專利名稱：用αVβ6的拮抗劑治療急性肺損傷和纖維化的制作方法
本工作部分由NIH資助號(hào)HL 47412和HL 53949支持。美國(guó)政府可能對(duì)本專利具有一定權(quán)利。
本發(fā)明的背景整聯(lián)蛋白是由兩個(gè)亞基α和β組成的異二聚體細(xì)胞粘附受體。整聯(lián)蛋白αVβ6是主要由上皮細(xì)胞表達(dá)的纖連蛋白和肌鍵蛋白受體。雖然β6在胎兒發(fā)育，傷口愈合和一些上皮腫瘤中表達(dá)，但在健康成年靈長(zhǎng)類組織中難以檢測(cè)到β6mRNA和蛋白質(zhì)。當(dāng)β6亞基在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)時(shí)(它正常是不在其中表達(dá)的)，該亞基的表達(dá)將增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。對(duì)于αVβ6整聯(lián)蛋白增強(qiáng)增殖的活性，一段β6亞基特異的11個(gè)氨基酸的羧基末端區(qū)域是必需的(Agrez等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)127547-556(1994))。在II型小泡(aveolar)上皮細(xì)胞由于注射活菌造成損傷時(shí)，誘導(dǎo)β6的表達(dá)，并且在亞臨床炎癥病灶區(qū)以及來自肺或腎慢性或急性炎癥病人的多種臨床樣品中觀察到β6表達(dá)(Breuss等，細(xì)胞科學(xué)雜志(J.Cell.Sci.)1082241-2251(1995))。
Huang等(細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)133921-928(1996))披露在編碼β6亞基的基因中的一種無效突變的鼠純合體造成幼畜禿發(fā)，并伴有巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到皮膚，以及在肺導(dǎo)氣管積累激活的淋巴細(xì)胞。
人們認(rèn)為肺纖維化是由白細(xì)胞釋放物破壞效應(yīng)造成的常見疾病(參看例如，Marshall等，Int.J.Biochem.Cell Bio.29107-120(1997))。博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷和肺纖維化相關(guān)于并可能依賴于淋巴細(xì)胞的募集和活化(Schrier，D.J.等，Am.J.Pathol.116270-278(1984))。治療實(shí)質(zhì)性肺損傷和肺纖維化的建議療法中有一種是使用抗細(xì)胞因子治療方法(Coker等，Thorax 52(2)294-296(1997))。
但是，目前急性肺損傷和肺纖維化的療法大部分是不充份的(參看例如，King等，“未知病因的自發(fā)肺纖維化和其它間質(zhì)肺病”，呼吸藥物教材(Textbook of Respiratory Medicine.，Murray和Nodel編輯，W.B.Saunders，Philadelphia，PA.pp.1827-1839(1994)))。因而，存在著對(duì)治療急性肺損傷和肺纖維化的療法的需要。本發(fā)明目的在于這種需要及其它需要。
本發(fā)明的總結(jié)本發(fā)明的一個(gè)方面是治療病人急性肺損傷的一種方法，包括對(duì)病人施用治療劑量的αVβ6的拮抗劑。本發(fā)明亦提供了抑制肺遷移的方法，包括向病人施用治療劑量的αVβ6的拮抗劑。本發(fā)明進(jìn)一個(gè)方面是一種治療病人纖維化的方法，包括向病人施用治療劑量的αVβ6的拮抗劑。
本發(fā)明的又一個(gè)方面是一種由雜交瘤ATCC HB 12382產(chǎn)生的單克隆抗體。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是雜交瘤ATCC HB 12382。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1A是在博來霉素(blm)或鹽水(sal)存在下表達(dá)β6整聯(lián)蛋白亞基基因無效突變的小鼠和對(duì)照小鼠的肺羥脯氨酸含量的比較圖。
圖1B是低分辨率肺切片的三色(trichrome)染色照片，顯示博來霉素處理30天后野生型(β6+/+)肺中形成膠原的胞外基質(zhì)的密集積累而在β6-/1中則沒有。
圖2圖示在博來霉素(blm)或鹽水(sal)存在下野生型小鼠(β6+/+)與β6-/-小鼠相比肺水增加的比較。
圖3圖示使用博來霉素(blm)或鹽水(sal)后野生型(β6+/+)和β6-/-小鼠的淋巴細(xì)胞的募集的比較。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了治療肺損傷的方法和組合物，肺損傷諸如但不限于由細(xì)菌性濃毒癥，出血性休克，毒性吸入導(dǎo)致的肺損傷，以及博來霉素及其它藥物誘導(dǎo)的肺損傷。此外，本發(fā)明的組合物可用于治療上皮器官，諸如肺，肝，腎，膀胱和食管的纖維化。
可用作預(yù)防或治療向具有或者可能會(huì)具有急性肺損傷或纖維化的病人提供這種組合物。例如，曾暴露于毒性吸入劑的病人在暴露后應(yīng)進(jìn)行處理，而接受博來霉素的病人可進(jìn)行預(yù)防和/或治療處理。雖然具有肺纖維化，一種漸進(jìn)性疾病的病人可接受數(shù)月至數(shù)年的治療劑量，但典型地，本發(fā)明的組合物是按天給藥，至少1-5天。此處使用的“治療劑量”是防止，緩解，降低或減輕病人癥狀嚴(yán)重程度的劑量。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了αVβ6的拮抗劑。這類拮抗劑包括但不限于特異性結(jié)合β6的抗體；特異性結(jié)合αVβ6配體的抗體；αVβ6的配體；反義核酸；以及肽；非肽，以及這類配體的肽模擬物類似物。
抗體可以是合成的，單克隆的或多克隆的，并可由本技術(shù)領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，拮抗劑是一種特異性識(shí)別β6亞基胞質(zhì)區(qū)的抗體(例如，參看Weinacker等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Bio.)2691-9(1994))。對(duì)于治療應(yīng)用，優(yōu)選地是具有人恒定區(qū)和可變區(qū)的“人”單克隆抗體，以盡量減小病人對(duì)抗體的免疫反應(yīng)?？赏ㄟ^免疫含有人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生這類抗體。參看Jakovobits等，Ann.NY Acad Sci 764525-535(1995)。在合成和半合成抗體方面，這類術(shù)語(yǔ)是為了覆蓋但不限于抗體片段，同種型轉(zhuǎn)換抗體，人源化抗體(例如，小鼠-人，人-小鼠，等等)，雜合體，其多種特異性的抗體，全合成類抗體分子，等等。
如下面所述，可以篩選具有阻礙配體和αVβ6結(jié)合的能力或其它特征，諸如體內(nèi)保護(hù)免除博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的能力的抗體。一個(gè)抗β6的單克隆抗體的實(shí)施例是10D5(ATCC保藏號(hào)HB 12382，1997年8月6日保藏)。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，使用了以含有細(xì)胞粘著結(jié)構(gòu)域精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)為基礎(chǔ)的設(shè)計(jì)為αVβ6配體的肽，多肽，蛋白質(zhì)，或肽類模擬物的拮抗劑。已經(jīng)有設(shè)計(jì)為整聯(lián)蛋白的配體的這類分子的實(shí)例，例如，Pierschbacher等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志(J.Cell.Biochem.)56150-154(1994)；Ruoslahti，Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.12697-715(1996)；Chorev等，Biopolymers37367-375(1995))；Pasqualini等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)1301189-1196(1995)；以及Smith等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)26932788-32795(1994))。
在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，使用反義核酸分子作為αVβ6的拮抗劑。反義核酸分子是與核酸互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，設(shè)計(jì)為能與特定核苷酸序列結(jié)合，從而抑制靶蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在1991年7月11日存檔的U.S.S.N.07/728,215中公布了β6整聯(lián)蛋白亞基的核苷酸序列，此處以參考文獻(xiàn)將其完整并入。這些藥劑可單獨(dú)使用或與其它拮抗劑組合使用。反義拮抗劑可通過反義寡核苷酸諸如RNA的形式提供(參看例如，Murayama等，Antisense Nucleic AcidDrug Dev.7109-114(1997))。反義基因亦可通過病毒載體提供，諸如，例如乙肝病毒(參看例如Ji等，J.Viral Hepat.4167-173(1997))；腺伴隨病毒(參看例如，Xiao等，Brain Res.75676-83(1997))；或其它系統(tǒng)包括但不限于HVJ(仙臺(tái)病毒)-脂質(zhì)體基因傳遞系統(tǒng)(參看例如，Kaneda等，Ann.N.Y.Acad.Sci.811299-308(1997))；一種“肽載體”(參看，例如，Vidal等，CR Acad.SciIII 32)279-287(1997)；游離型或質(zhì)粒載體中的基因(參看，例如，Cooper等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)946450-6455(1997)，Yew等，人類基因治療(Hum Gene Ther.)8575-584(1997))；在肽-DNA聚集物中的基因(參看，例如，Niidome等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27215307-15312(1997))；“裸DNA”(參看，例如U.S.5,580,859和U.S.5,589,466)；以及脂載體系統(tǒng)(參看，例如，Lee等，Crit Rev Ther DrugCarrier Syst.14173-206(1997))。
可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的或本申請(qǐng)中公布的多種技術(shù)，諸如在小鼠模型中防止博來霉素誘導(dǎo)的纖維化；抑制腫瘤細(xì)胞增殖(Agrez等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Bio)，127547-556(1994))；以及抑制細(xì)胞遷移和/或抑制細(xì)胞粘著(參看實(shí)驗(yàn)實(shí)施例部分)來篩選αVβ6的候選拮抗劑的功能。
在所有藥物化學(xué)家所知的處方集中可發(fā)現(xiàn)本發(fā)明拮抗劑的多種適用劑型雷明頓藥物科學(xué)(Remington′s Pharmaceutical Seiences.)(第15版，MackPublishing Company，Easton，Pennsyluania(1975))，特別是其中的Blaug，Seymour的第87章。這些劑型包括例如粉劑，糊劑，軟膏劑，膠體，蠟，油，脂，無水吸收基質(zhì)(anhydrous absorption bases)，水包油或油包水乳劑，聚乙二醇乳劑(多種分子量的聚乙二醇)，半固體凝膠，以及含聚乙二醇的半固體混合物。
有效治療所需的活性成分的量依賴于不同的因素，包括給藥方法，靶部位，病人生理狀態(tài)，及使用的其它藥物。因而，應(yīng)當(dāng)?shù)味ㄖ委焺┝恳詢?yōu)化安全性和有效性。典型地，體外使用劑量可提供原位使用的活性成分的量的有效指導(dǎo)。治療特定疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的有效量將為人體用量提供進(jìn)一步的預(yù)測(cè)性指示。已經(jīng)描述了多種考慮，例如，Goodman and Gilman′s thePharmacological Basis of Therapeutics，第7版(1985)，Maclnill an PublishingCompany，New York，以及Remington′s Pharmaceutical Sciences第18版(1990)，Mack Publishing Co，Easton Penn.其中討論了用藥方法，包括口服，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，經(jīng)皮的，鼻的，離子電滲療法給藥等等。
依據(jù)給藥方法，本發(fā)明的組合物可通過多種單位劑量形式給藥。例如，適于口服的單位劑量形式包括固體劑量形式諸如粉劑，片劑，丸劑，膠囊，和糖衣丸以及液體劑量形式諸如酏劑，糖漿和懸浮液。也可以無菌液體劑量形式將活性組分腸胃外用藥。明膠膠囊含有活性組分以及作為無活成分的粉狀載體，諸如葡萄糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，淀粉，纖維素或纖維素衍生物，硬脂酸鎂，硬脂酸，糖精鈉，滑石粉，碳酸鎂等等。其它可能為了提供所需顏色，味道，穩(wěn)定性，緩沖能力，分散性或其它已知所需特征而加入的無活成分的例子有紅色氧化鐵，二氧化硅凝膠，月桂硫酸鈉，二氧化鈦，可食性白色墨水(white ink)等等。可使用類似的稀釋劑制備壓縮的片劑。片劑和膠囊均可制成緩釋產(chǎn)品，從而在數(shù)小時(shí)內(nèi)提供藥物的緩釋。壓縮片劑可以是糖包被的或膜包被的，從而掩蓋令人不快的味道并保護(hù)片劑不接受空氣，或是腸包被的，從而在胃腸道中選擇性降解。用于口服的液體劑量形式可含有顏色和調(diào)味劑使病人易于接受。
藥物制劑中本發(fā)明組合物的濃度可變范圍很大，即從低于重量的大約0.1％，通常在或至少大約2％多至20％以至50％或更高，并且濃度將主要由流體體積，粘度等來選擇，并基于選擇的特定用藥方式而定。
本發(fā)明的組合物亦可通過脂質(zhì)體用藥。脂質(zhì)體包括乳濁液，泡沫塑料，微團(tuán)，不溶性單層，液晶，磷脂分散體，薄片層及類似物。在這些制備物中，本發(fā)明的組合物摻入到脂質(zhì)體中進(jìn)行藥物傳遞，它可以是單獨(dú)使用或與結(jié)合所需靶的分子諸如抗體或與其它治療或免疫原性組合物共同使用。這樣，可將填充或修飾了所需的本發(fā)明組分的脂質(zhì)體全身給藥，或定向至感興趣組織，在該處脂質(zhì)體遞送選擇的治療/免疫原性肽組合物。
本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體是由標(biāo)準(zhǔn)的能形成小泡的脂類形成的，一般包括中性和帶負(fù)電的磷脂和固醇，諸如膽固醇。通常通過考慮例如脂質(zhì)體大小，酸不穩(wěn)定性和脂質(zhì)體在血流中的不穩(wěn)定性來指導(dǎo)對(duì)脂類的選擇?，F(xiàn)有多種制備脂質(zhì)體的方法，例如Szoka等，生物物理與生物工程年評(píng)(Ann.Rev.Biophys.Bioeng.)9467(1980)，美國(guó)專利4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369中所述，以參考文獻(xiàn)并于此處。
含有本發(fā)明組合物的脂質(zhì)體懸浮液可以靜脈內(nèi)，局部，表面用藥，其劑量可依據(jù)包括用藥方式，要傳遞的本發(fā)明組合物，和治療的疾病的階段等變化。
對(duì)于固體組合物，可使用傳統(tǒng)的無毒固相載體，包括例如，藥品級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石粉，纖維素，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂，及其類似物。對(duì)于口服用藥，藥物學(xué)可接受的無毒性組合物是通過將正常應(yīng)用的賦形劑，諸如前面列舉的載體，與通常為10-95％的活性成分，即一種或多種本發(fā)明組合物，并且更優(yōu)選地在25％-75％的濃度摻合后形成的。
對(duì)于氣霧劑用藥，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地以精細(xì)的形式與表面活性劑和推進(jìn)物一起提供。本發(fā)明組合物的典型百分含量是重量的0.01％-20％，優(yōu)選地1％-10％。表面活性劑當(dāng)然必須是無毒的并優(yōu)選地溶于推進(jìn)物。這類藥劑的代表是含有6至22個(gè)碳原子的脂肪酸，諸如己酸，辛酸，月桂酸，棕櫚酸，硬脂酸，亞油酸，亞麻酸，olesteric acids和油酸與脂肪族多羥醇或其環(huán)酐的酯或部分酯?？梢允褂弥T如混合的或天然甘油酯的混合酯。表面活性劑可占組合物重量的0.1％-20％，優(yōu)選地0.25-5％。組合物的平衡通常是推進(jìn)物。如果需要，亦可包括載體，例如用于鼻內(nèi)給藥時(shí)可包括卵磷脂。
本發(fā)明的構(gòu)建物另外可用于儲(chǔ)存型系統(tǒng)中給藥，通過本技術(shù)領(lǐng)域熟知技術(shù)的一種膠囊形式，或一種移植物。類似地，可通過泵向目的組織傳遞構(gòu)建體。
只要?jiǎng)┬椭械幕钚运巹┎灰驗(yàn)閯┬投Щ畈⑶以搫┬褪巧砑嫒莸模罁?jù)本發(fā)明的任何上述劑型都適用于處理和治療。
下面提供的實(shí)施例是為了說明本發(fā)明的特定方面而不是限制其主題。
實(shí)驗(yàn)實(shí)施例I.導(dǎo)言人們認(rèn)為肺纖維化是由于白細(xì)胞釋放物的破壞效應(yīng)造成的常見疾病。雖然在纖維化發(fā)生中損傷了呼吸上皮細(xì)胞，但以前并未表明上皮細(xì)胞本身有助于此過程。我們檢測(cè)了博來霉素，一種已知造成肺纖維化的藥物，對(duì)完全限于上皮細(xì)胞表現(xiàn)單個(gè)整聯(lián)蛋白亞基(β6)基因無效突變的小鼠的作用。β6-/-小鼠顯著地受到保護(hù)，免除博來霉素誘導(dǎo)的纖維化。靶向此整聯(lián)蛋白的療法從而提供了治療這種大部分未能治療的疾病的新方法。
整聯(lián)蛋白αVβ6只在上皮細(xì)胞上表達(dá)，主要是在器官形成和對(duì)損傷起反應(yīng)時(shí)。β6-/-小鼠放大了對(duì)皮膚和氣管損傷的炎癥反應(yīng)，但發(fā)育和繁殖正常(Huang，X.Z.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)133921-928(1996))。II.αVβ6整聯(lián)蛋白亞基基因的失活保護(hù)小鼠免于博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化測(cè)定了年齡和性別匹配的129 SVEMS/ter種野生型(β6+/+)和β6-/-小鼠在氣管內(nèi)注射博來霉素(60μl鹽中0.03單位(U))或鹽載體(60μl)后的肺毒性。在處理15，30和60天后，通過檢查肺形態(tài)和測(cè)定羥脯氨酸含量，膠原沉積的一種指標(biāo)，評(píng)價(jià)了肺纖維化。在博來霉素處理30天的野生型小鼠中有顯著的纖維化，并在60天有發(fā)展(圖1A-1B)。與此相反，β6-/-小鼠肺形態(tài)在實(shí)驗(yàn)中幾乎保持正常，只有小的纖維化斑；并且肺羥脯氨酸含量與鹽處理動(dòng)物中測(cè)得的量在任何時(shí)間點(diǎn)均無顯著差別。這一發(fā)現(xiàn)不是僅對(duì)純合129小鼠是獨(dú)特的，因?yàn)樵?29與C57B 1/6雜交后代中獲得類似結(jié)果。這些未料到的結(jié)果表明整聯(lián)蛋白αVβ6的表達(dá)對(duì)于肺纖維化的誘導(dǎo)是必要的。
為了確定αVβ6在博來霉素誘導(dǎo)纖維化早期階段中的作用，我們測(cè)定了使用博來霉素或鹽1，5和15天后的肺水含量，它是由于增加了血管通透性造成肺水腫的一個(gè)標(biāo)記。在野生型小鼠中，博來霉素處理后5天時(shí)肺水增至最高并保持增加至15天(圖2)。對(duì)于肺纖維化，β6-/-小鼠大部分保護(hù)免于博來霉素的這種早期效應(yīng)，表明上皮αVβ6在博來霉素誘導(dǎo)的血管滲漏前的作用。
我們以前報(bào)道了β6-/-小鼠證實(shí)在皮膚和氣管中有擴(kuò)大的單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)(Huang，X.Z.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)133921-928(1996))。博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷和肺纖維化相關(guān)于并可能依賴于淋巴細(xì)胞的募集和活化(Schrier，D.J.等，Am.J.Pathol.116270-278(1984))。為了確定β6-/-小鼠對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的損傷和纖維化的抗性是否歸因于變化的淋巴細(xì)胞恢復(fù)或活化，我們計(jì)數(shù)CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞并通過測(cè)定鹽或博來霉素處理5天和15天后小鼠肺中獲取的細(xì)胞中白介素2-受體(CD25)的表達(dá)評(píng)價(jià)了淋巴細(xì)胞活性。與先前的報(bào)道一致，在β6-/-小鼠肺中有比野生型動(dòng)物中更多的CD4+，CD8+和CD25+細(xì)胞。在野生型和β6-/-小鼠中，博來霉素誘導(dǎo)了表達(dá)CD4和CD8的淋巴細(xì)胞的數(shù)目大量增加，并且顯著增加表達(dá)CD25的淋巴細(xì)胞百分含量。在野生型和β6-/-小鼠中肺淋巴細(xì)胞恢復(fù)和活化在使用博來霉素后5天最大，并在15天時(shí)開始下降。不限于任何一個(gè)理論，這些資料提示β6-/-小鼠中淋巴細(xì)胞的募集或活化失敗不太可能起保護(hù)它們免于博來霉素的損害肺的效應(yīng)。
整聯(lián)蛋白與它們的基質(zhì)配體調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞功能包括增殖(Agrez，M等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)127547-556(1994))，存活(Lukacs，N.W.等，歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Im Munol.)25245-251(1995))和細(xì)胞因子表達(dá)(Miyake，S.等，J.Exp.Med.177863-868(1993)以及金屬蛋白酶(Werb，Z.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)109877-889(1989))。據(jù)報(bào)道β6亞基僅形成單一的整聯(lián)蛋白異二聚體，αVβ6并且限于上皮細(xì)胞。與上皮損傷后快速誘導(dǎo)αVβ6的表達(dá)相平行，這種整聯(lián)蛋白的至少兩種配體(纖連蛋白和肌鍵蛋白)局部濃度增加。我們以前報(bào)道過，αVβ6的表達(dá)在皮膚和肺導(dǎo)氣管中終止單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起作用(Huang，X.Z.等，細(xì)胞生物學(xué)雜志J.Cell.Biol.133921-928(1996))。此處報(bào)道的結(jié)果顯示，這種整聯(lián)蛋白在對(duì)博來霉素起反應(yīng)誘導(dǎo)肺損傷和肺纖維化中亦有著關(guān)鍵作用。
長(zhǎng)期以來，人們認(rèn)為呼吸上皮細(xì)胞主要是作為被動(dòng)屏障成分，將其它肺細(xì)胞與吸入空氣中可能的毒性組分分開。然而在此接觸面上，這些細(xì)胞很好的定位可起始和調(diào)節(jié)對(duì)損傷的局部反應(yīng)。最近的證據(jù)暗示呼吸上皮細(xì)胞具有合成和分泌一系列能起始和調(diào)節(jié)對(duì)損傷的反應(yīng)的蛋白質(zhì)，包括趨化因子(例如白介素-8，GROα，GROγ，RANTES，GMCSF，M2P-1α和MCP-1)，其它細(xì)胞因子(例如IL-6，IL-11，和IL15)以及生長(zhǎng)因子(例如TGFβ)。不局限于任何一種理論，上皮αVβ6對(duì)肺損傷和肺纖維化可能有貢獻(xiàn)的一種可能機(jī)制是調(diào)節(jié)一種或多種這些蛋白質(zhì)的表達(dá)。
目前的肺纖維化療法很大程度上是不適當(dāng)?shù)?。本研究的結(jié)果表明，呼吸上皮細(xì)胞，以及上皮整聯(lián)蛋白，αVβ6，在實(shí)質(zhì)性肺損傷和肺纖維化的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，并且特異設(shè)計(jì)的干擾這種整聯(lián)蛋白功能的藥物可用于治療這些很大程度上不能治療的肺病。III產(chǎn)生阻礙抗體A.產(chǎn)生單克隆抗體為了產(chǎn)生抗αVβ6的抗體，在福氏佐劑中用來自野生型鼠的角質(zhì)化細(xì)胞或重組體分泌的人αVβ6免疫β6-/-(Weinacker等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)2696940-6948(1994))。按照標(biāo)準(zhǔn)方法將收獲的鼠脾細(xì)胞與SP210鼠myenoma細(xì)胞融合。使用β6-和模擬轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)篩選產(chǎn)生的上清。將發(fā)現(xiàn)的識(shí)別β6-轉(zhuǎn)染但不識(shí)別模擬轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞的抗體用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
B.單克隆抗體的表征為了產(chǎn)生抗鼠αVβ6的抗體，在129/C57背景β6-/-小鼠中使用分泌的人αVβ6和鼠角質(zhì)化細(xì)胞作為免疫原。篩查雜交瘤產(chǎn)生的上清，選擇模擬和β-6轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞的染色差別。產(chǎn)生的抗體CSβ6和10D5對(duì)SW480細(xì)胞表達(dá)的人β6和野生型角質(zhì)化細(xì)胞的鼠β6均能染色。CSβ6通過(35S)-標(biāo)記的鼠角質(zhì)化細(xì)胞裂解液的免疫沉淀進(jìn)一步表征。這種抗體沉淀來自β6+/+角質(zhì)化細(xì)胞的與αVβ6相應(yīng)分子量的異二聚體但不沉淀來自β6-/-角質(zhì)化細(xì)胞的，表明這些抗體對(duì)整聯(lián)蛋白αVβ6是特異的。
我們還通過用β6-轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞和鼠角質(zhì)化細(xì)胞對(duì)纖連蛋白進(jìn)行細(xì)胞粘著測(cè)定檢測(cè)了CSβ6和10D5的阻礙活性。但是只有10D5在鼠細(xì)胞上表現(xiàn)阻礙活性。10D5抑制野生型角質(zhì)化細(xì)胞在纖連蛋白上的遷移，與在β6-/-角質(zhì)化細(xì)胞中的觀察有相同的程度。
C.細(xì)胞粘著測(cè)定用玻連蛋白，纖連蛋白或膠原將96孔非組織培養(yǎng)處理的聚苯乙烯多孔微量滴定板(Linbro/Titertek，F(xiàn)low Laboratories，Molean，VA)包被。將含有不同量基質(zhì)的100μl溶液加至孔中并在37℃溫育1小時(shí)。溫育后，用PBS洗孔，然后在37℃下用含1％BSA的無血清DMEM阻斷30分鐘。對(duì)照孔用含1％BSA的DMEM填充。用遷移檢測(cè)中相同方式收獲細(xì)胞并重新懸浮于無血清KGM，然后在含或不含PMA的條件下加到蛋白質(zhì)涂層的每個(gè)孔中。對(duì)于阻礙實(shí)驗(yàn)，鋪板前在4℃將細(xì)胞與抗體溫育5分鐘。在10×g將板離心(上面朝上)5分鐘，然后在34℃下潮濕的7％CO2溫育1個(gè)小時(shí)。通過上面朝下48×g離心5分鐘除去未粘著的細(xì)胞。用1％甲醛固定粘著的細(xì)胞并用0.5％結(jié)晶紫染色，然后用PBS洗孔。通過在MicroplateReader(Bio-Rad)中測(cè)量595nm處的吸收估計(jì)每孔中的相對(duì)細(xì)胞數(shù)量。
D.遷移檢測(cè)用基質(zhì)涂層的穿孔板(transwell plate)(8μm孔，Costar，Cambridge，MA)進(jìn)行細(xì)胞遷移檢測(cè)。在37℃PBS中用膠原(10μg/ml)，纖連蛋白(10μg/ml)或玻連蛋白(10μg/ml)包被膜的下表面1小時(shí)，并用1％BSA阻斷。用胰蛋白酶/EDTA收獲原代培養(yǎng)的角質(zhì)化細(xì)胞并用大豆胰蛋白酶抑制劑滅活胰蛋白酶。將細(xì)胞懸浮于無血清KGM并以每孔3.6×104的密度將含或不含豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA，10μg/ml)的100μl培養(yǎng)基鋪在上層室中。對(duì)于抑制實(shí)驗(yàn)，在PMA存在下將抗體加到上層和下層室中。溫育6小時(shí)后，用2％低聚甲醛固定細(xì)胞并用1％甲醛中的0.5％結(jié)晶紫染色。除去上層室中的細(xì)胞并在10×載網(wǎng)高分辨放大(40×)下計(jì)數(shù)下表面細(xì)胞。計(jì)數(shù)多個(gè)視野并對(duì)每一研究條件取平均。IV.β6敲除小鼠具有降低的肺轉(zhuǎn)移發(fā)病率將自發(fā)發(fā)生轉(zhuǎn)移性乳腺癌的轉(zhuǎn)基因鼠系(MMTV-mTAg小鼠)與β-6敲除小鼠雜交。缺少β6的子代出現(xiàn)快速生長(zhǎng)的原發(fā)性乳房腫瘤，但與表達(dá)β6的同窩仔相比具有顯著降低的發(fā)病率和肺轉(zhuǎn)移瘤程度。免疫組織化學(xué)顯示，β6在轉(zhuǎn)移損傷邊緣有強(qiáng)烈表達(dá)。這就提示在這種模型中β6-對(duì)最大轉(zhuǎn)移是必需的。
由于β6敲除小鼠有慢性肺部炎癥，降低的轉(zhuǎn)移可能歸因于干擾了轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的肺的炎癥的存在。為提出此論點(diǎn)進(jìn)行了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)1.將由原發(fā)性腫瘤衍生的表達(dá)β6的細(xì)胞系注射到野生型或β6敲除的共存小鼠中。在兩組鼠中均快速出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移瘤，暗示敲除鼠中炎癥的存在不干擾肺中的瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。2.將來自β6敲除的或野生型小鼠的腫瘤的細(xì)胞系注射到共存的野生型小鼠。野生型細(xì)胞系無一例外造成肺部腫瘤，而敲除細(xì)胞系則不然。這一實(shí)驗(yàn)提示在這種系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞β6對(duì)最大轉(zhuǎn)移是必需的。
此處引用的所有文獻(xiàn)(包括書，論文，文章，專利，和專利申請(qǐng))在所有目的上均完整并于此處。
雖然本發(fā)明是與特定實(shí)施方案相連來描述的，但應(yīng)該理解能夠進(jìn)一步修改，并且本申請(qǐng)意圖覆蓋本發(fā)明的概括而言，依據(jù)本發(fā)明原理的任何變化，用途或修改，并且包括那些本發(fā)明相關(guān)的本技術(shù)領(lǐng)域已知或?qū)嶋H通用的，以及那些可用于前面陳述的關(guān)鍵特征的，以及落在本發(fā)明范圍內(nèi)和附錄權(quán)利要求書范圍內(nèi)的本公開的偏離。
權(quán)利要求
1.治療病人急性肺損傷的一種方法，包括向病人施用治療劑量的αVβ6的拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中拮抗劑是一種特異性結(jié)合β6的抗體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中抗體是一種單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1的方法，其中拮抗劑含有氨基酸序列RGD。
5.權(quán)利要求1的方法，其中拮抗劑含有一種反義核酸分子。
6.權(quán)利要求1的方法，其中拮抗劑是治療性用藥。
7.權(quán)利要求1的方法，其中拮抗劑是預(yù)防用藥。
8.治療病人纖維化的一種方法，包括向病人施用治療劑量的αVβ6的拮抗劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中纖維化是肺纖維化。
10.權(quán)利要求9的方法，此處肺纖維化是由急性肺損傷引起的。
11.權(quán)利要求8的方法，其中拮抗劑是一種特異結(jié)合β6的抗體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中抗體是一種單克隆抗體。
13.權(quán)利要求8的方法，其中拮抗劑含有氨基酸序列RGD。
14.權(quán)利要求8的方法，其中拮抗劑含有反義核酸分子。
15.權(quán)利要求8的方法，其中拮抗劑是治療性用藥。
16.權(quán)利要求8的方法，其中拮抗劑是預(yù)防性用藥。
17.由雜交瘤ATCC HB 12382產(chǎn)生的單克隆抗體。
18.雜交瘤ATCC HB 12382。
全文摘要
提供了治療急性肺損傷和纖維化的包括αVβ6的拮抗劑的方法和組合物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1267224SQ98807892
公開日2000年9月20日 申請(qǐng)日期1998年8月7日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月8日
發(fā)明者黃曉珠, 迪安·謝潑德, 羅伯特·派特拉 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)