專利名稱：植物的延遲衰老和逆境耐力的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景技術(shù)許多高等植物在它們生命周期的某些階段會遭受至少暫時的相對水分缺失，因此，進化了一些干燥保護機能。然而，如果水分缺失的變化狀態(tài)延長，對植物生長和發(fā)育的影響就會很大。由于干旱，寒冷或鹽度逆境造成的水分缺失會不可恢復(fù)地損失植物細胞，限制植物生長及農(nóng)業(yè)作物產(chǎn)量。
對干旱，鹽度及寒冷不利條件反應(yīng)，植物會有一些形態(tài)上和生理上的變化。盡管我們對植物對于這些逆境耐力機能了解是不完整的，但植物激素落葉酸(ABA)已被提議為環(huán)境刺激與植物反應(yīng)間的重要介質(zhì)。對水分缺失反應(yīng)，ABA含量增加，外源使用的ABA模擬許多種通常由水分缺失誘發(fā)的反應(yīng)。一旦ABA合成，它會引起葉子氣孔關(guān)閉，從而減少蒸發(fā)造成的水分損失。
對將ABA傳導(dǎo)到細胞反應(yīng)的基因的確定，開拓了利用這些調(diào)節(jié)基因增強農(nóng)作物物種干旱耐力的可能。一般地，這些ABA信號基因可與適當(dāng)?shù)目刂埔蜃优悸?lián)以最優(yōu)化植物的生長和發(fā)育。這樣，這些基因不僅僅使農(nóng)作物遺傳改性(tailoring)可抵擋暫時的環(huán)境侵害，它們還可拓寬傳統(tǒng)農(nóng)作物可生長的環(huán)境。
此外，有關(guān)控制植物生長和發(fā)育的遺傳機理幾乎不被了解。進一步影響其他代謝過程如植物的衰老和生長習(xí)性的基因可應(yīng)用在多種農(nóng)作物和園藝植物中。
本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及編碼包括SEQ ID NO:1的法呢基轉(zhuǎn)移酶(Farnesyl Transferase)的分離的核酸。本發(fā)明包括的核酸還有編碼SEQ ID NO:1的功能等同物的雜交序列。本發(fā)明還涉及使用由這些核酸編碼的產(chǎn)品的抑制劑來增強植物的干旱耐力的方法。另外，本發(fā)明涉及控制光合成有機體內(nèi)的調(diào)節(jié)功能；如控制這樣有機體的生長習(xí)性，開花，種子制備，種子發(fā)芽，和衰老。
本發(fā)明還涉及通過改變編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶(Ftase)蛋白質(zhì)或其功能等同物的分離或重組核酸來增強植物干旱耐力的方法。當(dāng)這樣的雜交序列編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的功能等同物時，與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶基因(ERA1)雜交的核酸也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明還涉及通過對ERA1基因和其功能等同物的基因處理改進農(nóng)作植物的逆境耐力，來增強植物的干旱耐力的方法。失去ERA1基因功能，就給成熟植物帶來了增強的干旱耐力。失去法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的ERA1突變基因的特性顯示，抑制法呢基作用增強了植物的ABA反應(yīng)。
進一步，本發(fā)明涉及通過抑制法呢基轉(zhuǎn)移酶活性，抑制光合成有機體的衰老。產(chǎn)物光合有機體可保持綠色，組織生存能力維持更長的時間。這樣，提供常綠植物及延緩衰老的方法也是本發(fā)明的一部分。
在另一個具體實施中，提供了改變植物生長習(xí)性和促進開花的方法。在特殊環(huán)境條件下失去ERA1基因功能會使植物生長的側(cè)枝數(shù)量減少，每個開花期花朵數(shù)量增加。
本發(fā)明還涉及用于植物細胞基因工程的調(diào)節(jié)序列，以提供控制與這種新型調(diào)節(jié)序列聯(lián)接的DNA序列表達的組織模式的方法。
圖2是ERA1蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
圖3A-3B表示ERA1啟動子的核酸序列(SEQ ID NO:3)。
圖4是擬南芥[Arabidopsis(Arab.)](SEQ ID NO:2)β-亞單元法呢基作用域和豌豆(SEQ ID NO:4)，酵母(SEQ ID NO:5)和鼠(SEQ ID NO:6)β-亞單元法呢基作用域的氨基酸序列。與擬南芥序列相同的殘基用點標(biāo)出。破折號表示空白。擬南芥基因的氨基酸位置標(biāo)在右手邊。
圖5是eral-轉(zhuǎn)化的擬南芥植物(右)與野生型(對照物，如自然生長的)植物(左)在非常干燥的條件下的對比照片。
圖6是失活的或突變法呢基轉(zhuǎn)移酶活性(M.Columbia,eral-2)的擬南芥植物與對照物(M.C.對照物，era 1-2對照物)的水含量對比圖。
圖7是失活的或突變法呢基轉(zhuǎn)移酶活性(M.Columbia,eral-2)的擬南芥植物與對照物(M.C.對照物，era 1-2對照物)的水失去速率對比圖。
圖8是對照物(野生型)和era-2突變植物的老葉對比。
圖9是對照物(野生型)和era-2突變植物老葉的轉(zhuǎn)錄水平對比。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及改變植物生長、繁殖和衰老的分離核酸和由這些核酸編碼的蛋白質(zhì)。具體地，本發(fā)明的構(gòu)建物包括編碼含SEQ IDNO:1的法呢基轉(zhuǎn)移酶(Ftase)多肽或其功能等同物的分離的核酸，和由這些核酸編碼的法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽或蛋白質(zhì)。特別是，本發(fā)明涉及其中序列是SEQ ID NO:2的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中還包括核酸構(gòu)建物，其中包括與含SEQ ID NO:1分離核酸、或其功能等同物、或兩者中任何一個的互補體可工作地聯(lián)接的啟動子(ERA1啟動子)。當(dāng)摻入到植物中時，ERA1啟動子在植物保衛(wèi)細胞內(nèi)被調(diào)節(jié)，可影響通過氣孔的水分失去。這種啟動子由含SEQ ID NO:3(圖3)的核酸構(gòu)成。
摻入這些構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物、種子、植物細胞和組織也是本發(fā)明的一部分。因此，本發(fā)明的一方面是，提供一種制備基因產(chǎn)品方法，在主要于保衛(wèi)細胞內(nèi)工作的啟動子的控制下，通過在植物細胞內(nèi)對編碼基因產(chǎn)品的基因進行表達來實現(xiàn)，該方法包括步驟用包括含SEQ ID NO:3或其功能部分的調(diào)節(jié)區(qū)域，含編碼基因產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)基因的DNA，和含多腺苷化區(qū)域的3’非翻譯區(qū)域的DNA構(gòu)建物來轉(zhuǎn)化植物細胞；從細胞再生植物、光合成有機體或組織培養(yǎng)物；將植物、光合成有機體或組織培養(yǎng)物置于使啟動子誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄及基因產(chǎn)品表達的條件下。
在本篇公開的上下文中，“調(diào)節(jié)區(qū)域”和“啟動子”是指DNA的序列，通常處于結(jié)構(gòu)基因編碼序列的上游(5’)，其通過為RNA聚合酶提供識別和結(jié)合位置，和/或為在正確位置開始轉(zhuǎn)錄提供所需要的因素，來控制編碼區(qū)域的表達?！肮δ懿糠帧被颉肮δ芷巍笔侵副景l(fā)明的啟動子的截斷序列，其在描述的法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)活性條件下，維持誘導(dǎo)ERA結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的能力。
本文所描述的構(gòu)建物和方法可適用于所有類型的植物和其他光合成有機體，包括但不限于被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)，裸子植物，帶孢子的或營養(yǎng)性再生的植物和藻類，包括藍(藍-綠藻類)。特別推薦的植物是那些提供商業(yè)價值的農(nóng)作物，如玉米，小麥，棉花，稻米，canola，甘蔗，甜菜，向日葵，土豆，番茄，椰菜，胡蘿卜，萵筍，蘋果，棕櫚，橙子，檸檬，玫瑰等等。
進一步，本發(fā)明的構(gòu)建物和方法還適用于植物的任何植物部分、原生質(zhì)體、或組織培養(yǎng)物，其中組織是從光合成有機體獲得的?！爸参锊糠帧币庵赴墚a(chǎn)生再生植物的部分植物。較好的植物部分包括根和椏枝和它們的分生部分。本發(fā)明包括的其他植物部分有葉子，花，種子，上胚軸，子葉下軸，子葉，子葉節(jié)點，移植體，花粉，胚珠，分生或胚胎組織，原生質(zhì)體，等等。轉(zhuǎn)基因植物可從任何這些植物部分包括組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體再生，并且也可從移植體再生。具體方法根據(jù)植物物種的不同而變化。
本發(fā)明涉及包括編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的分離核酸(DNA和RNA)和其光合成有機體部分的組合物和構(gòu)建物。本發(fā)明進一步涉及包括編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶啟動子的分離的核酸的組合物和構(gòu)建物。具體地，編碼擬南芥法呢基轉(zhuǎn)移酶β亞單元的ERA1基因，和調(diào)節(jié)ERA1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列已被分離和測序。編碼光合成有機體法呢基轉(zhuǎn)移酶的核酸，和這些核酸的同源物和同類物也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明進一步涉及使用分離的和/或重組的核酸(DNA和RNA)的方法，核酸的特點在于它們與(a)編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)或多肽，如含序列SEQ ID NO:1的核酸雜交，或與(b)部分前述物，如含編碼功能法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)所需的最小核苷酸的部分雜交的能力；或其編碼含法呢基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列的多肽(如SEQ ID NO:2，或編碼其功能等同物；如含與SEQ IDNO:2至少80％相同序列的多肽，當(dāng)摻入到植物細胞內(nèi)時，可用如SEQ ID NO:1相同的方式促進光合成有機體的生長習(xí)性，種子發(fā)芽，和新陳代謝)的能力。因此，法呢基轉(zhuǎn)移酶的功能等同物，應(yīng)含與由SEQ ID NO；2編碼的多肽至少80％相同的氨基酸序列，具有與由SEQ ID NO；2編碼的多肽相同特點，或用與由SEQ ID NO；2編碼的多肽基本上相同的方法工作。與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽如SEQ ID NO:2的核酸雜交的核酸可以是雙鏈的，或是單鏈的。與DNA如含序列SEQ ID NO:1的DNA的雜交作用，包括與所顯示出的鏈的雜交，以及與其互補鏈的雜交。
在一個具體實施中，法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽如SEQ ID NO:2，和其功能等同物之間氨基酸序列的相同率為至少約60％。在一個較好的具體實施中，法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽和其功能等同物之間氨基酸序列的相同率為至少約75％(≥75％)。更好地，法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽和其功能等同物之間氨基酸序列的相同率為至少約80％，還要好地是，當(dāng)比較連續(xù)的氨基酸序列時，相同率為至少約90％。
符合這些標(biāo)準(zhǔn)的分離的和/或重組的核酸包括，與天然的ERA1基因或其部分基因、或天然的基因的變異體含相同序列的核酸。這樣的變異體包括通過添加、刪除或替代一個或多個核苷酸而不同的突變體，其中一個或多個核苷酸被修飾的修飾核酸(如DNA,RNA的類似物)的突變體，及包含一個或多個修飾核苷酸的突變體。
這樣的核酸，包括DNA和RNA，可通過在高度嚴緊條件或中度嚴緊條件下的雜交進行檢測和分離，如選出不允許含非互補序列的核酸進行雜交的核酸。雜交的“嚴緊條件”是本領(lǐng)域的術(shù)語，是指溫度和緩沖液濃度條件允許一種特定的核酸與另一種核酸雜交，其中第一種核酸可能與第二種核酸完全互補，或第一種和第二種核酸可能共有比完全互補少的一定程度的互補。如，某些高度嚴緊條件可以用來從互補性小的核酸中將完全互補核酸區(qū)分出來。核酸雜交的“高度嚴緊條件”和“中度嚴緊條件”在《現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊》(Ausubel,F.M.et al.,eds.,Vol.1，包括補充部分至補充29,1995)6.3.1-6頁和2.10.1-2.10.16頁上作了解釋。決定嚴緊雜交的確切條件不僅僅取決于離子濃度，溫度和脫穩(wěn)定劑如甲酰胺濃度，還取決于其他因素如核酸序列長度，堿基組合，雜交序列之間的誤配率，和在其他非一致序列內(nèi)那種序列小分子團的出現(xiàn)頻率。這樣，高度或中度嚴緊條件可以經(jīng)驗確定。
高度嚴緊雜交過程可以(1)使用低離子濃度和高溫進行淋洗，如0.015MNaCl/0.0015M檸檬酸鈉，pH7.0(0.1xSSC)和0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS),50℃；(2)雜交期間使用50％(體積/體積)甲酰胺和5xDenhardt溶液(0.1％重量/體積高度提純的牛血清清蛋白/0.1％重量/體積Ficoll/0.1％重量/體積聚乙烯基吡咯烷酮),50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5和5xSSC,42℃；或(3)雜交使用50％甲酰胺，5xSSC,50mM磷酸鈉(pH6.8),0.1％焦磷酸鈉，5xDenhardt溶液，超聲波降解的鮭魚精液DNA(50μg/ml),0.1％SDS，和10％右旋糖苷硫酸鹽，42℃，在42℃用0.2xSSC和0.1％SDS淋洗。除了雜交使用25％甲酰胺替換50％甲酰胺，中度嚴緊條件的其它方面是相同的。
通過改變雜交條件，從沒有雜交發(fā)生的嚴緊程度到第一次觀察到雜交發(fā)生的程度，使給定序列能與樣品中最相似序列雜交的條件可以被確定。
示例條件在Krause,M.H.和S.A.Aaronson的(1991)《酶學(xué)中的方法》,200∶546-556中作了描述。同樣，參閱《當(dāng)代分子生物學(xué)手冊》(咄處同上)中2.10.11頁，其中描述了如何確定中度或低度嚴緊條件的淋洗條件。淋洗是這樣一種步驟，其中通常設(shè)定的條件是為了確定雜交體之間的最小程度的互補性。一般，對于任何選取的SSC濃度，從僅有同源雜交發(fā)生的最低溫度，雜交核酸間的1％誤配會導(dǎo)致解鏈溫度Tm降低1℃。通常，加倍SSC濃度會使Tm增加約17℃。利用這些準(zhǔn)則，根據(jù)查尋的誤配程度，可經(jīng)驗性地確定中度或低度嚴緊雜交的淋洗溫度。
以(a)與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽的核酸，如SEQ ID NO:1描述的核酸雜交，(b)與SEQ ID NO:1的互補序列雜交，(c)與部分(a)和(b)(如在高度和中度嚴緊條件下)雜交的能力為特征的分離的和/或重組的核酸，還可進一步編碼含有至少一種法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽功能特性的蛋白質(zhì)或多肽，如晝夜光照循環(huán)下調(diào)節(jié)側(cè)分枝，或調(diào)節(jié)對ABA的反應(yīng)，或調(diào)節(jié)衰老。
在確定和/或分離編碼多肽如含氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽或這種多肽的功能等同物的核酸的過程中，還可以使用酶學(xué)檢測，互補檢測，或其他適當(dāng)?shù)姆椒?。由雜交核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽的抗原屬性可以通過免疫法使用與法呢基多肽結(jié)合的抗體來確定，如免疫印跡法，免疫沉淀法，放射免疫測定法。PCR方法，包括RAGE(基因組DNA末端快速擴增法)，也可用來篩查和探測編碼類-法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)和多肽的核酸的存在，并協(xié)助從基因組DNA中克隆出這樣的核酸。適用于此的PCR方法可在Innis,M.A.，等人的《PCR手冊》(Innis,M.A.,et al.,(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,San Diego,CA)中找到。
本文所描述的核酸使用在本發(fā)明的方法中，以制備摻入細胞、組織、植物部分、植物和其他光合成有機體內(nèi)的蛋白質(zhì)和多肽。在一個具體實施中，含有全部或部分法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽編碼序列的DNA，或與含序列SEQ ID NO:2的DNA雜交的DNA，被引入到在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎麅?nèi)對被編碼的多肽進行表達的載體中。包含法呢基轉(zhuǎn)移酶亞單元或其功能等同物的被編碼的多肽具有法呢基轉(zhuǎn)移酶活性。本文中所用的“載體”指一種核酸分子，能轉(zhuǎn)運與其已聯(lián)接的其他核酸。
包含20個或更多個上述核酸的鄰接核苷酸的引物和探針也是本發(fā)明所包括的一部分。這樣，本發(fā)明的一種核酸包括約20個到約200個或更多個核苷酸的特殊序列，其與編碼法呢基蛋白質(zhì)DNA或轉(zhuǎn)錄的mRNA的核苷酸特異序列相同或互補。這些引物和探針可用來在其他光合成有機體中識別和分離編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的核酸。
本文所稱為“分離的”核酸是從它們的原始來源(如當(dāng)存在于細胞中或核酸混合物中如文庫中)的基因組DNA或細胞RNA的核酸中分離出來的核酸，并可能進行進一步的加工。“分離的”核酸包括用本文描述的方法、類似的方法、以及其它的適宜的方法所獲得的核酸，包括幾乎純的核酸，化學(xué)合成制備的核酸，通過生物和化學(xué)方法制備的核酸，分離的重組體核酸。本文所稱為“重組體”核酸是用重組DNA方法制備的核酸，包括那些用人工重組方法制備的核酸，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和/或使用限制酶克隆到載體內(nèi)?！爸亟M體”核酸還有那些通過細胞天然機能發(fā)生的重組事件中產(chǎn)生的核酸，但在為所需重組事件發(fā)生或可能發(fā)生而設(shè)計的核酸被引入細胞中后進行選取。編碼具有某種功能的多肽的部分分離核酸可用如Jasin,M.等人的美國專利第4,952,501號中的方法進行識別和分離。
本發(fā)明的另一個具體實施是全部或部分與含有義鏈的靶分子互補，并能與靶分子雜交的反義核酸或寡聚核苷酸。靶分子可以是DNA，或其相對的RNA(如其中DNA的T殘基相對RNA的U殘基)。當(dāng)引入細胞時，反義核酸和寡聚核苷酸可抑制有義鏈編碼基因的表達或從有義鏈轉(zhuǎn)錄的mRNA的表達。反義核酸可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。參閱，如Shewmaker等人的美國專利第5,107,065號。
在一個具體實施中，反義核酸或寡聚核苷酸全部或部分與靶核酸(DNA或RNA)互補，并能雜交，其中靶核酸能與含SEQ IDNO:1鏈互補序列的核酸雜交。如反義核酸或寡聚核苷酸可以與含如SEQ ID NO:1的開放讀框鏈所示序列的靶核酸互補，或與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶功能等同物的核酸互補，或與足夠允許雜交的部分這些核酸互補。部分核酸，如16個核苷酸的序列足夠抑制蛋白質(zhì)的表達。含與SEQ ID NO:1互補的25個或更多個連續(xù)核苷酸的片段也可被使用?；蛘撸cERA1基因的5’或3’非翻譯區(qū)域，或重疊翻譯起始密碼子(5’未翻譯的和翻譯的區(qū)域)，或編碼功能等同物的基因互補的核酸或寡聚核苷酸也是有效的。在另一個具體實施中，反義核酸與編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽的靶核酸全部或部分互補并與之雜交。
除了本發(fā)明的反義核酸，還可構(gòu)建寡聚核苷酸，其與基因中或轉(zhuǎn)錄DNA∶RNA復(fù)合體中的復(fù)式核酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的含三重螺旋體或三聯(lián)核酸，抑制編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶多肽或其等同物的基因的表達和/或轉(zhuǎn)錄。參見Frank-Kamenetskii,M.D.和Mirkin,S.M在《生物化學(xué)回顧年刊》的文獻[Frank-Kamenetskii,M.D.andMirkin,S.M.(1995)Ann.Rev.Biochem.64∶65-95]。本發(fā)明的這種寡聚核苷酸的構(gòu)建是采用三重螺旋形成的堿基配對原則和法呢基轉(zhuǎn)移酶mRNA或基因的核苷酸序列。這些寡聚核苷酸可以用一些方式阻礙法呢基轉(zhuǎn)移酶類的活性，如預(yù)防ERA1基因轉(zhuǎn)錄，或當(dāng)它被基因轉(zhuǎn)錄時與mRNA結(jié)合。
本發(fā)明還涉及如本文所描述的新型核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是分離的和/或是重組體。本文稱作“分離的”蛋白質(zhì)或多肽是指提純到超過它們在細胞中存在的程度的蛋白質(zhì)或多肽。在一個較好的具體實施中，它們至少是10％純度；如充分提純的?！胺蛛x的”蛋白質(zhì)或多肽包括用下文描述的方法，相似的方法，或其他適當(dāng)方法獲得的蛋白質(zhì)或多肽，包括基本上純的蛋白質(zhì)和多肽，用化學(xué)方法或用生物及化學(xué)結(jié)合的方法合成的蛋白質(zhì)或多肽，和分離的重組體蛋白質(zhì)或多肽。本文稱作“重組體”蛋白質(zhì)或多肽是指由重組體核酸表達制備的蛋白質(zhì)或多肽。
在一個較好的具體實施中，蛋白質(zhì)或其部分至少具有一種法呢基轉(zhuǎn)移酶功能特性；如，影響正常例分枝，花/花序，種子發(fā)芽，或氣孔張開，結(jié)合功能，和/或抗原功能(如，結(jié)合的抗體也與自然產(chǎn)生的法呢基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合)的催化活性。因此，這些蛋白質(zhì)被稱作植物來源法呢基轉(zhuǎn)移酶，包括如天然的法呢基轉(zhuǎn)移酶，這些蛋白質(zhì)和/或其部分的變異體(如突變體)。這樣的變異體包括由于添加、刪除或替代一個或多個氨基酸殘基而不同的突變體，或其中一個或多個殘基被修飾的修飾多肽，含一個或多個修飾殘基的突變體。
本發(fā)明還涉及如上所述的法呢基轉(zhuǎn)移酶的分離和/或重組體部分，特別是法呢基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的β-亞單元?？芍苽浔旧砭哂腥炕虿糠止δ艿牟糠置?，或當(dāng)部分酶混合時(全部地，部分地，或僅為非功能地)，自然與一個或多個其他多肽裝配，重新組成含至少一種本發(fā)明法呢基轉(zhuǎn)移酶功能特性的功能蛋白質(zhì)。
被ABA誘導(dǎo)的一些基因已確定。這說明不利環(huán)境條件的ABA-誘導(dǎo)的耐力是復(fù)雜的多基因事件。這樣，識別及轉(zhuǎn)移信號基因進入農(nóng)作植物中，由于對ABA反應(yīng)的增加，以改進植物在不同環(huán)境條件下的生存能力，這是很新潁的并且非常有用。
為了識別可能是ABA-調(diào)節(jié)植物過程的全局控制物的基因，在一些植物物種中使用基因篩查，以分離改變植物對激素反應(yīng)的突變。
增強擬南芥種子對ABA(era)反應(yīng)的突變，可通過它們在通常使野生型植物(對照物，如自然生長的)種子發(fā)芽的低濃度ABA下能預(yù)防種子發(fā)芽來確定。其中，era1突變類型，其包括一種轉(zhuǎn)運DNA(T-DNA)系(era1-1，生態(tài)型Wassilewskija)和兩種中子-產(chǎn)生的突變(era1-2,era1-3，生態(tài)型Columbia)，因為這種era1突變類型在正常吸收后作用下顯示降低的發(fā)芽率，所以引起更多的關(guān)注。一般來講，增強ABA反應(yīng)的突變應(yīng)是休眠更深的。通過4天的冷凍處理，era等位基因的休眠減弱；隨著種子冷凍時間增長，era1發(fā)芽率增加。在許多植物物種中，打破休眠發(fā)芽需要進行春化處理并曝露在濕潤低溫環(huán)境下一段時間(Baskin和Baskin,1971)。Era突變的發(fā)芽情況可反映出ABA-誘導(dǎo)休眠的增加狀況。因此，這些種子發(fā)芽需要較長時間的春化處理。對這種論點的支持來自era的ABA生物合成突變體(abi1-1)和不敏感突變體(abi1-1和abi3-6)的雙突變體構(gòu)建物。在所有情況中，與era1相比，雙突變體減緩了休眠程度，說明在era1種子中觀察到的增強的休眠取決與ABA的合成或敏感性。
除了拓寬新ABA反應(yīng)突變體的型譜，超敏感性篩查也用來識別ABA敏感性的負調(diào)節(jié)基因。也就是，對這些基因功能抑制增強了ABA反應(yīng)。這些基因中的一種(ERA1)已被克隆并顯示編碼異源二聚蛋白質(zhì)法呢基轉(zhuǎn)移酶(Ftase)的β-亞單元(Cutler等人，1996)。T-DNA插入產(chǎn)生的era1-1突變，使得插入點側(cè)翼植物基因組區(qū)域可被分離。使用側(cè)翼區(qū)域作為探針，野生型cDNA和基因組克隆體被分離。對這些進行序列分析顯示了含3.5kb基因組DNA的基因。這種基因含13個內(nèi)含子，在

圖1A-1C中以下劃線標(biāo)出，T-DNA在era1-1中的插入位置在內(nèi)含子8中。對用EralcDNA探測的野生型DNA,era1-2，和era1-3進行Southern(DNA)分析顯示，兩個快速-中子等位基因含有跨越ERA1位點的刪除?？焖?中子突變形成誘導(dǎo)擬南芥中的小型刪除(Shirley等人，1992)，隨后用14-kb探針進行跨越ERA1位點的基因組分析，確定era1-2的刪除大小約為7.5 kb,era1-3的刪除稍大些。這樣，全部三個era1等位基因在相同位點含有DNA中斷，證實了ERA位點的同一性。
在ERA基因中最長的開放讀框(404氨基酸)的概念上的翻譯，產(chǎn)生與酵母，豌豆，和哺乳動物蛋白質(zhì)法呢基轉(zhuǎn)移酶β-亞單元基因序列高度相似性的蛋白質(zhì)(圖2和圖4)(Goodman等人，1988；Chen等人，1991；Yang等人，1993)。法呢基轉(zhuǎn)移酶由α和β亞單元構(gòu)成，二元聚合形成酶，催化法呢基焦磷酸酯(15個碳)與含COOH-終端CaaX基元序列的蛋白質(zhì)裝配(Schafer和Rine,1992)，其中C指的是半胱氨酸殘基，aa一般為脂族氨基酸，X可指的是半胱氨酸，絲氨酸，蛋氨酸，谷氨酸殘基。植物β亞單元的兩種基因在鄰近COOH終端都含有約50個氨基酸的區(qū)域，在酵母和動物β亞單元基因中不含。
在酵母和哺乳動物系統(tǒng)中，法呢基轉(zhuǎn)移酶修飾幾種膜定位信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)。這是通過法呢基轉(zhuǎn)移酶將親脂性法呢基側(cè)鏈裝配到蛋白質(zhì)靶標(biāo)上完成的。裝配法呢基基團使靶標(biāo)的整體疏水性發(fā)生變化，使得蛋白質(zhì)錨定在通常它與其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互作用的膜中。在era1突變體中失去法呢基活性，導(dǎo)致種子對ABA反應(yīng)增強，這說明在擬南芥中的靶蛋白質(zhì)一定位于膜內(nèi)以削弱ABA信號。這樣，在擬南芥中的法呢基化可被認為是ABA敏感性的負調(diào)節(jié)基因的正常功能所必需的。
隨后的研究顯示在擬南芥中ERA1基因功能的失去，增強了成熟植物對環(huán)境逆境的耐力。如，在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下，比較在土壤中成長的野生型植物和era1突變體植物(24小時光照，150μE m-2sec-1,30％濕度)顯示，突變體不象野生型植物一樣為了維持生存頻繁需要澆水(圖5)。當(dāng)突變體和野生型植物成長到開花時，停止?jié)菜?，觀察植物隨后每天的逆境跡象。與野生型植物相比，突變體植物中的水分失去顯著降低(圖6和圖7)。
為了確定所觀察的era突變體增加的干旱耐力是否與ERA1基因功能有關(guān)，構(gòu)建含融合到報告基因GUS基因的ERA1啟動子的轉(zhuǎn)基因植物(通過將5kb ERA1啟動子片段插入到無啟動子的GUS T-DNA質(zhì)粒中制備)。分析轉(zhuǎn)基因植物顯示ERA1轉(zhuǎn)錄表達在擬南芥的表皮組織中，這種表達是保衛(wèi)細胞特異性的。ERA1表達也在植物分生組織和根須中記錄到。ERA1的保衛(wèi)細胞表達與突變體的干旱耐力相一致，因為這些細胞是植物水分蒸發(fā)的主要調(diào)節(jié)細胞?？梢哉J為ERA1-調(diào)節(jié)的氣孔傳導(dǎo)率需要ERA1基因在保衛(wèi)細胞中的表達。因此ERA1基因功能的失去產(chǎn)生對ABA有更強反應(yīng)的保衛(wèi)細胞，這樣，就產(chǎn)生更強的對干旱反應(yīng)的保衛(wèi)細胞調(diào)節(jié)作用。因此，在高等植物中修飾法呢基轉(zhuǎn)移酶表達或活性，特別是農(nóng)作植物，會對植物中的氣孔傳導(dǎo)率和蒸發(fā)速率有很大的影響。
在擬南芥中的era1突變特性說明，抑制法呢基作用會增強植物中的ABA反應(yīng)及農(nóng)作物物種中這種酶活性的改變。對農(nóng)作植物中法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的抑制可通過一些方法完成。如，不同農(nóng)作物物種的同類ERA1基因的反義技術(shù)可用來減弱法呢基轉(zhuǎn)移酶活性，這樣增強干旱耐力。通過特異制備保衛(wèi)細胞內(nèi)的ERA1的反義RNA，可將合成的法呢基轉(zhuǎn)移酶的量減到可模擬era突變體顯型的程度。ERA1啟動子的調(diào)節(jié)，發(fā)生在從椏枝分生組織到根須的一些不同組織內(nèi)。通過確定使ERA1啟動子在特異組織表達的要素，使制作僅適合一種組織或細胞類型，如保衛(wèi)細胞的反義ERA1表達成為可能。
在植物中抑制法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的另一種方法是，在轉(zhuǎn)基因植物中制備法呢基作用的特異肽抑制劑。在哺乳動物和酵母系統(tǒng)中，使法呢基基團裝配到特異蛋白質(zhì)上的羧基終端靶序列(CaaX，其中C=半胱氨酸，x=脂族，X=任何氨基酸)已清楚確定。模擬這些靶序列的肽已被制備，并顯示在這些系統(tǒng)中抑制內(nèi)源靶蛋白質(zhì)的法呢基作用。并且，CAIM在擬南芥活體內(nèi)是法呢基化的。這樣，類似的抑制劑可于高等植物以競爭抑制活體內(nèi)法呢基轉(zhuǎn)移酶。此外，這也可通過在轉(zhuǎn)基因植物中表達抑制劑肽完成，通過合成CaaX肽的DNA序列并將其融合到保衛(wèi)細胞特異啟動子內(nèi)。在這兩種方法中，使用適當(dāng)?shù)膯幼樱商禺愋缘匕兄泻涂刂品戳x法呢基轉(zhuǎn)移酶或肽抑制劑。
這樣，本發(fā)明提供了一種制備耐干旱植物的方法，其包括制備包括可與含有或編碼SEQ ID NO:1反義序列的核酸，或與含有反義序列功能等同物的核酸可工作聯(lián)接的啟動子的核酸構(gòu)建物；將核酸構(gòu)建物插入到載體中；用載體轉(zhuǎn)化植物，組織培養(yǎng)物，或植物細胞；培養(yǎng)植物或從組織培養(yǎng)物或植物細胞再生植物；其中，制備了耐干旱植物。可使用這種方法的情況是，其中核酸是從下列基團中選取的，含25-100個或更多個與SEQID NO:1互補的連續(xù)核苷酸基團，含25個或更多個SEQ ID NO:1的連續(xù)核苷酸或其互補體的寡聚核苷酸，或編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑肽的核酸。
除了對ABA非常敏感的氣孔調(diào)節(jié)外，era植物還表現(xiàn)出在干旱條件下延遲衰老現(xiàn)象，說明法呢基作用負調(diào)節(jié)擬南芥內(nèi)的一些干旱誘導(dǎo)反應(yīng)。在正常實驗室條件下生長的era植物用更長的時間變黃。在野生型植物衰老死亡后，突變體植物長時間保持綠色并存活。Era突變體植物的離體葉子不象野生型植物的離體葉子一樣快速變黃(圖8)。將發(fā)育相同的大小相似的野生型植物和era植物葉子取下，并置于含瓊脂的陪替氏培養(yǎng)皿上(參閱實例7)。通常，野生型葉子在約5天后失去葉綠素并最終脫色。突變體植物葉子保持綠色兩倍長的時間。因為葉子持續(xù)與瓊脂接觸，它們不是在干旱逆境中，說明era1突變體的減緩衰老不是干旱誘導(dǎo)現(xiàn)象。
另外，在10小時白天/16小時夜晚循環(huán)下，植物生命周期可以是野生型植物的兩倍(3個月)。因此，看來era突變體中葉綠素換新率和衰老信號被改變了。如，野生型植物和突變體植物在充分水分條件下在罐中培養(yǎng)到發(fā)育階段，野生型植物葉子開始衰老(約在花發(fā)育階段)。在這個時候，通過Northnern印跡分析對發(fā)育相同的葉子進行衰老誘導(dǎo)標(biāo)記基因檢測(實例8)。兩種基因，SAG12和SAG13，它們通常在野生型植物衰老期間基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄被誘導(dǎo)，但在era1突變體中不被誘導(dǎo)(圖9)。并且，保持CAB轉(zhuǎn)錄(圖9)。綜合起來，這些結(jié)果說明在era1突變體中的衰老誘導(dǎo)程序與野生型植物相比被延遲了，表示即使在水分逆境不是環(huán)境因素的條件下，法呢基作用活性的降低也會遲滯植物的衰老誘導(dǎo)。
除了對衰老和水分失去的影響，當(dāng)在晝夜光照循環(huán)下培養(yǎng)時，era1突變體顯示出在分枝和開花習(xí)性上的不同。在連續(xù)光照下(24小時光照/天)，突變體的分枝模式與野生型植物沒有不同。然而，當(dāng)給予一定的黑暗時間時，突變體不象野生型植物一樣產(chǎn)生許多側(cè)枝。測量的結(jié)果是，與每株野生型植物產(chǎn)生3.6個側(cè)枝相比，每株法呢基作用活性失去的植物僅產(chǎn)生2.4個側(cè)枝。這表示每株植物減少30％的側(cè)枝。
開花也受法呢基轉(zhuǎn)移酶活性失去的影響。每株缺少法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的植物(25-30個花蕾/花序)比每株野生型植物(10-15個花蕾/花序)產(chǎn)生更多的花。這樣，突變體上的花蕾平均是野生型植物上的兩倍。
缺失一定功能的era1突變體對整體植物發(fā)育的這些多效影響說明，ERA1基因可以是一些植物發(fā)育功能的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)基因。
直到現(xiàn)在，在高等植物中還沒有法呢基作用的功能已被了解，包括ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。法呢基轉(zhuǎn)移酶已在許多高等植物如番茄和豌豆中發(fā)現(xiàn)，所以這種酶具有跨越物種界限的功能這一點很清楚。并且，法呢基轉(zhuǎn)移酶靶肽的過量產(chǎn)生或使用法呢基作用抑制劑可完全抑制哺乳動物和酵母系統(tǒng)中的法呢基轉(zhuǎn)移酶。這樣，同樣的抑制劑可使用在高等植物上以抑制活體內(nèi)法呢基轉(zhuǎn)移酶。在兩種情況中使用適當(dāng)?shù)膯幼?，可特異地靶中及控制反義法呢基轉(zhuǎn)移酶或肽抑制劑。
法呢基作用缺失突變體對外源植物生長素也是超敏感的。這些突變體表現(xiàn)出分枝減少及在分裂組織中較小的變化，可用改變植物生長素的調(diào)節(jié)作用來解釋。這樣，其他激素功能在這種突變體中受到影響，這說明除了ABA途徑，其他激素調(diào)節(jié)途徑也受法呢基轉(zhuǎn)移酶活性控制。這些結(jié)果顯示ERA1基因提供分子機能以協(xié)調(diào)不同激素信號分子的調(diào)節(jié)作用。
根據(jù)本發(fā)明，包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的植物有植物界中的高等植物和低等植物。成熟植物、秧苗和種子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。成熟植物包括秧苗后發(fā)育的任何階段的植物。秧苗是非常年幼，在發(fā)育早期的未成熟植物。本發(fā)明也提供植物部分，原生質(zhì)體和組織培養(yǎng)物。
具有era1突變的表型特征的轉(zhuǎn)基因植物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明也提供轉(zhuǎn)基因植物的種子，這些種子可用來繁殖更多含本發(fā)明的構(gòu)建物的植物。
在一些農(nóng)作植物中ERA1功能可以被抑制，以增強植物對需要ABA調(diào)節(jié)信號的不利環(huán)境條件的反應(yīng)?？刂聘叩戎参锏姆鼗饔谜{(diào)節(jié)了胚胎和植物性組織對這種激素的反應(yīng)(Cutler等人，1996)。增加的敏感性轉(zhuǎn)變?yōu)榻M織對逆境條件的快速反應(yīng)，從而給環(huán)境逆境中的植物帶來增加的保護性。因為這僅需要對單一基因，即ERA1的控制，所以通過控制這種酶的合成或活性來控制各種植物中法呢基作用應(yīng)是可能的。并且，本文所描述的研究清楚地表明，通過改變控制ABA反應(yīng)的基因來改變ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使改進植物對不利水分逆境條件的反應(yīng)成為可能。
為了制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知或已使用的方法，將包括編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的基因構(gòu)建物，或編碼其功能等同物的核酸，和啟動子整合到載體中。啟動子可以包括全部或部分的SEQ ID NO:3。構(gòu)建物也可包括任何其他必要的與編碼序列可工作地聯(lián)接的調(diào)節(jié)因子，如終止子或類似因子。在該構(gòu)建物中包括5’前導(dǎo)序列，如從紫花苜蓿嵌合病毒的外被蛋白mRNA獲取的非翻譯前導(dǎo)序列(Jobling,S.A.和Gehrke,L.1987自然325∶622-625)或玉米萎黃病色斑病毒(MCMV)前導(dǎo)序列(Lommel,S.A.等人，1991濾過性微生物學(xué)81∶382-385)等，將是有益的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認識到用作不同目的其他前導(dǎo)序列的適用性。
靶標(biāo)序列也是有用的，也可整合到本發(fā)明的構(gòu)建物中。靶標(biāo)序列通常被翻譯成肽，指導(dǎo)編碼核酸序列的多肽產(chǎn)物到細胞內(nèi)所需的位置上，如到質(zhì)粒上，并在肽轉(zhuǎn)換完成后從肽分離出來或隨轉(zhuǎn)換同時存在。用于本發(fā)明中的靶標(biāo)序列實例包括但不限于，酵母線粒體RNA前序列(Schmitz等人，1989，植物細胞，1:783-791)，從煙草致病原因有關(guān)基因(PR-1)中獲取的靶標(biāo)序列(Cornellisen等人，1986,EMBO J.5:37-40)，液泡靶信號(Chrispeels,M.J.和Raikhel,N.V 1992細胞68:613-616),分泌途徑序列如ER或Golgi(Chrispeels,M.J.1991，植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年刊，42:21-53)。內(nèi)細胞器序列對內(nèi)部位點，如葉綠體內(nèi)的類囊體也是有用的(Theg,S.M.和Scott,S.V1993細胞生物學(xué)趨勢，3:186-190)。
除了5’前導(dǎo)序列，終止序列通常也包括在構(gòu)建物中。在植物構(gòu)建物中，3’非翻譯區(qū)域(3’UTR)一般是表達質(zhì)粒的一部分，并含polyA終止序列。使用的終止區(qū)域通常是一種方便區(qū)域，因為終止區(qū)域呈現(xiàn)出相當(dāng)?shù)目苫Q性。從根瘤農(nóng)桿菌(A.Tumefaciens)的Ti質(zhì)粒獲得的章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)域，在本發(fā)明的構(gòu)建物中用作這種用途是適合的。
任何適用的技術(shù)可用來引入本發(fā)明的核酸和構(gòu)建物，以制備帶有改變基因組的轉(zhuǎn)基因植物。對于禾本植物如玉米，可使用微型射彈轟擊法(參閱如，Sanford J.C.等人的美國專利第5,100,792號，1992)。在這個具體實施中，核苷酸構(gòu)建物或含這種構(gòu)建物的載體涂在小顆粒的表面，小顆粒用高速彈子穿擊而引入到靶組織(細胞)內(nèi)。載體可以是任何允許外源DNA在引入該載體的植物細胞內(nèi)進行表達的載體。然后將轉(zhuǎn)化細胞在適合植物再生的條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
使用多種方法對帶有構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物進行所需要的表型的檢測，這些方法包括但不限于，適當(dāng)?shù)谋硇蜆?biāo)記，如對抗生素或除草劑的抵抗性，或與自然生長植物相比，對花誘導(dǎo)時間的視覺觀察。
其他已知的將核酸構(gòu)建物插入到植物中的方法包括農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化法(參閱如Smith,R.H.，等人的美國專利第5,164,310號,1992)，電穿孔法(參閱如Calvin,N.等人的美國專利第5,098,843號，1992)，使用激光束引入法(參閱如Kasuya,T.等人的美國專利第5,013,660號，1991)，或使用試劑如聚乙烯乙二醇引入法(參閱如Golds,T.等人，1991,生物技術(shù)，11∶95-97)，等等。通常，根據(jù)已熟知的技術(shù)，植物細胞可用多種載體轉(zhuǎn)化，如病毒，游離基因載體，Ti質(zhì)粒載體等等。對于本發(fā)明，將核酸引入植物細胞的方法不是至關(guān)重要的。
本發(fā)明的方法可與不需要培養(yǎng)或再生的in planta或種子轉(zhuǎn)化技術(shù)一起使用。這些技術(shù)的實例在下列文獻中公開了，Bechtold,N.等人，1993 CR.Acad.Sci.巴黎/生命科學(xué)316∶118-93；Chang,S.S.等人，1990，關(guān)于擬南芥研究第四次國際會議摘要，維也納，P.28；Feldmann,K.A.和Marks,D.M.1987,Mol.Gen.Genet.208:1-9；Ledoux,L.等人，1985,Arabidopsis Inf.Serv.22:1-11；Feldmann,K.A.1992,In擬南芥研究方法(Eds.Koncz,C.,Chua,N-H,Schell,J.)pp.274-289；Chee，等人美國專利序第5,376,543號。
轉(zhuǎn)錄開始區(qū)域可提供組成表達和調(diào)節(jié)表達。除了ERA1啟動子，在植物中起作用的許多啟動子可以使用。
植物基因表達的組成啟動子包括但不限于，章魚堿合成酶，胭脂堿合成酶，或從農(nóng)桿菌屬獲取的甘露堿合成酶啟動子，花椰菜嵌合病毒(35S)啟動子，玄參嵌合病毒(FMV)啟動子，及煙草嵌合病毒(TMV)啟動子。植物基因組成表達也可由谷酰胺合成酶啟動子(Edwards等人，1990 PNAS 87:3459-3463)，玉米蔗糖合成酶1啟動子(Yang等人，1990 PNAS 87:4144-4148)，從Ri質(zhì)粒TLDNA的Rol-C基因獲取的啟動子(Sagaya等人，1989，植物細胞生理，30:649-654)，和pRVC-S-3A啟動子的韌皮-特異區(qū)域(Aoyagi等人，1988,Mol.Gen.Genet.213:179-185)提供。
熱擊啟動子，核酮糖-1,6-雙磷酸鹽(RUBP)羧基酶小亞單元(ssu)啟動子，組織特異啟動子等等也可用來調(diào)節(jié)植物基因的表達。也可使用發(fā)育調(diào)節(jié)，逆境誘導(dǎo)，傷害誘導(dǎo)或致病誘導(dǎo)啟動子。
調(diào)節(jié)區(qū)域可對物理刺激反應(yīng)，如光照，如用RUBP羧基酶ssu啟動子，分化信號，或代謝物刺激。有義和反義取向表達水平和時間對所產(chǎn)生的表型有一定的影響。因此，啟動子的選擇，與外源DNA取向的偶聯(lián)，在基因組中載體整合位置，將決定引入基因的效果。
調(diào)節(jié)啟動子的具體實例包括但不限于，低溫Kin1和cor6.6啟動子(Wang，等人，1995植物分子生物學(xué)28:605；Wang，等人，1995植物分子生物學(xué)28:619-634),ABA可誘導(dǎo)啟動子(Marcotte Jr.等人，1989植物細胞1:969-976)，熱擊啟動子，如從Drosphilia melanogaster獲取的可誘導(dǎo)hsp70熱擊啟動子(Freeling,M.等人，1985，年刊修訂本，基因?qū)W19:297-323),從B.napus獲取的可冷誘導(dǎo)啟動子(White,T.C等人，1994,植物生理學(xué)，106:917)，由乙醇誘導(dǎo)的乙醇脫氫酶啟動子(Nagao,R.T.等人，Miflin,B.J.，植物分子和細胞生物學(xué)牛津概觀Vol.3,p384-438，牛津大學(xué)出版社，牛津1986)，從擬南芥獲取的韌皮特異蔗糖合成酶ASUS1啟動子(Martin，等人，1993植物J.4:367-377),ACS1啟動子(Rodrigues-Pousada等人，1993植物細胞5:897-911)，從玉米獲取的22kDa玉米蛋白啟動子(Unger等人，1993植物細胞5:831-841)。豌豆ps1植物凝集素啟動子(de Pater等人，1993植物細胞5:877-886)，從Phaseolusvulgaris獲取的phas啟動子(Frisch等人，1995植物J.7:503-512),lea啟動子(Thomas,T.L.1993植物細胞5:1401-1410),從番茄獲取的E8基因啟動子(Cordes等人，1989植物細胞1:1025-1034),PCNA啟動子(Kosugi等人，1995植物J.7:877-886),NTP303啟動子(Weterings等人，1995植物J.8:55-63),OSEM啟動子(Hattori等人，1995植物J.7:913-925)，從土豆獲取的ADP GP啟動子(Muller-Rober等人，1994植物細胞6:601-604)，從大麥獲取的Myb啟動子(Wisenbach等人，1993植物J.4:411-422)，和從擬南芥獲取的質(zhì)體藍素啟動子(Vorst等人，1993植物J.4:933-945)。
載體可用適合宿主細胞類型的方法引入細胞(如轉(zhuǎn)化法，電穿孔法，轉(zhuǎn)染法)。對本文來說，“用…轉(zhuǎn)化的”,“轉(zhuǎn)化體”,“轉(zhuǎn)化”“用…轉(zhuǎn)染”，和“轉(zhuǎn)染”都是指通過一種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將核酸引入細胞內(nèi)的過程。如，原核細胞的轉(zhuǎn)化一般通過用氯化鈣處理細胞以使它們有能力接納外源DNA，然后混合這樣的DNA和“有能力”細胞而實施的。原核細胞也可用重組體噬菌載體感染。
取決于具體細胞類型，也可采用病毒感染法，細菌調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移法(如Agrobacterium T-DNA運送系統(tǒng))，電穿孔法，磷酸鈣共沉淀法，微注射法，脂轉(zhuǎn)染法，用核酸覆蓋顆粒轟擊法或其他技術(shù)，將核酸引入高等有機體的細胞內(nèi)。對于禾本植物如農(nóng)作物和高梁屬植物，可使用如在Sanford,J.C.等人的美國專利第5,100,792號(1992)中所描述的微粒轟擊法。植物細胞轉(zhuǎn)化的其他有用方案在Gelvin等人1992的文獻中提供。轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)染細胞的適用方案也可在Sambrook等人1989的文獻中找到。通過本文所描述的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染技術(shù)，本發(fā)明的核酸構(gòu)建物也可被引入到如前面所描述的那些具體的植物部分中。
為了幫助確定轉(zhuǎn)化的植物細胞，可對本發(fā)明的構(gòu)建物進行進一步的加工以包括編碼植物可選擇性標(biāo)記的基因。有用的可選擇性標(biāo)記包括提供對抗生素如慶大霉素、勻霉素、卡那霉素等有抗性的酶。同樣地，提供產(chǎn)生通過顏色改變可識別的化合物如GUS(β-葡萄糖苷酸酶)，或通過發(fā)光可識別的化合物如熒光素酶的酶也可使用。
如，反義法呢基轉(zhuǎn)移酶可通過將與含SEQ ID NO:3 DNA聯(lián)接的ERA1基因的互補體，整合到進入宿主細胞的病毒基因組內(nèi)來制備。通過感染宿主細胞，允許反義基因的轉(zhuǎn)錄的系統(tǒng)的組成就存在于宿主細胞中。
當(dāng)獲得被本發(fā)明的啟動子驅(qū)動的含反義基因的細胞和原生質(zhì)體時，細胞或原生質(zhì)體再生成整體植物。然后在適合植物再生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。選擇再生步驟的方法不是至關(guān)重要的，已經(jīng)存在著眾多的適用于植物，組織和其他光合有機體的適當(dāng)方案。參閱如Gelvin S.B.和Schilperoort R.A.eds.植物分子生物學(xué)手冊，第二版，增刊1,1995 Kluwer學(xué)院出版社，波士頓，馬薩諸塞州，美國。
可使用多種方法對帶有構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因植物進行所需要的表型的檢測，這些方法包括但不限于，適當(dāng)?shù)谋硇蜆?biāo)記，如對抗生素或除草劑的抗性，如前所述，或視覺觀察生長狀況，與在相同的條件下自然生長植物的生長狀況相比較。
在本文所使用的術(shù)語，轉(zhuǎn)基因植物，包括，含在野生型植物(天然的)或已知變異體中不是自然產(chǎn)生的DNA或RNA的植物，或含如本文所描述的方法引入的自然產(chǎn)生的DNA另外的或反向復(fù)制體的植物。轉(zhuǎn)基因植物包括其中分離核酸已被引入的植物，和由種子，營養(yǎng)性繁殖，細胞，組織或原生質(zhì)體培養(yǎng)物等產(chǎn)生的其中維持著這種改變的它們的后代。
在一個具體實施中，這樣的轉(zhuǎn)基因植物包括，轉(zhuǎn)基因植物是被子植物，單子葉植物和雙子葉植物。轉(zhuǎn)基因植物包括DNA已被引入的植物，和由種子，營養(yǎng)性繁殖，細胞，組織或原生質(zhì)體培養(yǎng)物等產(chǎn)生的它們的后代。
種子可從再生植物獲得，或從再生植物和適當(dāng)?shù)耐锓N植物雜交獲得。另外，植物也可通過在適合這種植物部分再生的條件下，培養(yǎng)植物部分進行營養(yǎng)性繁殖而獲得。
另一方面，本發(fā)明提供了植物組織培養(yǎng)物和原生質(zhì)體，其中含有包括反義基因或可與REA1啟動子可工作地聯(lián)接的改變的ERA1核酸的DNA，這改變了植物組織或原生質(zhì)體對不同環(huán)境條件的反應(yīng)。
本發(fā)明的方法還與不需要培養(yǎng)或再生的in planta或種子轉(zhuǎn)化技術(shù)一起使用。這些技術(shù)的實例在Bechtold,N.等人，1993 CR.Acad.Sci.巴黎/生命科學(xué)316:118-93；Chang,S.S.等人，1990,關(guān)于擬南芥研究第四次國際會議摘要，維也納，P.28；Feldmann,K.A.和Marks,D.M.1987,Mol.Gen.Genet.208:1-9；Ledoux,L.等人，1985,Arabidopsis Inf.Serv.22:1-11；Feldmann,K.A.1992,In:Arabidopsis研究方法(Eds.Koncz,C.,Chua,N-H,Schell,J.)pp.274-289；Chee，等人美國專利第5,376,543號中作了描述。
具體實施本發(fā)明的方法和構(gòu)建物有許多具有商業(yè)價值的應(yīng)用，特別是在水分逆境期間預(yù)防植物組織干燥方面。摻入法呢基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑或抑制編碼外源植物法呢基轉(zhuǎn)移酶的基因，對農(nóng)作植物的基因加工會使這樣的植物能忍耐暫時的環(huán)境逆境，并能拓寬這些植物可以生長的環(huán)境。這樣改進農(nóng)作植物對寒冷，鹽度和干旱逆境的耐力，可提高植物在這樣的不利條件下的產(chǎn)量。
本文所描述的技術(shù)也可用來改變植物的收獲時間和收獲質(zhì)量。如，過度表達法呢基轉(zhuǎn)移酶會導(dǎo)致農(nóng)作物快速干燥，如谷物和其他禾本植物。干燥谷物包括使用大量的丙烷氣體。農(nóng)作物如干草的干燥時間，在田地里自然干燥會被縮短，使雨水對農(nóng)作物毀壞的可能減小。
此外，對植物法呢基作用的抑制也可用來控制植物的衰老程序，這樣葉子可以保持在綠色狀態(tài)更長些，果實可以保持不成熟。例如，如果將ERA1的反義構(gòu)建物或CaaX框抑制劑蛋白質(zhì)構(gòu)建物置于衰老誘導(dǎo)啟動子的控制下，那么當(dāng)衰老程序被啟動，植物會誘導(dǎo)法呢基作用的抑制劑，這樣聚抑制了衰老。結(jié)果是植物保持綠色或果實保持不成熟。這樣，植物會堅持更長時間來生產(chǎn)產(chǎn)物，如營養(yǎng)性部分，花或果實。這樣，園藝師可以制備出保持綠色并持續(xù)生長的植物，在相同的條件下，相同種類的野生型植物甚至開始衰老了。切花可被保持更長的時間?；蚬麑嵖杀３植怀墒欤瑢κ卟斯I(yè)是重要成果，產(chǎn)物壽命對市場是非常重要的。
并且，抑制果實和蔬菜中的法呢基轉(zhuǎn)移酶可減緩枯萎。這樣，在運送和運輸期間產(chǎn)物的枯萎能被減緩。果實和蔬菜在商店貨架上也會需要較少水霧以保持它們的新鮮和味道，這樣就較少需要給產(chǎn)物如黃瓜，蘋果和橙子涂蠟以防止它們變干。
較少澆水也意味著真菌和細菌對農(nóng)作物，或果實和蔬菜的襲擊會減小。如，由于植物病原體從土壤飛濺到植物葉子和果實而產(chǎn)生的田地中的植物疾病會被抑制。
在園藝領(lǐng)域中，可制備許多抗干旱植物品種用來美化風(fēng)景及用作裝飾房屋的植物。特別有價值的是用作盆栽的各種植物，如用作辦公室和家居內(nèi)外的裝飾，并且不常澆水也能存活。這對園藝師來說是相當(dāng)實惠的，特別在干旱夏季的幾個月期間，忘記照顧的植物在太陽下很快變干。并且，生長在樹下和其他陰暗區(qū)域內(nèi)的植物常常遭受干旱條件和有限的光照。本文所提供的技術(shù)可提供在這些條件下能較好生存的植物品種。
在另一個具體實施中，園藝師會發(fā)現(xiàn)其側(cè)分枝和/或花的數(shù)目可用光照/黑暗循環(huán)來調(diào)節(jié)的植物的許多用途。莖干較長且無分枝會帶來市場利益的植物實例包括玫瑰，康耐馨，百合等。能增加植物上的花或菊科小花的數(shù)目也具有很高的價值。這些特性對于許多農(nóng)作物也是有用的，使用更容易收獲的方式使產(chǎn)量增加。
本文提供的方法和構(gòu)建的另一個優(yōu)點是，ERA1啟動子在葉子的保衛(wèi)細胞中是活性的。部分ERA1基因啟動子可融合到ERA1基因的反義核酸中，這樣法呢基轉(zhuǎn)移酶的活性只在保衛(wèi)細胞中被減小。
另一個具體實施是使用抗干旱特性作為植物，植物細胞，植物組織轉(zhuǎn)化作用的可選擇標(biāo)記。檢測植物轉(zhuǎn)化作用的一種方法包括(a)摻入含可與含SEQ ID NO:1反義基因核酸，或含反義基因功能等同物的核酸可工作地聯(lián)接的啟動子的核酸構(gòu)建物；(b)將核酸構(gòu)建物插入到植物，植物細胞，或植物組織中；(c)培育植物，或從植物細胞或植物組織再生植物直到氣孔形成；(d)將植物或再生植物置于植物處于干旱逆境條件下，其中在干旱條件下存活植物與未轉(zhuǎn)化植物相比較說明轉(zhuǎn)化。這樣這種技術(shù)可用作可選擇的基因標(biāo)記，如特別當(dāng)與植物選擇和轉(zhuǎn)化設(shè)計結(jié)合時可用作視標(biāo)記。
此外，在沒有采取措施處理基因植物的情況下，失去法呢基轉(zhuǎn)移酶功能的植物的分枝和或開花習(xí)性與野生型植物顯著不同，這可用作轉(zhuǎn)化成功的標(biāo)記。在采用植物中(in planta)轉(zhuǎn)化技術(shù)的領(lǐng)域中，這種方法非常有用。在晝夜光照條件下，轉(zhuǎn)基因植物的椏枝顯示比未轉(zhuǎn)化的椏枝較少分枝，這樣在沒有使用選擇性抗生素標(biāo)記的情況下，有效顯示出法呢基轉(zhuǎn)移酶活失去。實例實例1突變發(fā)生條件本研究所使用的擬南芥(Arabidopsis)植物在連續(xù)光照在土壤或含瓊脂的陪替氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，如在其他文獻中所描述的(Haughn和Somerville)使用兩種不同的野生型擬南芥Meyerowitz的Colombia(Col)(Lelhe種子，Dripping Springs,TX)和Wassilewskija(Ws)(ABRC，俄亥俄州立大學(xué))。將用篩查T-DNA基因突變種子分離出的突變體置于Wssailewkija背景中。這些從俄亥俄州擬南芥種子儲備站(ABRC儲備號CS2606-2654)獲得。T-DNA種子站包括從100個基因突變親體獲取的49組1200個第四代(T4)后代?；蛲蛔冇H體是通過在充滿農(nóng)桿菌屬的含T-DNA質(zhì)粒的培養(yǎng)物中培育野生型種子(T1)獲得的。種子用水沖洗并種在罐中。T2代種子從每株植物獲得并作抗卡那霉素試驗(在T-DNA上實施)。抗卡那霉素植物培育到T3代。T4代種子交給儲備中心。每組獨立篩查。
將通過篩查快速中子照射過的種子分離的突變體置于Meyerowitz的Columbia背景中?；蛲蛔兊囊吧头N子(N1)用60Gy的快速中子照射并培育到下一代。獲得從1387個N1親體產(chǎn)出的約11,000個種子的N2種子庫。十個種子庫獨立進行ABA超敏感突變篩查。在初始篩查時種子保存在4℃不吸脹置于板上。所有后面重篩查的種子在4℃0.3μM ABA下吸脹一周，并評定在22℃光照下5-7天后的子葉突出體。
實例2基因分析突變體組與野生型植物反交三次。T-DNA突變與Ws反交，快速中子突變與Mcol反交。Era表型隔離后，將F2種子覆在0.3μM ABA板上并吸脹4天。吸脹后，將板轉(zhuǎn)移到室溫光照下。在吸脹后一周當(dāng)秧苗上存在或不存在張開的子葉時測定發(fā)芽。通過雜交隔離后每種突變的純合子組，及識別帶有一種突變體顯型的組構(gòu)建雙突變體。使用在本研究中的abi3等位基因是abi3-6(Nambara等人，1994)和abi1-1(Koornneef等人，1982)。Era1-2等位基因用作era親體。隔離分析顯示era1部分地抑制abi1的不敏感性，這樣，F(xiàn)2植物首先被篩查到對3mM ABA不敏感性，對從這些植物獲取的F3種子評定對0.3μM ABA敏感性。推定雙突變體是在F4代中測試的后代，并通過Abi1和Era1的DNA多態(tài)性證實。對于era1和abi1雙突變體，對F2種子篩查不敏感性(對3μMABA)，對突變體植物進行突出心皮和不成熟綠色種子評定(Nambara等人，1994)。推定的雙突變體組被Abi1和Era1的DNA多態(tài)性證實。
實例3:DNA和RNA分析用已描述的方法提取DNA(Dellaporta等人，1983)和RNA(Verwoerd等人，1989)。如所描述在65C實施高度嚴緊Southerns(Sambrook等人，1989)。依據(jù)制造商(Gelman Sciences)建議在Gelman BioTrace NT膜上實施基因組和cDNA文庫篩查?？寺12W突變體(era1-1)內(nèi)的T-DNA和基因組DNA之間插入結(jié)合點，T12W DNA文庫在γ-ZAPⅡ(Stratagene)中制備。用EcoRI消化及用T-DNA右邊探測的T12W DNA的基因組Southern印跡產(chǎn)生三條帶(13kb,7.0kb，和8.0kb)。隨后用其他限制酶證實7和8kb的帶含T-DNA的插入點，并是側(cè)翼植物DNA。通過用EcoRI消化基因組DNA克隆這些片段，使用Prep細胞(Pharmacia)分級分離DNA。使用PB作探針，通過對匯集分級進行Southern分析確定分級含7和8kb片段。依據(jù)制造商建議(Stratagene)將這些匯集體結(jié)合在γ-ZAPⅡ臂上。對40,000重組體文庫進行篩查。確定5個陽性噬菌斑，并依據(jù)制造商建議(Stratagene)分離克隆插入的切除質(zhì)粒形式。選定pL4B和pL7的兩個質(zhì)粒，與PB探針雜交進一步定性。使用pBluescript，從pL4B獲取的2.3kb的EcoRI BamHⅠ片段亞克隆，選定pSC10，從pL7獲取的1.3kb的HindⅢ BamHⅠ片段亞克隆，選定pSC11。這兩個質(zhì)粒含約1.2kb T-DNA與側(cè)翼植物DNA相連。將pSC10用作探針篩查擬南芥cDNA文庫，PRL21-ZipLox(ABRC,StockCD4-7)。確定5個cDNA和最長的cDNA插入，pZL23，用來篩查其他200,00 PRL2噬菌體。從這次篩查，較長cDNA插入，pZL51,(1.35kb)被分離。測序這些克隆體，并用來篩查從部分消化的EcoEI野生型Columbia基因組DNA制備的30.000γ-ZAPⅡ噬菌斑。如上所述除了不分級分離消化的DNA構(gòu)建這種文庫。確定4個陽性克隆體。插入被切除，對含pZL51克隆的6kb區(qū)域進行徹底測序。用同樣的方法(ABRC,Stock CD4-7)?？蓪?-FIX Lansberg erecta基因文庫中分離的這種基因組插入和14kb基因組插入用作探針,以篩查在快速中子突變體(era1-2,era1-3)中的刪除部分。
實例4蛋白質(zhì)法呢基轉(zhuǎn)移酶測試使用從野生型植物和突變體植物中提取的游離細胞作為法呢基轉(zhuǎn)移酶源，合成七肽作為反應(yīng)底物，實施法呢基轉(zhuǎn)移酶(Ftase)測試。肽從Genemed生物技術(shù)公司購得。肽的適當(dāng)序列以Randall等人的1993年資料為根據(jù)；它們是GGCCAIM(-CAIM)和GGCCALL(-CALL)。肽溶液制備在含10mM的二硫蘇糖醇(DTT)的100％二甲基亞砜(DMSO)中，并用無DNSO的10mM DTT稀釋。作轉(zhuǎn)移酶測試的法呢基轉(zhuǎn)移酶源是取自三周大的植物萌芽的可溶蛋白質(zhì)。收集1g野生型植物和突變體植物的萌芽(鮮重)，并均勻分布在(含50mM Hepes pH7.5,1mMMgCl2,1mM EGTA,5mM DTT,2μg/ml亮肽素，2μg/ml抑肽素，和1mM PMSF)緩沖液中。在4℃,10,000g 10分鐘和100,000g,30分鐘離心分離細胞碎片和膜。保留留在表面的物質(zhì),依據(jù)Bradford(1976)測定可溶蛋白質(zhì)的總量。可溶提取物用肽底物和3H-法呢基焦磷酸酯(Amershem)在30℃溫育40分鐘。每種總體積25μl的反應(yīng)混合物含有下列組分50mMHepes pH7.5,5mM MgCl2,5mM DTT,50μM肽，0.5μM[3H]FPP,100μg可溶蛋白質(zhì)提取物。作為對照一個含可溶提取物的反應(yīng)煮沸5分鐘。加入EDTA到最終濃度為50mM反應(yīng)終止，然后點在薄層硅膠60色譜板上(Millipore)。用n-丙醇-水(7∶3v/v)將板顯影4-5小時。干燥板，用En3Hance(新英格蘭Nuclear)噴灑，在-70℃，對柯達X-OMAT AR膠片曝光4天。
實例5:ERA1-GUS基因構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植物ERA1-GUS融合構(gòu)建是通過將ERA1啟動子的5kb EcoEⅠ-HindⅢ基因組片段插入到無啟動子的GUS T-DNA質(zhì)粒(pBI121)中制備的。將這種構(gòu)建轉(zhuǎn)化成農(nóng)桿菌屬菌株LB4404。將農(nóng)桿菌屬培育到(0.8O.D.單位，595nm)，然后用水徹底沖洗，將細胞重新懸浮在10％甘油中，在電穿孔器中在200 Ohms,25μF,2.5伏特下脈沖處理。然后將細胞鋪在有LB介質(zhì)和氨比西林(100μg/ml)板上，并在28℃培育2天。抗氨比西林轉(zhuǎn)化株使用在隨后的植物轉(zhuǎn)化試驗中，用充滿農(nóng)桿菌屬的培養(yǎng)物(0.8O.D.單位，595nm)真空滲透植物制備轉(zhuǎn)基因植物。野生型植物在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件(25℃,150μEm-2sec-1，濕潤，連續(xù)光照)下培育，直到約5周它們產(chǎn)生它們的最初抽苔。移出莖干，并將植物浸沒在農(nóng)桿菌屬溶液中，置于真空(20mBar)下5分鐘。真空中斷后將植物轉(zhuǎn)移到土壤中，并在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下恢復(fù)。植物產(chǎn)生2個月后收獲的新的花和種子，并干燥2周。從個體植物獲取的種子種在最小限度介質(zhì)MS的培養(yǎng)皿(含50μg/ml卡那霉素)上。確定綠色抗卡那霉素植物小芽，并將其2周后移到土壤中，使其培育到接種。將這些種子發(fā)芽，使用熒光GUS底物Imagene綠(分子探針，Eugene,Oregon)檢測秧苗的GUS活性。在室溫下黑暗中，通過將秧苗懸浮在GUS-緩沖液(50mM磷酸鈉，pH7.0,10mM EDTA,0.1％Triton X-100,0.1％sarcosyl鈉，4mM Imagene綠)中2-4小時來實施檢測。將秧苗直接在顯微鏡(25X)下觀察，對正熒光信號使用藍色激發(fā)光，其在紅色葉綠素自熒光背景上呈黃色。
實例6干旱試驗六株野生型秧苗和六株era1-2秧苗在連續(xù)光照(25℃,150 μEm-2 sec-1,70％濕度，連續(xù)光照)下培育4周。然后用錫紙將罐蓋住以減緩?fù)寥勒舭l(fā)，植物和罐稱重。這時，不再給植物澆水，每天稱重罐。在試驗的最后將植物移出，將罐再干燥兩周，然后稱重以確定干燥土壤和罐的重量。將這個重量從每個樣品中減去。
實例7離體葉子中與年齡有關(guān)的變化當(dāng)擬南芥植物成年葉子離體后，將野生型Columbia和era1-2突變體成年葉子中的葉綠素含量作比較。植物在連續(xù)光照(150μE m-2sec-1)和22℃溫度下培育到相同的發(fā)育年齡(發(fā)芽后3周)。這時，摘掉發(fā)芽后已長出葉子的幾株植物的第五片葉子，并將其置于陪替氏培養(yǎng)皿中含最小限度鹽的0.8％瓊脂上。將植物密封并置于連續(xù)光照(50μE m-2sec-1)環(huán)境中12天。拍攝并比較0,3,6,9,12天的顏色。
實例8在衰老葉子中選擇基因的轉(zhuǎn)錄水平確定植物在連續(xù)光照(150μEm-2sec-1)和22℃溫度下培育到相同的發(fā)育年齡(發(fā)芽后4周)，這時，摘掉突變體(era1-2)植物和野生型植物發(fā)芽后長出的第五片葉子。用Northern分析對這些葉子作三種基因(CAB,SAG12,SAG13)表達的檢測。CAB基因編碼涉及光合作用中捕獲光的擬南芥葉綠素結(jié)合蛋白質(zhì)。CBA對于葉子綠色是必需的，并且它也是植物中葉綠素換新率很好的標(biāo)記。一旦衰老被誘導(dǎo)，野生型植物中CBA顯示轉(zhuǎn)錄水平降低。在era1-2突變體的衰老葉子中沒有觀察到轉(zhuǎn)錄水平降低。SAG12和SAG13是衰老期間由差異表達克隆的擬南芥基因(SAG表示衰老激活基因)。在野生型擬南芥植物中衰老開始期間兩種基因的轉(zhuǎn)錄都被誘導(dǎo)?？梢源_定這些基因在相同的發(fā)育條件下在era-2突變體中沒有被誘導(dǎo)。
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權(quán)利要求
1．一種分離的核酸，其包括SEQ ID NO:1或其功能等同物。
2．一種分離的核酸，其包括20-200個SEQ ID NO:1的連續(xù)核苷。
3．一種分離的核酸，其(a)在高度嚴緊條件下與權(quán)利要求2的DNA雜交；(b)與權(quán)利要求1的DNA有80％的相同序列；(c)含有權(quán)利要求2的DNA的互補序列。
4．一種分離的蛋白質(zhì)，其包括SEQ ID NO:2或其功能等同物。
5．一種多肽，其與權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)有80％的相同序列。
6．一種分離的核酸構(gòu)建物，其包括(a)啟動子；以及(b)編碼植物法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的核酸。
7．一種轉(zhuǎn)基因植物，其含有根據(jù)權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建物。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
9．一種植物部分，其含有根據(jù)權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建物。
10．根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物是單子葉植物。
11．根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物是雙子葉植物。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物是Brassica sp。
13．一種細胞或組織培養(yǎng)物，其含有根據(jù)權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建物。
14．從權(quán)利要求13的細胞或組織培養(yǎng)物再生的植物。
15．一種含權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建物的植物，與在相同環(huán)境條件下自然生長的相同種類植物相比具有改進的抗干旱，鹽度，寒冷逆境的耐力。
16．一種含編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶基因突變的植物，導(dǎo)致法呢基轉(zhuǎn)移酶活性失去。
17．轉(zhuǎn)基因植物種子，其中由于植物轉(zhuǎn)化，或再生制備轉(zhuǎn)基因植物的植物部分轉(zhuǎn)化造成種子內(nèi)法呢基轉(zhuǎn)移酶活性被抑制，其中所說的轉(zhuǎn)化導(dǎo)致法呢基轉(zhuǎn)移酶活性失去。
18．一種改變植物中法呢基轉(zhuǎn)移酶水平的方法，該方法包括(a)轉(zhuǎn)移核酸到植物從中再生的植物細胞中，其中核酸包括在高度嚴緊條件下與含SEQ ID NO:1核苷酸序列的DNA雜交的分離核酸，其中所說的核酸編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶活性必需的產(chǎn)物；(b)從植物細胞再生植物，這樣植物表達核酸。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中的核酸包括擬南芥(Arabidopsis)法呢基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。
20．一種制備抗干旱植物的方法，該方法包括(a)制備核酸構(gòu)建物，其含可與含SEQ ID NO:1反義序列的核酸或與含反義序列功能等同物的核酸可工作地聯(lián)接的啟動子；(b)將核酸構(gòu)建物插入到載體中；(c)用載體轉(zhuǎn)化植物，組織培養(yǎng)物，或植物細胞；(d)從組織培養(yǎng)物或植物細胞培育植物或再生植物；其中抗干旱植物被制備。
21．一種檢測植物轉(zhuǎn)化的方法，該方法包括(a)摻入核酸構(gòu)建物，其含可與含SEQ ID NO:1反義序列的核酸或與含反義序列功能等同物的核酸可工作地聯(lián)接的啟動子；(b)將核酸構(gòu)建物插入到植物，植物細胞或植物組織中；(c)從組織培養(yǎng)物或植物細胞培育植物或再生植物直到氣孔形成；(d)將植物或再生植物置于其中植物處于干旱逆境條件下，其中在干旱條件下存活的植物與未轉(zhuǎn)化植物相比較說明轉(zhuǎn)化。
22．一種減少側(cè)分枝的方法，其中包括將編碼抑制內(nèi)源法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)物的核酸引入到植物或植物細胞內(nèi)。
23．根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中核酸是從含25-200個或更多個與SEQ ID NO:1互補的連續(xù)核苷酸，或含25個或更多個SEQ ID NO:1連續(xù)核苷酸或其互補體的寡聚核苷酸；編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑肽的核酸中選取的。
24．根據(jù)權(quán)利要求22的方法制備的植物。
25．根據(jù)權(quán)利要求22的方法制備的植物的種子。
26．一種延遲衰老的方法，其包括將編碼抑制內(nèi)源法呢基轉(zhuǎn)移酶活性的產(chǎn)物的核酸引入植物或植物細胞中。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中核酸是從含25-200個或更多個與SEQ ID NO:1互補的連續(xù)核苷酸，或含25個或更多個SEQ ID NO:1連續(xù)核苷酸或其互補體的寡聚核苷酸；編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑肽的核酸中選取的。
28．根據(jù)權(quán)利要求26的方法制備的植物。
29．根據(jù)權(quán)利要求26的方法制備的植物的種子。
30．一種在相同環(huán)境條件下與自然生長植物相比，通過抑制植物中法呢基轉(zhuǎn)移酶活性在植物中延遲衰老，維持葉綠素含量，減少側(cè)分枝，增加每個花序的花朵數(shù)量的方法。
全文摘要
本發(fā)明的新型構(gòu)建物和方法改進了植物對環(huán)境逆境和衰老的耐力。描述了編碼法呢基轉(zhuǎn)移酶的核酸,也描述了摻入這些核酸和蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物和種子。還提供了天然法呢基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑,當(dāng)表達時,會增強植物對干旱的耐力,提高抗衰老能力,改變生長習(xí)性。
文檔編號C12N15/09GK1314944SQ98808770
公開日2001年9月26日 申請日期1998年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月1日
發(fā)明者彼得·麥克康特, 馬奇德·戈斯梅恩, 肖恩·卡特勒, 達里奧·伯尼塔 申請人:波夫曼斯種植公司