(nèi)酰胺環(huán)的缺陷在于由于酰化劑的水解作用而導(dǎo)致的大量?；瘎┑娜笔?。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在酶?；磻?yīng)后獲得的反應(yīng)混合物中含有的相當(dāng)大量的D-苯基甘氨酸(相對(duì)于氨芐青霉素來說)會(huì)妨礙氨芐青霉素的改良，結(jié)果是可以分離較小量的氨芐青霉素。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)為在本方法中實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化率，非常重要的是能夠在高濃度下、且由此在高濃度的b-內(nèi)酰胺環(huán)條件下進(jìn)行反應(yīng)。
WO-A-96/02663中描述了一種方法，其中b-內(nèi)酰胺環(huán)的酶?；磻?yīng)在恒定濃度的反應(yīng)劑下進(jìn)行。在本文所述的連續(xù)方法中，目的是達(dá)到最高可接受水平的兩種反應(yīng)劑濃度。
然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與在制備其它b-內(nèi)酰胺衍生物、諸如頭孢氨芐中可以實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化率相比，當(dāng)在高濃度的6-APA下進(jìn)行氨芐青霉素的制備時(shí)，僅能實(shí)現(xiàn)相對(duì)低的轉(zhuǎn)化率。
目前申請(qǐng)人意外地發(fā)現(xiàn)通過確保將反應(yīng)混合物中含有的可溶形式的6-APA的濃度保持相對(duì)較低，所實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化率可以比選擇盡可能高的溶解的6-APA的濃度時(shí)的轉(zhuǎn)化率要高。此外，發(fā)現(xiàn)當(dāng)將溶解的6-APA的濃度保持較低時(shí)反應(yīng)混合物的可攪拌性相對(duì)更好。
在本發(fā)明的上下文中，“轉(zhuǎn)化率”指的是所形成的氨芐青霉素與所用的6-APA的量的摩爾比。將溶解的6-APA的濃度表示為用摩爾表示的6-APA的量/kg反應(yīng)混合物；將6-APA與氨芐青霉素的總濃度(溶解的和未溶解的)表示為用摩爾表示的6-APA與氨芐青霉素的量/kg的總反應(yīng)混合物；除溶液外，總反應(yīng)混合物可以含有許多固體物質(zhì)，例如6-APA、氨芐青霉素、苯基甘氨酸和固定化酶。
?；瘎┡c6-APA的摩爾比、即所添加的苯基甘氨酸衍生物的總量除以所添加的6-APA的總量(均用摩爾表示)小于2.5。優(yōu)選所述的摩爾比在1.0-2.0之間。特別是在1.2-1.8之間。
優(yōu)選酶?；磻?yīng)以分批工藝進(jìn)行。如果需要，也能夠在順序控制溶解的6-APA的濃度的條件下使反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。
在本發(fā)明的方法中，使得反應(yīng)混合物中6-APA與氨芐青霉素(溶解的和未溶解的形式)的總濃度高于250mM，優(yōu)選高于300mM，1，且特別是高于350mM。
在制備氨芐青霉素的過程中，基本上將溶解的6-APA的濃度保持在低于300mM的水平。在高濃度?；瘎┫?，如果必要，可以將溶解的6-APA的濃度選擇為高于低濃度酰化劑下選擇的溶解的6-APA的濃度。這是因?yàn)樵诟邼舛弱；瘎┫碌姆磻?yīng)速率較高，即高濃度溶解形式的6-APA僅能存在相對(duì)較短的時(shí)間。
可以以不同方式將反應(yīng)混合物中所含溶解形式的6-APA的濃度保持在較低的水平。保持溶解的6-APA的濃度較低的一種可能性是僅在開始階段加入6-APA總量的一部分并在反應(yīng)過程中添加其余的部分。然而，這種方法的缺陷在于必須將6-APA作為固體添加-這產(chǎn)生實(shí)際的難題。結(jié)果是優(yōu)選在反應(yīng)的開始時(shí)最初以分批法加入6-APA的總量，此后，在酶?；磻?yīng)過程中，反應(yīng)混合物中6-APA的濃度會(huì)降低且氨芐青霉素的濃度會(huì)提高。不過，實(shí)現(xiàn)較低濃度溶解的6-APA的合適方法是、例如與反應(yīng)劑達(dá)到最高溶解度時(shí)的pH相比將pH保持在較低值。將溶解形式的6-APA濃度保持較低的一種特別合適的方法是、例如確保將苯基甘氨酸衍生物的濃度保持在較低的水平，該方法例如通過在反應(yīng)過程中部分量入(metering in)苯基甘氨酸衍生物來實(shí)現(xiàn)。
實(shí)際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)將苯基甘氨酸衍生物的濃度保持較低時(shí)，幾乎沒有6-APA進(jìn)入溶液，使得通過量入苯基甘氨酸衍生物可以控制溶液中6-APA的濃度。
可以將活化形式的苯基甘氨酸例如一種酰胺或一種酯、特別是一種甲酯用作(酶)酰化反應(yīng)中的?；瘎?。優(yōu)選使用D-苯基甘氨酸酰胺(PGA)。
如果將PGA以一種其鹽的形式、優(yōu)選PGA與一種無機(jī)酸的鹽、例如PGA.HCl、PGA.1/2H2SO4和PGA.HNO3來添加，那么會(huì)獲得一種特別合適的實(shí)施方案。在這種方式中，實(shí)際上能夠以一種簡單的方式通過保持pH恒定來實(shí)現(xiàn)PGA的最佳添加量。優(yōu)選使用PGA.1/2H2SO4，因?yàn)檫@種鹽具有很高的溶解度。
酶酰化反應(yīng)一般在低于40℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選-5℃-35℃。所述的酶?；磻?yīng)一般在5.5-8.0的pH下進(jìn)行，優(yōu)選6.0-6.8。
原則上可以將適合用作連接反應(yīng)中的催化劑的任何酶用作這種酶。這類酶例如是公知為一般名稱是青霉素酰胺酶或青霉素?；D(zhuǎn)移酶的酶類。例如J.G.Shewale等在《生物化學(xué)方法》(ProcessBiochemistry)1989年8月，pp 146-154頁和J.G.Shewale等在《國際生物化學(xué)方法》(Process Biochemistry International)1990年6月，pp.97-103中描述了這類酶。合適的酶的實(shí)例是來源于下列菌的酶類醋桿菌屬、特別是巴斯德氏醋桿菌；氣單胞菌屬；產(chǎn)堿桿菌屬、特別是糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)、Aphanocladium；芽孢桿菌屬、特別是巨大芽孢桿菌；頭孢屬；埃希氏桿菌屬、特別是大腸桿菌；黃桿菌屬；鐮孢屬、特別是尖孢鐮孢和茄病鐮孢；克呂沃爾氏菌屬；枝動(dòng)菌屬；魚精蛋白桿菌屬；變形菌屬、特別是雷脫茄氏變形菌；假單胞菌屬和黃單胞菌屬、特別是柑桔黃單胞菌(Xanthomonas citrii)。
優(yōu)選使用一種固定化酶，因?yàn)榭梢詫⑦@種酶簡單地分離并再利用。合適的固定技術(shù)例如在EP-A-222462中所述。另一種合適的技術(shù)包括在一種載體上固定青霉素G?；D(zhuǎn)移酶的步驟，其中所述的載體含有一種膠凝劑、例如明膠和一種帶有游離氨基的聚合物、例如藻酸胺、脫乙酰殼多糖或聚乙烯亞胺(polyethylenimine)。此外，還可以使用結(jié)晶形式的酶(CLEC’sTM)。
在商購的固定化酶中，發(fā)現(xiàn)下列酶是特別合適的例如來自Boehringer Mannheim GmbH的大腸桿菌酶，它商購的商品名為Enzygel；來自Recordati的固定化青霉素-G酰基轉(zhuǎn)移酶和來自Pharma Biotechnology，Hannover的固定化青霉素-G?；D(zhuǎn)移酶。
(酶)?；磻?yīng)和反應(yīng)混合物的進(jìn)一步改良實(shí)際上通常在水中進(jìn)行。如果需要，反應(yīng)混合物還可以含有一種有機(jī)溶劑或一種有機(jī)溶劑的混合物、優(yōu)選小于30％(體積)。可以使用的有機(jī)溶劑的實(shí)例是帶有1-7個(gè)碳原子的醇類，例如一醇、特別是甲醇或乙醇；二醇、特別是乙二醇；或者三醇、特別是甘油。
當(dāng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)接近最高轉(zhuǎn)化率時(shí)在大多數(shù)情況下優(yōu)選終止反應(yīng)。用于實(shí)現(xiàn)這一目的的合適的實(shí)施方案是降低pH，優(yōu)選將pH降至4.0-6.3，特別是5.0-5.7。另一種合適的實(shí)施方案是一旦達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率就降低反應(yīng)混合物的溫度。也能夠?qū)煞N實(shí)施方案合并使用。
在大多數(shù)情況下達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率時(shí)將反應(yīng)終止后，反應(yīng)混合物通常以一種懸浮液的形式存在，它含有幾種固體物質(zhì)，例如氨芐青霉素、D-苯基甘氨酸和固定化酶。就反應(yīng)的經(jīng)濟(jì)性來說，優(yōu)選回收所述的固定化酶。進(jìn)行這一過程的合適方式是例如通過一種篩來過濾反應(yīng)混合物，同時(shí)優(yōu)選用定向旋轉(zhuǎn)的攪拌器來進(jìn)行攪拌，以便將所述的懸浮液向上壓至攪拌器的中心部分。隨后例如通過pH調(diào)節(jié)器可以回收有價(jià)值的成分，例如AMPI和PG。遺留的母液中僅含有少量的副產(chǎn)物，且如果需要可以隨后將它們進(jìn)行再循環(huán)。
在本發(fā)明的上下文中，各種成分可以以游離形式或作為鹽存在于反應(yīng)混合物中。所述的pH值通常指的是用在室溫下校準(zhǔn)的pH電極測定的pH值。
本發(fā)明通過實(shí)施例來進(jìn)一步進(jìn)行解釋，然而，它們不用來限定本發(fā)明。
縮寫AMPI.3H2O＝氨芐青霉素三水合物6-APA ＝6-氨基青霉烷酸PGA ＝D-苯基甘氨酸酰胺PG＝D-苯基甘氨酸AssemblaseTM是一種來源于如WO-A-97/04086中所述的大腸桿菌ATCC1105的固定化大腸桿菌青霉素?；D(zhuǎn)移酶。固定方法如EP-A-222462中所述進(jìn)行，將明膠和脫乙酰殼多糖用作膠凝劑并將戊二醛用作交聯(lián)劑。用已添加到活化小顆粒中的酶的量來測定大腸桿菌青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶的總活性且等于3 ASU/g干重，將1 ASU(阿莫西林合成單位)定義為每小時(shí)由6-APA和D-p-羥苯基甘氨酸甲酯(HPGM)生成1g的阿莫西林。3H2O的酶的量(在20℃下，6.5％的6-APA和6.5％的HPGM)。
實(shí)施例IPGA.1/2H2SO4溶液的制備。
在T＝5℃下將301.6g的PGA(2.00mol)懸浮于650g的水中。在1小時(shí)的期限內(nèi)逐滴加入102.1g、96％H2SO4(1.00mol)，同時(shí)攪拌，通過冷卻將溫度保持在T＜25℃。
實(shí)施例II氨芐青霉素的合成將300g凈重(net wet)的Assemblase填入一種安裝了帶有175μm篩目的篩底的酶反應(yīng)器(1.5l，直徑11cm)中。
向制備反應(yīng)器(1.2l)中添加131.6g的6-APA(0.600mol)、30.2g的PGA(0.200mol)和400ml的水(T＝10℃)。在T＝10℃下將該混合物攪拌15分鐘且然后將其在時(shí)間t＝0時(shí)轉(zhuǎn)入裝有100ml水(T＝10℃)的酶反應(yīng)器中。
在t＝0時(shí)，啟動(dòng)所述酶反應(yīng)器中的攪拌器。在283分鐘的期限內(nèi)以恒定的速度加入423.7g(0.800mol)的PGA.1/2H2SO4溶液，同時(shí)將溫度保持在10℃。pH約為6.3。從t＝328分鐘開始，通過用6N(含水)H2SO4滴定將pH保持在6.3。在t＝540分鐘時(shí)氨芐青霉素的量為最大值且通過加入6N的H2SO4使pH降至5.6。
目前酶反應(yīng)器中含有575mmol的AMPI(＝相當(dāng)于所用6-APA量的96％)15mmol的6-APA50mmol的PGA365mmol的PG反應(yīng)過程中的濃度如

圖1中所示。
比較實(shí)驗(yàn)A氨芐青霉素的合成將300g凈重(net wet)的Assemblase填入一種安裝了帶有175μm篩目的篩底的酶反應(yīng)器(1.5l，直徑11cm)中。
在10℃下向制備反應(yīng)器(1.2l)中添加溶于500ml水的143.2g(0.950mol)PGA。在10℃下15分鐘的期限內(nèi)以小量方式添加131.6g的6-APA(0.600mol)，同時(shí)冷卻，而通過用6N(含水)H2SO4滴定將pH保持在7.0?？傆?jì)需要54.5ml的6N H2SO4。在T＝10℃下將混合物攪拌15分鐘且然后在時(shí)間t＝0時(shí)轉(zhuǎn)入裝有100ml水(T＝10℃)的酶反應(yīng)器中。在t＝10時(shí)起動(dòng)酶反應(yīng)器中的攪拌器。通過用6N的H2SO4滴定將pH保持在7.0。使溫度保持在10℃。在t＝160分鐘時(shí)氨芐青霉素的量為最大值且通過加入6N的H2SO4使pH降至5.6?？傆?jì)向所述的酶反應(yīng)器中添加147.6ml的6N H2SO4。所述的混合物相對(duì)較粘而難以攪拌。
目前酶反應(yīng)器中含有551mmol的AMPI(＝相當(dāng)于所用6-APA量的92％)24mmol的6-APA50mmol的PGA330mmol的PG反應(yīng)過程中的濃度如圖2中所示。
權(quán)利要求
1.用于制備氨芐青霉素的方法，其中用苯基甘氨酸衍生物使6-氨基青霉烷酸(6-APA)進(jìn)行酶酰化反應(yīng)，反應(yīng)混合物中所含6-APA與氨芐青霉素的總濃度大于250mM，溶液中6-APA的濃度被保持在低于300mM的水平且所用?；瘎┡c6-APA的摩爾比小于2.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)混合物中所含6-APA與氨芐青霉素之和的濃度大于300mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中溶液中6-PAP的濃度被保持在低于250mM的水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的方法，其中所用總?；瘎┡c6-APA的摩爾比小于2.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于在酶?；磻?yīng)過程中部分量入6-APA和/或苯基甘氨酸衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于將苯基甘氨酸衍生物作為D-苯基甘氨酸酰胺與一種酸的鹽的形式量入。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于將苯基甘氨酸衍生物以D-苯基甘氨酸酰胺。1/2 H2SO4水溶液的形式量入。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于通過測定pH來控制苯基甘氨酸衍生物的添加量。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于一旦達(dá)到接近最高轉(zhuǎn)化率就降低反應(yīng)混合物的pH。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的方法，其特征在于一旦達(dá)到接近最高轉(zhuǎn)化率就降低反應(yīng)混合物的溫度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備氨芐青霉素的方法,其中用苯基甘氨酸衍生物使6－氨基青霉烷酸(6－APA)進(jìn)行酶?；磻?yīng),反應(yīng)混合物中所含6－APA與氨芐青霉素的總濃度大于250mM,溶液中6－APA的濃度被保持在低于300mM的水平且所用?；瘎┡c6－APA的摩爾比小于2.5。
文檔編號(hào)C12P37/00GK1265706SQ98807876
公開日2000年9月6日 申請(qǐng)日期1998年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月10日
發(fā)明者H·M·莫迪, W·H·J·貝特森 申請(qǐng)人:Dsm有限公司