專利名稱：具有遲發(fā)性種子散布的特性的種子植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是在全國科學(xué)基金DCB9018749提供的政府資助下進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中擁有一定的權(quán)利。本發(fā)明的背景本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及植物分子生物學(xué)和遺傳工程，尤其涉及經(jīng)遺傳改良、其天然的熟裂過程被延遲了的種子植物。
背景信息油菜籽是僅次于大豆和棉籽的最為重要的油籽作物，在1990年它占世界油籽生產(chǎn)的10％。油菜籽含有40％的油，從種子中榨取，剩下的高蛋白的種子粉可用作動(dòng)物飼料和氮肥。菜籽油，也稱作canola油，它是一種很有價(jià)值的產(chǎn)品，是世界第四大普通貿(mào)易植物油。
油料種子的產(chǎn)品，油菜籽的種子粉和油，作為食物和飼料糧食，在過去的30年中，主要由于栽培面積的擴(kuò)大而持續(xù)增加。大部分的北歐國家生產(chǎn)油菜籽作為其主要的食用油作物。到2000年，中國預(yù)計(jì)是最大的生產(chǎn)國，生產(chǎn)9.2噸(Mt；26％)；其后是印度，7.8Mt(22％)；歐共體(12國)，7.6Mt(21％)；加拿大，3.8Mt(11％)和東歐，2.6Mt(7％)。
遺憾的是，油菜籽和相關(guān)植物中種子的產(chǎn)生受到果莢熟裂的限制，這是發(fā)生在果實(shí)發(fā)育后期的一個(gè)過程，果莢打開，包裹的種子釋放出來。沿著分隔果莢的兩半的分離的細(xì)胞層，稱作“熟裂區(qū)域”的細(xì)胞壁降解并分離，使得兩半果莢分開并釋放出內(nèi)含的種子。種子“散落”，因而在收獲作物之前，種子過早地熟裂而散去，這是商業(yè)種子生產(chǎn)者所要面對(duì)的一個(gè)重要的問題，它意味著產(chǎn)業(yè)收入的損失。不利的氣候條件會(huì)惡化熟裂過程，導(dǎo)致50％以上的種子產(chǎn)量的損失。
在過去的20年中，對(duì)于解決此問題的嘗試曾集中于培育抗散落的變異體。但是，植物雜種通常是不育的，而且必須回交以重新獲得喪失的優(yōu)良特性，這些都是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。其他緩解果莢散落的策略包括使用化學(xué)藥物諸如果莢密封劑，或者機(jī)械技術(shù)，諸如鋪草來降低風(fēng)刺激的散落。而到目前為止，還未見有文獻(xiàn)描述一種簡單的方法，能夠產(chǎn)生經(jīng)過遺傳學(xué)改良而不會(huì)提前打開釋放出種子的種子植物。
因此，有必要鑒定調(diào)控熟裂過程的基因，并開發(fā)出經(jīng)過遺傳學(xué)改良、其天然的種子散布過程被延遲了的種子植物變種。本發(fā)明正滿足于這種需要并且還提供了相關(guān)的優(yōu)勢。
本發(fā)明的小結(jié)本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物，它由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)因而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。這種AGL-8類的基因產(chǎn)物可以基本上具有，例如，AGL8定向進(jìn)化同源物諸如擬南芥屬的AGL8(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。本發(fā)明中尤其有用的、具有了遲發(fā)性種子散布的特性的種子植物包括十字花科的成員，諸如油菜籽，以及豆科(Fabaceae)成員如大豆、花生、扁豆和菜豆。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)因而具有了遲發(fā)性種子散布的特性的轉(zhuǎn)基因種子植物。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子植物中，編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子可以與外源性調(diào)控因子可操縱相連。有用的外源性調(diào)控因子包括組成型調(diào)控因子和熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。尤其是，外源性調(diào)控因子可以是AGL1調(diào)控因子和AGL5調(diào)控因子的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物，由于該種子植物中AGL-1和AGL-5表達(dá)的抑制因而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。這種非天然存在的、具有了遲發(fā)性種子散布的特性的種子植物可以是，例如，agl1 agl5雙突變體。
本發(fā)明進(jìn)一步還提供了一種來自本發(fā)明的非天然存在的種子植物的組織。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種來自本發(fā)明的非天然存在的種子植物的組織，該種子植物具有異位表達(dá)的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子，并具有遲發(fā)性種子散布的特性。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種來自非天然存在的種子植物的組織，該種子植物中AGL1的表達(dá)和AGL5的表達(dá)都被抑制，從而該種子植物具有遲發(fā)性種子散布的特性。
本文還提供了生產(chǎn)非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布的特性的種子植物的方法。該方法使得編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子在種子植物中異位表達(dá)，從而由于該核酸分子的異位表達(dá)而推遲種子的散布。
本發(fā)明還提供了一種基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，包括能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)的核苷酸序列，條件是該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子不具有SEQ ID NO4中的第1889至2703位核苷酸所構(gòu)成的核苷酸序列，該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以是，例如，AGL1調(diào)控因子或者AGL5調(diào)控因子。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一種植物表達(dá)載體，它含有能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，條件是該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子不具有SEQ ID NO4中的第1889至2703位核苷酸所構(gòu)成的核苷酸序列。如果需要，植物表達(dá)載體除了含有熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子之外，還含有編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子。
本發(fā)明還提供了用以生產(chǎn)具有遲發(fā)性種子散布的特性的轉(zhuǎn)基因種子植物的試劑盒，該試劑盒含有熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)，條件是該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子不具有SEQ ID NO4中的第1889至2703位核苷酸所構(gòu)成的核苷酸序列。在本發(fā)明的試劑盒中，該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以，如果需要，與一個(gè)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子可操縱相連。
附圖的簡要描述

圖1顯示的是授粉時(shí)擬南芥屬的雌蕊的掃描電鏡圖，顯示出多種具有明顯區(qū)別的細(xì)胞類型，包括頂端柱頭、花柱和子房。標(biāo)出的子房壁，或殼瓣，沿著其全部長度被一個(gè)所謂“胎座框”的小的接縫所分開。還標(biāo)出了熟裂區(qū)域，一個(gè)具有一至三個(gè)細(xì)胞寬度的沿著殼瓣/胎座框接界的狹窄的細(xì)胞條帶。
圖2顯示一個(gè)果莢剛剛破裂的野生型擬南芥屬的果實(shí)。種子以及胎座框都清晰可見。
圖3顯示野生型擬南芥屬和一個(gè)代表性的35S∷AGL8轉(zhuǎn)基因株系的掃描電鏡圖。在野生型中可以見到熟裂區(qū)域。相反，在35S∷AGL8轉(zhuǎn)基因株系中，外部胎座框的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成殼瓣細(xì)胞，而熟裂區(qū)域不存在了。
圖4表示agl5和agl1基因組區(qū)域和agl5或agl1突變體中AGL5或AGL1表達(dá)的喪失。圖4A表示AGL5基因的基因組結(jié)構(gòu)，方框表示外顯子的位置，細(xì)線表示內(nèi)含子的位置。通過定位分裂和同源重組產(chǎn)生的agl5突變等位基因帶有一個(gè)卡那霉素抗性盒，以一個(gè)黃色的陰影框表示，位于MADS盒的區(qū)域內(nèi)。圖4B表示AGL1基因的基因組結(jié)構(gòu)，箭頭表示在agl1-1位點(diǎn)的大內(nèi)含子中的大約17kb T-DNA插入的位置。方框表示外顯子的位置，細(xì)線表示內(nèi)含子的位置。陰影框表示MADS盒的區(qū)域。圖4C表示對(duì)AGL5基因的互補(bǔ)cDNA的3′端特異的探針，用以檢測野生型中具有的而在agl5的敲除突變體中不具有的AGL5的轉(zhuǎn)錄。圖4D表示對(duì)AGL1基因的互補(bǔ)DNA(cDNA)的3′端特異的探針，用以檢測在野生型中具有而在T-DNA插入產(chǎn)生的agl1的突變體中不具有的AGL1的轉(zhuǎn)錄。
圖5表示野生型擬南芥屬和agl1 agl5雙突變體的掃描電鏡圖。在熟裂過程中，野生型擬南芥屬果實(shí)上殼瓣正與胎座框分開。在相同的發(fā)育時(shí)期，agl1 agl5雙突變體則保持著與胎座框相連。
圖6表示擬南芥屬AGL8的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQID NO2)序列。
圖7表示擬南芥屬AGL1基因(SEQ ID NO3)。標(biāo)出了外顯子和翻譯起始位點(diǎn)。
圖8表示擬南芥屬AGL5基因(SEQ ID NO4)。標(biāo)出了外顯子和翻譯起始位點(diǎn)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物，它由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)因而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。這種AGL-8類的基因產(chǎn)物可以基本上具有例如AGL8定向進(jìn)化同源物諸如擬南芥屬的AGL8(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。
果實(shí)，是開花植物才有的一種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)種子的成熟與散布。大多數(shù)開花植物的果實(shí)由子房壁發(fā)育而來的心皮以及由受精胚珠發(fā)育而來的種子組成。擬南芥屬，屬于典型的十字花科，有3000多個(gè)種，它產(chǎn)生的果實(shí)中兩個(gè)心皮殼瓣(子房壁)與胎座框相連，胎座框是分開兩個(gè)心皮的一個(gè)可見的接縫。在圖1中顯示了授粉時(shí)期的擬南芥屬的雌蕊的結(jié)構(gòu)，包括心皮殼瓣和胎座框。
果莢熟裂或散落發(fā)生在許多種重要的作物例如油籽油菜(Brassicanapus L.)果實(shí)發(fā)育的后期，具有經(jīng)濟(jì)上的重要性，它能導(dǎo)致種子產(chǎn)量的顯著損失。在油籽油菜中，熟裂涉及細(xì)胞壁材料的分解，這發(fā)生在所謂“熟裂區(qū)域”的不連續(xù)的細(xì)胞層上，這是一至三個(gè)細(xì)胞寬度的沿著殼瓣/胎座框接界全長的區(qū)域(Meakin和Roberts，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志，41995-1002(1990))。當(dāng)熟裂區(qū)域的細(xì)胞彼此分開后，殼瓣與胎座框分開，使種子散布出來(見圖2)。
植物激素乙烯由發(fā)育中的種子產(chǎn)生，它看來是一種重要的熟裂過程的調(diào)節(jié)因素。支持乙烯在熟裂中的調(diào)節(jié)作用的證據(jù)來自對(duì)果實(shí)成熟的研究，即，果實(shí)的熟裂是一個(gè)涉及細(xì)胞壁材料的分解的過程。在果實(shí)成熟中，乙烯的作用在某種程度上是激活細(xì)胞壁的降解酶，如聚半乳糖醛酸酶(Theologis等，發(fā)育遺傳學(xué)，14282-295(1993))。而且，在遺傳改良的番茄植物中，乙烯應(yīng)答被抑制了，諸如表達(dá)反義聚半乳糖醛酸酶的轉(zhuǎn)基因番茄植物，果實(shí)成熟的過程被顯著地延遲了(Lanahan等，植物細(xì)胞，6521-530(1994)；Smith等，自然，334724-726(1988))。
在熟裂過程中，熟裂區(qū)域細(xì)胞壁的中間層的降解所發(fā)生的超結(jié)構(gòu)變化，使得油菜籽果莢弱化，最終導(dǎo)致果莢散落。在果實(shí)成熟過程中，水解酶包括聚半乳糖醛酸酶在這個(gè)程序化分解過程中起作用。例如，油籽油菜中，特異的內(nèi)-聚半乳糖醛酸酶，RDPG1，被正向調(diào)節(jié)，并在果莢發(fā)育后期的熟裂區(qū)域被唯一表達(dá)(Petersen等，植物分子生物學(xué)，31517-527(1996)，在此提及可供參考)。在果實(shí)成熟中，乙烯可以調(diào)節(jié)與熟裂過程相關(guān)的水解酶(Meakin和Roberts，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志，411003-1011(1990)，在此提及可供參考)。迄今為止，調(diào)控熟裂過程的蛋白質(zhì)，諸如那些能調(diào)節(jié)相關(guān)的水解酶的，還未被鑒定出來。
本發(fā)明得出了令人驚奇的發(fā)現(xiàn)AGL8轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)熟裂過程。如本文所公開的，轉(zhuǎn)化了在35S花椰菜花葉病毒(CaMV)組成型啟動(dòng)子調(diào)控下的AGL8 cDNA的擬南芥屬植物，在整個(gè)轉(zhuǎn)化植物中AGL8被異位表達(dá)。尤其是，正常情況下在心皮殼瓣表達(dá)的AGL8，也在胎座框表達(dá)，胎座框是成熟果實(shí)中分隔兩個(gè)殼瓣的細(xì)胞小帶。這樣異位表達(dá)的結(jié)果，果實(shí)的胎座框不存在了，外部胎座框的細(xì)胞被具有與殼瓣相同特性的細(xì)胞所替代，這表明，在此范圍內(nèi)，AGL8的表達(dá)足以確定殼瓣細(xì)胞的命運(yùn)。而且，AGL8 cDNA的異位表達(dá)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，其熟裂區(qū)域無法正常發(fā)育，導(dǎo)致遲發(fā)性種子散布(見實(shí)施例I)。野生型擬南芥屬所產(chǎn)果實(shí)在大約授粉后第14天打開并釋放種子，而轉(zhuǎn)化的AGL8異位表達(dá)的擬南芥屬所產(chǎn)果實(shí)的種子散布被延遲了，或者種子永不釋放，除非被人工打開(見圖3)。因此，本文首次將種子植物經(jīng)遺傳改良而延遲了它的天然熟裂過程。
本發(fā)明還涉及令人驚奇的發(fā)現(xiàn)agl1 agl5雙突變體種子植物具有與AGL8功能獲得表型顯著相似的遲發(fā)性種子散布的表型。如本文所述，由分裂性T-DNA插入以及同源重組產(chǎn)生了AGL1和AGL5基因的功能喪失的突變(見實(shí)施例II)。得到的agl1 agl5雙突變體植物中，熟裂區(qū)域無法正常發(fā)育，成熟的果實(shí)不能進(jìn)行熟裂(見圖5)。因而，AGL1和AGL5基因是熟裂區(qū)域發(fā)育所需要的。這些結(jié)果表明，AGL1、AGL5和AGL8調(diào)控果莢熟裂，對(duì)AGL1、AGL5和AGL8表達(dá)的操縱可以使得果莢散落得以受到控制。
因此，本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物，它由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)因而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。這種AGL-8類的基因產(chǎn)物可以基本上具有例如AGL8定向進(jìn)化同源物諸如擬南芥屬的AGL8(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。
本文中對(duì)于種子植物所用的術(shù)語“非天然存在的”是指，被人遺傳改良的種子植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子植物，例如，就是一種非天然存在的、含有外源的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物核酸分子，從而被人遺傳改良的種子植物。此外含有，例如，由于有目的地暴露于誘變劑，諸如化學(xué)誘變劑，或者“插入誘變劑”，諸如轉(zhuǎn)座子，而導(dǎo)致在外源的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物調(diào)控因子或者編碼序列上的突變，也被認(rèn)為是非天然存在的種子植物，因?yàn)樗脖蝗诉z傳改良了。相反，含有自發(fā)的或天然存在的突變的種子植物不是本文所定義的“非天然存在的種子植物”，因而也就不包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道，雖然非天然存在的種子植物一般與天然存在的種子植物相比，具有改變了的核苷酸序列，但是，非天然存在的種子植物也可以并不改變其核苷酸序列而被人遺傳改良，例如，通過修飾其甲基化類型。
本文中對(duì)于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子所用的術(shù)語“異位表達(dá)”是指，不同于野生型種子植物中的表達(dá)類型。因此，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員知道，編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)可以指，在一種不是該核酸分子正常表達(dá)所在的細(xì)胞類型中表達(dá)，或者在不是該核酸分子正常表達(dá)所在的時(shí)間表達(dá)，或者以不是該核酸分子正常表達(dá)所具有的水平表達(dá)。在野生型擬南芥屬中，例如，AGL8的表達(dá)只是限制在花發(fā)育的后期的心皮殼瓣上，而在胎座框中無表達(dá)。然而，在組成型啟動(dòng)子諸如5S花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子的調(diào)控下，AGL8在胎座框中表達(dá)，并且以一種比在其他組織諸如在殼瓣邊緣中表達(dá)水平更高的水平表達(dá)，因而這是異位表達(dá)。
對(duì)于本發(fā)明的非天然存在的種子植物產(chǎn)生的果實(shí)中種子熟裂的時(shí)間，本文中所用的術(shù)語“遲發(fā)性”是指，相比于沒有編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)的相應(yīng)的種子植物種子正常散布的時(shí)間，種子散布的時(shí)間顯著推遲了。因而，術(shù)語“遲發(fā)性”的廣泛使用范圍包含與相應(yīng)的種子植物相比，種子散布被顯著推遲了，還包括種子散布被完全阻止了，因而果實(shí)不再釋放其種子，除非受到人為的或其他的干涉。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，在一個(gè)種子植物的品種中種子散布的時(shí)間存在著天然的變化。然而，對(duì)本發(fā)明的非天然存在的種子植物的種子散布的“延遲”的鑒定，可以方便地通過對(duì)非天然存在的種子植物群體的抽樣，并確定種子散布時(shí)間的正常分布，在平均水平上，顯著地遲于相應(yīng)的不含有異位表達(dá)的AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的種子植物品種群體中種子散布的時(shí)間。本發(fā)明的非天然存在的種子植物提供了一種方法，分析群體的種子散布時(shí)間的正常分布的不對(duì)稱性，因而種子散布在平均水平上比相應(yīng)的不含有異位表達(dá)的AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的種子植物品種，至少延遲了約1％，2％，5％，10％，30％，50％或100％。
種子散布的僅僅一至兩天的延遲就對(duì)于提高從種子植物中成功地收獲種子的產(chǎn)量很有價(jià)值。在canola油菜籽中，例如，熟裂正常發(fā)生于大約授粉后第8周。在非天然存在的、異位表達(dá)AGL-8類的基因產(chǎn)物的canola油菜籽中，熟裂可以比野生型品種推遲發(fā)生一至兩天，而減少了無控制種子散布的損失，使得收獲的該種子作物產(chǎn)量顯著增加。
本發(fā)明涉及應(yīng)用編碼特定的“AGAMOUS類”或稱“AGL”基因產(chǎn)物的核酸分子。AGAMOUS(AG)是花器官的特性基因，是轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)家族中的一員。這些轉(zhuǎn)錄因子以各種組合規(guī)定了花器官的特性花瓣、萼片、雄蕊和心皮(Bowman等，發(fā)育，1121-20(1991)；Weigel和Meyerowitz，細(xì)胞，78203-209(1994)；Yanofsky，植物生理分子生物學(xué)年鑒，46167-188(1995))。AGAMOUS基因產(chǎn)物是描述心皮和雄蕊特性所不可缺少的(Bowman等，植物細(xì)胞，137-52(1989)；Yanofsky等，自然，34635-39(1990)。相關(guān)基因最近被鑒定并命名為“AGAMOUS”或“AGL”基因(Ma等，基因發(fā)育，5484-495(1991)；Mandel和Yanofsky，植物細(xì)胞，71763-1771(1995)，在此提及可供參考)。
AGL8，如同AGAMOUS和其他的AGL基因一樣，從某些特性上看，是植物MADS盒基因。植物MADS盒基因通常編碼大約260個(gè)氨基酸的蛋白，其中包括約56個(gè)氨基酸的高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域(Riechmann和Meyerowitz，生物化學(xué)，3781079-1101(1997)，在此提及可供參考)。MADS結(jié)構(gòu)域，首先鑒定于擬南芥屬的AGAMOUS基因和Antirrhimum majus的DEFICINES基因，它在人(血漿應(yīng)答因子；SRF)和酵母(MCM1；Norman等，細(xì)胞，55989-1003(1988)；Passmore等，分子生物學(xué)雜志，20459-606(1988))中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子中是保守的，而且是MADS結(jié)構(gòu)域蛋白中最為高度保守的區(qū)域。MADS結(jié)構(gòu)域是序列特異性DNA結(jié)合活性的主要決定物，并能完成二聚作用和其它附屬功能(Huang等，植物細(xì)胞，881-94(1996))。MADS結(jié)構(gòu)域常常位于N末端，盡管某些蛋白在MADS結(jié)構(gòu)域的N末端還含有其他附加的殘基。
“間插結(jié)構(gòu)域”和“I-結(jié)構(gòu)域”，緊靠MADS結(jié)構(gòu)域的C末端，它是具有約30個(gè)氨基酸的可變長度的弱保守結(jié)構(gòu)域(Purugganan等，遺傳學(xué)，140345-356(1995))。在某些蛋白中，I-結(jié)構(gòu)域在DNA結(jié)合二聚體的形成過程中起作用。存在于植物MADS結(jié)構(gòu)域蛋白中的第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是中度保守的70個(gè)氨基酸的區(qū)域，被稱作“角蛋白類結(jié)構(gòu)域”或“K-結(jié)構(gòu)域”。由于它與角蛋白分子區(qū)域相類似而被命名，K-結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)看來可以形成兼性螺旋并可以介導(dǎo)蛋白-蛋白之間的相互作用(Ma等，基因發(fā)育，5484-495(1991))。在序列上和長度上最具變化的結(jié)構(gòu)域是MADS結(jié)構(gòu)域蛋白的羧基端或“C-結(jié)構(gòu)域”。由于在某些MADS結(jié)構(gòu)域蛋白中它對(duì)于DNA結(jié)合和蛋白二聚作用不是必需的，所以C-結(jié)構(gòu)域的功能尚未清楚。
擬南芥屬AGL8是242個(gè)氨基酸的MADS盒蛋白(見圖6；SEQID NO2；Mandel和Yanofsky，同上，1995)。AGL8 MADS結(jié)構(gòu)域位于SEQ ID NO2的第2位至第56位氨基酸。AGL8的K-結(jié)構(gòu)域位于SEQ ID NO2的第92位至第158位氨基酸。
在野生型擬南芥屬中，AGL8 RNA在兩個(gè)不同的階段中累積，第一個(gè)階段發(fā)生在莖和莖生葉的開花發(fā)育期，第二個(gè)階段發(fā)生在花的發(fā)育晚期(Mandel和Yanofsky，同上，1995)。尤其是，當(dāng)植物從營養(yǎng)期轉(zhuǎn)向繁殖發(fā)育期時(shí)，AGL8 RNA即在開花分生組織中被最先檢測出。隨著開花莖的延伸，AGL8 RNA在開花分生組織和莖中累積。其次，雖然AGL8在花發(fā)育的最初階段(1和2)未能檢測出。但是AGL8的表達(dá)在大約第3期的花頂中心相應(yīng)于第四(心皮)花輪的區(qū)域中恢復(fù)。在其他所有的原基和花梗中都沒有AGL8的表達(dá)。在第四心皮輪中AGL8表達(dá)的時(shí)間通常相當(dāng)于該組織的確定基因APETALA3，PISTILLATA和AGAMOUS開始表達(dá)的時(shí)間(Yanlfsky等，自然，34635-39(1990)；Drews等，細(xì)胞，65991-1002(1991)；Jack等，細(xì)胞，68683-697(1992)；Goto和Meyerowitz，基因發(fā)育，81548-1560(1994))。在后期，AGL8的表達(dá)定位于心皮壁，位于構(gòu)成子房殼瓣的區(qū)域，在幾乎所有其它的心皮細(xì)胞類型中沒有表達(dá)。在胚珠、眼點(diǎn)組織或者分隔子房的隔膜中沒有檢測出AGL8RNA的表達(dá)。因此，天然情況下，在花的發(fā)育晚期AGL8的表達(dá)指限制于心皮的殼瓣和花柱的細(xì)胞中。
本文所用的“AGL-8類的基因產(chǎn)物”是指，與擬南芥屬AGL8具有相同或相似功能的基因產(chǎn)物，因而當(dāng)它在種子植物中異位表達(dá)時(shí)，熟裂區(qū)域的正常發(fā)育被改變，種子散布被延遲。AGL-8類的基因產(chǎn)物可以具有，例如，將外胎座框細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)闅ぐ昙?xì)胞的能力。擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)正是本文所定義的AGL-8類的基因產(chǎn)物的一個(gè)例子。正如在實(shí)施例I中所公開的，在串聯(lián)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下，內(nèi)在的啟動(dòng)子被復(fù)制，擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的異位表達(dá)改變了熟裂區(qū)域的形成，從而導(dǎo)致果實(shí)完全喪失了種子散布的特性。AGL-8類的基因產(chǎn)物在某種程度上也可以通過它與AGL1作用的能力，以及還可以通過它與AGL5作用的能力來鑒定。
AGL-8類的基因產(chǎn)物通常，在某種程度上，可以通過其含有的氨基酸序列有至少約50％的氨基酸相同于擬南芥屬AGL8(SEQ IDNO2)的氨基酸序列來鑒定。AGL-8類的基因產(chǎn)物可以具有，例如，大于65％的相同于擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，優(yōu)選地大于75％的相同于擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，更為優(yōu)選地大于85％的相同于擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的氨基酸序列，以及可以具有大于90％，95％或97％的相同于擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。
優(yōu)選地，AGL-8類的基因產(chǎn)物定向進(jìn)化同源于其異位表達(dá)所在的種子植物品種。編碼擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的核酸分子，例如，可以在擬南芥屬植物中異位表達(dá)以產(chǎn)生非天然存在的具有遲發(fā)性種子散布特性的擬南芥屬變異體。類似地，編碼canola AGL8的核酸分子可以在canola植物中異位表達(dá)以產(chǎn)生非天然存在的具有遲發(fā)性種子散布特性的canola變異體。
編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子也可以在異源的種子植物中異位表達(dá)產(chǎn)生非天然存在的具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物。AGAMOUS-類的基因產(chǎn)物在整個(gè)植物王國中是廣泛保守的；例如，AGAMOUS在番茄(TAG1)和玉米(ZAG1)中是保守的，這表明AGAMOUS-類的基因的定向進(jìn)化同源物存在于大多數(shù)，如果不是全部的話，被子植物中(Pnueli等，植物細(xì)胞，6163-173(1994)；Schmidt等，植物細(xì)胞，5729-737(1993))。AGL-8類的基因產(chǎn)物諸如AGL8的定向進(jìn)化同源物也可以是保守的并且可以跨種作用而延遲種子散布。因此，在異源的十字花科種子植物，諸如Brassica napusL.(油菜籽)，或者豆科，諸如Glycine(大豆)中編碼擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的核酸分子的異位表達(dá)，可以改變熟裂區(qū)域的正常發(fā)育，從而導(dǎo)致遲發(fā)性種子散布。而且，編碼擬南芥屬AGL8(SEQ IDNO2)的核酸分子，例如，可以在更為遠(yuǎn)源相關(guān)的異源種子植物，包括熟裂種子植物以及其他的雙子葉和單子葉的被子植物和裸子植物中異位表達(dá)，并且由于其異位表達(dá)，它可以在異源種子植物中改變熟裂區(qū)域的正常發(fā)育并延遲種子散布。
本文所用的術(shù)語“AGL-8類的基因產(chǎn)物”包括，它是AGL-8類的基因產(chǎn)物的一個(gè)多肽部分，當(dāng)其異位表達(dá)時(shí)，可改變熟裂區(qū)域的正常發(fā)育并延遲種子散布?；钚云慰梢允?，例如，擬南芥屬AGL8(SEQ ID NO2)的氨基端、中間或者羧基端片段，當(dāng)其異位表達(dá)時(shí)，可改變熟裂區(qū)域的正常發(fā)育并延遲種子散布。活性片段可以包括，例如，MADS結(jié)構(gòu)域，并且能夠特異結(jié)合DNA。熟練的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的活性片段的核酸分子可以用于生產(chǎn)出本發(fā)明的具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物，并可用于本發(fā)明下文中進(jìn)一步闡述的相關(guān)的方法和試劑盒中。
AGL-8類的基因產(chǎn)物的活性片段可以用實(shí)施例I中所述的方法或者其他的常規(guī)方法來鑒定。簡單地說，將種子植物諸如擬南芥屬用在組成型調(diào)控因子諸如串聯(lián)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的核酸分子轉(zhuǎn)化。對(duì)該種子植物的進(jìn)行表型分析，查明異位表達(dá)了特定的多肽部分得此種種子植物是否具有遲發(fā)性種子散布特性。對(duì)種子散布被延遲了的轉(zhuǎn)基因植物作進(jìn)一步的分析，以確定其熟裂區(qū)域的正常發(fā)育被改變。為了分析大量的AGL-8類的基因產(chǎn)物的多肽部分，可以將編碼該多肽部分的核酸分子以庫的形式分析，具有活性的庫進(jìn)一步細(xì)分以確定出有活性的核苷酸分子。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物，它由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)因而具有了遲發(fā)性種子散布的特性，該基因產(chǎn)物基本上具有AGL8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列。本文所用的術(shù)語“AGL8定向進(jìn)化同源物”是指擬南芥屬的AGL8(SEQ ID NO2)的定向進(jìn)化同源物，并且，在特定的種子植物品種種，是指具有與擬南芥屬的AGL8(SEQ IDNO2)最高百分比同源性的AGL-8類的基因產(chǎn)物。AGL8定向進(jìn)化同源物可以是，例如，Brassica的AGL8定向進(jìn)化同源物，如Brassicanapus L.的AGL8定向進(jìn)化同源物，或者Fabacea的AGL8定向進(jìn)化同源物，如大豆、豌豆、扁豆、或菜豆的AGL8定向進(jìn)化同源物。遠(yuǎn)期植物Sinapis alba的AGL8定向進(jìn)化同源物，記作SaMADS B，已有描述(Menzel等，植物雜志，9399-408(1996)，在此提及可供參考)。新的AGL8定向進(jìn)化同源物的cDNA可以通過以一個(gè)核苷酸序列作為探針，利用分子生物學(xué)領(lǐng)域所熟知的方法，從其他的種子植物品種中分離出來(Glick和Thompson(eds.)，植物分子生物學(xué)于生物技術(shù)方法，Boca Raton，F(xiàn)LCRC Press(1993)；Sambrook等(eds.)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版)，Plainview，NYCold SpringHarbor Laboratory Press(1989)，在此提及可供參考)。
本文中對(duì)于AGL8定向進(jìn)化同源物所用的術(shù)語“基本上具有的氨基酸序列”是指，具有相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段，或者具有相似而不相同的、可被本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員能認(rèn)為在功能上相當(dāng)?shù)陌被嵝蛄械亩嚯幕蚨嚯钠?。例如，基本上具有擬南芥屬AGL8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列的AGL-8類的基因產(chǎn)物，可以具有圖6所示的擬南芥屬的AGL8序列(SEQ ID NO2)相同的氨基酸序列，或者相似而不相同的在功能上相當(dāng)?shù)男蛄?。尤其是，基本上具有AGL8的氨基酸序列的一個(gè)氨基酸序列可以具有一個(gè)或多個(gè)修飾，諸如對(duì)所示的AGL8氨基酸序列(SEQ ID NO2)進(jìn)行的氨基酸添加、缺失或者替換，前提是經(jīng)修飾的多肽基本上保持了在種子植物異位表達(dá)時(shí)可改變熟裂區(qū)域的正常發(fā)育并延遲種子散布的能力。對(duì)序列基本相似性的比較可以在任何長度的兩個(gè)序列間進(jìn)行，通常是在大約6至1200個(gè)殘基間，優(yōu)選地在大約10至100個(gè)殘基間，更為優(yōu)選地在大約25至35個(gè)殘基間的序列間進(jìn)行。這種對(duì)基本相似性的比較可利用本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行。
應(yīng)當(dāng)明白的是，一級(jí)氨基酸序列的最小修飾可以產(chǎn)生與其所來自的AGL8定向進(jìn)化同源物相比，具有基本相當(dāng)?shù)幕蛟鰪?qiáng)功能的AGL-8類的基因產(chǎn)物。而且，可以將多種分子與AGL8定向進(jìn)化同源物或其活性片段相連，例如，其他多肽、抗原性或其他小肽標(biāo)記、糖類、脂類、或化學(xué)半族。這種修飾包括在本文所定義的AGL8定向進(jìn)化同源物范圍之內(nèi)。
利用例如定點(diǎn)誘變(見Wu(Ed.)，酶學(xué)方法，Vol.217，San DiegoAcademic Press(1993)；Innis等，PCR方法，San DiegoAcademic Press(1993)中的Higuchi，“重組PCR”，在此提及可供參考)?？蓪⒁粋€(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變引入編碼AGL8定向進(jìn)化同源物的核酸分子中，以產(chǎn)生經(jīng)修飾的核酸分子。此中誘變可以用于誘導(dǎo)特定的所需的氨基酸插入、缺失或替換；也可以合成在預(yù)定位點(diǎn)上具有隨機(jī)核苷酸的核酸序列以產(chǎn)生隨機(jī)的氨基酸替換。篩選誘變也可以用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的基本上編碼AGL8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列的核酸分子。
對(duì)于經(jīng)修飾的核酸分子可以常規(guī)地測驗(yàn)其改變熟裂區(qū)域的正常發(fā)育并延遲種子散布的能力。在如實(shí)施例I和III中所描述的相同方式下，例如，利用組成型調(diào)控因子諸如CaMV 35S啟動(dòng)子或者利用熟裂區(qū)域選擇調(diào)控因子諸如AGL1啟動(dòng)子，基本上編碼AGL8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列的核酸分子可以異位表達(dá)。如果這種異位表達(dá)導(dǎo)致種子植物的熟裂區(qū)域無法發(fā)育且種子散布被延遲，那么該修飾的多肽或片段就是一個(gè)本文所定義的“AGL8定向進(jìn)化同源物”。
本發(fā)明的非天然存在的、具有了遲發(fā)性種子散布的特性的種子植物可以是各種種子植物中的一種，諸如熟裂種子植物或其他的雙子葉和單子葉的被子植物和裸子植物。本發(fā)明中可用的種子植物可以是熟裂種子植物，尤其可用的種子植物可以是十字花科的成員，諸如油菜籽，以及豆科(Fabaceae)的成員，諸如大豆、花生、扁豆和菜豆植物。
本文所用的術(shù)語“種子植物”是指被子植物或裸子植物。被子植物是種子載于成熟的子房(果實(shí))中的帶籽植物。被子植物一般是開花植物。根據(jù)其子葉的數(shù)量被子植物分為兩大類，子葉是種子的葉，通常用以儲(chǔ)藏和吸收食物。因此，單子葉植物是具有單個(gè)子葉的被子植物，而雙子葉植物是具有兩個(gè)子葉的被子植物。各種已知的被子植物包括，例如，含油種子植物，豆科植物，帶果植物，觀賞花，谷類植物和硬木樹，這些總的分類并非是完全排他性的。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的方法可以根據(jù)需要應(yīng)用于這些或者其他的被子植物。裸子植物是種子不包含在子房中的帶籽植物。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的熟裂種子植物，它由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的在該熟裂種子植物的異位表達(dá)而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。本文所用的術(shù)語“熟裂種子植物”是指，種子植物產(chǎn)生干的熟裂果實(shí)，它具有可打開而從中釋放所含種子的果實(shí)壁。熟裂果實(shí)一般含有多個(gè)種子，包括已知果實(shí)有例如豆莢果、蒴果和長角果。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物，它由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)而具有了遲發(fā)性種子散布的特性，其中該種子植物是十字花科的成員。十字花科，如通常所知的蕓苔，有各種在世界范圍內(nèi)具有很大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物(見，例如，Williams和Hill，科學(xué)，2321385-1389(1996)，在此提及可供參考)。十字花科生產(chǎn)的種子油可以用于人造黃油，色拉油，烹調(diào)油，塑料和工業(yè)用途；調(diào)味品芥末；多葉的，儲(chǔ)備的，加工的和鹽漬的蔬菜；動(dòng)物飼料以及土壤更生所需的綠色肥料。尤其有用的本發(fā)明的非天然存在的蕓苔種子植物是含油種子植物canola。
有六種具有經(jīng)濟(jì)意義的主要蕓苔品種，各種都含有一系列植物類型。Brassica napus包括諸如油籽油菜和蕪菁甘藍(lán)。Brassica oleracea是油菜作物諸如圓白菜、花椰菜、羽衣甘藍(lán)、大頭菜和芽甘藍(lán)。Brassicacampestris(Brassica rapa)包括諸如大白菜、蕪菁和白菜。Brassicajuncea包括各種芥末；Brassica nigra是黑色芥末；Brassica carinata是埃塞俄比亞芥末。熟練的技術(shù)人員知道，任何十字花科的成員都可以進(jìn)行如本文所公開的修飾，以產(chǎn)生非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布的特性蕓苔植物。
在第二個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物，它由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)而具有了遲發(fā)性種子散布的特性，其中該種子植物是豆科的成員。豆科，如通常所知的豌豆科，是能夠產(chǎn)特征性的干性熟裂果實(shí)如所知的莢果的種子植物。莢果衍生自單個(gè)心皮，沿著心皮邊緣的接縫并沿著中心紋路熟裂。谷物莢果包括，例如，大豆(glycine)，豌豆，鷹嘴豆，蛾豆，蠶豆、菜豆、利馬豆、小扁豆、豇豆、干豆和花生。飼料莢果包括紫花苜蓿、三葉苜蓿、牛角花、三葉草、Stylosanthes種、lotononis bainessii和紅豆草。熟練的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，任何豆科的成員都可以進(jìn)行如本文所公開的修飾，以產(chǎn)生非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布的特性豆科植物。
本發(fā)明的非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物也可以是Cuphea屬植物的成員(千屈菜科)。Cuphea種子植物尤其具有價(jià)值，因?yàn)镃uphea的含油種子含有具有工業(yè)價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值的中鏈脂肪酸，尤其是目前只能由椰子和棕櫚仁提供的月桂酸。
本發(fā)明的非天然存在的種子植物也可以是，例如，單子葉草本科植物中的一種，它可生產(chǎn)世界上許多種有價(jià)值的小型谷物禾谷作物。在本發(fā)明的非天然存在的小型谷物禾谷作物中，谷物仍保持在種子植物中，并且，編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)，或者如下文所述AGL1和AGL5的表達(dá)被抑制，由此可以產(chǎn)生出非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布的特性的小型谷物禾谷植物，諸如大麥、小麥、燕麥、果園草本、guinea草本、高粱或草皮草本植物。
本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因種子植物，它由于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子植物中，異位表達(dá)的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子可以與一個(gè)外源調(diào)節(jié)因子可操縱相連。本發(fā)明提供了，例如，一種具有遲發(fā)性種子散布特性的轉(zhuǎn)基因種子植物，它具有與外源組成型調(diào)節(jié)因子可操縱相連的、異位表達(dá)的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種由于與花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子可操縱相連的、基本上編碼AGL-8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列的外源核酸分子的異位表達(dá)，從而具有遲發(fā)性種子散布特性的轉(zhuǎn)基因種子植物。
本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因種子植物，它由于與熟裂區(qū)域調(diào)控因子可操縱相連的、編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。這種熟裂區(qū)域調(diào)控因子可以是，例如，AGL1調(diào)控因子或AGL5調(diào)控因子。AGL1調(diào)控因子可以來自如本文SEQ ID NO3所公開的擬南芥屬的AGL1序列并且可以是，例如，5′調(diào)控序列或者內(nèi)部調(diào)控序列。相似地，AGL5調(diào)控因子可以來自如本文SEQ ID NO4所公開的擬南芥屬的AGL5序列并且可以是，例如，5′調(diào)控序列或者內(nèi)部調(diào)控序列。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子植物所具有的異位表達(dá)的基本上編碼AGL-8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列的外源核酸分子，與之可操縱相連的熟裂區(qū)域調(diào)控因子是AGL1調(diào)控因子，該調(diào)控因子具有SEQ ID NO3中第1至第2599位核苷酸；SEQ ID NO3中第2833至第4128位核苷酸；SEQ ID NO3中第4211至第4363位核苷酸；SEQ ID NO3中第4426至第4554位核苷酸；SEQ ID NO3中第4796至第4878位核苷酸；SEQ ID NO3中第4921至第5028位核苷酸；或者SEQ ID NO3中第5421至第5682位核苷酸中的至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子植物所具有的異位表達(dá)的基本上編碼AGL-8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列的外源核酸分子，與之可操縱相連的熟裂區(qū)域調(diào)控因子是AGL5調(diào)控因子，該調(diào)控因子具有SEQ ID NO4中第1至第1890位核苷酸；SEQ ID NO4中第2536至第2683位核苷酸；SEQ ID NO4中第2928至第5002位核苷酸；SEQ ID NO4中第5085至第5204位核苷酸；SEQ ID NO4中第5645至第5734位核苷酸；或者SEQ ID NO4中第6062至6138第位核苷酸中的至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸。
本文中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”是指，含有外源核酸分子的種子植物，該外源核酸分子可以來自同一種種子植物品種或者異源的種子植物品種。
本文中對(duì)于一個(gè)核酸分子和一個(gè)轉(zhuǎn)基因種子植物所用的術(shù)語“外源的”是指，核酸分子是從該種子植物以外來源的。外源的核酸分子可以是，例如，編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子或者外源的調(diào)控因子諸如下文進(jìn)一步描述的組成型調(diào)節(jié)因子或熟裂區(qū)域調(diào)控因子。外源的核酸分子可以具有天然存在的或者非天然存在的核苷酸序列，并且，可以是來自不同于被引入該核酸分子的種子植物品種的其他種子植物品種的異源核苷酸分子，或者可以是來自與被引入該核酸分子的種子植物品種相同的種子植物品種的核苷酸分子。
對(duì)于一個(gè)調(diào)控因子一個(gè)核酸分子所用的術(shù)語“可操縱相連的”是指，該調(diào)控因子能夠調(diào)控可操縱相連的核酸分子的表達(dá)。因此，對(duì)于外源的調(diào)控因子諸如熟裂區(qū)域調(diào)控因子和編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子，術(shù)語“可操縱相連的”是指，該熟裂區(qū)域調(diào)控因子與編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子相連，因而該熟裂區(qū)域調(diào)控因子的表達(dá)類型能夠作用于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，調(diào)控因子和可操縱相連的核酸分子具有，在最低程度上，所有轉(zhuǎn)錄所必需的因子，包括，例如，TATA盒。
本文所用的術(shù)語“組成型調(diào)控因子”是指，在其表達(dá)時(shí)，能夠使可操縱相連的核酸分子獨(dú)立于細(xì)胞或組織類型而以一定的水平表達(dá)的調(diào)控因子。在種子植物中表達(dá)的組成型調(diào)控因子通?？梢詮V泛地在多種細(xì)胞和組織類型中表達(dá)。
各種可用于在轉(zhuǎn)基因種子植物中異位表達(dá)的組成型調(diào)控因子是本領(lǐng)域所熟知的。花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV 35S)，例如，就是一種已詳細(xì)了解的組成型啟動(dòng)子元件，它能夠在所有植物組織中產(chǎn)生高水平表達(dá)(Odell等，自然，313810-812(1985))。由于它在大量的不同的種子植物品種中的活性，CaMV 35S啟動(dòng)子尤為有用(Benfey和Chua，科學(xué)，250959-966(1990)；Futterer等，植物生理，79154(1990)；Odell等，同上，1985)。串聯(lián)的35S啟動(dòng)子，其內(nèi)在的啟動(dòng)子已被復(fù)制，與未經(jīng)修飾的35S啟動(dòng)子相比能夠產(chǎn)生更高的表達(dá)水平(Kay等，科學(xué)，2361299(1987))。其他的可以用于在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子植物中異位表達(dá)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的組成型調(diào)控因子包括，例如，椰菜花葉病毒19S啟動(dòng)子；胭脂堿合成酶(nos)基因啟動(dòng)子(Siger等，植物分子生物學(xué)，14433(1990)；An，植物生理學(xué)，8186(1986))。
其他的包括那些有效地用于單子葉植物中異位表達(dá)的組成型調(diào)控因子也是本領(lǐng)域所熟知的，例如，pEmu啟動(dòng)子和基于水稻Actin-1 5′區(qū)域的啟動(dòng)子(Last等，理論引用遺傳學(xué)，81581(1991)；Mcelroy等，分子普通遺傳學(xué)，231150(1991)；Mcelroy等，植物細(xì)胞，2163(1990))。嵌合調(diào)控因子，聯(lián)合了來自不同基因的元件，也可用于編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)(Comai等，植物分子生物學(xué)，15373(1990))。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，對(duì)于特定的組成型調(diào)控因子，在某種程度上，是根據(jù)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)所在的種子植物的品種以及所需要的表達(dá)水平來選擇。
可用于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因種子植物的外源調(diào)控因子也可以是一種誘導(dǎo)型的調(diào)控因子，它能夠使可操縱相連的核酸分子有條件地表達(dá)，當(dāng)存在某種誘導(dǎo)劑或刺激物時(shí)，比不存在該誘導(dǎo)劑或刺激物時(shí)，該可操縱相連的核酸分子的表達(dá)量增加了。尤其有用的誘導(dǎo)型調(diào)控因子包括銅-誘導(dǎo)調(diào)控因子(Mett等，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，904567-4571(1993)；Furst等，細(xì)胞，55705-717(1988))；四環(huán)素和氯四環(huán)素誘導(dǎo)型調(diào)控因子(Gatz等，植物雜志，2397-404(1992)；Roder等，分子普通遺傳學(xué)，24332-38(1992)；Gatz，細(xì)胞生物學(xué)方法，50411-424(1995))；蛻皮激素誘導(dǎo)型調(diào)控因子(Christopherson等，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，896314-6318(1992)；Kreutzweiser等，生態(tài)環(huán)境安全，2814-24(1994))；熱刺激誘導(dǎo)型調(diào)控因子(Takahashi等，植物生理，99383-390(1992)；Yabe等，植物細(xì)胞生理學(xué)，351207-1219(1994)；Ueda等，分子普通遺傳學(xué)，250533-539(1996))；和lac操縱子元件，它可聯(lián)合使用一個(gè)組成型表達(dá)的lac應(yīng)答子而用于，例如，IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)。(Wilde等，EMBO雜志，111251-1259(1992))。
可用于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因種子植物的誘導(dǎo)型調(diào)控因子也可以是，例如，來自菠菜硝酸鹽還原酶基因的硝酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Back等，植物分子生物學(xué)，179(1991))或者光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如，與RuBP羧基化酶小亞基或者LHCP基因家族相關(guān)的啟動(dòng)子(Feinbaum等，分子普通遺傳學(xué)，226449(1991)；Lam和Chua，科學(xué)248471(1990))。其他的誘導(dǎo)型調(diào)控因子包括水楊酸誘導(dǎo)型調(diào)控因子(Uknes等，植物細(xì)胞，5159-169(1993)；Bi等，植物雜志，8235-245(1995))；植物激素誘導(dǎo)型調(diào)控因子(Yamaguchi-Shinozaki等，植物分子生物學(xué)，15905(1990)；Kares等，植物分子生物學(xué)，15225(1990))；人激素誘導(dǎo)型調(diào)控因子諸如人糖皮質(zhì)激素應(yīng)答因子(Schena等，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，8810421(1991))。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，本發(fā)明的非天然存在的、含有異位表達(dá)的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的種子植物，也可以含有能夠調(diào)節(jié)種子散布遲發(fā)性的一種或多種其他的修飾，包括天然的或者非天然的修飾。例如，植物激素乙烯可以促使果實(shí)熟裂，可以在本發(fā)明的種子植物中引入乙烯應(yīng)答的正向或負(fù)向調(diào)控子從而獲得經(jīng)修飾的表達(dá)或活性(見，一般性的，Meakin和Roberts，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)，411003-1011(1990)；Ecker，科學(xué)268667-675(1995)；Chao等，細(xì)胞，891133-1144(1997))。
乙烯應(yīng)答的正向調(diào)控子的突變表現(xiàn)出對(duì)外源乙烯應(yīng)答性的降低或喪失。擬南芥屬乙烯應(yīng)答的正向調(diào)控子的突變包括在etr的突變，它使組氨酸激酶乙烯應(yīng)答受體失活(Bleeker等，科學(xué)，2411086-1089(1988)；Schaller和Bleeker，科學(xué)，2701809-1811(1995))；ers(Hua等，科學(xué)2691712-1714(1995))；ein2(Guzman和Ecker，植物細(xì)胞，2513(1990))；ein3(Rothenberg和Echker，Sem發(fā)育生物學(xué)植物發(fā)育遺傳學(xué)，43-13(1993)；Kieber和Echker，遺傳學(xué)趨勢，9356-362(1993))；ain1(van der Straeten等，植物生理學(xué)，102401-408(1993))；eti(Harpham等，植物學(xué)年鑒6855(1991)和ein4，ein5，ein6，和ein7(Roman等，遺傳學(xué)，1391393-1409(1995))。類似的遺傳學(xué)功能在其他的種子植物品種中也有發(fā)現(xiàn)；例如，相應(yīng)于etr的never-ripe突變使得在番茄中產(chǎn)生乙烯的不敏感性(Lanahan等，植物細(xì)胞，6521-530(1994)；Wilkinson等，科學(xué)，2701807-1809(1995))。本發(fā)明的種子植物可以引入一個(gè)能夠?qū)е氯魏未祟愐蚁?yīng)答正向調(diào)控子的表達(dá)發(fā)生改變的修飾?？梢詫⒄蛘{(diào)控子引入本發(fā)明的種子植物，調(diào)節(jié)該種子植物的種子散布的遲發(fā)性，例如，進(jìn)一步地推遲種子散布的遲發(fā)性。
乙烯應(yīng)答的負(fù)向調(diào)控子的突變?cè)跊]有外源乙烯時(shí)表現(xiàn)出乙烯應(yīng)答性。這些突變包括那些與乙烯過量生產(chǎn)相關(guān)的，例如，eto1，eto2，和eto3突變體，和那些與乙烯信號(hào)途徑的組成型活化作用相關(guān)的，例如，CTR1的突變，它是具有蛋白激酶Raf家族相似序列的負(fù)向調(diào)控子(Kieber等，細(xì)胞，72427-441(1993)，在此提及可供參考)。本發(fā)明的種子植物可以包括一個(gè)能夠?qū)е氯魏未祟愐蚁?yīng)答負(fù)向調(diào)控子的表達(dá)或活性發(fā)生改變的修飾?？梢詫⒛軌?qū)е略诓淮嬖谕庠匆蚁r(shí)具有乙烯應(yīng)答性的突變引入本發(fā)明的非天然存在的種子植物，從而可以調(diào)節(jié)，例如減小，種子散布的遲發(fā)性。
還可以將果實(shí)的形態(tài)突變引入本發(fā)明的種子植物。此類突變包括那些心皮特定基因諸如AGAMOUS(Bowman等，同上，1989；Yanofsky等，同上，1990)和正常果實(shí)發(fā)育所需的基因諸如ETTIN，CRABS CLAW，SPAULA，AGL8和TOUSLED(Sessions等，發(fā)育，1211519-1532(1995)Alvarez和Smyth，開花通訊，2312-17(1997)；和Roe等，細(xì)胞，75939-950(1993))。因此，應(yīng)當(dāng)明白的是，本發(fā)明的具有異位表達(dá)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的種子植物，可以引入能夠減小或增強(qiáng)種子散布遲發(fā)性的一個(gè)或多個(gè)其他的遺傳學(xué)修飾。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物的方法。本發(fā)明的方法要求在種子植物中異位表達(dá)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子，由于該核酸分子的異位表達(dá)，種子散布被延遲了。
如上所述，術(shù)語“異位地”是指，編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子在一種細(xì)胞類型中表達(dá)，而此細(xì)胞類型不是該核酸分子正常表達(dá)所在的細(xì)胞類型，在一個(gè)時(shí)間上表達(dá)，而此時(shí)間不是該核酸分子正常表達(dá)所處的時(shí)間，或者以一種表達(dá)水平表達(dá)，而此表達(dá)水平不是該核酸分子正常表達(dá)水平。例如在野生型擬南芥屬中，AGL8的表達(dá)限制在花發(fā)育的后期的心皮殼瓣上，而在胎座框中無表達(dá)。在本發(fā)明的方法中，尤為有用的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)所涉及是在作為熟裂區(qū)域起源的外胎座框細(xì)胞中的表達(dá)。
實(shí)際上編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)基于多種因素。異位表達(dá)可以是貫穿大多數(shù)或整個(gè)植物組織的廣范圍的表達(dá)，或者可以是限制在一小部分植物組織表達(dá)，它可以通過各種常規(guī)技術(shù)來完成。誘變，包括種子或花粉誘變可以用于產(chǎn)生非天然存在的、編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子被異位表達(dá)的種子植物。乙基甲磺酸(EMS)誘變，轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的誘變或者T-DNA介導(dǎo)的誘變也可以用于異位表達(dá)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子，以產(chǎn)生具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物(見，一般性地，Glick和Thompson，同上，1993)。由于不希望束縛于任何一種特定的機(jī)制，可以將一種或多種AGL8的負(fù)向調(diào)控子失活而獲得在誘變植物中的異位表達(dá)，例如，將AGL1和AGL5聯(lián)合失活。
AGL-8類的基因產(chǎn)物的異位表達(dá)還可以通過在異源調(diào)控因子或者經(jīng)修飾的它本身的啟動(dòng)子的變異體控制下表達(dá)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子而完成。異源調(diào)控因子包括組成型調(diào)控因子，它可以使AGL-8類的基因產(chǎn)物在外胎座框以及在各種其他細(xì)胞類型中表達(dá)，還包括熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，它可以在限定的一些細(xì)胞類型中包括殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中獲得AGL-8類的基因產(chǎn)物的選擇性表達(dá)。
AGL-8類的基因產(chǎn)物的異位表達(dá)可以通過利用內(nèi)源的或者外源的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子來完成。重組內(nèi)源性核酸分子可以含有異源的調(diào)控因子與編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子可操縱相連的異源的調(diào)控因子。產(chǎn)生所需的在一個(gè)異源的調(diào)控因子控制下的重組核酸分子，從而產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的種子植物的方法是本領(lǐng)域所熟知的(見，一般性地，Sambrook等，同時(shí)，1989；Glick和Thompson，同上，1993)。
可以利用多種轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化以及直接基因轉(zhuǎn)入法如電轉(zhuǎn)導(dǎo)和顯微注射介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將外源性的核酸分子引入種子植物以獲得異位表達(dá)(見，一般性地，Wang等(eds)，植物和土壤微生物的轉(zhuǎn)化，Cambridge，UKUniversity Press(1995)，在此提及可供參考)。基于土壤細(xì)菌根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化方法對(duì)于將外源核酸分子引入種子植物尤為有用。野生型的農(nóng)桿菌含有Ti(腫瘤誘發(fā))質(zhì)粒，它可導(dǎo)致發(fā)生宿主植物的根瘤生長。在植物基因組中轉(zhuǎn)入Ti質(zhì)粒的腫瘤誘發(fā)T-DNA區(qū)域需要Ti質(zhì)粒編碼的毒性基因以及T-DNA邊緣區(qū)，它是一組指導(dǎo)性的DNA重復(fù)序列用以表明轉(zhuǎn)移的區(qū)域。農(nóng)桿菌基礎(chǔ)的載體是一種Ti質(zhì)粒修飾形式，其中的腫瘤誘發(fā)功能區(qū)被需要引入植物宿主中去的核酸序列所替代。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通常使用共合體載體或者，優(yōu)選地，雙載體系統(tǒng)，其中的Ti質(zhì)粒的成分被分開置于輔助質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒上，前者永久存在于宿主中并攜帶著毒性基因，后者含有兩側(cè)以T-DNA為邊緣區(qū)的所需的基因。各種雙在體系統(tǒng)是本領(lǐng)域所熟知的，并可以，例如，從Clontech(Palo Alto，CA)商業(yè)購得。利用培養(yǎng)的植物細(xì)胞或者受傷組織諸如葉組織、根的外植體、下胚軸、干的小片或塊莖來培養(yǎng)農(nóng)桿菌的方法，也是本領(lǐng)域所熟知的(Glick和Thompson，同上，1993)。受農(nóng)桿菌感染的植物組織上的損傷細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)可以重新發(fā)育出器官；得到的轉(zhuǎn)基因芽條最終長出異位表達(dá)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物。農(nóng)桿菌還可以用于整個(gè)種子植物的轉(zhuǎn)化，(見Bechtold等，C.R.Acad.Sci.Paris，LifeSci.3161194-1199(1993)，在此提及可供參考)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可以用于產(chǎn)生各種轉(zhuǎn)基因種子植物(Wang等，同上，1995)包括十字花科家族的轉(zhuǎn)基因植物，諸如油菜籽，Arbidopsis，芥末、亞麻、以及豆科家族的轉(zhuǎn)基因植物，諸如大豆、豌豆、扁豆和菜豆。
顯微注射介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化也可以用以產(chǎn)生異位表達(dá)AGL-8類的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因種子植物。此方法最早由Klein等描述(自然，32770-73(1987)，在此提及可供參考)，它是基于顯微注射包被了經(jīng)氯化鈣、亞精胺或PEG沉淀的所需的核酸分子的金或者鎢。利用儀器諸如BIOLISTIC PD-1000(Biorad；Hercules CA)將顯微注射顆粒高速加速射入被子植物的組織中。
顯微注射介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)或“顆粒轟擊”尤其適合于轉(zhuǎn)化那些用其他方法難于轉(zhuǎn)化或再生的種子植物。顯微注射介導(dǎo)已經(jīng)用來產(chǎn)生了多種轉(zhuǎn)基因植物品種，例如，包括棉花、土豆、玉米、雜交白楊和番木瓜(見，Glick和Thompson，同上，1993)，以及谷類作物諸如小麥、燕麥、大麥、高粱和水稻(Duan等，自然生物技術(shù)，14494-498(1996)；Shimamoto，生物技術(shù)現(xiàn)代評(píng)論，5158-162(1994)，在此提及可供參考)。從上述可以看出，熟練的技術(shù)人員應(yīng)能認(rèn)識(shí)到，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的或者顯微注射介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，如本文所公開的，或者其他的本領(lǐng)域所熟知的方法都可以用于將編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子引入種子植物以異位表達(dá)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物，它由于該種子植物中AGL1的表達(dá)和AGL5的表達(dá)的抑制而具有遲發(fā)性種子散布的特性。這種非天然存在的、具有了遲發(fā)性種子散布的特性的種子植物可以是，例如，agl1 agl5雙突變體。
正如本文所公開的，通過聯(lián)合利用同源重組合插入性T-DNA的插入(見實(shí)施例II)產(chǎn)生了AGL1和AGL5基因的功能喪失突變。在得到的，agl1 agl5雙突變體中AGL1和AGL5的RNA都不表達(dá)，而且掃描電子圖表明突變體種子植物中熟裂區(qū)域無法正常發(fā)育。而且，成熟的果實(shí)無法進(jìn)行熟裂，如圖5所示。這些結(jié)果表明AGL1和AGL5基因的表達(dá)對(duì)于熟裂區(qū)域的正常發(fā)育是必須的，而在種子植物中AGL1的表達(dá)和AGL5的表達(dá)的聯(lián)合抑制可以延遲熟裂，使得果莢散落的過程受到控制。
擬南芥屬的AGL1和AGL5基因編碼的MADS盒蛋白在氨基酸水平具有85％的相同性(將表1和2)。AGL1和AGL5的RNA表達(dá)類型也具有驚人的相似性。尤其是，兩種RNA都在花中特異表達(dá)，他們都聚積在發(fā)育的心皮中。尤其是，在沿著殼瓣/胎座框邊界的外胎座框中觀察到這些基因的強(qiáng)烈表達(dá)(Ma等，同上，1991Savidge等，植物細(xì)胞，7721-723(1995)；Flanagan等，植物雜志，10343-353(1996)，在此提及可供參考)。因此，AGL1和AGL5在殼瓣邊緣，至少在外胎座框的細(xì)胞中表達(dá)。
表2AGAMOUS，AGL1和AGL5的I-結(jié)構(gòu)域和C-結(jié)構(gòu)域中的氨基酸相同性AGAMOUSAGL1AGL5ICICICAGAMOUS------------AGL171％39％--------AGL565％37％95％72％----
本文所用的術(shù)語“AGL1”是指，擬南芥屬的AGL1(SEQ ID NO6)或者擬南芥屬的AGL1(SEQ ID NO6)的定向進(jìn)化同源物。AGL1的定向進(jìn)化同源物是，至少在某種程度上，在種子植物殼瓣邊緣表達(dá)的MADS盒基因，并且具有與擬南芥屬的AGL1(SEQ ID NO6)的氨基酸序列的同源性。AGL1和AGL1的定向進(jìn)化同源物可以，在某種程度上，通過與AGL-8類的基因產(chǎn)物形成復(fù)合物而具有功能。AGL1的定向進(jìn)化同源物通常所具有的氨基酸序列具有與擬南芥屬AGL1(SEQ ID NO6)至少63％的氨基酸相同性，并且，所含有的多肽具有與AGL1(SEQ ID NO6)大于約70％，75％，85％，或90％的氨基酸相同性?？紤]到AGL1和AGL5產(chǎn)物的高度相關(guān)性，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)能認(rèn)識(shí)到，根據(jù)它與擬南芥屬的AGL1(SEQ IDNO6)的相關(guān)性比它與擬南芥屬的AGL5(SEQ ID NO8)的相關(guān)性更為接近，AGL1的定向進(jìn)化同源物可以與AGL5的定向進(jìn)化同源物相區(qū)別開。AGL1的定向進(jìn)化同源物在野生型植物中可以具有像擬南芥屬AGL1一樣的功能，將AGL-8類的基因產(chǎn)物的表達(dá)區(qū)域限制在花發(fā)育的后期的心皮殼瓣上。
本文所用的術(shù)語“AGL5”是指，擬南芥屬的AGL5(SEQ ID NO8)或者擬南芥屬的AGL5(SEQ ID NO8)的定向進(jìn)化同源物。AGL5的定向進(jìn)化同源物是，至少在某種程度上，在種子植物殼瓣邊緣表達(dá)的MADS盒基因，并且具有與擬南芥屬的AGL5(SEQ ID NO8)的氨基酸的同源性。AGL5和AGL5的定向進(jìn)化同源物可以，在某種程度上，通過與AGL-8類的基因產(chǎn)物形成復(fù)合物而具有功能。AGL5的定向進(jìn)化同源物通常所具有的氨基酸序列具有與擬南芥屬AGL5(SEQ ID NO8)至少60％的氨基酸相同性，并且，所含有的多肽具有與AGL5(SEQ ID NO8)大于約65％，70％，75％，85％，或95％的氨基酸相同性?？紤]到AGL1和AGL5基因產(chǎn)物的高度相關(guān)性，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)能認(rèn)識(shí)到，根據(jù)它與擬南芥屬的AGL5(SEQID NO8)的相關(guān)性比它與擬南芥屬的AGL1(SEQ ID NO6)的相關(guān)性更為接近，AGL5的定向進(jìn)化同源物可以與AGL1的定向進(jìn)化同源物相區(qū)別開。AGL1的定向進(jìn)化同源物在野生型子物中可以具有像擬南芥屬AGL5一樣的功能，將AGL-8類的基因產(chǎn)物的表達(dá)區(qū)域限制在花發(fā)育的后期的心皮殼瓣上。
本文對(duì)于AGL1的表達(dá)所用的術(shù)語“被抑制”是指，與相應(yīng)的野生型種子植物中的功能性AGL1蛋白相比，種子植物中的功能性AGL1蛋白數(shù)量被降低了。類似地，對(duì)于AGL5的表達(dá)所用的術(shù)語“被抑制”是指，與相應(yīng)的野生型種子植物中的功能性AGL5蛋白相比，種子植物中的功能性AGL5蛋白數(shù)量被降低了。因此，本文所用的術(shù)語“被抑制”包括種子植物中不存在AGL1和AGL5蛋白，以及存在蛋白表達(dá)但是與在野生型種子植物中的AGL1和AGL5蛋白的表達(dá)水平相比被降低了。而且，所用的術(shù)語“被抑制”是指AGL1或AGL5的蛋白表達(dá)在整個(gè)AGL1或AGL5的蛋白表達(dá)區(qū)域被降低了，或者是指在某些AGL1或AGL5的蛋白表達(dá)區(qū)域被降低了，前提是得到的種子植物具有遲發(fā)性種子散布的特性。
本文所用的術(shù)語“被抑制”還包括AGL1和AGL5蛋白量相當(dāng)于野生型AGL5和AGL5的表達(dá)量，但是AGL1和AGL5蛋白具有的活性被降低了。如上所述，AGL1和AGL5都含有保守的MADS結(jié)構(gòu)域；在MADS結(jié)構(gòu)域中，降低AGL1和AGL5的DNA結(jié)合活性的點(diǎn)突變和嚴(yán)重的缺失，可以降低或破壞AGL1和AGL5的活性，從而，如本文所定義的，“抑制”了AGL1和AGL5表達(dá)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)能認(rèn)識(shí)到，優(yōu)選地，在種子植物的殼瓣邊緣AGL1基本上沒有表達(dá)或者AGL1基本上是非功能性的，相類似地，優(yōu)選地，在種子植物的殼瓣邊緣AGL5基本上沒有表達(dá)或者AGL1基本上是非功能性的。
多種方法可以用于抑制種子植物中AGL1和AGL5的表達(dá)。抑制可以通過直接修飾AGL1和AGL5的基因組位點(diǎn)來進(jìn)行，例如，通過修飾AGL1和AGL5的調(diào)控序列從而降低AGL1和AGL5位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者通過修飾AGL1和AGL5的編碼序列從而產(chǎn)生非功能性的AGL1和AGL5蛋白。種子植物中AGL1和AGL5表達(dá)的抑制可以直接完成，例如，通過修飾能夠調(diào)節(jié)AGL1和AGL5表達(dá)的蛋白的表達(dá)或活性。由于增強(qiáng)抑制種子植物中AGL1和AGL5表達(dá)的方法包括，例如，同源重組、化學(xué)和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的誘變、共抑制和反義技術(shù)以及顯性失活方法。
可以利用AGL1和AGL5的同源重組來抑制種子植物中AGL1和AGL5的表達(dá)(Kempin等，自然，389802-803(基因組序列1997)，在此提及可供參考)。利用同源重組可以，例如，用兩側(cè)至少1kb的AGL5序列的卡那霉素抗性基因的一個(gè)結(jié)構(gòu)來替換野生型的AGL5基因組序列。同源重組抑制AGL5的表達(dá)的應(yīng)用在實(shí)施例II中有所描述。
也可以利用Ds轉(zhuǎn)座子或Stm轉(zhuǎn)座子進(jìn)行轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的插入誘變，通過產(chǎn)生功能喪失的突變體來完成對(duì)AGL1和AGL5表達(dá)的抑制(見，例如，Sundaresan等，基因發(fā)育，91797-1810(1995)，在此提及可供參考)。轉(zhuǎn)座子在AGL1和AGL5靶基因中的插入可以通過例如限制性圖譜來確定，可以確定出該基因的啟動(dòng)子或編碼區(qū)域中插入的存在，從而功能性基因的表達(dá)被抑制。轉(zhuǎn)座子的插入可以通過檢測殼瓣邊緣中靶基因mRNA的消失或基因產(chǎn)物的消失來確定。也可以利用T-DNA介導(dǎo)的插入誘變，通過產(chǎn)生功能喪失的突變體來完成對(duì)AGL1和AGL5表達(dá)的抑制(見，Krysan等，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，938145-8150(1996))。應(yīng)用T-DNA介導(dǎo)的插入誘變來抑制AGL1的表達(dá)在實(shí)施例II中有所描述。
也可以利用共抑制來完成對(duì)種子植物中AGL1和AGL5表達(dá)的抑制，這是一種周知的方法，它是通過一個(gè)核酸分子在有義方向上的表達(dá)而產(chǎn)生被誘導(dǎo)的核酸分子和同源的內(nèi)源基因協(xié)同抑制(見，例如，F(xiàn)lavell，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，913490-3496(1994)；Kooter和Mol，現(xiàn)代生物學(xué)評(píng)論，4166-171(1993)，在此提及可供參考)。共抑制可以通過大量的轉(zhuǎn)基因拷貝或者過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因RNA而被強(qiáng)烈地誘導(dǎo)，并可以由于轉(zhuǎn)基因的修飾而無法翻譯得到增強(qiáng)。
還可以利用編碼AGL1和AGL5基因產(chǎn)物或其片段的反義核酸分子來抑制對(duì)種子植物中AGL1和AGL5的表達(dá)。反義核酸分子降低mRNA的翻譯或者增加mRNA的降解，從而抑制基因表達(dá)(見，例如，Kooter和Mol，同上，1993；Pnueli等，植物細(xì)胞，6175-186(1994)，在此提及可供參考)。
為了產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的、AGL1和AGL5的表達(dá)都被抑制的種子植物，可以在一個(gè)，至少某種程度上在種子植物的殼瓣邊緣中表達(dá)的，強(qiáng)調(diào)控因子的控制下，表達(dá)一種或多種有義或反義核酸分子。例如，組成型CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell等，同上，1985)或其他的組成型啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的此種方法。熟裂區(qū)域選擇性啟動(dòng)子也可用于表達(dá)一種或多種有義或反義核酸分子以抑制種子植物的AGL1和AGL5的表達(dá)。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)能認(rèn)識(shí)到，內(nèi)源性AGL1和AGL5表達(dá)的有效抑制是基于一種或多種被誘導(dǎo)的核酸分子與相應(yīng)的內(nèi)源性基因位點(diǎn)具有高度百分比的同源性。本文提供了編碼擬南芥屬的AGL1(SEQ ID NO5)和AGL5(SEQ ID NO7)的核酸分子(也見，Ma等，同上，1991)。編碼擬南芥屬的AGL1和AGL5的核酸分子可以用于本發(fā)明的方法或者用于分離定向進(jìn)化同源的AGL1和AGL5序列。
利用同源重組、共抑制或反義方法產(chǎn)生有效抑制所要求的同源性可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。通常，有效抑制AGL1和AGL5的表達(dá)要求最少大約80-90％的核酸序列相同性。因此，來自被引入核酸分子的種子植物品種的同科或同屬的編碼基因定向進(jìn)化同源物的核酸分子，可以優(yōu)選地用于通過同源重組、共抑制或反義技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的種子植物。更為優(yōu)選地，可將來自同種種子植物品種的編碼基因定向進(jìn)化同源物的核酸分子用于在本發(fā)明的種子植物中抑制AGL1和AGL5的表達(dá)。例如，編碼canola AGL1和AGL5的核酸分子可優(yōu)選地用于抑制canola植物中AGL1和AGL5的表達(dá)。
盡管本發(fā)明的方法中優(yōu)選地利用高度同源的核酸分子，但是用于同源重組、共抑制或反義抑制的核酸分子不需要全部地含有要被抑制的AGL1和AGL5序列。因此，只編碼部分的擬南芥屬的AGL1(SEQID NO5)的有義或反義核酸分子，例如，或者只編碼部分的擬南芥屬的AGL5(SEQ ID NO7)的有義或反義核酸分子，就可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的非天然存在的、的表達(dá)都被抑制的種子植物。
與AGL1和AGL5位點(diǎn)同源重組的部分核酸分子通常含有至少大約1kb的與靶基因同源的序列，優(yōu)選地含有至少大約2kb，更為優(yōu)選地含有至少大約3kb和含有至少大約5kb的與靶基因同源的序列。可用于共抑制或反義抑制的編碼AGL1和AGL5的部分核酸分子通常含有編碼AGL1和AGL5定向進(jìn)化同源物的核酸分子全長的至少大約50個(gè)堿基對(duì)。與本文所定義的活性片段相反，用于同源重組、共抑制或反義抑制的部分核酸分子不需要編碼基因產(chǎn)物的功能性部分。
還可以利用顯性失活結(jié)構(gòu)來抑制種子植物中AGL1和AGL5的表達(dá)。可用于本發(fā)明的顯性失活結(jié)構(gòu)通常含有完整的AGL1和AGL5的編碼序列部分，它足以形成，例如，DNA結(jié)合或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，諸如同源二聚化或者異源二聚化的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，但是不含有野生型蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。例如，將AGAMOUS羧基端缺失突變體用作顯性失活結(jié)構(gòu)來抑制MADS盒基因AGAMOUS的表達(dá)(Mizukami等，植物細(xì)胞，8831-844(1996)，在此提及可供參考)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道是，相類似地，顯性失活A(yù)GL1和AGL5結(jié)構(gòu)也可以用于抑制種子植物中AGL1和AGL5的表達(dá)。可使用的顯性失活結(jié)構(gòu)可以是缺失突變，它編碼，例如，單獨(dú)的MADS盒結(jié)構(gòu)域(“M”)；MADS盒結(jié)構(gòu)域和“插入”區(qū)域(“MI”)；MADS盒、“插入”區(qū)域和“K”結(jié)構(gòu)域(“MIK”)；或者“插入”“K”和羧基端結(jié)構(gòu)域(“IKC”)。
在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的非天然存在的種子植物是agl1 agl5雙突變體。agl1 agl5雙突變體是一種尤其有用的非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物。
本文所用的術(shù)語“agl1 agl5雙突變體”是指，具有在AGL1位點(diǎn)的功能喪失型突變而且在AGL5位點(diǎn)的功能喪失型突變的種子植物。功能喪失型突變包括點(diǎn)突變，包括替換、缺失和插入，以及在AGL1和AGL5位點(diǎn)上嚴(yán)重的修飾，它可以發(fā)生在編碼或者非編碼序列上。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道是，任何這種在AGL1位點(diǎn)上的功能喪失型突變與任何這種在AGL5位點(diǎn)上的功能喪失型突變相結(jié)合，可以產(chǎn)生本發(fā)明的agl1 agl5雙突變體。實(shí)例性的蕓苔種子植物擬南芥屬的agl1 agl5雙突變體產(chǎn)物公開在實(shí)施例II中。
AGL1和AGL5是密切相關(guān)的最近才區(qū)分開的基因。由于不希望被其他所束縛，所以某些植物可抑制含有AGL1或只含有AGL5，或只含有單個(gè)的與AGL1和AGL5相關(guān)的祖先基因。在這種植物中，具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物可以通過只抑制AGL1表達(dá)，或者只抑制AGL5表達(dá)，或者只抑制與AGL1和AGL5相關(guān)的祖先基因表達(dá)來產(chǎn)生。因此，本發(fā)明提供了一種非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物，其中AGL1表達(dá)被抑制了。這種非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物可以是，例如，agl1單突變體。本發(fā)明還提供了一種非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物，其中AGL5表達(dá)被抑制了。這種非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物可以是，例如，agl5單突變體。
本發(fā)明進(jìn)而還提供了來自本發(fā)明的非天然存在的種子植物的組織。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)提供了來自本發(fā)明的非天然存在的、異位表達(dá)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子并且具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物的組織。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)提供了來自本發(fā)明的非天然存在的、AGL1和AGL5的表達(dá)都被抑制且具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物的組織。
本文所用的術(shù)語“組織”是指，組成在一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能單位中的種子植物的細(xì)胞和細(xì)胞間的材料的集合。本發(fā)明的尤為有用的組織是能夠無性地或者非無性地繁殖的組織，因而該組織所來源的種子植物可以被繁殖。本發(fā)明的組織可以是，例如，種子、葉、根、或其部分。
本文所用的術(shù)語“種子”是指，種子植物的胚珠經(jīng)受精后發(fā)育成熟所形成的結(jié)構(gòu)。這種種子可以方便地從本發(fā)明的非天然存在的、具有遲發(fā)性種子散布特性的種子植物中收獲得到。
具有增強(qiáng)性的種子散布特性的種子植物也可以通過操作AGL-8類的基因產(chǎn)物或者AGL1和AGL5的表達(dá)而產(chǎn)生。在種子植物中抑制AGL-8類的基因產(chǎn)物的表達(dá)，例如，抑制AGL-8類的基因產(chǎn)物在殼瓣組織的表達(dá)，可以用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)性的種子散布特性的種子植物。在種子植物中AGL1或AGL5，或者兩者同時(shí)的異位表達(dá)，例如，AGL1或AGL5的早熟表達(dá)，也可以用于產(chǎn)生具有增強(qiáng)性的種子散布特性的種子植物。熟練的技術(shù)人員清楚的是，這些或者其他操作AGL8、AGL1或AGL5的表達(dá)策略用于產(chǎn)生非天然存在的、具有增強(qiáng)性的種子散布特性的種子植物。
本發(fā)明還提供了一種基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，包括能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)的核苷酸序列，即便該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子不具有SEQ ID NO4中的第1889至2703個(gè)核苷酸所構(gòu)成的核苷酸序列。
本文所用的術(shù)語“熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子”是指，一個(gè)核酸序列，當(dāng)它與一個(gè)核酸分子可操縱相連時(shí)，能使與其可操縱相連的核酸分子在限定的植物組織中，包括殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域，選擇性地表達(dá)。如上所述，殼瓣邊緣是熟裂區(qū)域的未來位置，包括外胎座框的邊緣以及與外胎座框相鄰的殼瓣細(xì)胞。在殼瓣邊緣區(qū)域中發(fā)育的熟裂區(qū)域是指，在熟裂過程中分離開的一組細(xì)胞，它使得殼瓣與胎座框分開并釋放出內(nèi)含的種子。因此，熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，如本文中所定義的，能夠在成熟的熟裂區(qū)域中發(fā)生選擇性表達(dá)，或者在作為熟裂區(qū)域的未來位置的殼瓣邊緣中發(fā)生選擇性表達(dá)。
熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子能夠僅僅在殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域的細(xì)胞中產(chǎn)生特異的表達(dá)，或者能夠只在有限數(shù)量的植物細(xì)胞類型中包括殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域的細(xì)胞中產(chǎn)生選擇性地表達(dá)。AGL5調(diào)控因子，例如，能夠在胚珠和胎座以及熟裂區(qū)域中產(chǎn)生選擇性表達(dá)，它就是本文所定義的一種熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子與其他調(diào)控因子的區(qū)別在于，它能夠在殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域產(chǎn)生選擇性表達(dá)而不能夠在整個(gè)相鄰的心皮殼瓣中產(chǎn)生表達(dá)。
圖7顯示了擬南芥屬AGL1基因(SEQ ID NO3)，標(biāo)出了內(nèi)含子-外顯子邊界。圖8顯示了擬南芥屬AGL5基因(SEQ ID NO4)，標(biāo)出了內(nèi)含子-外顯子邊界。AGL1和AGL5調(diào)控因子，諸如5調(diào)控因子或內(nèi)部調(diào)控因子，能夠在殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域產(chǎn)生選擇性表達(dá)，因而它們是本文所定義的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。AGL5基因，例如，在熟裂區(qū)域、胎座和胚珠中選擇性地表達(dá)，而AGL5調(diào)控因子能夠使可操縱相連的核酸分子在熟裂區(qū)域、胎座和胚珠中選擇性地表達(dá)。
本發(fā)明提供了作為AGL1和AGL5調(diào)控因子的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。這種熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以是，例如，AGL1調(diào)控因子。AGL1調(diào)控因子可以具有，例如，SEQ ID NO3所列的擬南芥屬AGL1基因組序列。熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子也可以是，例如，AGL5調(diào)控因子。AGL5調(diào)控因子可以具有，例如，SEQ ID NO4所列的擬南芥屬AGL5基因組序列，只要該選擇性調(diào)控因子不具有SEQ ID NO4中的第1889至2703個(gè)核苷酸所構(gòu)成的核苷酸序列。
本文所用的術(shù)語“基本上具有的核苷酸序列”，當(dāng)用于AGL1和AGL5調(diào)控因子時(shí)是指，具有相同序列的核苷酸序列，或者具有相似但不相同的序列、可被本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員認(rèn)為是功能上相當(dāng)?shù)男蛄械暮塑账嵝蛄小＠?，是AGL1調(diào)控因子的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以具有，例如，與具有圖7所示SEQ ID NO3中的第1至2599個(gè)核苷酸的擬南芥屬AGL1序列相同的核苷酸序列，或者相似但不相同的、功能上相當(dāng)?shù)男蛄?。熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以具有，例如，一個(gè)或多個(gè)修飾，諸如在圖8所示序列上涉及的核苷酸添加、缺失或置換，前提是經(jīng)修飾的核苷酸序列保持了能夠使可操縱相連的核酸分子在殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域產(chǎn)生選擇性表達(dá)的能力。
應(yīng)當(dāng)明白的是，可以不破壞AGL1和AGL5調(diào)控因子的生物功能而進(jìn)行限定的修飾，這種限定的修飾可以獲得與野生型AGL1和AGL5調(diào)控因子相比，具有基本上相當(dāng)?shù)幕蛘咴鰪?qiáng)功能的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。這些修飾可以通過例如定點(diǎn)誘變而有意制造，或者通過例如含有該調(diào)控因子的宿主的突變而隨機(jī)產(chǎn)生。所有這些經(jīng)修飾的核苷酸序列都包括在對(duì)熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子的定義中，只要它們能夠在殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域產(chǎn)生選擇性表達(dá)的能力被基本保持了。
熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以來自擬南芥屬AGL1或AGL5的定向進(jìn)化同源物的基因，該基因在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域選擇性表達(dá)。熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以來自十字花科AGL1或AGL5的定向進(jìn)化同源物，如Brassica napus、Brassica oleracea、Brassicacampestris、Brassica juncea、Brassica nigra、Brassica carinata的AGL1或AGL5的定向進(jìn)化同源物。熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以來自，例如，canola的AGL1或AGL5的定向進(jìn)化同源物。熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以來自，例如，豆科的AGL1或AGL5的定向進(jìn)化同源物，諸如大豆、豌豆、鷹嘴豆、蛾豆，蠶豆、菜豆、利馬豆、小扁豆、豇豆、干豆、花生、紫花苜蓿、三葉苜蓿、牛角花、三葉草、Stylosanthes、lotononis bainessii或紅豆草的AGL1或AGL5的定向進(jìn)化同源物。
熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以來自各種其他的能夠在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域選擇性表達(dá)的基因。例如，油菜籽基因RDPG1可以在熟裂區(qū)域選擇性表達(dá)的基因(Petersen等，植物分子生物學(xué)，31517-527(1996)，在此提及可供參考)。因此RDPG1的啟動(dòng)子或其或性片段可以是本文所定義的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。其他的基因如油菜籽SAC51也已知是在熟裂區(qū)域選擇性表達(dá)的；SAC51的啟動(dòng)子或其或性片段也可以是本發(fā)明的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子(Coupe等，植物分子生物學(xué)，231223-1232(1993)，在此提及可供參考)。而且，在熟裂區(qū)域選擇性表達(dá)的基因還包括能夠在擬南芥屬轉(zhuǎn)座子品系GT140中產(chǎn)生選擇性GUS表達(dá)的基因(Sundaresan等，基因發(fā)育，91797-1810)，在此提及可供參考)。熟練的技術(shù)人員能夠明白的是，任何此類在殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域選擇性表達(dá)的基因的調(diào)控因子都可以是本發(fā)明所定義的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。
其他的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以利用常規(guī)的方法確定和分離。例如，利用來自熟裂區(qū)域的RNA和來自相鄰的果莢材料中的RNA而進(jìn)行的差異掃描法，可以用于分離在熟裂區(qū)域的細(xì)胞中選擇性表達(dá)的cDNA(Coupe等，同上，1993)；然后，用該cDNA作為探針分離出相應(yīng)的基因。
增強(qiáng)子陷阱或基因陷阱也可以用于確定和分離本發(fā)明的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子(Sundaresan等，同上，1995；Koncz等，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，868467-8471(1989)；Kertbundit等，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，885212-5216(1991)；Toppin等，發(fā)育，1121009-1019(1991)，在此提及可供參考)。增強(qiáng)子陷阱的元件包括一個(gè)帶有弱啟動(dòng)子的報(bào)告基因如GUS，由于增強(qiáng)子陷阱的元件缺少啟動(dòng)子序列，依靠附近的染色體基因的轉(zhuǎn)錄來進(jìn)行報(bào)告基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)座因子包括在誘導(dǎo)與內(nèi)源位點(diǎn)融合的結(jié)構(gòu)中；在殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域選擇性表達(dá)的結(jié)構(gòu)通過它們的表達(dá)類型而確定。以插入因子為標(biāo)簽，利用反向聚合酶鏈反應(yīng)將側(cè)旁的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子克隆(見，例如，Aarts等，自然，363715-717(1993)；還可見，Ochman等，“利用反向?qū)?cè)旁序列的擴(kuò)增”在Innis等，同上，1990)。Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)(Sundaresan等，同上，1995)在鑒定和分離本發(fā)明的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子上尤為有用。
熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子的分離還可以通過，在無啟動(dòng)子的報(bào)告基因前插入隨機(jī)基因組DNA片段的文庫，并對(duì)用該文庫轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因種子植物掃描，確定熟裂區(qū)域選擇性報(bào)告基因的表達(dá)。無啟動(dòng)子載體pROA97，含有都在最小35S啟動(dòng)子控制下的npt基因盒GUS基因，它可以用于此種掃描?；蚪M文庫可以是，例如，來自Arabidopsisthliana基因組DNA的Sau3A片段，或者來自其他感興趣的十字花科的基因組DNA的Sau3A片段(Ott等，分子Gen.遺傳學(xué)，223169-179(1990)；Claes等，植物雜志，115-26(1991)，在此提及可供參考)。
本發(fā)明的調(diào)控因子在熟裂區(qū)域選擇性的表達(dá)可以通過常規(guī)的方法來顯示和確定，例如，利用報(bào)告基因和原位表達(dá)分析。GUS和螢火蟲的瑩光素酶報(bào)告子尤其有用于植物基因表達(dá)的原位定位(Jefferson等，EMBO，63901(1987)；Ow等，科學(xué)，334856(1986)在此提及可供參考)，含有GUS表達(dá)盒的無啟動(dòng)子載體可以商業(yè)購得，例如，從Clontech公司(PaloAlto，CA)為了鑒定所研究的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子如AGL1和AGL5調(diào)控因子，可以利用酶學(xué)或PCR的方法產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)AGL1和AGL5基因核苷酸部分(Glick和Thompson，同上，1993；Innis等，同上，1990)；將得到的片段與一個(gè)報(bào)告基因如GUS融合，進(jìn)行上述的分析。
本發(fā)明提供了一種基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，它能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)，其中該因子是具有下列核苷酸序列中至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸的AGL1調(diào)控因子SEQ ID NO3中第1至第2599位核苷酸；SEQID NO3中第2833至第4128位核苷酸；SEQ ID NO3中第4211至第4363位核苷酸；SEQ ID NO3中第4426至第4554位核苷酸；SEQID NO3中第4655至第4753位核苷酸；SEQ ID NO3中第4796至第4878位核苷酸；或者SEQ ID NO3中第4921至第5028位核苷酸；基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子是可具有，例如，上述SEQ IDNO3中各部分之一中的至少16，18，20，25，30，40，50，100或500個(gè)連續(xù)的核苷酸的AGL1調(diào)控因子。
本發(fā)明還提供了一種基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，它能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)，其中該因子是具有下列核苷酸序列中至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸的AGL5調(diào)控因子SEQ ID NO4中第1至第1888位核苷酸；SEQ ID NO4中第2928至第5002位核苷酸；SEQ ID NO4中第5085至第5204位核苷酸；SEQ ID NO4中第5367至第5453位核苷酸；SEQ ID NO4中第5496至第5602位核苷酸；SEQ ID NO4中第5645至第5734位核苷酸；或者SEQ ID NO4中第6062至第6138位核苷酸基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子是可具有，例如，上述SEQ IDNO4中各部分之一中的至少16，18，20，25，30，40，50，100或500個(gè)連續(xù)的核苷酸的AGL5調(diào)控因子。
擬南芥屬AGL5啟動(dòng)子的臨近片段已有描述(Savdge等，植物細(xì)胞，7721-733(1995))。但是，該片段(如圖8中第1889至2703個(gè)核苷酸所示)缺少許多本文所公開的擬南芥屬AGL5基因組序列(SEQ ID NO4)中所含的遠(yuǎn)端調(diào)控因子。本發(fā)明提供了大約2.7kb的擬南芥屬AGL5 5′側(cè)翼序列，包括其中所含的多個(gè)調(diào)控因子。該公開的擬南芥屬AGL5 5′側(cè)翼序列含有大量的涉及調(diào)控內(nèi)源性AGL5基因體內(nèi)表達(dá)的調(diào)控因子，因而，尤為可以用于熟裂區(qū)域選擇性表達(dá)。
含有擬南芥屬AGL5啟動(dòng)子的臨近區(qū)域(SEQ ID NO4的第1889至2703個(gè)核苷酸)的核苷酸序列顯然不在本發(fā)明的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子之內(nèi)。但是，熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以包括SEQ ID NO4的第1889至2703個(gè)核苷酸，連同SEQ ID NO4的第1至1888個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的核苷酸。熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以具有，例如，至少15個(gè)連續(xù)的SEQ ID NO4的核苷酸，包括SEQID NO4的第1至1888位所示的核苷酸序列中至少1，2，4，6，10，20或30個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸。
考慮到熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子的定義，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的是，例如，只具有圖8(SEQ ID NO4)中第1889至第2703位核苷酸的擬南芥屬AGL5基因的部分，不是本文所定義的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。但是，如果該因子能使與其可操縱相連的核酸分子在限定的植物組織中，包括在殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)，只具有SEQ ID NO4中第1889至第2703位核苷酸的擬南芥屬AGL5基因的部分也可以被視為熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。顯類似地，具有擬南芥屬AGL5啟動(dòng)子的臨近區(qū)域亞部分的擬南芥屬AGL5基因的部分也可以被視為熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，只要該亞部分能使與其可操縱相連的核酸分子在限定的植物組織中，包括在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)。因此，例如，具有第1889至第2000位核苷酸序列的調(diào)控因子可以是本發(fā)明的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，只要因子能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)。
本發(fā)明還提供了重組核酸分子，它包括與一個(gè)編碼細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物的核酸分子可操縱相連的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。進(jìn)而本文提供了一種非天然存在的種子植物，它由于具有與一個(gè)編碼細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物的核酸分子可操縱相連的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子的重組核酸分子的表達(dá)，而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。
細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物是一種可以導(dǎo)致細(xì)胞因其表達(dá)而死亡的基因產(chǎn)物，優(yōu)選地，它不會(huì)導(dǎo)致不在其中表達(dá)的細(xì)胞的死亡，除非它在其中表達(dá)。因此，熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子作用下的細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物的表達(dá)可以用于消除熟裂區(qū)域而不打擾相鄰的胎座或殼瓣細(xì)胞。各種可用于種子植物的細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物是本領(lǐng)域所周知的，包括例如白喉毒素A鏈多肽；RNase T1；芽孢桿菌RNase；篦麻毒素A鏈多肽；單純皰疹病毒腺苷激酶(tk)基因產(chǎn)物。雖然白喉毒素A鏈多肽；RNase T1；芽孢桿菌Rnase是優(yōu)選的細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物，熟練的技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，這些或者其他的細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物可以與熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子一起用于產(chǎn)生非天然存在的、具有了遲發(fā)性種子散布的特性種子植物。
白喉毒素是天然存在的Cornebacterium diphtheriae的毒素，它能催化延長因子2的ADP-糖基化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的起始從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Collier，細(xì)菌學(xué)評(píng)論，3954-85(1975))。一個(gè)完全活性的毒素分子足以殺死一個(gè)細(xì)胞(Yamaizumi等，細(xì)胞，15245-250(1978))。白喉毒素有兩個(gè)亞基白喉毒素B鏈作用是通過特異的膜受體進(jìn)入大多數(shù)的真核細(xì)胞，而A鏈編碼毒性催化結(jié)構(gòu)域。催化的DT-A鏈不含有信號(hào)肽而不能分泌。而且，任何從死亡細(xì)胞中釋放出來的DT-A缺少白喉毒素B鏈而不能附著細(xì)胞。因此，DT-A是細(xì)胞自主性的并且只能夠殺死自己表達(dá)的細(xì)胞而對(duì)相鄰的細(xì)胞沒有損害。Palmiter等的DT-A表達(dá)盒含有193個(gè)A鏈殘基，接上了合成的ATG并去除了天然的引導(dǎo)序列，它尤為有用于本發(fā)明的種子植物(Palmiter等，細(xì)胞，50435-443(1987)；Greenfiled等，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，806853-6857(1983)，在此提及可供參考)。
米曲霉的RNase T1和解淀粉芽孢桿菌的芽孢桿菌Rnase也是可以用于本發(fā)明的種子植物的細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物(Thorsness和Nasrallah，細(xì)胞生物學(xué)方法，50439-448(1995))。芽孢桿菌Rnase比RNase T1是更為常用的植物毒素，因而也就在本發(fā)明的方法中更為優(yōu)選。
篦麻毒素是蓖麻子產(chǎn)生的核糖體失活蛋白，也是可以用于本發(fā)明的非天然存在的種子植物的細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物。篦麻毒素A鏈多肽可以用于產(chǎn)生細(xì)胞特異的溶解，如Moffat等，發(fā)育，114681-687(1992)中所描述的。植物的核糖體對(duì)于植物來源的篦麻毒素具有不同的易感性。熟練的技術(shù)人員能夠明白的是，篦麻毒素的毒性是不同的，需要對(duì)所研究的種子植物進(jìn)行評(píng)估(見Olsnes和Pihl，毒素和病毒的分子作用，第51-105頁，AmsterdamElsewier BiomedicalPress(1982))。
本文進(jìn)而提供了含有熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子的植物表達(dá)載體。植物表達(dá)載體可以包括，如果需要的話，編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子以及熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。
本文所用的術(shù)語“植物表達(dá)載體”是指一種自我復(fù)制的核酸分子，它能夠提供一種手段將外源的核酸分子轉(zhuǎn)運(yùn)到種子植物宿主細(xì)胞中并在其中表達(dá)該分子。植物表達(dá)載體包括適于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的載體，包括二元和共整合載體，以及用于物理轉(zhuǎn)化的載體。
植物表達(dá)載體可以用于短暫表達(dá)外源的核酸分子，或者可以整合并穩(wěn)定表達(dá)外源序列。本領(lǐng)域的熟練的技術(shù)人員能夠明白的是，植物表達(dá)載體可以含有所有的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)外源核酸分子所需的功能；或者，可以將一種或幾種功能以反式形式提供，如用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的二元載體系統(tǒng)。
除了熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，本發(fā)明的植物表達(dá)載體還可以含有，如果需要的話，其他的元件。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的二元載體系統(tǒng)含有一個(gè)或所有兩個(gè)T-DNA邊界重復(fù)，并且還可以含有，例如，一個(gè)或多個(gè)下列元件廣泛的宿主范圍的復(fù)制子，用于有效地從E.coli到農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)的ori T，細(xì)菌選擇性標(biāo)記如氨芐青霉素和多克隆位點(diǎn)。
用于物理轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體可以具有，例如，植物選擇性標(biāo)記以及熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，它們位于諸如pBR322，pUC，pGEM和M13載體上，這些載體是可以商業(yè)購得的，例如從Pharmacia(Piscataway，NJ)或Promega(Madison，WI)。在用于種子植物物理轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體上，可選擇地含有T-DNA邊界或ori T區(qū)域，但它們不起作用。
本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生具有遲發(fā)性種子散布特性的轉(zhuǎn)基因植物的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒含有熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。如果需要的話，該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子可以與編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子可操縱相連。
下列的實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的解釋而非對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例I表現(xiàn)出完全喪失熟裂的35S-AGL8轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的產(chǎn)生本實(shí)施例描述了產(chǎn)生由于結(jié)構(gòu)中AGL8的表達(dá)而喪失了正常的熟裂的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的方法。
利用引物AGL8 5-γ(SEQ ID NO9；5′-CCGTCGACGATGGGAAGAGGTAGGGTT-3′)和引物OAM14(SEQ ID NO10；5′-AATCATTACCAAGATATGAA-3′)，通過聚合酶鏈反應(yīng)制備全長的AGL8，并將其克隆到表達(dá)載體pBIN-JIT的SalI和BamHI位點(diǎn)，該載體是從pBIN19修飾而來的，含有串聯(lián)的CaMV 35S啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)和CaMV polyA信號(hào)。基本上按照Bechtold等所描述的(C.R.Acad.Sci.Paris，3161194-1199(1993)，在此提及可供參考)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，利用in planta法進(jìn)行擬南芥屬的轉(zhuǎn)化。利用對(duì)35S啟動(dòng)子特異的引物和對(duì)AGL8 cDNA特異的引物進(jìn)行PCR，分析卡那霉素抗性品系中35S-AGL8結(jié)構(gòu)的存在，在35S-AGL8轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生了850和550bp的兩個(gè)片段。這些片段在未轉(zhuǎn)化有35S-AGL8結(jié)構(gòu)的植物中不存在。
分析了大約35個(gè)35∷AGL8品系的表型。在35個(gè)品系中，7個(gè)表現(xiàn)出全喪失熟裂。在這些品系中，成熟的果實(shí)不釋放它們的種子，除非人工操作。幾個(gè)保持35S∷AGL8的品系表現(xiàn)出遲發(fā)性熟裂，其種子的釋放比野生型擬南芥屬植物至少晚一周。
實(shí)施例II表現(xiàn)出完全喪失熟裂的擬南芥屬agl1 agl5雙突變體的產(chǎn)生本實(shí)施例描述了表現(xiàn)出完全喪失熟裂的擬南芥屬agl1 agl5雙突變體的產(chǎn)生A.通過同源重組產(chǎn)生agl1 agl5雙突變體利用PCR法檢測轉(zhuǎn)基因植物以確定AGL5上的定位插入，如Kempin等所描述的(自然，389802-803(1997)，在此提及可供參考)。將含有卡那霉素抗性盒的靶結(jié)構(gòu)插入到分別處于AGL5基因的5′和3′端區(qū)域的3kb和2kb片段之間。成功的定點(diǎn)插入在AGL5基因上產(chǎn)生1.6kb的缺失，因而，靶基因只編碼246個(gè)氨基酸殘基的前26個(gè)，并只編碼含有DNA結(jié)合MADS結(jié)構(gòu)域的56個(gè)氨基酸中的26個(gè)。重組的結(jié)果還導(dǎo)致在AGL5編碼序列中插入了2.5kb的卡那霉素抗性盒。
750個(gè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因品系通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，按下文所述的PCR檢測來分析轉(zhuǎn)化子，確定這些初級(jí)轉(zhuǎn)化子是否產(chǎn)生了所需的AGL5定位插入。確定出一個(gè)品系含有預(yù)期的插入，使該品系白花授粉以便在其后代中作進(jìn)一步分析。對(duì)來自該同源突變體植物的基因組DNA，通過四種以上的限制酶以及幾次獨(dú)立的PCR擴(kuò)增進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)都與所設(shè)計(jì)的定點(diǎn)誘變相符合。對(duì)AGL5基因側(cè)翼的區(qū)域也進(jìn)行了分析，確認(rèn)在AGL5之外的序列中沒有可檢測到的缺失或重排。
AGL5靶結(jié)構(gòu)內(nèi)的卡那霉素抗性盒含有確定轉(zhuǎn)錄終止的序列，因而在同源重組突變的植物中幾乎沒有或完全沒有AGL5 mRNA。利用對(duì)AGL5 cDNA 3′部分特異的探針，在野生型中檢測到AGL5基因的轉(zhuǎn)錄，而在agl5突變植物中沒有檢測出。這些數(shù)據(jù)表明這種AGL5基因定位干擾產(chǎn)生了一種功能喪失的等位基因。
agl5品系的鑒定表明該轉(zhuǎn)基因的表型與野生型擬南芥屬?zèng)]有不同。
在載體pZM104A上制備了AGL5的敲除(KO)結(jié)構(gòu)，該載體帶有側(cè)翼為多克隆位點(diǎn)的卡那霉素抗性盒(Miao和Lam植物雜志，7359-365(1995)，在此提及可供參考)。在載體pZM104A還含有編碼β-葡糖苷酸酶(GUS)，它用以區(qū)分非同源的和同源的整合情況。利用引物SEQ ID NO11(5′-CGGATAGCTCGAATATCG-3′)和引物SEQID NO12(5′-AACCATTGCGTCGTTTGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得AGL55′部分的3kb區(qū)域。將得到的片段克隆入載體pCRII(Invitrogen)，并將切下的EcoRI片段克隆入pZM104A的EcoRI位點(diǎn)。將3′部分的AGL5從位于在pCIT30(Ma等，基因，117161-167(1992)，在此提及可供參考)中的基因組克隆用XbaI切下，并插入到pZM104A的XbaI位點(diǎn)。將得到的質(zhì)粒，記作AGL5 KO，用于對(duì)Columbia生態(tài)型的野生型擬南芥屬植物進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的滲透。敲除結(jié)構(gòu)來自Landsberg erecta基因組DNA。
對(duì)AGL5位點(diǎn)上含有同源重組的植物作如下的鑒定。選取大于750個(gè)初級(jí)(T1)卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，10個(gè)植物一組，分別從葉子中抽提DNA，如Edward等所述(核酸研究，191349(1991)，在此提及可供參考)。為了確定出含有候選的定點(diǎn)破壞的一組，利用作為AGL5位基因組的序列但不處于AGL5 KO結(jié)構(gòu)中的引物SEQ IDNO13(5′-GTAATTACCAGGCAAGGACTCTCC-3′)，和對(duì)卡那霉素盒特異的引物SEQ ID NO14(5′-GTCATCGGCGGGGGTCATAACGTG-3′)，對(duì)分離的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上組份分離，并用探針1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的DNA斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)。含有10個(gè)植物的一組在正確位置顯現(xiàn)出預(yù)期的雜交條帶，將該組進(jìn)而分開為單個(gè)植物。最后確定出單個(gè)一株(T1)植物表現(xiàn)出含有預(yù)期的重組，使該植物自花授粉以便進(jìn)一步對(duì)其后代進(jìn)行分析。該T1植物顯示出含有GUS報(bào)告基因，這表明除了假定的同源整合之外，還有發(fā)生了獨(dú)立的非同源事件。在其后代中的繁殖隔離確定出不再含有GUS報(bào)告基因的植物，并將這種品系用于進(jìn)一步的分析。利用引物SEQ IDNO15(5′-GAGGATAGAGAACACTACGAATCG-3′)和引物SEQ IDNO16(5′-CAGGTCAAGTCAATAGATTC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定出重組破壞的純合子植物，擴(kuò)增在野生型植物中產(chǎn)生一個(gè)1.5kb的產(chǎn)物，而在突變體中產(chǎn)生一個(gè)2.6kb的產(chǎn)物。通過用引物SEQ IDNO17(5′-CAGAATTTAGTGAATAATATTG-3′)和引物SEQ ID NO14進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在突變體中獲得了預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物而在野生型中沒有產(chǎn)物，進(jìn)一步對(duì)含有所需的重組破壞的植物進(jìn)行了確定。
為了證實(shí)發(fā)生了所需重組破壞，分析了一系列的野生型和突變(T4代)植物的基因組雜交印漬。探針1可與預(yù)期的3.9kb的野生型和突變植物的XbaI片段雜交，但是只有在野生型中才存在1.3kb的XbaI片段。同樣的探針可與野生型中的6kb的EcoRI片段以及預(yù)期的突變型中的4.1和2.8kb的EcoRI片段雜交。另外用BglII和HindII的酶解也可以確定突變體中含有所需的靶序列。為了確定在靶區(qū)域范圍之外沒有可檢測的缺失或重組，進(jìn)一步分析了野生型和純合子突變植物的基因組雜交印跡。探針2可與野生型和突變型DNA的預(yù)期的2.9kb的XmnI片段，1.5kb和0.4kb的HincII片段，以及0.6kb的HindIII片段雜交。探針3可與野生型和突變型DNA的預(yù)期的9kb的ScaI片段，3.9kb的XbaI片段，以及1.8kb的NdeI片段雜交。ScaI酶解物中的微弱雜交帶表示的是跨越插入位點(diǎn)的片段，并且，如所期望的，在野生型和agl5突變型植物中大小不同。
RNA雜交分子如下進(jìn)行。利用Dynbeads(Dynal)從野生型和agl5突變型花序中純化出大約6μg的polyA+RNA，按照標(biāo)準(zhǔn)的程序進(jìn)行組份分離和雜交(Crawford等，美國科學(xué)院研究進(jìn)展，838073-8076(1986)，在此提及可供參考)，使用了一個(gè)來自pCIT2242(Ma等，同上，1991)的經(jīng)過凝膠純化的450bp的HindII-EcoRI片段，它是對(duì)AGL5 cDNA的3′端特異的。然后將同一濾膜剝下并與微管蛋白特異的探針(Marks等，植物分子生物學(xué)，1091-104(1987)，在此提及可供參考)再次雜交。與微管蛋白特異的探針的雜交可以確定各個(gè)泳道中存在大致相同數(shù)量的RNA。B.agl1突變體的產(chǎn)生基本上按照Krysan等，同上，1996所述的，利用PCR法掃描來確定AGL1基因中T-DNA的插入。
RNA雜交分析表明AGL1 RNA沒有表達(dá)。agl1突變體基本上顯示為野生型表型。C.agl1 agl5雙突變體的產(chǎn)生和鑒定
agl1 agl5雙突變體通過agl1和agl5單一突變體的雜交產(chǎn)生。如上文所描述的，進(jìn)行agl1 agl5雙突變體的RNA雜交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明agl1和agl5 RNA在agl1 agl5雙突變體中都沒有表達(dá)。
與基本上是野生型表型的agl1和agl5單一突變體相反，通過掃描電子顯微鏡對(duì)agl1 agl5雙突變體的分析表明其熟裂區(qū)域無法正常發(fā)育。而且，agl1 agl5雙突變體的成熟果實(shí)無法熟裂。這種遲發(fā)性種子散布的表型與35S-AGL8轉(zhuǎn)基因植物中的AGL8功能獲得型表型相似。這些結(jié)果表明AGL1和AGL5基因是功能上多余的，并且它們編碼的基因產(chǎn)物調(diào)控果莢的熟裂。35S∷AGL8和agl1 agl5雙突變表型的相似性，以及下文中所描述的酵母雙雜交的結(jié)果表明，AGL1和AGL8或者AGL5和AGL8可以相互作用來調(diào)控熟裂過程。D.各種條件下對(duì)熟裂表型的分析利用透射電子顯微鏡對(duì)Brassica napus L.的果莢熟裂進(jìn)行的研究表明，在熟裂中，熟裂區(qū)域細(xì)胞的中間的薄層降解，使得殼瓣與胎座框分離(Petersen等，同上，1996)。在agl1 agl5雙突變體中以及在野生型擬南芥屬和agl1和agl5單一突變型中也進(jìn)行了類似的分析。
先前的研究表明，當(dāng)溫度更高和相對(duì)濕度更低時(shí)果莢熟裂更強(qiáng)烈。上述的agl1 agl5雙突變體熟裂表型是將植物置于連續(xù)光照、25℃下獲得的。為了確定agl1 agl5雙突變體是否對(duì)環(huán)境條件敏感，上述的分析在不同的環(huán)境條件下，包括變化溫度、變化濕度和短日照的連續(xù)光照條件下進(jìn)行了重復(fù)。
實(shí)施例III在AGL1啟動(dòng)子控制下表達(dá)AGL8的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的產(chǎn)生本實(shí)施例表明在熟裂區(qū)域選擇性啟動(dòng)子控制下表達(dá)AGL8的轉(zhuǎn)基因植物具有遲發(fā)性種子散布的特性。AGL1∷AGL8轉(zhuǎn)基因植物在35S啟動(dòng)子控制下AGL8的異位表達(dá)因熟裂區(qū)域無法正常發(fā)育而防止了果莢的散落。但是，35S啟動(dòng)子產(chǎn)生的組成型AGL8的表達(dá)也可以導(dǎo)致其他的變化，包括過早開花。為了特異地控制熟裂，AGL8的表達(dá)由熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子控制，諸如來自通常表達(dá)于殼瓣區(qū)域的調(diào)控啟動(dòng)子，如下文所述。
在熟裂區(qū)域選擇性2.5kb的AGL1啟動(dòng)子片段控制下的AGL8表達(dá)結(jié)構(gòu)和第一個(gè)AGL1內(nèi)部序列，按照如下方法制備。利用引物AGL1pds(SEQ ID NO18；5′-GCCAGAGATAATGCTATTCC-3′)和引物AGL1pus(SEQ ID NO19；5′-CATTGATCCATATATGACATCAC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增出2.5kb的AGL1啟動(dòng)子片段，利用寡聚片段AGL8eds(SEQ ID NO20；5′-GTGATGTCATATATGGATCAATGGGAAGAGGTAGGGTTCAG-3′)和寡聚片段AGL8eus(SEQ ID NO21；5′-CAAGAGTCGGTGGAATATTCG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增出AGL8內(nèi)的第一個(gè)編碼外顯子。另外，利用寡聚片段AGL1ids(SEQ ID NO22；5′-CGAATATTCCACCGACTCTTGGTACGCTTCTCCTACTCTAT-3′)和寡聚片段AGL1iup(SEQ ID NO23；5′-CTAATAAGTAAGATCGCGGAA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增出含有調(diào)控因子的AGL1的第一個(gè)內(nèi)含子。利用寡聚片段AGL8rds(SEQ ID NO24；5′-TTCCGCGATCTTACTTATTAGCATGGAGAGGATACTTGAAC-3′)和寡聚片段OAM14(SEQ IDNO10)進(jìn)行PCR擴(kuò)增出其余的AGL8編碼區(qū)域。利用引物AGL1pds(SEQ ID NO18)和寡聚片段OAM14(SEQ ID NO10)進(jìn)行PCR，將四個(gè)片段按照下列順序連接起來AGL1啟動(dòng)子，AGL8的第一個(gè)外顯子，AGL1的第一個(gè)內(nèi)含子和其余的AGL8編碼序列。將得到的4.6kb的片段克隆入pCFM83載體，該載體是以pBIN19位基礎(chǔ)的，它經(jīng)修飾含有BASTA抗性基因和3′NOS終止序列。
只在熟裂區(qū)域選擇性2.5kb的AGL1啟動(dòng)子片段控制下的第二個(gè)AGL8表達(dá)結(jié)構(gòu)，按照如下方法制備。利用引物AGL1pds(SEQ IDNO18)和引物AGL1pus(SEQ ID NO19)進(jìn)行PCR擴(kuò)增出2.5kb的AGL1啟動(dòng)子片段，利用寡聚片段AGL8eds(SEQ ID NO20)和OAM14(SEQ ID NO10)進(jìn)行PCR擴(kuò)增出AGL8編碼區(qū)域。利用引物AGL1pds(SEQ ID NO18)和OAM14(SEQ ID NO10)進(jìn)行PCR，將3.5kb的片段克隆入pCFM83載體。
用上述的這兩種AGL1-AGL8結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化擬南芥屬植物。篩選出帶有或者不帶有AGL1內(nèi)含子的含有AGL1∷AGL8轉(zhuǎn)基因的BASTA抗性植物。表性分析表明，含有任何這些結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化植物具有遲發(fā)熟裂的特性。但是，AGL1∷AGL8轉(zhuǎn)基因植物不同于35S∷AGL8轉(zhuǎn)基因植物，總體上未發(fā)現(xiàn)增大的果實(shí)和過早開花表型。
這些結(jié)果表明，在AGL1熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子控制下表達(dá)AGL8的轉(zhuǎn)基因種子植物具有遲發(fā)性種子散布的特性。
實(shí)施例IV酵母中AGL8與AGL5的相互作用本實(shí)施例表明，在酵母雙雜交系統(tǒng)中，AGL8基因產(chǎn)物與AGL5的相互作用。
Finley和Brent的“相互作用陷阱”(基因探針實(shí)用方法(1994)；也可見，Gyurs等，細(xì)胞，75791-803(1993))是Fields和Song的酵母雙雜交系統(tǒng)(自然，340245-246(1989)的一種變化形式。該系統(tǒng)中，第一個(gè)蛋白與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，而第二個(gè)蛋白與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合。擬南芥屬AGL5和AGL8基因產(chǎn)物之間的相互作用通過1acZ報(bào)告基因的激活來檢測。
“誘餌”和“獵物”結(jié)構(gòu)制備于單拷貝著絲點(diǎn)質(zhì)粒pBI-880和pBI-771中，它們分別含有組成型ADH1啟動(dòng)子，且基本上如Chevray和Nathans所述(美國科學(xué)院研究進(jìn)展，895789-5793(1992)。誘餌結(jié)構(gòu)含有與全長的AGL8編碼序列融合的GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(第1至147位氨基酸)。獵物結(jié)構(gòu)含有與GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域相融合的全長的AGL5編碼序列，后跟有核定位序列。將誘餌和獵物結(jié)構(gòu)在S.cerevisiae的YPB2菌種中檢測，該菌種缺損GAL4和GAL80而含有整合的在GAL1啟動(dòng)子元件控制下的lacZ報(bào)告基因(Feilotter等，核酸研究，221502-1530(1994))。
通過在含有X-gal的培養(yǎng)基上的藍(lán)色菌落的顯色，AGL8的“誘餌”和AGL5“獵物”間的相互作用在YPB2菌種中表現(xiàn)出來。對(duì)照“誘餌”-“獵物”的結(jié)合，包括單獨(dú)的GAL4(1-147)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域都只產(chǎn)生白色菌落。這些結(jié)果顯示AGL8可以和AGL5在酵母中相互作用，并且表明AGL8和AGL5的植物MADS盒基因產(chǎn)物在種子植物中也可以相互作用。
上文中，以圓括號(hào)或其他形式提供的所有的雜志文章、參考文獻(xiàn)、和專利引用，無論是否在前文中加以說明，它們?cè)诒疚闹斜惶峒安⒖梢詤⒖肌?br> 盡管本發(fā)明以上述的實(shí)施例為參考進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)明白的是，不背離本發(fā)明的精神可以進(jìn)行各種修改。因此，本發(fā)明只限制于下列的權(quán)利要求。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)(ii)發(fā)明名稱具有遲發(fā)性種子散布的特性的種子植物(iii)序列數(shù)24(iv)通信地址(A)收信人Campbell & Flores LLP(B)街道4370 La Jolla Village Drive，Suite 700(C)城市San Diego(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵政編碼92122(v)計(jì)算機(jī)閱讀格式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0 Version#1.25(vi)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(vii)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 60/051,030(B)申請(qǐng)日1997年6月27日(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 60/067,800(B)申請(qǐng)日1998年4月28日(viii)律師/代理人信息(A)姓名Campbell，Cathryn A.
(B)注冊(cè)號(hào)31，815(C)參考/文檔號(hào)FP-UD 3188(ix)電訊信息(A)電話(619)535-9001(B)電傳(619)535-8984(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)長度1062個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)CDS(B)位置101..827(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置1062(D)其他信息/注＝″末端有poly(A)尾″(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置1..1062(D)其他信息/注＝″AGL8 cDNA克隆的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列″(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCAGAGAGA CATAAGAAAG AAAGAGAGAG AGAGATACTT TGGTCATTTC AGGGTTGTCG 60TTTCTCTCTC TTGTTCTTGA GATTTTGAAG AGAGAGAGAT ATG GGA AGA GGT AGG115Met Gly Arg Gly Arg1 5GTT CAG CTG AAG AGG ATA GAG AAC AAG ATC AAT AGG CAA GTT ACT TTC163Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn Arg Gln Val Thr Phe10 15 20TCA AAG AGA AGG TCT GGT TTG CTC AAG AAA GCT CAT GAG ATC TCT GTT211Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala His Glu Ile Ser Val25 30 35CTC TGC GAT GCT GAG GTT GCT CTC ATC GTC TTC TCT TCC AAA GGC AAA259Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe Ser Ser Lys Gly Lys40 45 50CTC TTC GAA TAT TCC ACC GAC TCT TGC ATG GAG AGG ATA CTT GAA CGC307Leu Phe Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Cys Met Glu Arg Ile Leu Glu Arg55 60 65TAT GAT CGC TAT TTA TAT TCA GAC AAA CAA CTT GTT GGC CGA GAC GTT355Tyr Asp Arg Tyr Leu Tyr Ser Asp Lys Gln Leu Val Gly Arg Asp Val70 75 80 85TCA CAA AGT GAA AAT TGG GTT CTA GAA CAT GCT AAG CTC AAG GCA AGA403Ser Gln Ser Glu Asn Trp Val Leu Glu His Ala Lys Leu Lys Ala Arg90 95 100GTT GAG GTA CTT GAG AAG AAC AAA AGG AAT TTT ATG GGG GAA GAT CTT451Val Glu Val Leu Glu Lys Asn Lys Arg Asn Phe Met Gly Glu Asp Leu105 110 115GAT TCG TTG AGC TTG AAG GAG CTC CAA AGC TTG GAG CAT CAG CTC GAT499Asp Ser Leu Ser Leu Lys Glu Leu Gln Ser Leu Glu His Gln Leu Asp120 125 130GCA GCT ATC AAG AGC ATT AGG TCA AGA AAG AAC CAA GCT ATG TTC GAA547Ala Ala Ile Lys Ser Ile Arg Ser Arg Lys Asn Gln Ala Met Phe Glu135 140 145TCC ATA TCT GCG CTC CAG AAG AAG GAT AAA GCC TTG CAA GAT CAC AAC595Ser Ile Ser Ala Leu Gln Lys Lys Asp Lys Ala Leu Gln Asp His Asn150 155 160 165AAT TCG CTT CTC AAA AAG ATT AAG GAG AGG GAG AAG AAA ACG GGT CAG643Asn Ser Leu Leu Lys Lys Ile Lys Glu Arg Glu Lys Lys Thr Gly Gln170 175 180CAA GAA GGA CAA TTA GTC CAA TGC TCC AAC TCT TCT TCA GTT CTT CTG691Gln Glu Gly Gln Leu Val Gln Cys Ser Asn Ser Ser Ser Val Leu Leu185 190 195CCT CAA TAC TGC GTA ACC TCC TCC AGA GAT GGC TTT GTG GAG AGA GTT739Pro Gln Tyr Cys Val Thr Ser Ser Arg Asp Gly Phe Val Glu Arg Val200 205 210GGG GGA GAG AAC GGT GGT GCA TCG TCG TTG ACG GAA CCA AAC TCT CTG787Gly Gly Glu Asn Gly Gly Ala Ser Ser Leu Thr Glu Pro Asn Ser Leu215 220 225CTT CCG GCT TGG ATG TTA CGT CCT ACC ACT ACG AAC GAG T AGAACTATCT 837Leu Pro Ala Trp Met Leu Arg Pro Thr Thr Thr Asn Glu230 235 240CACTCTTTAT AATATAATGA TAATATAATT AATGTTTAAT ATTTTCATAA CATTCAGCAT 897TTTTTTGGTG ACTTATACTC ATTATTAATA CCGATATGTT TTAGCTAGTC ATATTATATG 957TATGATGGAA CTCCGTTGTC GAGACGTATG TACGTAAGCT ATCATTAGAT TCACTGCGTC 1017TTAAGAACAA AGATTCATAT CTTGGTAATG ATTTCTCATG AAATA 1062(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度242個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gly Arg Gly Arg Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn1 5 10 15Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala20 25 30His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe35 40 45Ser Ser Lys Gly Lys Leu Phe Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Cys Mer Glu50 55 60Arg Ile Leu Glu Arg Tyr Asp Arg Tyr Leu Tyr Ser Asp Lys Gln Leu65 70 75 80Val Gly Arg Asp Val Ser Gln Ser Glu Asn Trp Val Leu Glu His Ala85 90 95Lys Leu Lys Ala Arg Val Glu Val Leu Glu Lys Asn Lys Arg Asn Phe100 105 110Met Gly Glu Asp Leu Asp Ser Leu Ser Leu Lys Glu Leu Gln Ser Leu115 120 125Glu His Gln Leu Asp Ala Ala Ile Lys Ser Ile Arg Ser Arg Lys Asn130 135 140Gln Ala Met Phe Glu Ser Ile Ser Ala Leu Gln Lys Lys Asp Lys Ala145 150 155 160Leu Gln Asp His Asn Asn Ser Leu Leu Lys Lys Ile Lys Glu Arg Glu165 170 175Lys Lys Thr Gly Gln Gln Glu Gly Gln Leu Val Gln Cys Ser Asn Ser180 185 190Ser Ser Val Leu Leu Pro Gln Tyr Cys Val Thr Ser Ser Arg Asp Gly195 200 205Phe Val Glu Arg Val Gly Gly Glu Asn Gly Gly Ala Ser Ser Leu Thr210 215 220Glu Pro Asn Ser Leu Leu Pro Ala Trp Met Leu Arg Pro Thr Thr Thr225 230 235 240Asn Glu(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度5622個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)湮粗?ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置1..5622(D)其他信息/標(biāo)記＝″AGL1啟動(dòng)子″/注＝″AGL1啟動(dòng)子的核苷酸序列″(xi)序列描述SEQ ID NO3AGATCTGCAA CAGTGAAAAG AGAAAACAAA ATGGACTTGA AGAGGTTTTG ACAATGCCAG60AGATAATGCT TATTCCCTAA TATGTTGCCA GCCAAGTGTC AAATTGGCTT TTTAAATATG 120GATTTCTGTA TCAGTGGTCA TATTTGTGGA TCCAACGTAT TCATCATCAA GTTCTCAAGT 180TTGCTTTCAG TGCAATTCTA ATTCACACGT TTAACTTTAA CATGCATGTC ATTATAATTA 240CTTCTTCACT AAGACACAAT ACGGCAAACC TTTCAGATTA TATTAATCTC CATAAATGAA 300ATAATTAACC TCATAATCAA GATTCAATGT TTCTAAATAT ATATGGACAA AATTTACACG 360GAAGATTAGA TACGTATATT AGTAGATTTA GTCTTTCGTT TGTGCGATAA GATTAACCAC 420CTCATAGATA GTAATATCAT TGTCAAATTC CTCTCGGTTT AGTCGCTAAA TTGTATCTTT 480TTTAAGCCTA AAAGTAGTGT ATTCGCATAT GACTTATCGT CCTAACTTTT TTTTTAATTA 540ACAAAAAAAT CGAAAAGAAA ATAATCTGTT AAATATTTTT TAAGTACTCC ATTAAGTTTA 600GTTTCTATTT AAAAAATGCT TGAAATTTGA CAGTTATGTT CAACAATTTT GAATCATGAG 660CGATGTCTAG ATACTCAGAA TTTAATCAAG ATGTCTTATC AAATTTGTTG TCACTCGAGG 720ACCCACGCAA AAGAAAAGAC TAATATGATT TTTATTTGGT CTGGATATTT TTGTAGAGGA 780TGAAACTAAG AGAGTGAAAG ATTCGAAATC CACAATGTTC AAGAGAGCTC AAAGCAAAAA 840GAAAAATGAA GATGAAGGAC TAAAGAACAA TAAGCAACTA CTTATACCCT ATTTCCATAA 900AGGATTCAGG TACTAGGAGA AGTTGAGGCA AGTTNNNNNN NATTGATTCA AATTTTCATT 960TATTTTTACA ATTTAATTCA CCTAAGTTAT TATGCATTTC TcATcATTGG TACATTTTCT 1020GTATAGCGTA TTTACATATA TGAAATAAAT TAAATATGTC CTCACGTTGC AAGTAGTTAA 1080TGAATGTCCC CACGCAAAAA AAAATCCCTC CAAATATGTC CACCTTTTCT TTTCTTTTTA 1140ATTCCAAAAT TACCATAAAC TTTTGGTTTA CAAAAGATTT CTAGAAATTG AGGAAGATAT 1200CCTAAATGAT TCATGAATCC TTCAATAATC TGAAGTTTGC GATATTTTCG ATTTTCTTCA 1260AGAGTTGCGA TATTTGTAAT TTGGTGACCT TAAACTTTTT TTGATAAAGA GTAAACGTTT1320TTTCTTAAAA GTAAAACTTG ATTTTATGTT TTAGGGTTCT AGCTCAACTT TGTATTATAT1380TTCTTGCAAA AAGAGTTCGT TAACTGCATT CTTCAACACT ATAAAGTGAT TATCAAAAAC1440ATCTTCATGA ACATTAAGAA AAACAATATT TGGTTTCGGT TAGAGCTTGG TTTTGCTTGG1500CTTGATTCAC ATACCCATTC TAGACTTTGG CATAAATTTG ATACGATAGA GAGTATCTAA1560TGGTAATGCA GAAGGGTAAA AAAAGGAAGA GAGAAAAGGT GAGAAAGATT ACCAAAAATA1620AGGAGTTTCA AAAGATGGTT CTGATGAGAA ACAGAGCCCA TCCCTCTCCT TTTCCCCTTC1680CCATGAAAGA AATCGGATGG TCCTCCTTCA ATGTCCTCCA CCTACTCTTC TCTTCTTTCT1740TTTTTTCTTT CTTATTATTA ACCATTTAAT TAATTTCCCC TTCAATTTCA GTTTCTAGTT1800CTGTAAAAAG AAAATACACA TCTCACTTAT AGATATCCAT ATCTATTTAT ATGCATGTAT1860AGAGAATAAA AAAGTGTGAG TTTCTAGGTA TGTTGAGTAT GTGCTGTTTG GACAATTGTT1920AGATGATCTG TCCATTTTTT TCTTTTTTCT TCTGTGTATA AATATATTTG AGCACAAAGA1980AAAACTAATA ACCTTCTGTT TTCAGCAACT AGGGTCTTAT AACCTTCAAA GAAATATTCC2040TTCAATTGAA AACCCATAAA CCAAAATAGA TATTACAAAA GGAAAGAGAG ATATTTTCAA2100GAACAACATA ATTAGAAAAG CAGAAGCAGC AGTTAAGTGG TACTGAGATA AATGATATAG2160TTTCTCTTCA AGAACAGTTT CTCATTACCC ACCTTCTCCT TTTTGCTGAT CTATCGTAAT2220CTTGAGAACT CAGGTAAGGT TGTGAATATT ATGCACCATT CATTAACCCT AAAAATAAGA2280GATTTAAAAT AAATGTTTCT TCTTTCTCTG ATTCTTGTGT AACCAATTCA TGGGTTTGAT2340ATGTTTCTTG GTTATTGCTT ATCAACAAAG AGATTTGATC ATTATAAAGT AGATTAATAA2400CTCTTAAACA CACAAAGTTT CTTTATTTTT TAGTTACATC CCTAATTCTA GACCAGAACA2460TGGATTTGAT CTATTTCTTG GTTATGTATC TTGATCAGGA AAAGGGATTT GATCATCAAG2520ATTAGCCTTC TCTCTCTCTC TCTAGATATC TTTCTTGAAT TTAGAAATCT TTATTTAATT2580ATTTGGTGAT GTCATATATG GATCAATGGA GGAAGGTGGG AGTAGTCACG ACGCAGAGAG2640TAGCAAGAAA CTAGGGAGAG GGAAAATAGA GATAAAGAGG ATAGAGAACA CAACAAATCG2700TCAAGTTACT TTCTGCAAAC GACGCAATGG TCTTCTCAAG AAAGCTTATG AACTCTCTGT2760CTTGTGTGAT GCCGAAGTTG CCCTCGTCAT CTTCTCCACT CGTGGCCGTC TCTATGAGTA2820CGCCAACAAC AGGTACGCTT CTCCTACTCT ATTTCTTGAT CTTGTTTTCT TAATTTTAAC2880TAAACAAGAT CCTAGTTCAA ATGATAACAA AGTGGGGATT GAGAGCCAAG ATTAGGGTTT2940GGTTAATTTA GAAAACCAGA TTTCACTTGT TGATACATTT AATATCTCTC TAGCTAGATT3000TAGTACTCTC TCCTCTATAT ATGTGTGGGT GTGTGTGTAA GTGTGTATAT GTATGCAAAT3060GCAAGAAGAA GAAGAAAAAG TTATCTTGTC TTCTCAAATT CTGATCAGCT TTGACCTTAG3120TTTCACTCTT TTTTCTGCAA ATCATTTGAA CCTGATGCAT GTCAGTTTCT ACAATACACT 3180TTTAATTTTG ACGGCCCATC AAATTTCCTA GGGTTTACTT CAGTGAACAA AATTGGGTTC 3240TTGACACGAT TTAGCATGTA TATATAAAAA TAGGGGATGA TCAAGACTTA TGTAACCTCT 3300GTCTGGTGAA ACTAGGGACA AAGTCTACTG ATGAGTTGTC ACTAGGGATC CATTTGATCA 3360TTTAATCCCA ACAAAAATGA AACAAAATTT TGAGAATTTA TATGCTGAAG TTTTTCAACC 3420CTCTTTTTTA AATAACTTTA TATTATGTAG ATTTGTATTT AGGGTAATTT GTCCAACTAG 3480AAGTCCTAAA AATCAATAAA CACACGGATG ACTTTGTCTA ACATTGTATC AGTCATCAAA 3540TGTAAAATTG TACAAATAAT GAAATTAAAG ATTTAGTCTC TTTTATTTTT TTTGTTTAGG 3600GTGTATATAT ATATATATAT GTATATTTGT TGCATTGATA TATCAATGAG AGGGAGAGAA 3660CTCAGAGAAG TGTCGGAAAT TAAAATGGTA CGAGCCAATT GGAATCTCTG GCATTCTGAG 3720CTTCATTTGT TTGTTATTAG AAAAAAAAAA AAAAAATCCT TTAAAGATAC CTTCATGATG 3780ACATTGAATC ATGTAATATA CACGATACAT GGTCTAATTC CTCCTCAAAC CCTAATTACC 3840AATTTCGAAA CCATAATATT TACTAGTATG TTTATATATC CTTACTTTAA GACATTGTTT 3900GTTTATAATA CCTTGTGAAT TAAGAAAAAA AAAAAAAAAC TTGTGGATCT ATTCAAGCCA 3960TGTGTTAGAA TAAATTTATA AATTTTCTCC TCGTACTGGT CAGATATTGG TCCAAACTCC 4020AAAGCCTTCC CTTTTCAGGA AAAAAAACAT TTCGAAATTA ACTCTAATTA ATCAAGAATT 4080TCCTACAATG TATACATCTA ATGTTTTTTC CGCGATCTTA CTTATTAGTG TGAGGGGTAC 4140AATTGAAAGG TACAAGAAAG CTTGTTCCGA TGCCGTCAAC CCTCCTTCCG TCACCGAAGC 4200TAATACTCAG GTACCAATTT ATATTGTTTG ATTCTCTTTG TTTTATCTTC TTCTTTTTCAT 4260TATATATATG ATCAACAAAA AATATAACCT ACAAAAAGAG AGAGTTCAAG GAAATGCATT 4320GAAACGGTTT CGTTATGGTG TTTGAATACA TGGATTTTTG AAGTACTATC AGCAAGAAGC 4380CTCTAAGCTT CGGAGGCAGA TTCGAGATAT TCAGAATTCA AATAGGTAAT TCATTAACTT 4440TTCATGAACT CTTCGATTTG GTATTAGGTC ACTTAATTTG GTGTCGGTCC AAAAGTCCGC 4500TTGTAGTTTT CTTTAGAAGT TGTTTTGTTT AATGTTCATG TTTACAAATT GAAGGCATAT 4560TGTTGGGGAA TCACTTGGTT CCTTGAACTT CAAGGAACTC AAAAACCTAG AAGGACGTCT 4620TGAAAAAGGA ATCAGCCGTG TCCGCTCCAA AAAGGTAAAA TCTACGTTGC TCTCTCTCTG 4680TGTCTCTGTC TCTCTCTCTA TATATAGTCC CTTAGTTTAT ATAGTTCATC ACCCTTTTGT 4740GAGAATTTTG CAGAATGAGC TGTTAGTGGC AGAGATAGAG TATATGCAGA AGAGGGTAAG 4800AACGTTTCTC CCATTCCAAG TAATTAGATC TTTCTTCGTC TTTGTGAGGG TTTGAGTTTT 4860CCCATAAATC ATGTGTAGGA AATGGAGTTG CAACACAATA ACATGTACCT GCGAGCAAAG 4920GTTAGCCACG TTCTGTTCCA AATCTTAATC TCAATATCTA CTCTTTTCTT CATTGTATAA 4980CTAAGATAAC GTGAATAACA AGAAAACTTT TGTTTTTGGG TTTAATAGAT AGCCGAAGGC 5040GCCAGATTGA ATCCGGACCA GCAGGAATCG AGTGTGATAC AAGGGACGAC AGTTTACGAA 5100TCCGGTGTAT CTTCTCATGA CCAGTCGCAG CATTATAATC GGAACTATAT TCCGGTGAAC 5160CTTCTTGAAC CGAATCAGCA ATTCTCCGGC CAAGACCAAC CTCCTCTTCA ACTTGTGTAA 5220CTCAAAACAT GATAACTTGT TTCTTCCCCT CATAACGATT AAGAGAGAGA CGAGAGAGTT 5280CATTTTATAT TTATAACGCG ACTGTGTATT CATAGTTTAG GTTCTAATAA TGATAATAAC 5340AAAACTGTTG TTTCTTTGCT TAATTACATC AACATTTAAA TCCAAAGTTC TAAAACACGT 5400CGAGATCCAA AGTTTGTCAT ACAAGATTAG ACGCATACAC GATCAGTTAA TAGATTTTAA 5460GTGCCTTTTA ATATTTACAT ATAGTTGCAG CTTCGATTAG ATCATGTCCA CCAAACACTC 5520ACAATTAGAG ACAAGCAAAA CTATAAACAT TGATCATAAA ATGATTACAA CATGTCCATA 5580AATTAATTAT GGATTACAAA AATAAAAACT TACAAAAGAT CT5622(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度6138個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)湮粗?ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置1..6138(D)其他信息/標(biāo)記＝″AGL5_啟動(dòng)子″/注＝″AGL5啟動(dòng)子的核苷酸序列″(xi)序列描述SEQ ID NO4GAATTCGTAA CAGAATTTAG TGAATAATAT TGTAATTACC AGGCAAGGAC TCTCCAAACG 60GATAGCTCGA ATATCGTTAT TAAAGAGTAA ATGATCCAAT ATGTAAGCCA TTGTTGATCA 120TCTAACATTG TTGGACTCTC TATTGCTCGA AATGATGCAT ACCTAATCAT TTATTCAGTT 180AACTATCAAG TTGCATTTGT AAAAACCAAA CATTTAAATT CAGATTTGAT ATCACTTACA 240GAGGATAGAG AAGCATGACT CCAGGCCTGC ATGCAACAAG AAAAAGGAAG AAAATAATGT 300TAAAAATTTG ACAAATATAG TGTTTATTTT TATTATATGA GACAGAATTT GAATAAAATC 360CTACCCAACT AGAGCATCAA AACGTTTTGC AATCGCAATA ATGAAACCCA TTTTCTTTTT 420GAGTTTTTAC TCTTCTTTCA ACAGAAACTT TCTCAAACGT CTTTAGCACT GTGACGTTAG 480ATATATACAC AAAAGCTTGA AATTTCTTCA AGCAAAAGAA TCTTTGTGGG AGTTAAGGCA 540ACAAGCCAGG TAAAGAATCT CCAACGCATT GTTACGTTTT CATGAACCTA TTTATTATAT 600GTTCTAAGAA AGAAAAAAAT ATCTCAAAGT AAACGTTGGA AATTTTCTGA TGAAGGGAAA 660TCCAAAGTCT TGGGTTTAGT ATCCCTATGA ATGGTATTTG GAATATGTTT TCGTCAAAAC 720AAAAGATTCT TTTCTTTTTC ACAAGAGTTA GTGATCAATA ACTTATGCAC TAATTAATGA 780GATTGGACGT ATACACAATT TGATTATGAT ACTTGAGTAA AAATCACCTG TCCTTTAATT 840TGGAAATCTC TCTTTCTTAC CCATTTATAT ACTACTTCTT TTCATTAAAA TTAAATTTCA 900ATTATCAATC ATCGTTCAAT TTGATAAAGA TTTAACATTT TTTGTCACAG GGCTAGTAAA 960AGCAATCTTT ACATAATTCA TCTTTCTTAC ATATATATAT TACCTTTTTC TTCATTAGTA1020TTCTATTTGA TTATGATTAT TTTGTCATAA AGCTAGTAAA TTAAACACTC GATATGAGAA1080TTATATTACT TCACGCTAAT TAACTCTTAA CACAACAAGA ACTAGTGCAT ATTCAACTTT1140CAAAGCATAT ACTATATATT GAGAATATAG ACCACGAAAG TCAATCAAAA GACCTACCAG1200CTCTCATCAA GTTCTTTCTT GAAATGATTT TGCAGAATTT CCAACTTAAT TAATTCGACA1260TGAATGTGAA AATGTGTGTT GCTCGTTAAG AAAATTGAAT AGAAGTACAA TGAAAATGAT1320GAGGAATGGG CAAAACACAA AAGAGTTTCC TTTCGTAACT ACAATTAATT AATGCAAATC1380TGAGAAAGGG TTCATGGATA ATGACTACAC ACATGATTAG TCATTCCCCG TGGGCTCTCT1440GCTTTCATTT ACTTTATTAG TTTCATCTTC TCTAATTATA TTGTCGCATA TATGATGCAG1500TTCTTTTGTC TAAATTACGT AATATGATGT AATTAATTAT CAAAATAAAT ATTCAAATTG1560CCGTTGGACT AACCTAATGT CCAAGATTAA GACTTGAACA TAAGAATTTT GGAAAAACTA1620AACCAGTTAT AATATATACT CTTAAATTGC CATTTCTGAA CACAACCAAA TAATAATATA1680TACTATTTAC AGTTTTTTTT AATTGGCAAG AACACTGAAA TCTTATTCAT TGTCTCGCTT1740GGTAGTTGAC AAGTTATAAC ACTCATATTC ATATAACCCC ATTCTAACGT TGACGACGAA1800CACTCATATA AACCACCCAA ATTCTTAGCA TATTAGCTAA ATATTGGTTT AATTGGAAAT1860ATTTTTTTTA TATATAAAAT GCCAGGTAAA TATTAACGAC ATGCAATGTA TATAGGAGTA1920GGGCAATAAA AAGAAAAGGA GAATAAAAAG GGATTACCAA AAAAGGAAAG TTTCCAAAAG1980GTGATTCTGA TGAGAAACAG AGCCCATACC TCTCTTTTTT CCTCTAAACA TGAAAGAAAA2040ATTGGATGGT CCTCCTTCAA TGCTCTCTCC CCACCCAATC CAAACCCAAC TGTCTTCTTT2100CTTTCTTTTT TCTTCTTTCT AATTTGATAT TTTCTACCAC TTAATTCCAA TCAATTTCAA2160ATTTCAATCT AAATGTATGC ATATAGAATT TAATTAAAAG AATTAGGTGT GTGATATTTG2220AGAAAATGTT AGAAGTAATG GTCCATGTTC TTTCTTTCTT TTTCCTTCTA TAACACTTCA2280GTTTGAAAAA AAACTACCAA ACCTTCTGTT TTCTGCAAAT GGGTTTTTAA ATACTTCCAA 2340AGAAATATTC CTCTAAAAGA AATTATAAAC CAAAACAGAA ACCAAAAACA AAAAATAAAG 2400TTGAAGCAGC AGTTAAGTGG TACTGAGATA ATAAGAATAG TATCTTTAGG CCAATGAACA 2460AATTAACTCT CTCATAATTC ATCTTCCCAT CCTCACTTCT CTTTCTTTCT GATATAATTA 2520ATCTTGCTAA GCCAGGTATG GTTATTGATG ATTTACACTT TTTTTTAAAA GTTTCTTCCT 2580TTTCTCCAAT CAAATTCTTC AGTTAATCCT TATAAACCAT TTCTTTAATC CAAGGTGTTT 2640GAGTGCAAAA GGATTTGATC TATTTCTCTT GTGTTTATAC TTCAGCTAGG GCTTATAGAA 2700ATGGAGGGTG GTGCGAGTAA TGAAGTAGCA GAGAGCAGCA AGAAGATAGG GAGAGGGAAG 2760ATAGAGATAA AGAGGATAGA GAACACTACG AATCGTCAAG TCACTTTCTG CAAACGACGC 2820AATGGTTTAC TCAAGAAAGC TTATGAGCTC TCTGTCTTGT GTGACGCTGA GGTTGCTCTT 2880GTCATCTTCT CCACTCGAGG CCGTCTCTAC GAGTACGCCA ACAACAGGTA CACATCTTTT 2940AGCTAGATCT TGATTTTGTT GAATTTTTTT TCTAGAATAA AGTTTCGACT CTTCTGGTGG 3000GTTTTTCAAT CTTTATGGTC TCTTTATAGT TTTTTTCCTT AGTTTCTCTG AAGCTCAAAT 3060CTCTTTAAAA ATCCCCAAAA TTAGGGTTTG TTTAAAACTA GGGAACCCTA CTTTAACTTC 3120TTTCTCTTAG TAAAAAAGCA GTGAGGGTCT TCTCTGATCA TTAATTAGCA TCCCCCATAC 3180CTTGTTCCAG TCACTTTTTC TCCACAAATC CTTATAACAG TATCTATATA TGTATCTATT 3240TATGTCAGTT TGTACAAGAC ACTTCGATCA ATTTGATGAC CCATCAAGTT TTATTTCTGC 3300AGATTGATCA TTAGGTTTCC ATCATAGTAA TGAAAAAGTA GGGTTcTTGA TAAAATTATA 3360ATAATATATA TTATTTGGCT ATATAAAAAA GCTATGTAGA TTCCTTAAAA ATTGATTCAC 3420TAGGGAGAGA CTAGTAGGTG TTTGTCTTCT GACACTTCTC TAATCTTTTG GTGAATCCTT 3480TTGTTAAATC AAGAAAATGA ATCAGGGACA AAGCTTATTG TTGAGTCACT TAATTAATCA 3540TCCGATCCAT CAATCAAGAA AAATAACGAA ACAGAAAATT TTGATTTTTG ATTGTTATTT 3600TCTCCACTTC AAGTTGGGGA CTTGTCATTT CCGTTTTTCT ATACGTTTCC AGCTATTAAC 3660AGCTCATGTT CATTTCACCA TTTTGATTAT TTGTCTGCTT TTTAAAGATA AATGTTTTCA 3720AAAATATTGT TTTTATTTGC TTGGCTAGTT AATACTATAA TTGAGGTTGA TGTATGACTA 3780TAATCTATAA GTCAAGTCTC ATATCATGGA TCTAAGTTAA AACTAGTAAA TTTGTAGTTT 3840CAATGTGAAC TTTCACAACG ACTAAAGAAC TGATCTGAAG TTTATAATGG ACATGACTAA 3900TTTGATTAAC AAAAGAGGAA TGCATTATGT ATGTAGAAAC ATGTGATATA TATATGTTTC 3960TATTATCAAA AGTGTAGTTA ACTTTCTTAT TTCAAACACC CTCATGCTTT AGTAGTATCT 4020TACTTTTGAC ATTTCTCAAC TTCAGCTTTC CATTATACAA CAGCACAATG TAAATTACTT 4080GTATATGAAT ATGAAAGCAT AACGTTATGC AAAGATTTCT AGCTTTTCTT TTTCTGTTTT 4140GCAAAAGATT TACAAATATC ATGTTCTTGG TAAAAACATA CTTGCCTCAG CCACATATGC 4200ATGTAAATGT AATGTTCAAA TATTAATTCA GGAAAAACAA AGAAGAAGCA AAATTAGCTT4260CTAGAGTAGG GAATCTATTG ACTTGACCTG AAAATCACTT CTTTTTCTTA AAGCCTAGTA4320GTGAATTTTT TAATCTAATT AGGCCAAAAT ATATACTAGC CTAAAATATA ATTTGGATTT4380TGTGTCGTAC ATAAATTGGG ACCAATTCCA ATTAACTAAG AGCATATGCA ATTCAAATTC4440TTTTTATTTT CTTCTCCGAT TTGCTACTTC TTTCTTTTGT ATGTTTTCAA ATTAGGATTA4500CACTTTTTTG GGGAAGTACA CATTAGGGTC TTCTCGAACT TTGATTATAC ATATATATAT4560ATATATATAT ATATAACTTT GTGAGATGTC ACTGTTAATA GATAATAGGC AATAACAATA4620ATATCCAAAA AAGAAGGCGC AAACAAATCA TATACTATAT GGTACTGGTC CATTCACTAT4680TTTGTCGGTT GAATTTAAGG TTTGGCGTAC AAACTTTGTT TCAAACCTTT ATTATTCCGT4740CTTTCTGTGT GTTTTGTATA TCCAGAAGAT AAAAATATCA ATTTCTTTAA CGACTTCATA4800TATATATATA TATATATATA TATATATATT TTTCTCTTCT GGTTTTAGTG TTTGAATCCA4860ACAGTTATAG TTTCGTGTGT CTTTGTTTTA CTTGTGGTGG TTTAAGTTTG AGATTTTCAC4920CGATTGCATC TATTTACATA TATAGCTACC ACAAAAAAGA TTGCATTTTA AAATCTTTTC4980CTTTGTGTGA ATGTTGATGA AGTGTGAGAG GAACAATAGA AAGGTACAAG AAAGCTTGCT5040CCGACGCCGT TAACCCTCCG ACCATCACCG AAGCTAATAC TCAGGTTAGC TTTTAATTAA5100TACACCTAGC TAGCTAGTTC GTTAATTACT TAATTTCTTC TTCTTTTAGT TATCTGACCT5160TTTTTTCACC TCTTGTAACA ATGATGGGAT CGAAATTGAT GAAGTACTAT CAGCAAGAGG5220CGTCTAAACT CCGGAGACAG ATTCGGGACA TTCAGAATTT GAACAGACAC ATTCTTGGTG5280AATCTCTTGG TTCCTTGAAC TTTAAGGAAC TCAAGAAcCT TGAAAGTAGG CTTGAGAAAG5340GAATCAGTCG TGTCCGATcc AAGAAGGTAC ATCACTAACT CTCCATCAAT CTCCTTATCA5400TTGAATATAT ATCCATCTGA TTCTTGCCCG TTATATTTGG TTTTTCTCTC CAGCACGAGA5460TGTTAGTTGC AGAGATTGAA TACATGCAAA AAAGGGTAAA AGTAAAACCT ATCTTCCTTC5520ACAATGAACT ACCCCTACTT TATTAGCAAC TTCTCTTTCT GATGATCATC TTTTTTATTT5580TCTGTTGTCG CTTGCATTGT AGGAAATCGA GCTGCAAAAC GATAACATGT ATCTCCGCTC5640CAAGGTTTTA TACATAACTC TTTTTGGCAT TTTTGATCAT CATTTTTTTC CGGTAGACAA5700TCTCTTGATG TGCAAATTCT AAATATCTCT GCAGATTACT GAAAGAACAG GTCTACAGCA5760ACAAGAATCG AGTGTGATAC ATCAAGGGAC AGTTTACGAG TCGGGTGTTA CTTCTTCTCA5820CCAGTCGGGG CAGTATAACC GGAATTATAT TGCGGTTAAC CTTCTTGAAC CGAATCAGAA5880TTCCTCCAAC CAAGACCAAC CACCTCTGCA ACTTGTTTGA TTCAGTCTAA CATAAGCTTC5940TTTCCTCAGC CTGAGATCGA TCTATAGTGT CACCTAAATG CGGCCGCGTC CCTCAACATC6000TAGTCGCAAG CTGAGGGGAA CCACTAGTGT CATACGAACC TCCAAGAGAC GGTTACACAA6060ACGGGTACAT TGTTGATGTC ATGTATGACA ATCGCCCAAG TAAGTATCCA GCTGTGTTCA6120GAACGTACGT CCGAATTC 6138(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度896個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)CDS(B)位置7..753(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置896(D)其他信息/注＝″cDNA序列的末端有poly(A)尾″(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置1..896(D)其他信息/注＝″AGL1 cDNA的核苷酸和推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列″(xi)序列描述SEQ ID NO5GGATCA ATG GAG GAA GGT GGG AGT AGT CAC GAC GCA GAG AGT AGC AAG 48Met Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Asp Ala Glu Ser Ser Lys1 5 10AAA CTA GGG AGA GGG AAA ATA GAG ATA AAG AGG ATA GAG AAC ACA ACA 96Lys Leu Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr15 20 25 30AAT CGT CAA GTT ACT TTC TGC AAA CGA CGC AAT GGT CTT CTC AAG AAA 144Asn Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys35 40 45GCT TAT GAA CTC TCT GTC TTG TGT GAT GCC GAA GTT GCC CTC GTC ATC 192Ala Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Val Ile50 55 60TTC TCC ACT CGT GGC CGT CTC TAT GAG TAC GCC AAC AAC AGT GTG AGG 240Phe Ser Thr Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ala Asn Asn Ser Val Arg65 70 75GGT ACA ATT GAA AGG TAC AAG AAA GCT TGT TCC GAT GCC GTC AAC CCT 288Gly Thr Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Cys Ser Asp Ala Val Asn Pro80 85 90CCT TCC GTC ACC GAA GCT AAT ACT CAG TAC TAT CAG CAA GAA GCC TCT 336Pro Ser Val Thr Glu Ala Asn Thr Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ala Ser95 100 105 110AAG CTT CGG AGG CAG ATT CGA GAT ATT CAG AAT TCA AAT AGG CAT ATT384Lys Leu Arg Arg Gln Ile Arg Asp Ile Gln Asn Ser Asn Arg His Ile115 120 125GTT GGG GAA TCA CTT GGT TCC TTG AAC TTC AAG GAA CTC AAA AAC CTA432Val Gly Glu Ser Leu Gly Ser Leu Asn Phe Lys Glu Leu Lys Asn Leu130 135 140GAA GGA CGT CTT GAA AAA GGA ATC AGC CGT GTC CGC TCC AAA AAG AAT480Glu Gly Arg Leu Glu Lys Gly Ile Ser Arg Val Arg Ser Lys Lys Asn145 150 155GAG CTG TTA GTG GCA GAG ATA GAG TAT ATG CAG AAG AGG GAA ATG GAG528Glu Leu Leu Val Ala Glu Ile Glu Tyr Met Gln Lys Arg Glu Met Glu160 165 170TTG CAA CAC AAT AAC ATG TAC CTG CGA GCA AAG ATA GCC GAA GGC GCC576Leu Gln His Asn Asn Met Tyr Leu Arg Ala Lys Ile Ala Glu Gly Ala175 180 185 190AGA TTG AAT CCG GAC CAG CAG GAA TCG AGT GTG ATA CAA GGG ACG ACA624Arg Leu Asn Pro Asp Gln Gln Glu Ser Ser Val Ile Gln Gly Thr Thr195 200 205GTT TAC GAA TCC GGT GTA TCT TCT CAT GAC CAG TCG CAG CAT TAT AAT672Val Tyr Glu Ser Gly Val Ser Ser His Asp Gln Ser Gln His Tyr Asn210 215 220CGG AAC TAT ATT CCG GTG AAC CTT CTT GAA CCG AAT CAG CAA TTC TCC720Arg Asn Tyr Ile Pro Val Asn Leu Leu Glu Pro Asn Gln Gln Phe Ser225 230 235GGC CAA GAC CAA CCT CCT CTT CAA CTT GTG TAACTCAAAA CATGATAACT 770Gly Gln Asp Gln Pro Pro Leu Gln Leu Val240 245TGTTTCTTCC CCTCATAACG ATTAAGAGAG AGACGAGAGA GTTCATTTTA TATTTATAAC 830GCGACTGTGT ATTCATAGTT TAGGTTCTAA TAATGATAAT AACAAAACTG TTGTTTCTTT 890GCTTCA 896(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度248個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Glu Glu Gly Gly Ser Ser His Asp Ala Glu Ser Ser Lys Lys Leu1 5 10 15Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn Arg20 25 30Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala Tyr35 40 45Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Val Ile Phe Ser50 55 60Thr Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ala Asn Asn Ser Val Arg Gly Thr65 70 75 80Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Cys Ser Asp Ala Val Asn Pro Pro Ser85 90 95Val Thr Glu Ala Asn Thr Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ala Ser Lys Leu100 105 110Arg Arg Gln Ile Arg Asp Ile Gln Asn Ser Asn Arg His Ile Val Gly115 120 125Glu Ser Leu Gly Ser Leu Asn Phe Lys Glu Leu Lys Asn Leu Glu Gly130 135 140Arg Leu Glu Lys Gly Ile Ser Arg Val Arg Ser Lys Lys Asn Glu Leu145 150 155 160Leu Val Ala Glu Ile Glu Tyr Met Gln Lys Arg Glu Met Glu Leu Gln165 170 175His Asn Asn Met Tyr Leu Arg Ala Lys Ile Ala Glu Gly Ala Arg Leu180 185 190Asn Pro Asp Gln Gln Glu Ser Ser Val Ile Gln Gly Thr Thr Val Tyr195 200 205Glu Ser Gly Val Ser Ser His Asp Gln Ser Gln His Tyr Asn Arg Asn210 215 220Tyr Ile Pro Val Asn Leu Leu Glu Pro Asn Gln Gln Phe Ser Gly Gln225 230 235 240Asp Gln Pro Pro Leu Gln Leu Val245(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度959個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)CDS(B)位置78..818(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置1..959(D)其他信息/注＝″AGL5 cDNA的核苷酸和推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列″(xi)序列描述SEQ ID NO7GAATTCATCT TCCCATCCTC ACTTCTCTTT CTTTCTGATC ATAATTAATC TTGCTAAGCC 60AGCTAGGGCT TATAGAA ATG GAG GGT GGT GCG AGT AAT GAA GTA GCA GAG 110Met Glu Gly Gly Ala Ser Asn Glu Val Ala Glu1 5 10AGC AGC AAG AAG ATA GGG AGA GGG AAG ATA GAG ATA AAG AGG ATA GAG158Ser Ser Lys Lys Ile Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu15 20 25AAC ACT ACG AAT CGT CAA GTC ACT TTC TGC AAA CGA CGC AAT GGT TTA206Asn Thr Thr Asn Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu30 35 40CTC AAG AAA GCT TAT GAG CTC TCT GTC TTG TGT GAC GCT GAG GTT GCT254Leu Lys Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala45 50 55CTT GTC ATC TTC TCC ACT CGA GGC CGT CTC TAC GAG TAC GCC AAC AAC302Leu Val Ile Phe Ser Thr Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ala Asn Asn60 65 70 75AGT GTG AGA GGA ACA ATA GAA AGG TAC AAG AAA GCT TGC TCC GAC GCC350Ser Val Arg Gly Thr Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Cys Ser Asp Ala80 85 90GTT AAC CCT CCG ACC ATC ACC GAA GCT AAT ACT CAG TAC TAT CAG CAA398Val Asn Pro Pro Thr Ile Thr Glu Ala Asn Thr Gln Tyr Tyr Gln Gln95 100 105GAG GCG TCT AAA CTC CGG AGA CAG ATT CGG GAC ATT CAG AAT TTG AAC446Glu Ala Ser Lys Leu Arg Arg Gln Ile Arg Asp Ile Gln Asn Leu Asn110 115 120AGA CAC ATT CTT GGT GAA TCT CTT GGT TCC TTG AAC TTT AAG GAA CTC494Arg His Ile Leu Gly Glu Ser Leu Gly Ser Leu Asn Phe Lys Glu Leu125 130 135AAG AAC CTT GAA AGT AGG CTT GAG AAA GGA ATC AGT CGT GTC CGA TCC542Lys Asn Leu Glu Ser Arg Leu Glu Lys Gly Ile Ser Arg Val Arg Ser140 145 150 155AAG AAG CAC GAG ATG TTA GTT GCA GAG ATT GAA TAC ATG CAA AAA AGG590Lys Lys His Glu Met Leu Val Ala Glu Ile Glu Tyr Met Gln Lys Arg160 165 170GAA ATC GAG CTG CAA AAC GAT AAC ATG TAT CTC CGC TCC AAG ATT ACT638Glu Ile Glu Leu Gln Asn Asp Asn Met Tyr Leu Arg Ser Lys Ile Thr175 180 185GAA AGA ACA GGT CTA CAG CAA CAA GAA TCG AGT GTG ATA CAT CAA GGG686Glu Arg Thr Gly Leu Gln Gln Gln Glu Ser Ser Val Ile His Gln Gly190 195 200ACA GTT TAC GAG TCG GGT GTT ACT TCT TCT CAC CAG TCG GGG CAG TAT734Thr Val Tyr Glu Ser Gly Val Thr Ser Ser His Gln Ser Gly Gln Tyr205 210 215AAC CGG AAT TAT ATT GCG GTT AAC CTT CTT GAA CCG AAT CAG AAT TCC782Asn Arg Asn Tyr Ile Ala Val Asn Leu Leu Glu Pro Asn Gln Asn Ser220 225 230 235TCC AAC CAA GAC CAA CCA CCT CTG CAA CTT GTT TGATTCAGTC TAACATAAGC 835Ser Asn Gln Asp Gln Pro Pro Leu Gln Leu Val240 245TTCTTTCCTC AGCCTGAGAT CGATCTATAG TGTCACCTAA ATGCGGCCGC GTCCCTCAAC 895ATCTAGTCGC AAGCTGAGGG GAACCACTAG TGTCATACGA ACCTCCAAGA GACGGTTACA 955CAAA 959(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度246個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Glu Gly Gly Ala Ser Asn Glu Val Ala Glu Ser Ser Lys Lys Ile1 5 10 15Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn Arg20 25 30Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala Tyr35 40 45Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Val Ile Phe Ser50 55 60Thr Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ala Asn Asn Ser Val Arg Gly Thr65 70 75 80Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Cys Ser Asp Ala Val Asn Pro Pro Thr85 90 95Ile Thr Glu Ala Asn Thr Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ala Ser Lys Leu100 105 110Arg Arg Gln Ile Arg Asp Ile Gln Asn Leu Asn Arg His Ile Leu Gly115 120 125Glu Ser Leu Gly Ser Leu Asn Phe Lys Glu Leu Lys Asn Leu Glu Ger130 135 140Arg Leu Glu Lys Gly Ile Ser Arg Val Arg Ser Lys Lys His Glu Met145 150 155 160Leu Val Ala Glu Ile Glu Tyr Met Gln Lys Arg Glu Ile Glu Leu Gln165 170 175Asn Asp Asn Met Tyr Leu Arg Ser Lys Ile Thr Glu Arg Thr Gly Leu180 185 190Gln Gln Gln Glu Ser Ser Val Ile His Gln Gly Thr Val Tyr Glu Ser195 200 205Gly Val Thr Ser Ser His Gln Ser Gly Gln Tyr Asn Arg Asn Tyr Ile210 215 220Ala Val Asn Leu Leu Glu Pro Asn Gln Asn Ser Ser Asn Gln Asp Gln225 230 235 240Pro Pro Leu Gln Leu Val245(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置1..27(D)其他信息/注＝″引物AGL8 5-4″(xi)序列描述SEQ ID NO9CCGTCGACGA TGGGAAGAGG TAGGGTT 27(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)渚€性(ix)特性(A)名稱/要點(diǎn)misc_feature(B)位置1..20(D)其他信息/注＝″引物OAM14″(xi)序列描述SEQ ID NO10AATCATTACC AAGATATGAA 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO11CGGATAGCTC GAATATCG18(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO12AACATTGCGT CGTTTGC 17(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO13GTAATTACCA GGCAAGGACT CTCC 24(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO14GTCATCGGCG GGGGTCATAA CGTG 24(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO15GAGGATAGAG AACACTACGA ATCG 24(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO16CAGGTCAAGT CAATAGATTC 20(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO17CAGAATTTAG TGAATAATAT TG 22(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO18GCCAGAGATA ATGCTATTCC 20(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO23CATTGATCCA TATATGACAT CAC 23(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO20GTGATGTCAT ATATGGATCA ATGGGAAGAG GTAGGGTTCA G 41(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO21CAAGAGTCGG TGGAATATTC G21(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO22CGAATATTCC ACCGACTCTT GGTACGCTTC TCCTACTCTA T 41(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征
(A)長度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO23CTAATAAGTA AGATCGCGGA A21(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQ ID NO24TTCCGCGATC TTACTTATTA GCATGGAGAG GATACTTGAA C 4權(quán)利要求
1.一種非天然存在的、含有異位表達(dá)的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的種子植物，所述的種子植物具有遲發(fā)性種子散布的特性。
2.如權(quán)利要求1所述的非天然存在的種子植物，其中所述的AGL-8類的基因產(chǎn)物基本上具有AGL8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的非天然存在的種子植物，其中所述的AGL-8類的基因產(chǎn)物具有擬南芥屬AGL8的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。
4.如權(quán)利要求3所述的非天然存在的種子植物，其是轉(zhuǎn)基因種子植物。
5.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的異位表達(dá)的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子與一個(gè)外源調(diào)控因子可操縱相連。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的外源調(diào)控因子是組成型調(diào)控因子。
7.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的核酸分子包括與花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子可操縱相連的基本上編碼AGL8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列的外源核酸分子。
8.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的外源調(diào)控因子是熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子選自AGL1調(diào)控因子和AGL5調(diào)控因子。
10.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子是基本上編碼AGL8定向進(jìn)化同源物的氨基酸序列的外源核酸分子。
11.如權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的AGL-8類的基因產(chǎn)物具有擬南芥屬AGL8的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
12.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子是含有選自如下一組的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的AGL1調(diào)控因子SEQ ID NO3中第1至第2599位核苷酸；SEQ ID NO3中第2833至第4128位核苷酸；SEQ ID NO3中第4211至第4363位核苷酸；SEQ ID NO3中第4426至第4554位核苷酸；SEQ ID NO3中第4655至第4753位核苷酸；SEQ ID NO3中第4796至第4878位核苷酸；SEQ ID NO3中第4921至第5028位核苷酸；和SEQ ID NO3中第5421至第5682位核苷酸
13.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因種子植物，其中所述的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子是含有選自如下一組的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的AGL5調(diào)控因子SEQ ID NO4中第1至第1888位核苷酸；SEQ ID NO4中第2928至第5002位核苷酸；SEQ ID NO4中第5085至第5204位核苷酸；SEQ ID NO4中第5367至第5453位核苷酸；SEQ ID NO4中第5496至第5602位核苷酸；SEQ ID NO4中第5645至第5734位核苷酸；和SEQ ID NO4中第6062至第6138位核苷酸
14.如權(quán)利要求1所述的非天然存在的種子植物，其是熟裂型的種子植物。
15.如權(quán)利要求14所述的非天然存在的種子植物，其是十字花科的成員。
16.如權(quán)利要求14所述的非天然存在的種子植物，其是豆科成員。
17.一種非天然存在的、AGL1的表達(dá)和AGL5的表達(dá)都被抑制的種子植物，所述的種子植物具有遲發(fā)性種子散布的特性。
18.如權(quán)利要求17所述的非天然存在的種子植物，其是agl1agl5雙突變體。
19.來自非天然存在的種子植物的組織，所述的種子植物含有異位表達(dá)的編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子并具有遲發(fā)性種子散布的特性。
20.如權(quán)利要求19所述的組織，其是種子。
21.來自非天然存在的種子植物的組織，所述的種子植物中AGL1的表達(dá)和AGL5的表達(dá)都被抑制，所述的種子植物具有遲發(fā)性種子散布的特性。
22.如權(quán)利要求21所述的組織，其是種子。
23.產(chǎn)生非天然存在的具有遲發(fā)性種子散布的特性的種子植物的方法，包括在所述的種子植物中異位表達(dá)編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子，因而由于所述的核酸分子的異位表達(dá)種子散布被延遲。
24.一種基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，含有能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)的核苷酸序列，條件是該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子不具有SEQ ID NO4中的第1889至2703位核苷酸所構(gòu)成的核苷酸序列。
25.如權(quán)利要求24所述的基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，選自AGL1調(diào)控因子和AGL5調(diào)控因子。
26.如權(quán)利要求25所述的基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，其中AGL1調(diào)控因子含有選自下列一組的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸SEQ ID NO3中第1至第2599位核苷酸；SEQ ID NO3中第2833至第4128位核苷酸；SEQ ID NO3中第4211至第4363位核苷酸；SEQ ID NO3中第4426至第4554位核苷酸；SEQ ID NO3中第4655至第4753位核苷酸；SEQ ID NO3中第4796至第4878位核苷酸；SEQ ID NO3中第4921至第5028位核苷酸；和SEQ ID NO3中第5361至第5622位核苷酸
27.如權(quán)利要求25所述的基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，其中AGL5調(diào)控因子含有選自下列一組的核苷酸序列的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸SEQ ID NO4中第1至第1888位核苷酸；SEQ ID NO4中第2928至第5002位核苷酸；SEQ ID NO4中第5085至第5204位核苷酸；SEQ ID NO4中第5367至第5453位核苷酸；SEQ ID NO4中第5496至第5602位核苷酸；SEQ ID NO4中第5645至第5734位核苷酸；和SEQ ID NO4中第6062至第6138位核苷酸
28.一種含有熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子的植物表達(dá)載體。
29.產(chǎn)生具有遲發(fā)性種子散布的特性的轉(zhuǎn)基因種子植物的試劑盒，其包括熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子，該調(diào)控因子具有能使與其可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)的核苷酸序列，條件是該熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子不具有SEQ ID NO4中的第1889至2703位核苷酸所構(gòu)成的核苷酸序列。
30.如權(quán)利要求29所述的試劑盒，其中所述的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子與編碼AGL-8類的基因產(chǎn)物的核酸分子可操縱相連。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種非天然存在的種子植物,它由于編碼AGL－8類的基因產(chǎn)物的核酸分子的異位表達(dá)因而具有了遲發(fā)性種子散布的特性。本文還提供了一種非天然存在的種子植物,諸如agl1 agl5雙突變化,由于該種子植物中AGL－1和AGL－5表達(dá)的抑制因而它具有了遲發(fā)性種子散布的特性。本發(fā)明還提供了一種基本純化的熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子,它包括能使與之可操縱相連的核酸分子在種子植物的殼瓣邊緣或熟裂區(qū)域中選擇性表達(dá)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了用以生產(chǎn)具有遲發(fā)性種子散布的特性的轉(zhuǎn)基因種子植物的試劑盒,該試劑盒含有熟裂區(qū)域選擇性調(diào)控因子。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1271388SQ98808448
公開日2000年10月25日 申請(qǐng)日期1998年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月27日
發(fā)明者馬丁·F·亞諾夫斯基, 克里斯蒂娜·費(fèi)蘭迪斯 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)