專利名稱：體外造血細(xì)胞的刺激的制作方法
本申請(qǐng)依據(jù)美國(guó)法典第35卷第119(e)的規(guī)定，享有1997年9月29日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?0/060,306的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，題目為體外造血細(xì)胞的刺激，其全部?jī)?nèi)容通過在此引述而合并于本篇。
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用與二肽基肽酶IV(DPIV也稱作CD26)結(jié)合的試劑體外刺激造血細(xì)胞。
本發(fā)明的背景骨髓移植廣泛地應(yīng)用在進(jìn)行大劑量化療或放射治療的患者中。化療和放射治療的劑量限制副作用是指它們通過破壞所有造血細(xì)胞的前體細(xì)胞-骨髓細(xì)胞，對(duì)造血細(xì)胞的有害作用。對(duì)骨髓的這種破壞導(dǎo)致骨髓抑制或骨髓消融，使患者在較長(zhǎng)一段時(shí)間易受機(jī)合感染。骨髓移植涉及輸注能重建患者造血系統(tǒng)，包括免疫系統(tǒng)的早期骨髓祖細(xì)胞。移植減短了化療或放射治療后免疫系統(tǒng)恢復(fù)通常所需的時(shí)間，這樣，就減短了機(jī)合感染的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)間。
骨髓細(xì)胞含有產(chǎn)生包括淋巴、脊髓、紅細(xì)胞的全部種類造血細(xì)胞的全能干細(xì)胞。干細(xì)胞能更新自身，也能分化成所有種類造血細(xì)胞的祖細(xì)胞。祖細(xì)胞保留增殖及產(chǎn)生全部種類分化細(xì)胞的能力。分化的細(xì)胞喪失增殖及表現(xiàn)出對(duì)其種類細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞，粒性白細(xì)胞，血小板，血紅細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞)特異形態(tài)特性的能力。干細(xì)胞和祖細(xì)胞在其表面表達(dá)CD34，而分化的細(xì)胞沒有表達(dá)。骨髓包括干細(xì)胞及淋巴(T和B細(xì)胞)，脊髓(粒性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)和紅細(xì)胞(血紅細(xì)胞)種類的祖細(xì)胞。使用在骨髓移植中，造血前體細(xì)胞可從癌癥患者(自身移植)或從組織相容的供體(同種異型供體)中獲取。這些細(xì)胞可從骨髓，外周血液或從臍帶血液中分離。一次可獲得的祖細(xì)胞的量很小，在很多情況下不足以作成功移植。因此，已發(fā)展了幾種對(duì)從血液分離程序(aphereses，一種從供體的血液中獲得有關(guān)成分，然后將其余的血液部分返還給供體的程序)或臍帶血液中獲得的祖細(xì)胞在體外擴(kuò)增骨髓細(xì)胞的方法。
能夠擴(kuò)增這些細(xì)胞幫助先前的骨髓移植技術(shù)成為涉及大劑量化療和/或放射治療的癌癥治療的可行的附屬方法。然而，存在的造血細(xì)胞擴(kuò)增的方法需要加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子，以使造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增。這種生長(zhǎng)因子的高成本不利地影響了此領(lǐng)域的技術(shù)人員，為移植或其他目的而進(jìn)行的體外造血細(xì)胞擴(kuò)增。因此，存在發(fā)展造血細(xì)胞體外擴(kuò)增新方法的需要，其中不需要外源加入支持細(xì)胞生長(zhǎng)及分化的細(xì)胞因子。
本發(fā)明的概述本發(fā)明提供刺激造血細(xì)胞體外生長(zhǎng)和分化的方法和組合物。有利的是，本發(fā)明的方法不需要外源加入細(xì)胞因子以支持造血細(xì)胞體外刺激作用。因此，本發(fā)明的方法和組合物對(duì)于增加體外造血細(xì)胞的量和/或促使早期祖細(xì)胞的分化是有用的。在培養(yǎng)物中增加造血細(xì)胞的量和/或分化可鑒定不同條件下培養(yǎng)物中的這種細(xì)胞，并可使用這種培養(yǎng)的細(xì)胞來制備體外重組體或從體外自然產(chǎn)生的分子。此外，本發(fā)明的刺激的造血細(xì)胞對(duì)治療，其特點(diǎn)在于體內(nèi)造血細(xì)胞或其前體細(xì)胞減少的病變是有用的。這樣的情況常常在免疫抑制的患者中出現(xiàn)，如，由于癌癥的化療和/或放射治療。
本發(fā)明的新穎性基于，至少部分基于發(fā)現(xiàn)二肽基肽酶類型IV(DPIV)抑制劑，在沒有外源加入的細(xì)胞因子或其他生長(zhǎng)因子或基質(zhì)細(xì)胞的情況下，對(duì)刺激造血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化是有用的。這種發(fā)現(xiàn)與造血細(xì)胞刺激作用領(lǐng)域中的定論是抵觸的，定論指出對(duì)于保持及刺激培養(yǎng)物中的造血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，加入細(xì)胞因子或產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞(基質(zhì)細(xì)胞)是必要因素(參閱如，PCT國(guó)際申請(qǐng)編號(hào)No.PCT/US93/017173，公布號(hào)為WO94/03055)。
依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種刺激體外造血細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的方法。該方法涉及(1)將造血細(xì)胞與充足量的二肽基肽酶IV抑制劑相接觸以增加造血細(xì)胞的量和/或分化，在存在抑制劑的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞，與在對(duì)比培養(yǎng)物中的，未與抑制劑接觸的，但使用與存在抑制劑培養(yǎng)的造血細(xì)胞相同的培養(yǎng)條件，造血細(xì)胞的量和分化狀況相比；(2)在存在抑制劑及不存在外源加入的細(xì)胞因子情況下，并有充分的時(shí)間培養(yǎng)造血細(xì)胞，增加造血細(xì)胞的量和/或這種細(xì)胞的分化與存在于對(duì)比培養(yǎng)物中的造血細(xì)胞的量相比；(3)在存在或不存在基質(zhì)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)造血細(xì)胞，(4)在存在DPIV抑制劑的情況下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞。通常，增加造血細(xì)胞的量是指，增加造血細(xì)胞的量與當(dāng)細(xì)胞與抑制劑最初接觸時(shí)存在在的造血細(xì)胞的量相比至少約為2倍。通常，存在于對(duì)比培養(yǎng)物中的，沒有與抑制劑接觸但處理方式相同的細(xì)胞量，與在與抑制劑接觸之前的培養(yǎng)物中的細(xì)胞初始量基本相同。較好地，與當(dāng)造血細(xì)胞最初與抑制劑接觸時(shí)存在造血細(xì)胞的量相比，造血細(xì)胞增加至少約4倍、10倍、20倍、或更好的為100倍。
如本文所使用的，造血細(xì)胞包括造血干細(xì)胞，原始干細(xì)胞，早期祖細(xì)胞，CD34+細(xì)胞，間葉細(xì)胞，脊髓，淋巴及紅細(xì)胞的早期種類細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，血細(xì)胞，臍帶血細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，和此領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他造血前體細(xì)胞。
如本文所使用的，二肽基肽酶IV(DPIV)抑制劑通常是指抑制DPIV功能活性的分子。因此，本發(fā)明的抑制劑包括二肽基肽酶IV酶活性抑制劑。較好地，DPIV酶活性抑制劑通過共價(jià)結(jié)合或通過形成離子相互作用與DPIV活性位點(diǎn)相聯(lián)系。這樣的抑制劑包括DPIV競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如DPIV的過渡態(tài)擬似物，DPIV非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如氟代烷基酮。DPIV抑制劑還包括在DPIV蛋白質(zhì)位點(diǎn)上而不是活性位點(diǎn)上與DPIV選擇性結(jié)合(共價(jià)或離子相互作用)，從而抑制DPIV酶活性的的DPIV非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。這樣的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑是一種與DPIV選擇性結(jié)合的結(jié)合分子，具有在體外刺激造血細(xì)胞或胸腺細(xì)胞的能力。其他與DPIV選擇性結(jié)合的并具有在體外刺激造血細(xì)胞能力的結(jié)合分子包括單克隆抗體，多克隆抗體和前述能(1)與DPIV結(jié)合，(2)在體外刺激造血細(xì)胞和/或胸腺細(xì)胞的片段。使用在本發(fā)明上下文中的DPIV抑制劑可以是固定化或不溶形式的。通常，前述抑制劑可以是單價(jià)的，二價(jià)的，或多價(jià)的。(參閱如美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?8/671,756和08/837,305，題目為“交聯(lián)受體的多價(jià)化合物及其應(yīng)用”，其中描述了DPIV抑制劑的二聚物和其他共軛物)。固定化DPIV抑制劑對(duì)于各種固定結(jié)構(gòu)包括傳統(tǒng)培養(yǎng)容器(如攪拌燒瓶，攪拌釜式反應(yīng)器，氣升式反應(yīng)器，懸浮細(xì)胞反應(yīng)器，細(xì)胞吸附反應(yīng)器，細(xì)胞捕集反應(yīng)器，培養(yǎng)皿，多孔板，微型滴定板，測(cè)試管，培養(yǎng)燒瓶、袋和中空纖維裝置，和細(xì)胞泡沫)可以是固定的。這種固定結(jié)構(gòu)較好地由包括如，聚苯乙烯，聚丙烯，丙烯酸酯聚合物，尼龍，布，硝化纖維，瓊脂糖，瓊脂糖凝膠等等物料構(gòu)成。
依據(jù)本發(fā)明的這種方法，當(dāng)細(xì)胞在存在抑制劑的情況下培養(yǎng)時(shí)，將在固定化結(jié)構(gòu)中或在含可溶性DPIV抑制劑的選擇性細(xì)胞培養(yǎng)裝置中的造血細(xì)胞，與充分量的DPIV抑制劑接觸，以增加造血細(xì)胞的量和/或使這樣的細(xì)胞分化。通常，確定造血細(xì)胞量的增加和/或其分化狀態(tài)可使用此領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)方法測(cè)定。本發(fā)明的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是培養(yǎng)的造血細(xì)胞可在不存在外源加入細(xì)胞因子的情況下發(fā)生分化和/或量增加。通過提供在不存在外源加入細(xì)胞因子的情況下刺激造血細(xì)胞的方法，本發(fā)明為培養(yǎng)這種細(xì)胞提供了顯著成本節(jié)省，以及通過去除申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)的不再是刺激培養(yǎng)物中造血細(xì)胞的必要試劑，有利地減小了污染這種細(xì)胞培養(yǎng)物的可能性。
依據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。裝置包括容器和包含在其中或附著在其上的DPIV抑制劑。較好地，容器是消毒容器，是從任何一種前述的此領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的細(xì)胞培養(yǎng)容器中選取的。DPIV抑制劑以可溶或固定化形式包含在容器中或直接附著在容器的內(nèi)表面。如，DPIV可包括磁性顆粒，其上附著著一種或多種不同的DPIV抑制劑。除了含有固定化或可溶的DPIV抑制劑，容器還任意地包括一種或多種細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)介質(zhì)組成。這樣的組成對(duì)此領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員是熟知的。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一套刺激培養(yǎng)物中造血細(xì)胞的工具。工具包括上面描述的裝置和使用裝置刺激體外造血細(xì)胞的用法說明。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供體外刺激造血細(xì)胞和擴(kuò)增抗原-特異T細(xì)胞的方法。刺激和擴(kuò)增步驟可同時(shí)實(shí)施或順序?qū)嵤Ｏ旅骊U述這種方法的三個(gè)具體實(shí)施來說明這種方法。通常，具體實(shí)施彼此區(qū)分在體外刺激的造血細(xì)胞的選取上。在每個(gè)具體實(shí)施中，培養(yǎng)步驟可在存在或不存在加入的細(xì)胞因子或基質(zhì)細(xì)胞的情況下實(shí)施。使用在每一種具體實(shí)施中的較好的復(fù)共軛對(duì)配合物含有與本發(fā)明的DPIV抑制劑共軛的腫瘤特異抗原或病原特異抗原。
這種方法的第一個(gè)具體實(shí)施是獲得抗原特異T細(xì)胞，涉及刺激培養(yǎng)物中的骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)物中骨髓細(xì)胞可包括細(xì)胞的混合物；然而，較好地，培養(yǎng)物中的骨髓細(xì)胞是分離的CD+34細(xì)胞或分離的干細(xì)胞。依據(jù)這個(gè)具體實(shí)施，方法包括(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞(如DPIV單體和/或共軛對(duì)配合物)以擴(kuò)增培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；(2)用充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，其中DPIV抑制劑附著在抗原肽上(如腫瘤-或病原特異抗原)，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量。步驟(2)可在存在或不存在特異抗原的情況下實(shí)施。步驟(1)和(2)可同時(shí)實(shí)施或順序?qū)嵤?。通常，將抗原特異T細(xì)胞的量與(除了對(duì)比培養(yǎng)物不與復(fù)共軛對(duì)配合物接觸)用如步驟(1)和(2)處理的骨髓細(xì)胞的對(duì)比培養(yǎng)物相比較。在每個(gè)步驟中，細(xì)胞在DPIV抑制劑中培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以增加早期T種類細(xì)胞的量和擴(kuò)增抗原特異T細(xì)胞的量，分別與對(duì)比培養(yǎng)物中這種細(xì)胞的存在量相比。
第二個(gè)具體實(shí)施目的在于刺激培養(yǎng)物中臍帶血細(xì)胞。這個(gè)具體實(shí)施涉及(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞(如DPIV單體和/或共軛對(duì)配合物)以擴(kuò)增培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；(2)用充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，其中DPIV抑制劑附著在抗原肽上(如腫瘤-或病原特異抗原)，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量。步驟(2)可在存在或不存在特異抗原的情況下實(shí)施。步驟(1)和(2)可同時(shí)實(shí)施或順序?qū)嵤?。通常，將抗原特異T細(xì)胞的量與(除了對(duì)比培養(yǎng)物不與復(fù)共軛對(duì)配合物接觸)用如步驟(1)和(2)處理的臍帶血細(xì)胞的對(duì)比培養(yǎng)物相比較。在每個(gè)步驟中，細(xì)胞在DPIV抑制劑中培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以增加早期T種類細(xì)胞的量和擴(kuò)增抗原特異T細(xì)胞的量，分別與對(duì)比培養(yǎng)物中這種細(xì)胞的存在量相比。
第三個(gè)具體實(shí)施目的在于刺激培養(yǎng)物中外周血液干細(xì)胞。這個(gè)具體實(shí)施涉及(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)外周血液干細(xì)胞(如DPIV單體和/或共軛對(duì)配合物)以擴(kuò)增培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；(2)用充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，其中DPIV抑制劑附著在抗原肽上(如腫瘤-或病原特異抗原)，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量。步驟(2)可在存在或不存在特異抗原的情況下實(shí)施。步驟(1)和(2)可同時(shí)實(shí)施或順序?qū)嵤?。通常，將抗原特異T細(xì)胞的量與(除了對(duì)比培養(yǎng)物不與復(fù)共軛對(duì)配合物接觸)用如步驟(1)和(2)處理的外周血液干細(xì)胞的對(duì)比培養(yǎng)物相比較。在每個(gè)步驟中，細(xì)胞在DPIV抑制劑中培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以增加早期T種類細(xì)胞的量和擴(kuò)增抗原特異T細(xì)胞的量，分別與對(duì)比培養(yǎng)物中這種細(xì)胞的存在量相比。另外，由于已知外周血液含有T細(xì)胞，所以，可能在沒有刺激步驟(1)的情況下，培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量擴(kuò)增，如擴(kuò)增抗原特異T細(xì)胞的方法涉及用充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，其中DPIV抑制劑附著在抗原肽上(如腫瘤-或病原特異抗原)，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量。這個(gè)步驟可在存在或不存在特異抗原的情況下實(shí)施。
參考示圖和本發(fā)明的詳細(xì)描述，本發(fā)明的這些和其他方面，以及應(yīng)用中的多種優(yōu)勢(shì)會(huì)更清楚。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1分離出新鮮分離骨髓細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)皿10,000個(gè)細(xì)胞在96微型滴定板Iscove改進(jìn)Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)上，有或沒有(對(duì)比)指定濃度的Pro-boroPro溫育4天。在這個(gè)溫育階段最后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。在第4天末沒有Pro-boroPro的培養(yǎng)物含10,000個(gè)細(xì)胞，含Pro-boroPro的培養(yǎng)物，在10-6M下有53,000個(gè)細(xì)胞，在10-8M下有38,000個(gè)細(xì)胞，在10-10M下有42,000個(gè)細(xì)胞。含生長(zhǎng)因子混合物(GF)的培養(yǎng)物含82,000個(gè)細(xì)胞。生長(zhǎng)因子是在OPTION_巨型細(xì)胞腫瘤-調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(IGEN)中提供的。圖2在如圖1圖例中所示的基本相同的條件下溫育臍帶血細(xì)胞，除了使用指定濃度的Val-boroPro作刺激劑，溫育4天后A大量臍帶血液；總量細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)比培養(yǎng)物0.2×106個(gè)細(xì)胞；生長(zhǎng)因子5×106個(gè)細(xì)胞；Val-boroPro3×106(10-6M)，3×106(10-8M)，4×106(10-10M)。
BCD34+分離細(xì)胞CD34+細(xì)胞采用CD34mAb結(jié)合玻珠作正選擇分離細(xì)胞制備含有98％CD34+細(xì)胞。溫育4天后含10-10M Val-boroPro的培養(yǎng)物含8.5×106個(gè)細(xì)胞，與生長(zhǎng)因子溫育物中的4×106個(gè)細(xì)胞和對(duì)比物中的0.6×106個(gè)細(xì)胞相比。
C4天培養(yǎng)后殘留CD34+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)用Val-boroPro溫育的培養(yǎng)物4天培養(yǎng)后含10到15％的CD34+細(xì)胞。用生長(zhǎng)因子溫育的培養(yǎng)物僅有4％的CD34+細(xì)胞殘留(試驗(yàn)組b)。這說明Val-boroPro除了對(duì)CD34+細(xì)胞分化成成熟外周血細(xì)胞有作用外，還對(duì)CD34+細(xì)胞生長(zhǎng)有刺激作用。觀察在Val-boroPro和生長(zhǎng)因子存在的情況下培養(yǎng)這些CD34+細(xì)胞，從只用Val-boroPro培養(yǎng)觀察到的百分?jǐn)?shù)中沒有改變培養(yǎng)物中CD34+細(xì)胞％可證實(shí)這一點(diǎn)，盡管與在只用Val-boroPro的溫育物(試驗(yàn)組a)中的8.5×106個(gè)細(xì)胞相比，在這種組合培養(yǎng)物中細(xì)胞的總量已增加到55×106個(gè)細(xì)胞。圖3與Lys-boroPro單體的作用相比，二聚化的Lys-boroPro(共軛對(duì)配合物)顯著地增加了對(duì)骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)的刺激作用。培養(yǎng)物用如圖1圖例中所示的構(gòu)成，除了使用Lys-boroPro和共軛對(duì)配合物，溫育4天。圖4骨髓細(xì)胞用如圖1所述溫育，除了在4天培養(yǎng)中使用Val-boroPro和共軛對(duì)配合物。
AVal-boroPro與生長(zhǎng)因子混合物(GF)提供了相似的骨髓細(xì)胞擴(kuò)增，而二聚物加倍了作用。
B(試驗(yàn)組a)用Val-boroPro溫育分離的CD34+細(xì)胞(98％純度)提供了多達(dá)20倍的細(xì)胞生長(zhǎng)刺激作用的增加，與用生長(zhǎng)因子培養(yǎng)的18倍的增加相比超過了對(duì)比培養(yǎng)物。共軛對(duì)配合物在10-6M濃度下增加生長(zhǎng)因子活性125倍，在10-6M增加96倍。
(試驗(yàn)組b)4天溫育后培養(yǎng)物中殘留的CD34+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)對(duì)比物63％；GF5％；Val-boroPro43％；均二聚物10％。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述本發(fā)明提供了刺激培養(yǎng)物中造血細(xì)胞的一種改進(jìn)方法，具體地，是在沒有外源加入細(xì)胞因子的情況下刺激體外造血細(xì)胞的一種方法。申請(qǐng)人的發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入DPIV抑制劑時(shí)，對(duì)于造血細(xì)胞的保持或刺激作用，向培養(yǎng)物中的造血細(xì)胞加入細(xì)胞因子或細(xì)胞因子表達(dá)細(xì)胞(基質(zhì)細(xì)胞)不是必要因素。因此，由于去除了向細(xì)胞培養(yǎng)物中提供細(xì)胞因子必要，申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)帶來顯著的成本節(jié)省，以及有利地消除了培養(yǎng)物中這種細(xì)胞的潛在污染源。
依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種體外刺激造血細(xì)胞的方法。該方法涉及(1)將造血細(xì)胞與充足量的二肽基肽酶IV(DPIV)抑制劑相接觸以增加造血細(xì)胞的量和/或這種造血細(xì)胞分化，與在對(duì)比培養(yǎng)物中的未與抑制劑接觸的，但使用與存在抑制劑培養(yǎng)的造血細(xì)胞相同的培養(yǎng)條件的，造血細(xì)胞的量和分化狀況相比；(2)在存在抑制劑及不存在外源加入細(xì)胞因子情況下，并有充分的時(shí)間培養(yǎng)造血細(xì)胞，增加造血細(xì)胞的量和/或其分化與存在于對(duì)比培養(yǎng)物中的造血細(xì)胞的量相比。如本文所用的，刺激造血細(xì)胞是指誘導(dǎo)造血細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化。這樣，本發(fā)明的方法及組合物和設(shè)備對(duì)于增加細(xì)胞量及促使早期祖細(xì)胞分化是有用的。造血細(xì)胞如本文所用的，造血細(xì)胞是指涉及制備血細(xì)胞的細(xì)胞。造血細(xì)胞的示例包括造血干細(xì)胞，原始干細(xì)胞，早期祖細(xì)胞，CD34+細(xì)胞，間葉細(xì)胞，脊髓，淋巴，紅細(xì)胞的早期種類細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，血細(xì)胞，臍帶血細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，和此領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他造血前體細(xì)胞。
依據(jù)此領(lǐng)域中的傳統(tǒng)，造血細(xì)胞的定義不包括胸腺細(xì)胞。從胸腺獲得的胸腺細(xì)胞不被認(rèn)為是“造血祖細(xì)胞”是因?yàn)檫@樣的細(xì)胞是從胸腺獲得的并且已經(jīng)定型。申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的某些方法對(duì)于造血細(xì)胞和胸腺細(xì)胞都是有用的。因此，可以認(rèn)為本發(fā)明的方法可以只用造血細(xì)胞實(shí)施，只用胸腺細(xì)胞實(shí)施，或用造血細(xì)胞和胸腺細(xì)胞一起實(shí)施。
骨髓細(xì)胞含全能干細(xì)胞，其產(chǎn)生包括淋巴，脊髓，紅細(xì)胞全部種類的造血細(xì)胞。干細(xì)胞能更新自身，也能分化成所有種類造血細(xì)胞的祖細(xì)胞。祖細(xì)胞保留增殖及產(chǎn)生全部種類分化細(xì)胞的能力。分化的細(xì)胞喪失增殖及表現(xiàn)出對(duì)其種類細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞，粒性白細(xì)胞，血小板，血紅細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞)特異形態(tài)特性的能力。骨髓包括干細(xì)胞及淋巴(T和B細(xì)胞)，脊髓(粒性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)和紅細(xì)胞(血紅細(xì)胞)種類的祖細(xì)胞。干細(xì)胞和祖細(xì)胞在其表面表達(dá)CD34，而分化細(xì)胞沒有表達(dá)。因此，鑒定CD34可用來區(qū)分分化細(xì)胞和未分化細(xì)胞。
使用在骨髓移植中，造血前體細(xì)胞可從癌癥患者(自身移植)或從組織相容的供體(同種異型供體)中獲取。這些細(xì)胞可從骨髓，外周血液或從臍帶血液中分離。通常，在化療或放射治療前獲取細(xì)胞。骨髓一般是從iliac骨櫛吸取，是一個(gè)時(shí)間長(zhǎng)且痛苦的過程。骨髓富含CD34+細(xì)胞；一般1％到2％的骨髓細(xì)胞是前體細(xì)胞。外周血液一般含少于1％的CD34+細(xì)胞。為了富化CD34+細(xì)胞，通過用低劑量的化療或用某些細(xì)胞因子如G-CSF或SCF的預(yù)處理，將血液祖細(xì)胞從骨髓遷移到外周。臍帶血液非常富含早期祖細(xì)胞，并很有希望作為造血細(xì)胞移植的一個(gè)細(xì)胞源。
從任何細(xì)胞源一次可獲取的祖細(xì)胞的量很小，在很多情況下不足以作成功移植。因此，已發(fā)展了幾種在體外培養(yǎng)物中對(duì)從血液分離程序(aphereses)或臍帶血液中獲得的祖細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增骨髓細(xì)胞的方法。能夠擴(kuò)增這些細(xì)胞幫助先前的骨髓移植技術(shù)成為涉及大劑量化療和/或放射治療的癌癥治療的可行的附屬方法。造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增需要加入適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子及由稱為基質(zhì)細(xì)胞提供的某些生長(zhǎng)條件?；|(zhì)細(xì)胞給造血祖細(xì)胞提供了物理載體及增加干細(xì)胞量所需的某些生長(zhǎng)因子。
從未分化細(xì)胞中分離CD34+細(xì)胞(分化細(xì)胞)可通過多種不同方法實(shí)現(xiàn)。最廣泛使用的是依據(jù)將這些細(xì)胞與固定在固體載體(Cellpro，Baxter)上的抗-CD-34抗體結(jié)合的正免疫選擇。其他選擇方法包括負(fù)選擇，其中根據(jù)肽酶種類特異細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，將不表達(dá)CD34+的所有細(xì)胞從CD34+細(xì)胞中分離。
在本發(fā)明的某些具體實(shí)施中，造血細(xì)胞用不存在加入的細(xì)胞因子，基質(zhì)細(xì)胞或胸腺細(xì)胞的單體刺激。在其他具體實(shí)施中，造血細(xì)胞或胸腺細(xì)胞用不存在或存在加入的細(xì)胞因子或基質(zhì)細(xì)胞的本發(fā)明的化合物(較好地，不包括單體)刺激。申請(qǐng)人已使用本發(fā)明代表性的單體和共軛物刺激不存在細(xì)胞因子和/或基質(zhì)細(xì)胞的分離CD34+細(xì)胞(如基質(zhì)細(xì)胞已被移出)。申請(qǐng)人也已說明這樣的細(xì)胞能在液態(tài)培養(yǎng)物中刺激生長(zhǎng)和分化。這樣，本發(fā)明的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是本文所公開的方法不需要造血細(xì)胞或胸腺細(xì)胞刺激作用的基質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是本文所公開的方法和化合物對(duì)刺激人類干細(xì)胞(CD34+)是有用的。對(duì)于擴(kuò)增，這種靶細(xì)胞是很重要的靶細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兡芊只沙墒斓募?xì)胞類型，具有重要的治療應(yīng)用。不存在加入的細(xì)胞因子或基質(zhì)細(xì)胞刺激干細(xì)胞先前沒有報(bào)道過。培養(yǎng)造血細(xì)胞祖細(xì)胞的擴(kuò)增可在多種不同的培養(yǎng)容器中，在不同的培養(yǎng)條件下實(shí)施。通常，使用在先有技術(shù)方法中的用于培養(yǎng)造血細(xì)胞的相同培養(yǎng)條件使用在本文中，除了用DPIV抑制劑替代先有技術(shù)培養(yǎng)方法中的細(xì)胞因子。培養(yǎng)細(xì)胞的先有技術(shù)方案示例在下面提供。因此，通過在存在DPIV抑制劑不存在外源加入細(xì)胞因子下培養(yǎng)細(xì)胞，修改了這種方案以符合本發(fā)明的方法。
接下來分離，前體細(xì)胞在如PRMI，Iscove的DMEM，TC199，X-VIVO-10的培養(yǎng)基中溫育，較好地加入人類或胎牛血清和生長(zhǎng)因子的混合物?？梢约尤胙寤蜓獫{的濃度為5％到50％。生長(zhǎng)因子包括任何一種或所有白細(xì)胞間介素(IL-1到IL-16)，干擾素(INF-α，β和γ)，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，干細(xì)胞因子(SCF)，類胰島素生長(zhǎng)因子，纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子，血小板衍生生長(zhǎng)因子，腫瘤生長(zhǎng)因子β，腫瘤壞死因子α，粒性白細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，粒性白細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，類fms酪氨酸激酶-3配體(Fft-3)，和cKIT配體(cKL)。許多這些生長(zhǎng)因子可購(gòu)得。最常用的生長(zhǎng)因子混合物包括G-CSF，GM-CSF，SCF，IL-1，IL-3和IL-6。使用的許多生長(zhǎng)因子是通過DNA重組技術(shù)制備的并提純到各種純度。通過標(biāo)準(zhǔn)生化技術(shù)可從腫瘤細(xì)胞組的培養(yǎng)基中提純一些生長(zhǎng)因子。廣泛使用的生長(zhǎng)因子是PIXY321，它是通過重組技術(shù)制備的，并表現(xiàn)出GM-CSF和IL-3兩種活性。使用在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)因子的量取決于因子制備的活性和使用生長(zhǎng)因子的組合。一般，濃度范圍從0.5到500ng/ml。必須確定具體培養(yǎng)條件下每種生長(zhǎng)因子的最適宜濃度，因?yàn)橐恍┥L(zhǎng)因子與其他生長(zhǎng)因子協(xié)同作用。如上面所提及的，本發(fā)明的方法不包括外源加入細(xì)胞因子，而是使用DPIV抑制劑刺激培養(yǎng)物中的造血細(xì)胞。
如本文所用的，增加造血細(xì)胞的量是指，與細(xì)胞的類似對(duì)比培養(yǎng)物中存在的造血細(xì)胞的量相比增加細(xì)胞的量至少約2倍，類似對(duì)比培養(yǎng)物使用與DPIV抑制劑處理培養(yǎng)物相同的條件，除了這種對(duì)比培養(yǎng)物不與DPIV抑制劑接觸。較好地，與在類似對(duì)比培養(yǎng)物中存在的造血細(xì)胞的量相比，造血細(xì)胞的量增加至少約4倍，更好地，10倍，最好的至少20倍。
增加造血細(xì)胞量的時(shí)間段是，至少部分是，隨細(xì)胞種類變化而變化，并取決于使用的培養(yǎng)容器表面。通常，時(shí)間段從約2-3天(對(duì)于短期擴(kuò)增)到適合長(zhǎng)期輸注的細(xì)胞擴(kuò)增的幾周。此領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的常規(guī)程序可用來確定培養(yǎng)物中細(xì)胞量，是隨用DPIV抑制劑培養(yǎng)的細(xì)胞的溫育時(shí)間增加而變化的。一般，用計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量來測(cè)量擴(kuò)增(細(xì)胞量的增加)，如，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，通過測(cè)量特異染料的摻入狀況或通過確定血細(xì)胞比容。這樣，獲得上述細(xì)胞量增加倍數(shù)必要的具體生長(zhǎng)條件的最優(yōu)化及DPIV抑制劑量的選擇，僅使用常規(guī)的試驗(yàn)就可確定。這樣的常規(guī)試驗(yàn)包括，如(i)溫育時(shí)間不變變化DPIV抑制劑的量；(ii)DPIV抑制劑量不變變化溫育時(shí)間；(iii)采用前述最優(yōu)化試驗(yàn)，以確定預(yù)先選擇的細(xì)胞種類獲得預(yù)先選擇的細(xì)胞量增加倍數(shù)必需的具體條件；(iv)變化其他因素，如同一性，價(jià)位(如一價(jià)或二價(jià))，或DPIV抑制劑的狀態(tài)(可溶的或固定的)，以優(yōu)化培養(yǎng)條件來獲得所需的結(jié)果。這樣，細(xì)胞培養(yǎng)溫育時(shí)間的長(zhǎng)短是變化的，并取決于所需擴(kuò)增的程度。對(duì)于大部分應(yīng)用，時(shí)間范圍從約4天到14天。通常，通過從溫育開始細(xì)胞總量的增加，和/或通過確定培養(yǎng)物中的CD34+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，和/或通過確定與不接觸DPIV抑制劑的對(duì)比培養(yǎng)物相比細(xì)胞總量的增加，來評(píng)估液態(tài)培養(yǎng)物中的擴(kuò)增。當(dāng)細(xì)胞在35mm的培養(yǎng)皿中Iscove甲基纖維素培養(yǎng)基中溫育10到14天時(shí)，其中含適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)因子，可確定CFU-GM值。一般的起始密度是1000個(gè)細(xì)胞/ml。在溫育階段的最后，使用倒置顯微鏡評(píng)定含多于50個(gè)細(xì)胞的脊髓(CFU-GM)和紅細(xì)胞(BFU-E)起源的集落數(shù)。擴(kuò)增后，獲取細(xì)胞，在給患者輸注前用新鮮培養(yǎng)基沖洗。造血細(xì)胞與DPIV抑制劑接觸如本文所用的，造血細(xì)胞與DPIV抑制劑接觸是指，將DPIV抑制劑以使得DPIV抑制劑與細(xì)胞直接物理接觸的方式引入到培養(yǎng)物中。通常，可溶DPIV抑制劑在培養(yǎng)物中以可溶細(xì)胞因子或其他可溶生長(zhǎng)因子引入細(xì)胞培養(yǎng)物中相同的方式與細(xì)胞接觸，除了用可溶DPIV抑制劑代替先有技術(shù)中較傳統(tǒng)的細(xì)胞因子。這樣，如，可溶DPIV抑制劑可以水溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)物中，或以粉末形式(如凍干的)在細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中產(chǎn)生水溶溶液。接觸幾種代表性DPIV抑制劑的示例程序在實(shí)例中提供。
通常，不溶DPIV抑制劑以由不溶DPIV抑制劑的物理形式要求的方式在培養(yǎng)物中與細(xì)胞接觸。不溶DPIV抑制劑是指DPIV抑制劑沒有及不能放置在溶液中。因此，不溶DPIV抑制劑是指附著在不溶載體上的DPIV抑制劑。不溶載體可以是細(xì)胞培養(yǎng)容器，在這種情況下抑制劑附著在培養(yǎng)容器的培養(yǎng)物接觸表面上或，要么，不溶載體可以是顆粒形式的(如磁性顆粒，瓊脂糖凝膠)，在這種情況下抑制劑附著在顆粒表面上。因此，接觸附著在培養(yǎng)容器表面上的不溶DPIV抑制劑，涉及將細(xì)胞放置在培養(yǎng)容器中。加上適當(dāng)已知的造血細(xì)胞生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物，但不包括外源加入的細(xì)胞因子。接觸附著在顆粒上的不溶DPIV抑制劑，涉及將顆粒(干燥的或懸浮的)引入到含造血細(xì)胞的培養(yǎng)容器中?；蛘撸梢詫⒃煅?xì)胞加入到已含有可溶或不溶DPIV抑制劑的培養(yǎng)容器中。無論DPIV抑制劑的狀態(tài)是什么(可溶的或不溶的)，造血細(xì)胞與抑制劑接觸是在不存在外源加入細(xì)胞因子的情況下實(shí)施。引入DPIV抑制劑本發(fā)明的DPIV抑制劑是與DPIV結(jié)合的分子。通常有兩個(gè)類型的DPIV抑制劑(1)活性位點(diǎn)抑制劑和(2)非活性位點(diǎn)結(jié)合試劑?；钚晕稽c(diǎn)抑制劑是指與DPIV催化活性位點(diǎn)結(jié)合(共價(jià)或離子相互作用)從而抑制DPIV酶活性的試劑?；钚晕稽c(diǎn)抑制劑示例包括DPIV競(jìng)爭(zhēng)性酶抑制劑，如自然DPIV底物的過渡態(tài)擬似物(下面所描述的)。非活性位點(diǎn)結(jié)合試劑是指與DPIV蛋白質(zhì)的一個(gè)位點(diǎn)而不是活性位點(diǎn)結(jié)合(共價(jià)或離子相互作用)，并在本文所描述的條件下能刺激造血細(xì)胞或胸腺細(xì)胞的試劑。某些非活性位點(diǎn)結(jié)合試劑與DPIV(如非競(jìng)爭(zhēng)性DPIV抑制劑)的結(jié)合，可通過觀察曝露在非活性位點(diǎn)結(jié)合試劑后，DPIV酶活性的降低來檢測(cè)。非活性位點(diǎn)結(jié)合試劑的示例包括，當(dāng)與造血細(xì)胞和/或胸腺細(xì)胞在本文所描述的條件下培養(yǎng)時(shí)，選擇性地以使結(jié)合試劑能刺激這些細(xì)胞方式與DPIV結(jié)合的DPIV抗體和其片段。
測(cè)定DPIV酶活性的試驗(yàn)已有描述(W.G.Gutheil和W.W.Bachovchin，生物化學(xué)32，8723-8731(1993)；Gutheil，W.G.，和W.，B.W.Kinlsq，分析生化223，13-20(1994)；Gutheil，W.G.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，6594-6598(1994))。這些方法使用了色譜基因底物(chromatogenic)Ala-Pro-p-硝基苯胺(AppNA)和熒光底物Ala-Pro-7-氨基-4-氟代甲基香豆素(AP-AFC)。AppNA和AP-AFC可購(gòu)得(如酶系統(tǒng)產(chǎn)物EnzymeSystems Products，Dublin，CA)。這樣的方法可用作篩選試驗(yàn)以確定是否DPIV抑制劑抑制了體外DPIV的酶功能。與DPIV活性位點(diǎn)結(jié)合的DPIV抑制劑DPIV是絲氨酸蛋白酶家族中的一員，其表現(xiàn)出后脯氨酰裂解活性。因此，DPIV的自然底物是一種肽，在它的氨基末端包括，二肽Xaa-Pro，其中依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸命名法Xaa表示任何氨基酸，Pro表示脯氨酸。本發(fā)明的活性位點(diǎn)抑制劑抑制DPIV自然底物的結(jié)合和/或裂解作用。
本發(fā)明的單體活性位點(diǎn)結(jié)合抑制劑由通式I表示(I) 表面-(L)q-P1R1其中P1表示第一靶組合成分，較好地是肽，模擬DPIV底物結(jié)合位點(diǎn)；R1表示與DPIV反應(yīng)中心的功能基團(tuán)反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)；L表示任意存在的接頭分子(i)分子量范圍在約100道爾頓到約2000道爾頓，(ii)長(zhǎng)度范圍在約20A到約300A；(iii)含從包括C，O，N，S和磷原子的基團(tuán)中選取的原子鏈，由單鍵，雙鍵或三鍵連接；(iv)如果附著在一個(gè)表面上，表面密度范圍在約20A到約300A，即一個(gè)接頭分子在表面的共價(jià)附著和另一個(gè)接頭分子在表面的共價(jià)附著之間的距離。
Q是0或1，即q＝0時(shí)，接頭是不存在的，單體活性位點(diǎn)結(jié)合抑制劑沒有通過接頭附著在表面上(如組織培養(yǎng)容器表面或磁性顆粒)，當(dāng)q＝1時(shí)，接頭是存在的，單體活性位點(diǎn)抑制劑通過接頭附著在表面。在這種具體實(shí)施中，L被認(rèn)為是二價(jià)接頭，因?yàn)樗鼘我唤Y(jié)合組合成分共價(jià)結(jié)合到表面。這樣的二價(jià)接頭對(duì)此領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是已知的，在下面作更詳細(xì)的描述。
模擬DPIV底物結(jié)合位點(diǎn)的肽P1包括DPIV的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如DPIV過渡態(tài)擬似物，DPIV的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，如氟代烷基酮。這些類型的抑制劑的每一種在下面闡述。在本發(fā)明重要的具體實(shí)施中，P1是肽或擬肽(peptidomimetic)。
本發(fā)明的多價(jià)活性位點(diǎn)抑制劑由通式II表示
其中P1，R1和L為上面所定義的，q＝1；P2表示第二個(gè)靶組合成分，較好地是肽，可與第一靶組合成分相同或不同；R2表示第二個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與第一反應(yīng)基團(tuán)相同或不同；M＝1或0；N是從0到10的整數(shù)；R＝0或1；A是可與表面結(jié)合的接頭的臂，即當(dāng)r＝0時(shí)，接頭L沒有與表面結(jié)合，當(dāng)r＝1時(shí)，接頭與表面結(jié)合。
在本發(fā)明的某些具體實(shí)施中，如果P2＝P1，那么R2不存在，與R1相同或不同。通常，n是1，本發(fā)明的化合物被認(rèn)為是共軛對(duì)配合物(即P2＝P1)或復(fù)共軛對(duì)配合物(即P2≠P1)。
在某些具體實(shí)施中，L通過表面較遠(yuǎn)附著(如組織培養(yǎng)容器或磁性顆粒)。在這樣的具體實(shí)施中，L被認(rèn)為是多價(jià)接頭，因?yàn)樗鼘蓚€(gè)或多個(gè)結(jié)合組合成分彼此，以及與表面共價(jià)結(jié)合。這樣的多價(jià)接頭對(duì)此領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。
結(jié)合組合成分R1的示例是一些肽，據(jù)報(bào)道如果其與反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合形成在后脯氨酰裂解酶的活性位點(diǎn)中帶有功能基團(tuán)的共價(jià)復(fù)合物，它可用于抑制后脯氨酰裂解酶，示例在下列資料中作了描述美國(guó)專利第4,935,493號(hào)，“蛋白酶抑制劑”，頒布給Bachovchin等人(“Bachovchin’493”)；美國(guó)專利第5,462,928號(hào)，“二肽基-氨基肽酶IV類的抑制劑”，頒布給Bachovchin等人(“Bachovchin’928”)；美國(guó)專利第5,543,396號(hào)，“脯氨酸磷酸鹽衍生物”，頒布給Power等人(“Power’369”)；美國(guó)專利第5,296,604號(hào)，“用作HIV蛋白酶抑制劑的脯氨酸衍生物和組合物”，頒布給Hanko等人(“Hanko’604”)；PCT/US89/09845，“制備脯氨酸硼酸酯的方法”，及其美國(guó)在先申請(qǐng)(USSN07/796,148和07/936,198)，申請(qǐng)人BoehringerIngelheim制藥公司(“Boehringer”)；PCT/GM94/02615，“DPIV-絲氨酸蛋白酶抑制劑”，申請(qǐng)人Ferring V.V.(“Ferring”)。前述抑制劑的典型實(shí)例在下面描述，包括過渡態(tài)擬似物基抑制劑Xaa-boroPro，包括Lys-BoroPro，Pro-BoroPro和Ala-BoroPro，其中“BoroPro”是指脯氨酸的擬似物，其中羧基基團(tuán)(COOH)被boronyl[B(OH)2]基團(tuán)替代。本發(fā)明可選擇的活性位點(diǎn)抑制劑具有類似結(jié)構(gòu)，其中boronyl基團(tuán)由磷酸鹽或氟代烷基酮(下面描述)替代。此領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)同還有其他一些可以作的但不會(huì)明顯影響這些化合物結(jié)合及復(fù)合物形成特性的這樣的改變。
噬菌體展示文庫(kù)及合成化合物可從中選取的模擬DPIV底物結(jié)合位點(diǎn)的化學(xué)組合文庫(kù)的發(fā)展，使得可以確認(rèn)R1反應(yīng)基團(tuán)可共價(jià)附著的其他P1靶組合成分，其形成模擬蛋白酶底物結(jié)合位點(diǎn)的，并與蛋白酶反應(yīng)位點(diǎn)中的功能基團(tuán)形成復(fù)合物的結(jié)合組合成分?？珊Y選這樣的文庫(kù)，通過檢測(cè)存在和不存在假定噬菌體展示文庫(kù)分子或組合文庫(kù)分子的情況下的蛋白酶裂解活性，以及確定分子是否抑制蛋白酶自然底物或類似底物的裂解(如在分光光度法測(cè)試中容易檢測(cè)出的生色團(tuán)底物類似物)，來確認(rèn)非自然產(chǎn)生的假定的靶組合成分。然后，那些表現(xiàn)出蛋白酶抑制作用的噬菌體文庫(kù)和/或組合文庫(kù)可共價(jià)結(jié)合在本文所公開的反應(yīng)基團(tuán)R1上，并再一次測(cè)試以確定這些新型分子是否選擇性地與蛋白酶結(jié)合(如通過重復(fù)上面描述的篩選測(cè)試)。以這種方式，提供了一種測(cè)試確認(rèn)本發(fā)明非自然產(chǎn)生的靶組合成分的簡(jiǎn)單、迅捷的篩選方法。
通常，本發(fā)明的第一結(jié)合組合成分，P1，通過羧基基團(tuán)在氨基酸羧基末端與第一反應(yīng)基團(tuán)R1共價(jià)結(jié)合。如本文所用的，R1是指能與DPIV反應(yīng)中心的功能基團(tuán)反應(yīng)的反應(yīng)基團(tuán)。通過與這種靶蛋白酶反應(yīng)中心的反應(yīng)，意味著R1與位于活性位點(diǎn)的功能基團(tuán)形成了共價(jià)鍵或強(qiáng)的離子相互作用。包含在本發(fā)明中的R1反應(yīng)基團(tuán)包括在頒布給Bachovchin等人的美國(guó)專利第4,935,493，“蛋白酶抑制劑”中稱作基團(tuán)“T”的反應(yīng)基團(tuán)。這些包括硼酸鹽基團(tuán)，磷酸鹽基團(tuán)，和氟代烷基酮基團(tuán)，硼酸鹽基團(tuán)示例在下面和實(shí)例中描述。磷酸鹽和氟代烷基酮基團(tuán)在下面描述。通常，較好地，靶組合成分的羧基末端與反應(yīng)基團(tuán)之間的連接應(yīng)是L形。又一種較好的情況是，反應(yīng)基團(tuán)與活性位點(diǎn)中的功能基團(tuán)形成共價(jià)鍵，然而，為了在結(jié)合組合成分和活性位點(diǎn)之間形成復(fù)合物，形成共價(jià)鍵不是必需條件。
貫穿這份申請(qǐng)，使用了傳統(tǒng)術(shù)語命名異構(gòu)體，如在下面及在此領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的適當(dāng)課本中所述的(參閱，生化原理，編輯A.L.Lehninger，99-100頁，價(jià)值出版公司(1983)紐約，NY；有機(jī)化學(xué)，Morrison和Boyd，第三版，第四章，Allyn和Bacon公司，MA(1978)，參閱專利合作條約公布的申請(qǐng)WO93/10127，申請(qǐng)?zhí)朜o.PCT/US92/09845)。
所有氨基酸，除了氨基乙酸，含有不對(duì)稱或手性碳原子并可能含有多于一個(gè)手性碳原子。氨基酸的不對(duì)稱α碳原子稱作手性中心，能以兩種不同的異構(gòu)體形式出現(xiàn)。除了它們能產(chǎn)生平面偏振光旋轉(zhuǎn)的方向外，這些形式在所有化學(xué)及物理特性上是一致的。這些氨基酸稱作具有“光學(xué)活性”，即氨基酸能以一個(gè)方向或另一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)平面偏振光。
附著在α碳原子上的四個(gè)不同的取代基可以占據(jù)空間上兩種不同的排列。這些排列彼此不是可疊加的鏡像，稱作光學(xué)異構(gòu)體，對(duì)映體，或立體異構(gòu)體。給定氨基酸的一種立體異構(gòu)體的溶液會(huì)向左旋轉(zhuǎn)平面偏振光，叫做左旋異構(gòu)體〔命名為(-)〕；氨基酸的另一種立體異構(gòu)體會(huì)以相同的程度但向右旋轉(zhuǎn)，叫做右旋異構(gòu)體〔命名為(+)〕。
更系統(tǒng)的分類和命名立體異構(gòu)體的方法是不對(duì)稱碳原子(如α碳原子)周圍的四面(tetrahedryin)中的四個(gè)不同取代基的絕對(duì)構(gòu)型。為了建立這個(gè)系統(tǒng)，選擇參照化合物(甘油醛)，是含不對(duì)稱碳原子最小的糖。按照此領(lǐng)域的慣例，甘油醛的兩個(gè)立體異構(gòu)體稱為L(zhǎng)和D。通過x-射線分析已建立了它們的絕對(duì)構(gòu)型。參考甘油醛的絕對(duì)構(gòu)型，命名L和D也已用來命名氨基酸。這樣，手性化合物的立體異構(gòu)體的構(gòu)型與L-甘油醛構(gòu)型相關(guān)的稱為L(zhǎng)，立體異構(gòu)體的構(gòu)型與D-甘油醛相關(guān)的稱為D，不論它們旋轉(zhuǎn)平面偏振光的方向是什么。這樣，符號(hào)L和D指手性碳周圍四個(gè)取代基的絕對(duì)構(gòu)型。
通常，含手性中心的自然產(chǎn)生化合物是僅以一種立體異構(gòu)形式存在，是D或是L。自然產(chǎn)生氨基酸是L立體異構(gòu)體；然而，本發(fā)明包括能以D立體異構(gòu)體構(gòu)型存在的氨基酸。
在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)氨基酸能用D和L系統(tǒng)清楚地命名。然而有兩個(gè)或兩個(gè)以上的手性中心的化合物可有2n種可能的立體異構(gòu)體構(gòu)型，其中n是手性中心數(shù)。這些立體異構(gòu)體有時(shí)使用RS系統(tǒng)命名，以更清楚地說明含兩個(gè)或更多手性中心的氨基酸的構(gòu)型。如，化合物如蘇氨酸異亮氨酸含兩個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此有四種立體異構(gòu)體構(gòu)型。含兩個(gè)手性中心的化合物的異構(gòu)體叫做非對(duì)映異構(gòu)體。有關(guān)命名氨基酸光學(xué)異構(gòu)體的RS系統(tǒng)的全面討論在上文生化原理中，編輯A.L.Lehninger，99-100頁提供。下面是這個(gè)系統(tǒng)的簡(jiǎn)介。
發(fā)明RS系統(tǒng)是為了避免當(dāng)化合物含兩個(gè)或多個(gè)手性中心時(shí)的不明確。通常，當(dāng)最小或最低等級(jí)基團(tuán)指向遠(yuǎn)離觀察者時(shí)，系統(tǒng)以原子數(shù)減少的順序或以價(jià)密度減少的順序，評(píng)定不對(duì)稱碳原子周圍的四個(gè)不同取代原子來命名。等級(jí)在此領(lǐng)域中是熟知的并在Lehninger，99頁有描述。如果減小等級(jí)順序是順時(shí)針的，則手性中心周圍的構(gòu)型為R型；如果減小等級(jí)順序是逆時(shí)針的，最則構(gòu)型是S型的。因此每個(gè)手性中心可使用這個(gè)系統(tǒng)命名。采用這個(gè)系統(tǒng)命名蘇氨酸，此領(lǐng)域中技術(shù)人員會(huì)確定命為L(zhǎng)-蘇氨酸在RS系統(tǒng)中為(2S，3R)-蘇氨酸。對(duì)于蘇氨酸，L-，D-，L-同分異構(gòu)，和D-同分異構(gòu)更傳統(tǒng)的命名已公用一段時(shí)間了，并且此領(lǐng)域中的技術(shù)人員仍在使用。而RS系統(tǒng)越來越多地使用在命名氨基酸中，特別是那些含多于一個(gè)手性中心的氨基酸中。
在本發(fā)明特別推薦的具體實(shí)施中，boroProline化合物是Val-boroProline化合物。“Val-boroProline化合物”是指其中羧基末端boroProline通過肽鍵依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)肽化學(xué)與纈氨酸氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合的化合物。纈氨酸氨基酸，任意地，進(jìn)一步通過肽鍵與其他氨基酸殘基結(jié)合，只要其他的氨基酸殘基不抑制Val-boroProline化合物與CD26結(jié)合的能力。在最好的具體實(shí)施中，本發(fā)明的化合物是Val-boroProline(也稱作“PT-100”)。由于存在于氨基酸殘基上的和附著在硼原子上的碳中的手性碳原子，Val-boroPro可以多種異構(gòu)體形式存在(a)L-Val-S-boroPro，(b)L-Val-R-boroPro，(c)D-Val-S-boroPro，(d)D-Val-R-boroPro。更好的，化合物是L-Val-S-boroPro或L-Val-R-boroPro。類似地，本發(fā)明的其他boroProline化合物能以多種異構(gòu)體形式存在；然而，通常其中每個(gè)氨基酸的手性中心有“L-”構(gòu)型，R或S構(gòu)型的boroPro形式是化合物較好的形式。
本發(fā)明帶第一反應(yīng)基團(tuán)P1R1的第一靶組合成分是硼酸脯氨酸，可以認(rèn)為具有結(jié)構(gòu)
(a)其中B是硼，(b)其中Y1和Y2的每一個(gè)分別從含羥基基團(tuán)和在生理性條件下轉(zhuǎn)化成羥基基團(tuán)的反應(yīng)基團(tuán)中選取。
(c)其中-A3-A4-具有結(jié)構(gòu)
(d)其中D1-A1-A2是含有從下列基團(tuán)選取的結(jié)構(gòu)的氨基酸
其中R表示氨基酸的側(cè)鏈。
這些硼酸脯氨酸通過氨基肽鍵和/或化學(xué)交聯(lián)試劑與第二靶組合成分P2連接，通過氨基酸側(cè)鏈R，如抗原肽的側(cè)鏈，形成上上述的化合物。[P2(R2)m]n-(L)q-P1R1]。示例肽包括自動(dòng)免疫疾病抗原肽，傳染疾病抗原肽和過敏疾病抗原肽。較好的抗原肽是與T細(xì)胞表面受體或B細(xì)胞表面受體結(jié)合的肽，如TCR/CD3，CD2，CD4，CD8，CD10，CD26，CD28，CD40，CD45，B7.1和B7.2。
或者，反應(yīng)組合成分可以是氟代烷基酮或磷酸鹽基團(tuán)。本發(fā)明的反應(yīng)基團(tuán)是具有如下通式的氟代烷基酮反應(yīng)基團(tuán)
其中G是H，F(xiàn)或含1到約20個(gè)碳原子和任意N，S或O雜原子的烷基基團(tuán)。如本文所用的，本發(fā)明的反應(yīng)基團(tuán)是具有如下通式的磷酸鹽基團(tuán)
其中每個(gè)J，分別地，是O-烷基，N-烷基，或烷基(含約1-20個(gè)碳原子)和，任意地，可以是n＝N，S，或O的雜原子。含過氟代烷基基團(tuán)，苯基基團(tuán)或取代苯基的脯氨酸磷酸鹽的并依據(jù)本發(fā)明的方法能使用的衍生物的其他示例在美國(guó)5,543,369(“Power’369”)中作了描述。對(duì)于與蛋白酶(如絲氨酸蛋白酶或半光胱氨酸蛋白酶)反應(yīng)中心反應(yīng)的，其他有用的反應(yīng)基團(tuán)酮酰胺，酮酸，酮酯在PCT/US91/09801，“肽，酮酰胺，酮酸和酮酯”中作了描述，申請(qǐng)人“Georgia技術(shù)研究公司(“GA Tech”)，要求1990年12月28日提交的U.S.635,287的優(yōu)先權(quán)。
在某些具體實(shí)施中，反應(yīng)基團(tuán)是從具有如下通式的基團(tuán)中選取的
，α酮酰胺
其中R是烷基或芳基基團(tuán)并可以是取代的或未取代的，α酮酯；
，α酮酰胺本發(fā)明的反應(yīng)基團(tuán)還包括在PCT/GB94/02615，“DPIV-絲氨酸蛋白酶抑制劑”(Ferring)中所描述的反應(yīng)基團(tuán)。這些包括上述的boronyl基團(tuán)[B(OH)2]，以及pyrrolidides和下列反應(yīng)基團(tuán)，其中任何基團(tuán)可以是取代的或未取代的，只要取代基不對(duì)反應(yīng)基團(tuán)的功能活性或其附著的結(jié)合組分CN，C＝-C，CHO和CH＝NPh有不利影響，其中Ph指苯基。這些實(shí)例僅是說明性的，不是限制本發(fā)明的范圍。如在Ferring中所描述的，含這些典型反應(yīng)基團(tuán)的化合物可通過E.Schon等人在生物化學(xué)Hoppe-Seyler372305-311(1991)中和W.W.Bachovchin等人在生化期刊2653738-3743(1990)中所描述的常規(guī)途徑的修正方法來制備。(參閱上面參考的Bachovchin美國(guó)專利。)
第二靶組合成分P2，與在與第一靶組合成分結(jié)合的相同或不同細(xì)胞的表面上的分子相結(jié)合。較好地，第二靶組合成分與存在于T細(xì)胞表面或B細(xì)胞表面上的分子(如受體，主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子)結(jié)合。在某些具體實(shí)施中，第二靶組合成分具有模擬存在于涉及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞上的蛋白酶的底物結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。這樣，第二靶組合成分可與第一靶組合成分相同，本發(fā)明的化合物可用來將DPIV分子交聯(lián)在相同或不同細(xì)胞上。如本發(fā)明的化合物可用來交聯(lián)在第一細(xì)胞上的第一蛋白酶(如后脯氨酰裂解酶)和在相同或不同的第二細(xì)胞表面表達(dá)的第二蛋白酶(如胰島素，胰凝乳蛋白酶，彈性蛋白酶或其他絲氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶)。在某些較好的具體實(shí)施中，第一和第二靶組合成分是一致的(即P1＝P2)，第二反應(yīng)基團(tuán)R2可以是不存在的(即m＝0)，與第一反應(yīng)基團(tuán)R1相同的或不同的(R1≠R2)。包括相同的P1和P2基團(tuán)和相同的R1和R2基團(tuán)的化合物被稱作“共軛對(duì)配合物”，在另一些其他具體實(shí)施中，第一和第二靶組合成分是不同，這些化合物被稱作“復(fù)共軛對(duì)配合物”。
在其他具體實(shí)施中，第二靶組合成分是選擇性與抗原存在細(xì)胞表面上的MHC分子結(jié)合的抗原。本發(fā)明這樣的具體實(shí)施對(duì)抗原(如腫瘤)特異T細(xì)胞擴(kuò)增是有用的。這樣，依據(jù)本發(fā)明的相關(guān)方面，上面描述的包括是抗原(如腫瘤-特異抗原)的第二靶組合成分P2的DPIV抑制劑，通?？捎脕泶碳細(xì)胞種類的造血祖細(xì)胞(通過第一靶組合成分)，以及特異擴(kuò)增外周血液T細(xì)胞亞群以獲取抗原特異T細(xì)胞。具體地，這些的化合物對(duì)于擴(kuò)增這種T細(xì)胞亞群以豐富抗原特異T細(xì)胞是有用的。這樣，本發(fā)明提供了一種協(xié)同體外造血細(xì)胞刺激作用和抗原特異T細(xì)胞擴(kuò)增的改進(jìn)方法。這可治療抗殘留腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)，或加強(qiáng)在同種異體移植中抗腫瘤T細(xì)胞的活性。它還可用來進(jìn)行與不利治療條件有關(guān)的對(duì)腫瘤抗原，病原抗原和其他抗原特異的外周記憶T細(xì)胞體外擴(kuò)增。這樣，依據(jù)前述方法可使用的抗原包括病原特性抗原和癌癥抗原。
前述方法和組合物也可用來進(jìn)行，用于基因治療的含異源核酸(如編碼治療蛋白質(zhì)或肽的反義寡聚核苷酸，核酸)的逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體轉(zhuǎn)染后的干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。異源核酸已被體外引入的干細(xì)胞，可使用已知的移植轉(zhuǎn)染細(xì)胞到人體中作基因治療的方法移植到受體中。參閱如美國(guó)專利編號(hào)No.5,399,346(“基因治療”)頒布給Anderson等人；PCT國(guó)際申請(qǐng)編號(hào)No.PCT/US92/1890(公布號(hào)No.WO92/15676，“體細(xì)胞基因治療”，要求1991年3月8日提交的美國(guó)序列號(hào)No.667,169優(yōu)先權(quán)，，發(fā)明者I.M.Verma)；PCT國(guó)際申請(qǐng)編號(hào)No.PCT/US89/05575(公布號(hào)No.WO90/06997，“基因工程內(nèi)皮細(xì)胞和其應(yīng)用”，要求1989年12月8日提交的美國(guó)序列號(hào)No.283,568，的優(yōu)先權(quán)，發(fā)明者Anderson，W.F.等人)。
具有腫瘤抗原特性的抗原一般是從細(xì)胞表面，細(xì)胞質(zhì)，核子，細(xì)胞器官，及腫瘤組織細(xì)胞類似物中獲取的。實(shí)例包括腫瘤蛋白質(zhì)特性的抗原，包括由突變癌基因編碼的蛋白質(zhì)；與腫瘤有關(guān)的濾過性病毒蛋白質(zhì)；腫瘤粘液素和糖脂素。腫瘤包括，但不限于此，下列部位的癌癥和種類的癌癥唇，鼻咽，咽和口腔，食道，胃，結(jié)腸，直腸，肝，膽囊，膽汁樹，胰腺，喉，肺和支氣管，皮膚惡性黑素瘤，乳腺，宮頸，子宮，卵巢，膀胱，腎，腦和神經(jīng)系統(tǒng)的其他部位，甲狀腺，前列腺，睪丸，Hosgkin癥，非Hosgkin淋巴瘤，多骨髓瘤和白血病。與腫瘤有關(guān)的濾過性病毒蛋白質(zhì)是那些上面提及的病毒種類。腫瘤的抗原特性可能是，通常不是由腫瘤前體細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)，或可能是通常在腫瘤前體細(xì)胞中表達(dá)但有腫瘤突變特性的蛋白質(zhì)。腫瘤抗原特性可以是具有改變活性或亞細(xì)胞分布的正常蛋白質(zhì)的突變體?；蛲蛔儺a(chǎn)生腫瘤抗原，除了那些上面所定義的，還可能在編碼區(qū)域，5’或3’非編碼區(qū)域，或基因內(nèi)含子中，并可能是點(diǎn)突變，移碼，缺失，插入，重復(fù)，染色體重排等的結(jié)果。此領(lǐng)域中普通技術(shù)人員對(duì)產(chǎn)生腫瘤抗原的正常基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的多種變更是熟悉的。腫瘤抗原的具體實(shí)例包括蛋白質(zhì)如B細(xì)胞淋巴瘤免疫球蛋白個(gè)體基因型，黑素瘤突變體依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶4，黑素瘤的Pmel-17(gp100)，黑素瘤的MART-1(Melan-A)，黑素瘤的p15蛋白，黑素瘤的酪氨酸酶，黑素瘤，甲狀腺髓質(zhì)素，小細(xì)胞肺癌，結(jié)腸和/或支氣管鱗狀細(xì)胞癌的MAGE1，2和3，膀胱，黑素瘤，乳腺，和鱗狀細(xì)胞癌的BSGA，黑素瘤的gp75，黑素瘤的癌胚抗原；碳水化合物和/或脂質(zhì)如乳腺，胰腺，和卵巢癌的muc1粘液素，黑素瘤的GM2和GD2神經(jīng)節(jié)苷脂；癌基因如癌的突變體p53，結(jié)腸癌的突變體ras和乳腺癌的HER-2/neu原-癌基因；濾過性病毒產(chǎn)物如宮頸和食道鱗狀細(xì)胞癌的人類乳突淋瘤病毒蛋白。還考慮到的是，類蛋白腫瘤抗原可由HLA分子作為從整體蛋白質(zhì)中衍生的特異肽而提呈。蛋白質(zhì)代謝過程產(chǎn)生抗原肽在此領(lǐng)域中是眾所周知的；如參閱美國(guó)專利第5,342,774(Boon等人)號(hào)。
本發(fā)明較好的腫瘤抗原包括黑素瘤腫瘤抗原(如MAGE蛋白質(zhì)家族(MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3)；MART-1(肽27-35)；和gp100)；和結(jié)腸癌抗原(如突變的APC基因產(chǎn)物的肽)。特別推薦的黑素瘤腫瘤抗原序列由Slingluff等人在Curr.Opin.In Immunol6733-740(1994)中報(bào)道
MAGE蛋白質(zhì)家族也報(bào)道與不止一種類型的癌癥有關(guān)MAGE-1(如黑素瘤，小細(xì)胞肺癌，甲狀腺髓質(zhì)癌)，MAGE-2(如黑素瘤，小細(xì)胞肺、結(jié)腸癌，支氣管鱗狀細(xì)胞和甲狀腺髓質(zhì)癌)，和MAGE-3(如黑素瘤，小細(xì)胞肺、結(jié)腸、支氣管鱗狀細(xì)胞和甲狀腺髓質(zhì)癌)。關(guān)于其他腫瘤抗原(如P1A，聯(lián)接蛋白37，MAGE-1，MAGE-3，MART1/Aa，gp100，酪氨酸酶)和/或有關(guān)選取腫瘤抗原的組織分布的資料參閱，Morioka等人的“人類黑素瘤中獲取的十肽(Gln-Asp-Leu-Thr-Met-Lys-Tyr-Gln-lle-Phe)由黑素瘤患者中的CTL識(shí)別”，J.Immuol.1535650(1994)。
特別推薦的腫瘤抗原是突變的APC基因產(chǎn)物的肽，由Townsend等人在自然371662(1994)中報(bào)道
在可選擇的具體實(shí)施中，第二靶組合成分是選擇性地與表達(dá)在細(xì)胞(較好的是T細(xì)胞或B細(xì)胞)表面上的受體結(jié)合的配體。具有能由本發(fā)明的第二靶組合成分模擬的自然產(chǎn)生配體的受體示例包括從下列基團(tuán)中選取的受體CD2、TCR/C3、CD4、CD8、CD10、CD26、CD28、CD40、CD44、CD45、B7.1、和B7.2。依據(jù)其他具體實(shí)施，第二靶組合成分是選擇性地與表達(dá)在細(xì)胞表面的抗原表位結(jié)合的抗體或抗體片段。抗原表位可以是部分任何前述受體。
不論第二靶組合成分的屬性是什么，噬菌體展示和其他類型的組合文庫(kù)都可以用上述方法類似的方法篩選，以鑒別用于形成本發(fā)明的化合物的非自然產(chǎn)生的靶組合成分。不與DPIV活性位點(diǎn)結(jié)合的DPIV抑制劑(非活性位點(diǎn)結(jié)合試劑)非活性位點(diǎn)結(jié)合試劑是(i)選擇性地與DPIV在不是活性位點(diǎn)的位置上結(jié)合的及(ii)能在本文所描述的條件下刺激造血細(xì)胞和/或胸腺細(xì)胞的試劑。某些非活性位點(diǎn)DPIV結(jié)合試劑(如非競(jìng)爭(zhēng)性DPIV抑制劑)也抑制DPIV的酶活性。對(duì)DPIV酶活性的抑制作用可以測(cè)定，如通過在存在或不存在假定DPIV抑制劑的情況下，測(cè)定DPIV的蛋白酶解裂解酶活性，確定是否抑制劑抑制這種DPIV的酶活性。較好地，這樣的結(jié)合試劑是選擇性地結(jié)合DPIV的分離多肽。分離結(jié)合多肽包括抗體和抗體片段(如Fab，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)d和包括選擇性地與DPIV結(jié)合的CDR3區(qū)域的抗體片段)。較好的分離結(jié)合多肽是與在DPIV催化位點(diǎn)上或附近的抗原表位結(jié)合的多肽。
因此，本發(fā)明涉及在本文所公開的條件下，使用能選擇性地與DPIV結(jié)合并刺激造血細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的抗體或抗體片段。抗體包括多克隆和單克隆抗體，依據(jù)傳統(tǒng)方法制備。
重要的是，正如此領(lǐng)域中所熟知的，抗體分子只有一小部分，即互補(bǔ)位，涉及抗體與抗原表位的結(jié)合(通常參閱，Clark，W.R.(1986)現(xiàn)代免疫試驗(yàn)基礎(chǔ)，Wiley&Sons公司，紐約；Roitt，I.(1991)基礎(chǔ)免疫學(xué)，第7版，Blackwell科學(xué)出版社，牛津)。如pFc和Fc區(qū)域是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的效應(yīng)子但不涉及抗原結(jié)合。PFc’區(qū)域已被酶裂解的，或制備沒有PFc’區(qū)域的抗體，命名為F(ab’)2片段，保留著整體抗體分子的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。同樣地，F(xiàn)c區(qū)域已被酶裂解的，或制備沒有Fc區(qū)域的抗體，命名為Fab片段，保留著整體抗體分子的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段包括共價(jià)鍵合抗體輕鏈和一部分表示Fd的抗體重鏈。Fd片段是抗體特異性的主要決定因素(單一Fd片段可能與多達(dá)十種不同的輕鏈有關(guān)并且沒有改變抗體的特異性)，F(xiàn)d在分離中保留著抗原結(jié)合能力。
如此領(lǐng)域中所熟知的，在抗體的抗原結(jié)合部分中有互補(bǔ)性確定區(qū)域(CDRs)，其直接與抗原的表位作用，和構(gòu)架區(qū)域(FRs)，其維持著互補(bǔ)位的三級(jí)結(jié)構(gòu)(參閱，Clark，1986；Roitt，1991)。在重鏈Fd片段和免疫球蛋白IgG的輕鏈中有分別由三個(gè)互補(bǔ)性確定區(qū)域(CDR1到CDR3)分離的四個(gè)構(gòu)架區(qū)域(FR1到FR4)。CDRs，具體地是CDR3，更具體地是重鏈CDR3決定著抗體特異性。
哺乳動(dòng)物抗體的非-CDR區(qū)域可用同特異性或異特異性抗體的相同區(qū)域替代，并保持著原抗體的抗原表位特異性，目前這一點(diǎn)在此領(lǐng)域中已非常確實(shí)。這一點(diǎn)在發(fā)展和使用“人化”抗體中非常清楚地表現(xiàn)出來，其中非人類CDRs與人類FR和/或Fc/pFc’區(qū)域共價(jià)結(jié)合制備功能抗體。這樣，如PCT國(guó)際公告號(hào)WO92/04381中公開了制備和使用其中至少部分鼠科FR區(qū)域被人類FR區(qū)域替代的人化的鼠科RSV抗體。這樣的抗體，包括整體抗體的帶有抗原結(jié)合能力的片段，常稱為“嵌合”抗體。
這樣，此領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將會(huì)明了的是，本發(fā)明還提供F(ab’)2，F(xiàn)ab，F(xiàn)v和Fd片段；其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域已被同源人類或非人類序列替代的嵌合抗體；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域已被同源人類或非人類序列替代的嵌合F(ab’)2片段抗體；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)域已被同源人類或非人類序列替代的嵌合Fab片段抗體；其中FR和/或CDR1和/或CDR2區(qū)域已被同源人類或非人類序列替代的嵌合Fd片段抗體。本發(fā)明還包括所謂的單鏈抗體。這樣，本發(fā)明涉及與DPIV特異結(jié)合并抑制其功能活性的多種大小和種類的多肽。這些多肽也可從不是抗體技術(shù)的來源獲得。如，這樣的多肽結(jié)合試劑可通過簡(jiǎn)并肽文庫(kù)提供，肽文庫(kù)可容易地制備成溶液或固定形式或如噬菌體展示文庫(kù)。也可合成含一種或多種氨基酸的肽的組合文庫(kù)。另外也可合成肽和非肽合成組合成分的文庫(kù)。
依據(jù)本發(fā)明，噬菌體展示在鑒別結(jié)合肽應(yīng)用中是特別有效的。簡(jiǎn)單地講，制備噬菌體文庫(kù)(如使用m13，fd，λ噬菌體)，使用傳統(tǒng)工藝展示從4個(gè)到約80個(gè)氨基酸殘基的插入。這些插入可表示完全的簡(jiǎn)并或偏性排列。然后可選擇與DPIV結(jié)合的帶噬菌體的插入。通過對(duì)與DPIV結(jié)合的噬菌體幾個(gè)周期的再選擇，可重復(fù)這個(gè)過程。重復(fù)循環(huán)致使豐富了帶噬菌體特別序列?？蓪?shí)施DNA序列分析以鑒別表達(dá)多肽的序列?？梢源_定與DPIV結(jié)合序列的最小線性部分?？墒褂煤ú糠只蛉孔钚【€性部分加其上游或下游的一個(gè)或多個(gè)其他簡(jiǎn)并殘基的插入的偏性文庫(kù)重復(fù)這個(gè)過程。這樣，DPIV，其胞外域，或類似物可用來篩選肽文庫(kù)，包括噬菌體展示文庫(kù)，以鑒別和選擇DPIV胞外部分的肽結(jié)合對(duì)。然后，這樣選擇的分子在篩選試驗(yàn)中檢測(cè)，測(cè)定結(jié)合試劑抑制DPIV功能活性的能力，如DPIV的酶功能活性或刺激造血細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化的活性。上面提及的選擇性結(jié)合DPIV的結(jié)合試劑，直接或間接地(通過接頭)附著在培養(yǎng)容器，或采用上述有關(guān)DPIV活性位點(diǎn)抑制劑附著這種表面相同類型的化學(xué)反應(yīng)附著其他表面。接頭和靶組合成分P1的附著接頭以對(duì)靶組合成分與它們分別的靶結(jié)合對(duì)的結(jié)合能力沒有不利影響的方式，與第一和(任意地)第二靶組合成分P1和P2共價(jià)結(jié)合。較好地，這樣的接頭還包括附著靶組合成分與培養(yǎng)容器，其他表面和/或其他靶組合成分的功能基團(tuán)。較好的接頭L的長(zhǎng)度是，當(dāng)它位于一個(gè)結(jié)合組合成分和第二個(gè)結(jié)合組合成分或表面之間時(shí)，組合成分之間或組合成分與表面之間的最小長(zhǎng)度為約20埃。較好地，這個(gè)距離為從20到60埃，更好是從30到50埃。接頭示例，包括有關(guān)接頭組合物，大小，和接頭和靶組合成分的結(jié)合方法的描述在下面提供。通常，這樣的接頭可以購(gòu)得(參閱如Pierce目錄和手冊(cè)，Rockford，Ill)，并使用此領(lǐng)域中普通技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)結(jié)合方法與靶組合成分結(jié)合。
通常，接頭L含至少兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)。同二價(jià)交聯(lián)劑可含兩個(gè)相同的反應(yīng)基團(tuán)，異二價(jià)交聯(lián)劑含兩個(gè)不同的反應(yīng)基團(tuán)。其他含多于兩個(gè)可以是相同(同多價(jià))或不同(異多價(jià))的反應(yīng)基團(tuán)的多價(jià)交聯(lián)劑也可使用。一般，本發(fā)明的接頭通過氨基或巰基，將靶組合成分P1與第二靶組合成分或表面結(jié)合，這是因?yàn)檫@樣的功能基團(tuán)普遍地在用于形成固定蛋白質(zhì)的載體物質(zhì)的蛋白質(zhì)和聚合物中發(fā)現(xiàn)。胺反應(yīng)基團(tuán)包括酰亞胺酯和N-羥基succinimidyl(NHS)酯。巰基反應(yīng)基團(tuán)包括順丁烯二酰亞胺，烷基和芳基鹵化物，α-鹵代乙酰基和吡啶基二硫化物。大多數(shù)可購(gòu)得的異二價(jià)交聯(lián)基含胺反應(yīng)功能基團(tuán)。一端是胺反應(yīng)基團(tuán)，另一端是巰基反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)劑相當(dāng)普遍。其他可購(gòu)得的交聯(lián)劑是，通過反應(yīng)基團(tuán)而不是氨基或巰基，將靶組合成分P1與另一個(gè)靶組合成分，表面或其他靶組合成分結(jié)合，如通過羥基，羧基，酚類或碳水化合物類基團(tuán)。碳化二亞胺也可用來結(jié)合羧基和伯胺或酰肼，致使形成酰胺或腙鍵。靶組合成分P1附著培養(yǎng)容器或其他表面依據(jù)本發(fā)明方法的應(yīng)用，蛋白質(zhì)、肽和其他分子能固定在固相基質(zhì)上。基質(zhì)可以是瓊脂糖，玻珠，聚合物，聚苯乙烯板或球，多孔玻璃或玻璃片，硝化纖維或其他膜物質(zhì)。一些載體可以是活性的，直接與配體結(jié)合。其他載體是用親核試劑或其他使用交聯(lián)劑能與蛋白質(zhì)或其他配體結(jié)合的功能基團(tuán)制備的。
本發(fā)明在固相載體上固定DPIV抑制劑可采用常規(guī)結(jié)合化學(xué)作用實(shí)施。通常，易接近的第一功能基團(tuán)(如乙醇基團(tuán))包含在化合物中，通過在允許第一和第二功能基團(tuán)彼此反應(yīng)形成共價(jià)鍵(如酯鍵)的條件下，將化合物與含互補(bǔ)的第二功能基團(tuán)(如羧基基團(tuán))的固體載體接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間，將本發(fā)明的化合物固定?！耙捉咏摹鄙婕肮δ芑鶊F(tuán)，其意指功能基團(tuán)的形式是活性的，并在空間上不妨礙與固體載體反應(yīng)。附著可以是直接的或是間接的(即通過接頭L)。
將本發(fā)明化合物固定到固體載體上的功能基團(tuán)可以引入到肽結(jié)合組合成分或這些化合物的接頭蛋白質(zhì)中。如在它們的側(cè)鏈(如天門冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸殘基)含功能基團(tuán)的氨基酸，可在合成期間摻入到結(jié)合組合成分肽中，并定位在距與靶蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)基團(tuán)足夠遠(yuǎn)的位置，以避免在化合物和其靶蛋白質(zhì)反應(yīng)中固體載體旁邊有不需要的空間障礙?；蛘?，本發(fā)明的化合物可通過接頭分子中的功能接頭固定在固體載體上。這樣，如使用在本發(fā)明這個(gè)方面的接頭包括，除與第一和第二肽結(jié)合組合成分結(jié)合的第一和第二接頭反應(yīng)基團(tuán)外，還有與固體載體結(jié)合的其他功能基團(tuán)。這種類型的多價(jià)接頭示例在下面演示。這樣的多價(jià)接頭可購(gòu)得，并且此領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員只采用常規(guī)試驗(yàn)就能合成
為了預(yù)防負(fù)反應(yīng)，較好的是用來結(jié)合接頭分子與肽結(jié)合組合成分的接頭反應(yīng)基團(tuán)，應(yīng)與用來結(jié)合接頭與固體載體的功能基團(tuán)不同。這樣的功能基團(tuán)可在合成接頭分子之后或期間的任何時(shí)候引入到接頭分子中。這樣，通常，在此領(lǐng)域中已建立的，使用接頭分子結(jié)合如蛋白質(zhì)或肽與另一個(gè)蛋白質(zhì)或肽、或固體載體的相同類型功能基團(tuán)，保護(hù)/脫保護(hù)反應(yīng)和試劑，反應(yīng)條件，都可用來將本發(fā)明的化合物固定在固體載體上。
包括在詳述最后的是演示可購(gòu)得的典型樣品交聯(lián)劑的表，如從Pierce目錄和手冊(cè)，Rockford，Ill.中。表中還確定了接頭是活性的基團(tuán)，如巰基，羧基。
培養(yǎng)容器和表面可以使用的容器很多?？少?gòu)得的溫育容器包括攪拌燒瓶(Corning公司，Corning，紐約)，攪拌釜式反應(yīng)器(Verax，Lebanon，新罕布什爾)，氣鼓式反應(yīng)器，懸浮細(xì)胞反應(yīng)器，細(xì)胞吸附反應(yīng)器和細(xì)胞捕集反應(yīng)器，培養(yǎng)皿，多孔板，燒瓶、袋和中空纖維裝置，細(xì)胞泡沫(細(xì)胞基質(zhì))，最大吸附板(NUNC)和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(如Aastrom細(xì)胞制備系統(tǒng)，參閱美國(guó)專利第5,635,386號(hào)，題目為“在人類造血細(xì)胞培養(yǎng)中制備的特異細(xì)胞種系的調(diào)節(jié)方法”，頒布給Palsson等人；美國(guó)專利第5,646,043號(hào)，題目為“體外復(fù)制人類干細(xì)胞和/或擴(kuò)增人類祖細(xì)胞的方法”，頒布給Emerson等人)。Aastrom培養(yǎng)裝置是使用特異培養(yǎng)基交換培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴(kuò)增人類干細(xì)胞的溫育箱。據(jù)報(bào)道，這種裝置可用來擴(kuò)增所有種類的造血細(xì)胞包括如，干細(xì)胞，祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，但不包括淋巴細(xì)胞。通常，使用上述培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)物通過多種技術(shù)保持在吸附狀態(tài)，包括攪拌，振搖或用玻珠方式吸附。通常，這種容器由一種或多種下列成分構(gòu)成聚苯乙烯，聚丙烯，丙烯酸，尼龍，和玻璃。對(duì)于其中第一靶組合成分P1附著在容器表面上的具體實(shí)施，可使用傳統(tǒng)固定技術(shù)將組合成分附著在表面上，直接或通過接頭L。
上面列出的不溶基質(zhì)自身不含附著本發(fā)明化合物的功能基團(tuán)，因此必須進(jìn)行化學(xué)修飾，過程稱為激活。如聚苯乙烯可通過苯基殘基氯甲基化作用被激活(Pierce化學(xué)目錄和手冊(cè)；組合肽和非肽文庫(kù)。手冊(cè)VCH Weinheim Ed.Giuntha Jung，1996年，16&17章)，產(chǎn)生氯代甲基聚苯乙烯。然后可利用活性芐基氯代物功能基團(tuán)來引入羧基，氨基，羥基，順丁二烯二酰亞胺，巰基，N-succinimidyl，和許多其他功能基團(tuán)。功能基團(tuán)的引入使得化學(xué)作用實(shí)施，使得本發(fā)明的化合物直接或通過接頭間隔單元共價(jià)附著。結(jié)合反應(yīng)需要在基質(zhì)和配體上、或附著或?qū)⒏街景l(fā)明化合物的間隔接頭上功能基團(tuán)相容。如在基質(zhì)上引入羧基基團(tuán)使得與自由氨基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合。衍生聚苯乙烯帶有羧基基團(tuán)能通過與Lys側(cè)鏈的自由∈氨基基團(tuán)結(jié)合，或通過有一個(gè)自由氨基基團(tuán)的間隔接頭直接共價(jià)附著Lys-boroPro?；蛘?，衍生聚苯乙烯帶有羧基基團(tuán)能通過如，通過含兩個(gè)羧基基團(tuán)的間隔接頭結(jié)合，一個(gè)與Lys-boroPro的∈氨基基團(tuán)結(jié)合，另一個(gè)與氨基衍生聚苯乙烯的氨基基團(tuán)結(jié)合附著Lys-boroPro。
產(chǎn)生這樣結(jié)合的化學(xué)作用是眾所周知的，并在許多資料中有描述，包括許多公司在如銷售基質(zhì)、活性或非活性的，和接頭間隔分子的Pierce化學(xué)中的目錄中。其他供方包括Sigma，Novabiochem，也在其中。如上述對(duì)于聚苯乙烯但對(duì)上面所列其他基質(zhì)特異的附著配體的方法是可以利用的，眾所周知的，并在如上所述的資料和固定親和配體技術(shù).“成功親和基質(zhì)制備的全部‘訣竅’”；Shan S.Wong的蛋白質(zhì)共軛和交聯(lián)化學(xué)中有描述。
可以使用的基質(zhì)的幾種形式包括如玻珠，和特別容易移去基質(zhì)附著配體的磁性玻珠?？股氐鞍?生物素化學(xué)提供了其他獲得相同最終結(jié)果的方法，將本發(fā)明的化合物附著在不溶基質(zhì)上。如生物素很容易附著在Lys-boroPro的∈氨基基團(tuán)上，產(chǎn)物共軛物以高親和力附著抗生素蛋白或鏈霉抗生素蛋白。抗生素蛋白和鏈霉抗生素蛋白的多種不溶衍生物可購(gòu)得(抗生素蛋白-生物素化學(xué)手冊(cè)-由Pierce技術(shù)協(xié)助專家研究)。
或者，靶組合成分P1可附著在有靶組合成分直接或間接附著的表面的顆粒(如顆?；蚰?形式上?？捎脕碇苽溥@種顆粒的物質(zhì)示例包括硝化纖維，瓊脂，瓊脂糖，和其他類型配體通常附著的載體物質(zhì)，如形成親和色譜物質(zhì)。在較好的具體實(shí)施中，顆粒是磁性顆粒，如在美國(guó)專利第4,554,088號(hào)，頒布給Whitehead等人，題目為“使用在分離中的磁性顆?！保坏?,382,468號(hào)，頒布給Chagnon等人，題目為“生物可降解磁性微束和制備它們的方法”；第4,454,234號(hào)，頒布給Czerlinkski，題目為“有被可磁化微粒，其可逆懸浮，和相關(guān)工藝”；第4,795,698號(hào)，頒布給Owen等人，題目為“磁性-聚合物顆?！?；第4,528,622號(hào)，頒布給Ikeda等人，題目為“固定生物蛋白的磁性顆粒及制備相同物的方法”。
依據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。裝置包括容器和包含在其中或附著在其上的DPIV抑制劑。較好地，容器是消毒容器。DPIV抑制劑可以是如上所述可溶或不溶的形式。這樣，如DPIV可以干燥狀態(tài)(如凍干)存在于容器中，無束縛或附著在容器表面，以消毒的形式售給最終用戶，以最小化被最終用戶污染的可能性(如當(dāng)將抑制劑引入容器時(shí))，進(jìn)一步最小化損失抑制劑活性的可能性(如通過提供干燥狀態(tài)的抑制劑較小可能在儲(chǔ)存中損失活性)?；蛘?，DPIV抑制劑可以附著在顆粒上，如磁性顆粒，顆?？梢愿稍餇顟B(tài)在獨(dú)立的容器中銷售或在細(xì)胞培養(yǎng)容器中提供。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一套刺激造血細(xì)胞體外生長(zhǎng)和/或分化的工具。工具包括上面描述的裝置和使用裝置刺激體外造血細(xì)胞的用法說明。任意地，工具還包括培養(yǎng)造血細(xì)胞用的其他適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物。這樣的營(yíng)養(yǎng)物可以在設(shè)備容器中或在獨(dú)立容器中、以液態(tài)或干燥狀態(tài)提供，營(yíng)養(yǎng)物內(nèi)容物可在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)加入到設(shè)備容器中。
依據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供體外刺激造血細(xì)胞和擴(kuò)增抗原-特異T細(xì)胞的方法。刺激和擴(kuò)增步驟可同時(shí)實(shí)施或順序?qū)嵤?。下面闡述這種方法的三個(gè)具體實(shí)施來說明這種方法。通常，具體實(shí)施彼此區(qū)分在體外刺激的造血細(xì)胞的選取上。在每個(gè)具體實(shí)施中，培養(yǎng)步驟可在存在或不存在加入的細(xì)胞因子或基質(zhì)細(xì)胞的情況下實(shí)施。使用在每一種具體實(shí)施中的較好的復(fù)共軛對(duì)配合物含有腫瘤特異抗原或病原特異抗原。
這種方法的第一個(gè)具體實(shí)施是獲得抗原特異T細(xì)胞，涉及刺激培養(yǎng)物中的骨髓細(xì)胞。培養(yǎng)物中骨髓細(xì)胞可能包括細(xì)胞的混合物；然而，較好地，培養(yǎng)物中的骨髓細(xì)胞是分離的CD+34細(xì)胞或分離的干細(xì)胞。依據(jù)這個(gè)具體實(shí)施，方法包括(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞(如DPIV單體和/或共軛對(duì)配合物)以擴(kuò)增培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；(2)用充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，其中DPIV抑制劑附著在抗原肽上(如腫瘤-或病原特異抗原)，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量。步驟(2)可在存在或不存在特異抗原的情況下實(shí)施。步驟(1)和(2)可同時(shí)實(shí)施或順序?qū)嵤?。通常，將抗原特異T細(xì)胞的量與(除了對(duì)比培養(yǎng)物不與復(fù)共軛對(duì)配合物接觸)用如步驟(1)和(2)處理的骨髓細(xì)胞的對(duì)比培養(yǎng)物相比較。在每個(gè)步驟中，細(xì)胞在DPIV抑制劑中培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以增加早期T種類細(xì)胞的量和擴(kuò)增抗原特異T細(xì)胞的量，分別與對(duì)比培養(yǎng)物中這種細(xì)胞的存在量相比。
第二個(gè)具體實(shí)施目的在于刺激培養(yǎng)物中臍帶血細(xì)胞。這個(gè)具體實(shí)施涉及(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞(如DPIV單體和/或共軛對(duì)配合物)以擴(kuò)增培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；(2)用充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，其中DPIV抑制劑附著在抗原肽上(如腫瘤-或病原特異抗原)，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量。步驟(2)可在存在或不存在特異抗原的情況下實(shí)施。步驟(1)和(2)可同時(shí)實(shí)施或順序?qū)嵤?。通常，將抗原特異T細(xì)胞的量與(除了對(duì)比培養(yǎng)物不與復(fù)共軛對(duì)配合物接觸)用如步驟(1)和(2)處理的臍帶血細(xì)胞的對(duì)比培養(yǎng)物相比較。在每個(gè)步驟中，細(xì)胞在DPIV抑制劑中培養(yǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以增加早期T種類細(xì)胞的量和擴(kuò)增抗原特異T細(xì)胞的量，分別與對(duì)比培養(yǎng)物中這種細(xì)胞的存在量相比。
第三個(gè)具體實(shí)施目的在于刺激培養(yǎng)物中外周血液干細(xì)胞。這個(gè)具體實(shí)施涉及(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)外周血液干細(xì)胞(如DPIV單體和/或共軛對(duì)配合物)以擴(kuò)增培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；(2)用充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，其中DPIV抑制劑附著在抗原肽上(如腫瘤-或病原特異抗原)，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量。步驟(2)可在存在或不存在特異抗原的情況下實(shí)施。步驟(1)和(2)可同時(shí)實(shí)施或順序?qū)嵤Ｍǔ?，將抗原特異T細(xì)胞的量與(除了對(duì)比培養(yǎng)物不與復(fù)共軛對(duì)配合物接觸)用如步驟(1)和(2)處理的外周血液干細(xì)胞的對(duì)比培養(yǎng)物相比較。在每個(gè)步驟中，細(xì)胞在DPIV抑制劑中培養(yǎng)足長(zhǎng)夠時(shí)間，以增加早期T種類細(xì)胞的量和擴(kuò)增抗原特異T細(xì)胞的量，分別與對(duì)比培養(yǎng)物中這種細(xì)胞的存在量相比。另外，由于已知外周血液含有T細(xì)胞，所以，可能在沒有刺激步驟(1)的情況下，培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量擴(kuò)增，如擴(kuò)增抗原特異T細(xì)胞的方法涉及用充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，其中DPIV抑制劑附著在抗原肽上(如腫瘤-或病原特異抗原)，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原特異T細(xì)胞的量。這個(gè)步驟可在存在或不存在特異抗原的情況下實(shí)施。
實(shí)例下面提供接觸幾種典型DPIV抑制劑的工藝示例。試驗(yàn)方案1.獲取骨髓或臍帶血液置于肝素化試管中，直至使用可在室溫儲(chǔ)存48小時(shí)以內(nèi)。
2.混合骨髓/血液和磷酸緩沖鹽溶液，PH7.4(PBS)儲(chǔ)存在4℃。
3.小心地將血液PBS混合物鋪在2個(gè)體體量的儲(chǔ)存在4℃d的Histopaque(Sigma)上。
4.在37℃400g×20分鐘離心分離。
5.在界面上小心收集細(xì)胞并2次用冷PBSA沖洗。
6.使用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。
7.將細(xì)胞和1ml培養(yǎng)物安裝在塑料培養(yǎng)試管(或96孔或24孔微型滴定板)中，104個(gè)細(xì)胞/ml CellGro Iscove改進(jìn)Dulbecco培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含卡那霉素(5μg/ml)，所需濃度的Xaa-boroPro或其他本發(fā)明的化合物，存在或不存在巨型細(xì)胞腫瘤調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(GCT-CM，Origen)作為生長(zhǎng)因子來源。Xaa-boroPro或其他本發(fā)明的化合物應(yīng)稀釋到半數(shù)濃縮，并僅在細(xì)胞在培養(yǎng)試管中后加入到培養(yǎng)物中。
8.細(xì)胞在37℃含5％CO2的濕潤(rùn)空氣中溫育。
9.在所需的時(shí)間，小份細(xì)胞移出并計(jì)數(shù)。
10.計(jì)數(shù)可在顯微鏡下實(shí)施或通過使用MTT測(cè)定(比色測(cè)定)。
實(shí)施這個(gè)的試驗(yàn)的結(jié)果在所附的示圖中作了演示，并在示圖簡(jiǎn)介中進(jìn)行了描述。
在本申請(qǐng)中所標(biāo)出的所有專利，專利公布和其他文件都全文參考收入本篇。
此領(lǐng)域中的技術(shù)人員可識(shí)別出，或僅使用常規(guī)試驗(yàn)?zāi)艽_定出許多本文所描述的本發(fā)明特殊具體實(shí)施的等同物。這樣的等同物包括在下面的權(quán)利要求書中。
下面列出表格和權(quán)利要求書，序列單，和摘要。
可購(gòu)買到的交聯(lián)劑的活性
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序列表<110>尖端醫(yī)療有限公司<120>體外造血細(xì)胞的刺激<130>I0248/7005<140>PCT/US98/20343<141>1998-09-29<150>US 60/060,306<151>1997-09-29<160>20<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>9<212>PRT<213>homo sapiens<400>1Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>homo sapiens<400>2Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>homo sapiens<400>3Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>homo sapiens<400>4Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>homo sapiens<400>5Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>homo sapiens<400>6Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala1 5<210>7<211>10<212>PRT<213>homo sapiens<400>7Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu1 510<210>8<211>9<212>PRT<213>homo sapiens<400>8Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5<210>9<211>31<212>PRT<213>homo sapiens<400>9Ser Ser Ser Thr Leu Cys Thr Ser Lys Ala Asp Lys Ser Ser Gly Asn1 5 1015Gln Gly Gly Asn Gly Val Phe Ile Val Val Asn Ala Trp Tyr Ser2025 30<210>10<211>22<212>PRT<213>homo sapiens<400>10Ser Glu Asp Leu Thr Ala Gly Tyr Cys Lys Cys Phe Glu Glu Phe Val1 510 15Leu Ala Ser Arg Cys Lys20<210>11<211>60<212>PRT<213>homo sapiens<400>11Glu Gln Arg Gln Gly Ile Lys Val Gln Leu Ile Leu Phe Ile Leu Arg1 5 10 15Ala Leu Met Ile Asn Thr Ser Ser Ser Asn His Ile Leu Asp Ser Arg20 25 30Asn Val Phe Leu His Thr Gly His Gly Glu Pro Met Val Gln Lys Gln35 40 45Ile Glu Trp Val Leu Ile Met Glu Leu Ile Lys Met50 5560<210>12<211>22<212>PRT<213>homo sapiens<400>12His Lys Ala Val Phe Arg Ser Glu Ile Ser Leu Gln Lys Trp Cys Ser1 5 1015Asp Thr Gln Lys Ser Thr20<210>13<211>20<212>PRT<213>homo sapiens<400>13Asp Ser Phe Glu Ser Val Arg Leu Pro Ala Pro Phe Arg Val Asn His1 5 10 15Ala Val Glu Trp20<210>14<211>55<212>PRT<213>homo sapiens<400>14Ile Ile Ser Pro Val Ile Phe Gln Ile Ala Leu Asp Lys Pro Cys His1 5 10 15Gln Ala Glu Val Lys His Leu His His Leu Leu Lys Gln Leu Lys Pro20 25 30Ser Glu Lys Tyr Leu Lys Ile Lys His Leu Leu Leu Lys Arg Glu Arg35 40 45al Asp Leu Ser Lys Leu Gln5055<210>15<211>37<212>PRT<213>homo sapiens<400>15Arg Ser Lys Thr Leu His His Leu Leu Lys Gln Leu Lys Pro Ser Glu1 5 1015Lys Tyr Leu Lys Ile Lys His Leu Leu Leu Lys Arg Glu Arg Val Asp20 25 30Leu Ser Lys Leu Gln35<210>16<211>27<212>PRT<213>homo sapiens<400>16Pro Pro Gln Thr Gly Glu Lys Tyr Leu Lys Ile Lys His Leu Leu Leu1 5 1015Lys Arg Glu Arg Val Asp Leu Ser Lys Leu Gln20 25<210>17<211>22<212>PRT<213>homo sapiens<400>17Asp Ala Asp Thr Tyr Tyr Ile Leu Pro Arg Lys Val Leu Gln Met Asp1 5 1015Phe Leu Val His Pro Ala20<210>18<211>20<212>PRT<213>homo sapiens<400>18Asp Thr Leu Leu Leu Leu Pro Arg Lys Val Leu Gln Met Asp Phe Leu15 10 15Val His Pro Ala20<210>19<211>20<212>PRT<213>homo sapiens<400>19Leu His Phe Ala Ser Arg Trp Ile Phe Leu Phe Ile Gln Pro Glu Cys1 5 10 15Ser Glu Pro Arg20<210>20<211>10<212>PRT<213>homo sapiens<400>20Gln Asp Leu Thr Met Lys Tyr Gln Ile Phe15 10
權(quán)利要求
1.一種體外刺激造血細(xì)胞的方法，其包括(1)將造血細(xì)胞與充分量的二肽基肽酶IV類的抑制劑接觸，以增加所說的造血細(xì)胞的量和/或所說的造血細(xì)胞的分化狀況，比較存在于不與抑制劑接觸但使用相同培養(yǎng)條件的對(duì)比培養(yǎng)物中造血細(xì)胞，和存在抑制劑的情況下培養(yǎng)的造血細(xì)胞的量和分化狀況；(2)在存在抑制劑和不存在外源細(xì)胞因子的情況下培養(yǎng)造血細(xì)胞充分長(zhǎng)的時(shí)間，以增加造血細(xì)胞的量和/或造血細(xì)胞的分化狀況，與存在于對(duì)比培養(yǎng)物中的造血細(xì)胞的量比較。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中增加造血細(xì)胞的量包括，與當(dāng)造血細(xì)胞最初與抑制劑接觸時(shí)存在的造血細(xì)胞的量相比增加細(xì)胞的量至少2倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中造血細(xì)胞從下列基團(tuán)中選取包括造血干細(xì)胞，原始干細(xì)胞，早期祖細(xì)胞，CD34+細(xì)胞，間葉細(xì)胞、脊髓、淋巴、紅細(xì)胞的早期種類細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，血細(xì)胞，臍帶血細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞和造血前體細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中二肽基肽酶IV類(DPIV)抑制劑是從下列基團(tuán)中選取的包括可溶DPIV抑制劑和固定DPIV抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中DPIV抑制劑是從下列基團(tuán)中選取的包括Lys-boroPro單體，Pro-boroPro單體，Val-boroPro單體和Lys-boroPro共軛物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抑制劑是固定抑制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中固定抑制劑包括附著在是組織培養(yǎng)容器的固定結(jié)構(gòu)上的抑制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中固定抑制劑包括附著在是顆粒的固定結(jié)構(gòu)上的抑制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抑制劑的充分量是增加造血細(xì)胞量至少2倍所需的量。
10.一種裝置，其包括(1)容器；(2)含在其中或附著在其上的DPIV抑制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的裝置，其中容器是消毒的。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的裝置，其中容器是細(xì)胞培養(yǎng)容器，DPIV抑制劑附著在細(xì)胞培養(yǎng)容器的表面。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的裝置，其中DPIV抑制劑附著在含在容器中的顆粒上。
14.一種組合物，其包括(1)磁性顆粒；和(2)附著在其上的DPIV抑制劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中組合物是消毒的。
16.一種體外刺激造血細(xì)胞的工具，其包括(1)任何權(quán)利要求10，11，12和13的裝置；和(2)使用裝置體外增加造血細(xì)胞量的說明。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的工具，進(jìn)一步包括一種或多種培養(yǎng)造血細(xì)胞的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物，其中所說的生長(zhǎng)是在設(shè)備容器中或是在獨(dú)立容器中提供的，營(yíng)養(yǎng)物內(nèi)容物可在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)加入到容器中。
18.一種體外擴(kuò)增抗原-特異T細(xì)胞的方法，其包括(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞以增加培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；和(2)在充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物存在可情況下培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，DPIV抑制劑附著在抗原肽上，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原-特異T細(xì)胞的量。
19.一種體外擴(kuò)增抗原-特異T細(xì)胞的方法，其包括(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞以增加培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；和(2)在充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物存在可情況下培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，DPIV抑制劑附著在抗原肽上，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原-特異T細(xì)胞的量。
20.一種體外擴(kuò)增抗原-特異T細(xì)胞的方法，包括(1)在充分量的DPIV抑制劑存在的情況下培養(yǎng)外周血細(xì)胞以增加培養(yǎng)物中早期T種類細(xì)胞的量；和(2)在充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物存在可情況下培養(yǎng)早期T種類細(xì)胞，DPIV抑制劑附著在抗原肽上，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原-特異T細(xì)胞的量。
21.一種體外擴(kuò)增抗原-特異T細(xì)胞的方法，其包括(1)在充分量的含抑制劑的復(fù)共軛對(duì)配合物存在可情況下培養(yǎng)外周血液細(xì)胞，DPIV抑制劑附著在抗原肽上，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中抗原-特異T細(xì)胞的量。
22.根據(jù)權(quán)利要求18，19，20或21的方法，其中DPIV抑制劑是從下列基團(tuán)中選取的包括DPIV單體，DPIV共軛對(duì)配合物，和前述的組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求18，19，20或21的方法，其中復(fù)共軛對(duì)配合物含腫瘤-特異抗原。
24.根據(jù)權(quán)利要求18，19，20或21的方法，其中復(fù)共軛對(duì)配合物含病原-特異抗原。
25.根據(jù)權(quán)利要求18，19，20或21的方法，其中至少一個(gè)培養(yǎng)步驟在存在加入的細(xì)胞因子或基質(zhì)細(xì)胞的情況下實(shí)施。
26.根據(jù)權(quán)利要求18，19，20或21的方法，其中至少一個(gè)培養(yǎng)步驟在不存在加入的細(xì)胞因子或基質(zhì)細(xì)胞的情況下實(shí)施。
27.根據(jù)權(quán)利要求18，19，或20的方法，其中步驟(2)在存在抗原肽的情況下實(shí)施。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中步驟(1)在存在抗原肽的情況下實(shí)施。
29.根據(jù)權(quán)利要求18，19，或20的方法，其中步驟(1)和步驟(2)順序?qū)嵤?br> 30.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中骨髓細(xì)胞是從包括分離CD34+細(xì)胞和分離干細(xì)胞中選取的。
全文摘要
提供了體外刺激造血細(xì)胞的量和/或分化的方法、組合物、設(shè)備。方法涉及在沒有外源性加入的細(xì)胞因子的情況下將造血細(xì)胞與二肽基肽酶(DPIV)抑制劑接觸。
文檔編號(hào)C12N5/02GK1272136SQ98809646
公開日2000年11月1日 申請(qǐng)日期1998年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者威廉姆·巴喬維琴, 巴巴拉·沃娜 申請(qǐng)人:尖端醫(yī)療有限公司