專利名稱：β－呋喃果糖苷酶及其基因的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有果糖轉(zhuǎn)移酶活性、可用于低聚果糖的工業(yè)生產(chǎn)的一種β-呋喃果糖苷酶及其基因和用途。
背景技術(shù)：
除了其果糖部分在C1和C2位通過β鍵與另外一到三個(gè)果糖分子偶聯(lián)外，低聚果糖的分子結(jié)構(gòu)與蔗糖相同。低聚果糖是不可消化的糖，以諸如促進(jìn)腸道雙歧桿菌生長(zhǎng)、加速膽固醇和其他脂類的新陳代謝及較少的齲齒發(fā)生率之類的生理學(xué)優(yōu)點(diǎn)著稱。
低聚果糖見于植物中，例如蘆筍、洋蔥、菊芋和蜂蜜。它也可以通過新近的工業(yè)化大生產(chǎn)技術(shù)由蔗糖合成，這種技術(shù)應(yīng)用來源于微生物的β-呋喃果糖苷酶催化的果糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
1-蔗果三糖和霉菌赤蘚醛糖構(gòu)成當(dāng)今工業(yè)生產(chǎn)的低聚果糖混合物的組分，它們除了果糖部分分別與一分子和兩分子果糖偶聯(lián)外，其分子結(jié)構(gòu)與蔗糖相同。最近發(fā)現(xiàn)，它們的高純度晶體在保持低聚果糖的一般生理學(xué)優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，在物理性質(zhì)和食品加工目的兩方面，顯示了新的合乎需要的特性(日本專利申請(qǐng)1995年第222923號(hào)，日本公開公報(bào)1994年第31160號(hào))。從這種意義上說，它們是具有新特征的低聚果糖制品。
鑒于以上因素，一些發(fā)明者已經(jīng)提出一種由蔗糖生產(chǎn)結(jié)晶1-蔗果三糖的工業(yè)方法(日本專利申請(qǐng)1996年第64682號(hào)，日本專利申請(qǐng)1996年第77534號(hào)，和日本專利申請(qǐng)1996年第77539號(hào))。根據(jù)本方法，首先使具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的β-呋喃果糖苷酶作用于蔗糖，以產(chǎn)生1-蔗果三糖；生成的1-蔗果三糖用層析分離法分級(jí)分離得到80％或更高的純度；然后，用這個(gè)級(jí)分作為結(jié)晶樣本，得到的結(jié)晶1-蔗果三糖達(dá)到95％或更高的純度。應(yīng)用于此方法的具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的β-呋喃果糖苷酶應(yīng)能從蔗糖高產(chǎn)量地產(chǎn)生1-蔗果三糖，且最小化副產(chǎn)物霉菌赤蘚醛糖的量，后者抑制上述層析分離和結(jié)晶反應(yīng)。當(dāng)前用于低聚果糖混合物的工業(yè)生產(chǎn)的衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)的酶中，從蔗糖生產(chǎn)1-蔗果三糖的產(chǎn)率約為44％，而7％轉(zhuǎn)變成霉菌赤蘚醛糖(日本專利申請(qǐng)1996年第64682號(hào))。這些數(shù)據(jù)表明，就結(jié)晶1-蔗果三糖的工業(yè)生產(chǎn)而論，此酶尚需改進(jìn)。
之后，一些發(fā)明者已成功地從婁地青霉(Penicillium roqueforti)和短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)篩選出具有更優(yōu)良特征的新酶。這些酶能分別將47％和55％的蔗糖轉(zhuǎn)變成1-蔗果三糖，而7％和4％轉(zhuǎn)變成霉菌赤蘚醛糖(日本專利申請(qǐng)1996年第77534號(hào)，和日本專利申請(qǐng)1996年第77539號(hào))。這些酶在生產(chǎn)率和穩(wěn)定性方面遜于源自黑曲霉的酶，而且就結(jié)晶1-蔗果三糖的工業(yè)生產(chǎn)而論尚需改進(jìn)。
因此，一些發(fā)明者已把注意力放在遺傳工程方法上以提高這種酶的生產(chǎn)率，分別從婁地青霉和短柄帚霉分離編碼β-呋喃果糖苷酶的基因，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析(PCT/JP97/00757)。結(jié)果，由來自婁地青霉和短柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因中分別推斷出編碼成熟蛋白質(zhì)的565個(gè)氨基酸和574個(gè)氨基酸的翻譯區(qū)，而且它們的表達(dá)產(chǎn)物像來自黑曲霉的β-呋喃果糖苷酶一樣，顯示出具有β-呋喃果糖苷酶活性(L.M.Boddy等人，當(dāng)代遺傳學(xué)(Curr.Genet.)，24，60-66(1993))。
發(fā)明概述發(fā)明者們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，在源自一些發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn)的婁地青霉和短柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因的C-端加上38和39個(gè)氨基酸，提高了它的活性。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種新的β-呋喃果糖苷酶及其基因。
根據(jù)本發(fā)明的這種新的β-呋喃果糖苷酶是包含SEQ ID No.1或3或其同系物的氨基酸序列的一種多肽。
此外，根據(jù)本發(fā)明的基因是編碼上述多肽的一種DNA。
在來自一些發(fā)明者先前發(fā)現(xiàn)的上述婁地青霉和短柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因的C-端加上38和39氨基酸，構(gòu)建了根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID No.1或3的氨基酸序列。已發(fā)現(xiàn)，被一些當(dāng)前的發(fā)明者推測(cè)編碼C-端氨基酸的β-呋喃果糖苷酶基因的這個(gè)區(qū)域?qū)嶋H上存在一個(gè)內(nèi)含子，還發(fā)現(xiàn)β-呋喃果糖苷酶基因進(jìn)一步編碼C-端的38和39個(gè)氨基酸。令人吃驚的是，同未加入這些序列的蛋白質(zhì)相比，在C-端加入這些氨基酸后β-呋喃果糖苷酶活性明顯提高。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A、B、C和D顯示了表達(dá)載體pYPEN02和表達(dá)載體pYPEN01的構(gòu)建，前者引入了編碼包含SEQ ID No.1氨基酸序列的酶蛋白質(zhì)的基因，而后者引入了編碼包含SEQ ID No.1氨基酸序列從1到565氨基酸序列的酶蛋白質(zhì)的基因。
圖2A和B顯示了表達(dá)載體pYSCOP02和表達(dá)載體pYSCOP01的構(gòu)建，前者引入了編碼包含SEQ ID No.3氨基酸序列的酶蛋白質(zhì)的基因，而后者引入了編碼包含SEQ ID No.3氨基酸序列從1到574氨基酸序列的酶蛋白質(zhì)的基因。
發(fā)明詳述β-呋喃果糖苷酶根據(jù)本發(fā)明的這種多肽包含SEQ ID No.1或3的氨基酸序列。含有SEQID No.1或3氨基酸序列的這種多肽具有β-呋喃果糖苷酶的酶解活性。根據(jù)本發(fā)明的這種多肽包括如同序列表顯示的SEQ ID No.1或3氨基酸序列的同系物。術(shù)語“同系物”指的是在SEQ ID Nos.1和3氨基酸序列內(nèi)插入、替換或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸、或在其一端或兩端加入一個(gè)或多個(gè)的氨基酸(如一至數(shù)個(gè)氨基酸)而保留β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。這樣的同系物能由本領(lǐng)域技術(shù)人員參考SEQ ID No.1或3序列選擇和生產(chǎn)，而不必進(jìn)行過分的試驗(yàn)。
含有根據(jù)本發(fā)明的SEQ ID No.1和3氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶具有高度果糖基轉(zhuǎn)移酶活性，能高效地生產(chǎn)低聚果糖。明確地說，用30wt％或更高濃度的蔗糖溶液作反應(yīng)底物時(shí)，含有SEQ ID No.1氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性比其水解活性至少高4倍，含有SEQ IDNo.3氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性比其水解活性至少高7倍。而且，在這兩種情況下，均有50％或更多的蔗糖轉(zhuǎn)變成低聚果糖。β-呋喃果糖苷酶基因編碼根據(jù)本發(fā)明的β-呋喃果糖苷酶的新基因包含編碼SEQ ID Nos.1和3的氨基酸序列或其同系物的DNA序列。
通常，編碼給定蛋白質(zhì)氨基酸序列的核苷酸序列能容易地從稱作“密碼子表”的參考表中確定。編碼SEQ ID No.1或3氨基酸序列的核苷酸序列中多種核苷酸序列是可用的。因此，術(shù)語“編碼SEQ ID No.1或3氨基酸序列的核苷酸序列”所指的含義包括SEQ ID No.2或4的核苷酸序列，以及包括與上面相同的簡(jiǎn)并性允許的密碼子組成并編碼SEQ ID No.1或3氨基酸序列的核苷酸序列。
作為根據(jù)本發(fā)明的新的基因的優(yōu)選實(shí)例，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案提供了包括SEQ ID No.2或4的核苷酸序列的DNA片段。
如上所述，本發(fā)明包括SEQ ID No.1或3氨基酸序列的同系物。因此，根據(jù)本發(fā)明得到的DNA片段包括編碼此同系物的核苷酸序列。
確定了根據(jù)本發(fā)明的DNA片段的核苷酸序列后，根據(jù)用于核酸合成的方法可以得到此DNA片段。
根據(jù)遺傳工程方法，由婁地青霉或短柄帚霉也能獲得此序列，婁地青霉IAM7254或短柄帚霉IFO4843更優(yōu)選。β-呋喃果糖苷酶基因的表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的β-呋喃果糖苷酶能在用編碼此酶的DNA片段轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。更確切地說，將編碼根據(jù)本發(fā)明的β-呋喃果糖苷酶的DNA片段，以可在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并能表達(dá)上述基因的DNA分子的形式引入宿主細(xì)胞，尤其是以表達(dá)載體的形式以便轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。然后，培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體。
因此，本發(fā)明提供了包含編碼根據(jù)本發(fā)明的β-呋喃果糖苷酶的基因的DNA分子，尤其是表達(dá)載體。通過在載體分子里引入編碼根據(jù)本發(fā)明的β-呋喃果糖苷酶的DNA片段，即可得到此DNA分子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，此載體是質(zhì)粒。
根據(jù)本發(fā)明的DNA分子可以通過遺傳工程的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。
考慮到使用的宿主細(xì)胞的類型，應(yīng)用在本發(fā)明中的載體可以恰當(dāng)?shù)貜牟《尽①|(zhì)粒、粘粒載體等中選擇。例如，λ噬菌體組中的噬菌體或pBR或pUC組中的質(zhì)?？捎糜诖竽c桿菌(E.coli)宿主細(xì)胞，pUB組中的質(zhì)?？捎糜诳莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)，以及YEp或YCp組中的載體可用于酵母菌。
為確保對(duì)得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇，包含可選擇標(biāo)志物的質(zhì)粒是優(yōu)選的，例如抗藥標(biāo)志物或修補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷突變的標(biāo)志物基因。標(biāo)志物基因的優(yōu)選實(shí)例包括用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因；用于酵母菌的N-(5′-磷酸核糖基)-鄰氨基苯甲酸酯異構(gòu)酶基因(TRP1)、乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶基因(URA3)和β-異丙基蘋果酸脫氫酶基因(LEU2)；以及用于霉菌的潮霉素抗性基因(hph)、bialophos抗性基因(bar)和硝酸還原酶基因(niaD)。
也優(yōu)選用作根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體的DNA分子包含表達(dá)β-呋喃果糖苷酶基因所需的核苷酸序列，此序列包括轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)，例如啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯終止信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
除了能在宿主中起作用的插入片段上的啟動(dòng)子外，優(yōu)選的啟動(dòng)子實(shí)例包括，諸如用于大腸桿菌的乳糖操縱子(lac)和色氨酸操縱子(trp)的啟動(dòng)子之類的啟動(dòng)子；諸如用于酵母菌的乙醇脫氫酶基因(ADH)、酸性磷酸酶基因(PHO)、半乳糖調(diào)控基因(GAL)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GPD)的啟動(dòng)子之類的啟動(dòng)子；以及諸如用于霉菌的α-淀粉酶基因(amy)和纖維二糖水解酶I基因(CBHI)的啟動(dòng)子之類的啟動(dòng)子。
當(dāng)宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌、酵母菌或霉菌時(shí)，使用分泌型載體以允許在細(xì)胞外分泌產(chǎn)生的重組β-呋喃果糖苷酶也是有利的。任何具有已建立的宿主-載體系統(tǒng)的宿主細(xì)胞都可以利用，優(yōu)選酵母菌、霉菌等。也優(yōu)選用PCT/JP97/00757中所述的無β-呋喃果糖苷酶活性的毛霉菌。
通過以下方法可以由上述轉(zhuǎn)化體獲得新的重組酶首先，在適宜的條件下培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，用諸如離心的已知技術(shù)，從生成的培養(yǎng)物中得到上清液或細(xì)胞體；細(xì)胞體應(yīng)進(jìn)一步懸浮在一種適宜的緩沖液中，然后用凍融、超聲處理或研缽使之勻漿化，緊接著通過離心或過濾，分離出包含這種新的重組酶的細(xì)胞體提取物。
通過結(jié)合用于分離和純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)能純化此酶。諸如此類技術(shù)的例子包括，如熱處理這一類依靠熱耐受差異的方法；如鹽沉淀和溶劑沉淀這一類依靠溶解性差異的方法；如透析、超濾和凝膠過濾以及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳這一類依靠分子量差異的方法；如離子交換層析這一類依靠電荷差異的方法；如親和層析這一類依靠特異親和性的方法；如疏水層析和反相分配層析這一類依靠疏水性差異的方法；以及如等電聚焦這一類依靠等電點(diǎn)差異的方法。應(yīng)用β--呋喃果糖苷酶生產(chǎn)低聚果糖本發(fā)明進(jìn)一步提供了應(yīng)用前述的重組宿主或重組β-呋喃果糖苷酶生產(chǎn)低聚果糖的方法。
在根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)低聚果糖的方法中，將前述的重組宿主或重組β-呋喃果糖苷酶與蔗糖相接觸。
只要這種新的重組酶能作用于蔗糖，根據(jù)本發(fā)明的重組β-呋喃果糖苷酶或重組宿主與蔗糖作用的方式和條件不局限于任何情形。在溶液中發(fā)生作用的優(yōu)選的實(shí)施方案如下蔗糖濃度可以在蔗糖能夠得到溶解的適宜的范圍內(nèi)選擇。然而，考慮到諸如酶的比活性和反應(yīng)溫度的條件，通常濃度應(yīng)在5％到80％的范圍內(nèi)，最好在30％到70％之間。這種酶作用于蔗糖反應(yīng)的溫度和pH應(yīng)該優(yōu)選地經(jīng)優(yōu)化以適于此新重組酶的特性。因此，合理的條件是溫度約30-80℃，pH約4-10，優(yōu)選的溫度在40-70℃，pH5-7。
可以適當(dāng)?shù)剡x擇這種新的重組酶的純化程度。這種酶可以來自轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物或細(xì)胞體勻漿物的上清液的形式作為非純化物使用，也可以經(jīng)多種純化步驟加工后作為純化物使用，或經(jīng)多種純化方式加工后作為分離物使用。
此外，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)固定在載體上的此酶的方式同蔗糖相接觸。
將這樣產(chǎn)生的低聚果糖根據(jù)已知的方法從所得溶液中純化出來。例如，可以加熱溶液使酶滅活，用活性碳脫色，然后用離子交換樹脂脫鹽。
實(shí)施例實(shí)施例1來自婁地青霉IAM7254的β-呋喃果糖苷酶基因翻譯區(qū)的確定應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)擴(kuò)增來自黑曲霉的含β-呋喃果糖苷酶基因的約2kbp的DNA片段，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序用由黑曲霉ATCC20611獲得的染色體DNA作為模板，引物為SEQ ID No.5或6的合成DNA。此DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳得以分級(jí)分離，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法提取、純化，然后在無菌水中溶解至0.1μg/μl，以制備用作探針的DNA樣本。
下一步是制備來自婁地青霉IAM7254的染色體DNA，用EcoRI完全消化約20μg的染色體DNA，接著用瓊脂糖凝膠電泳回收大約4kbp的DNA片段。
將回收的大約4kbp(約0.5μg)的DNA片段與1μg的λgt10載體相結(jié)合，此載體已先用EcoRI消化，并用磷酸酶處理，用體外包裝試劑盒GIGAPACK II Gold(Stratagene L.L.C)包裝，然后引入大腸桿菌NM514，來制備文庫。
從上述用以制備探針的DNA樣本中制備探針。用ECL直接DNA/RNA標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)(Amershan International)進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，結(jié)果在約25000個(gè)斑點(diǎn)中4個(gè)克隆呈陽性。這些陽性克隆經(jīng)第二次篩選得到純化，用來制備噬菌體DNA，然后用限制酶進(jìn)行分析。結(jié)果表明所有的陽性克隆都有約4kbp的相同EcoRI片段。
用限制酶將這個(gè)大約4kbp的EcoRI片段再分解為小片段以選擇期望的DNA區(qū)域，然后將其亞克隆到質(zhì)粒載體pUC118或pUC119。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從這個(gè)亞克隆得到質(zhì)粒DNA，并用ALFredDNA測(cè)序儀(Pharmacia)測(cè)序如SEQ ID No.7所示。
在這個(gè)序列里包含從1695到1744的50個(gè)堿基的序列經(jīng)鑒定為內(nèi)含子，因?yàn)樗@示出絲狀真菌的典型內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。結(jié)果，通過從SEQ ID No.7序列刪除內(nèi)含子，得到了作為蛋白質(zhì)編碼序列的SEQ ID No.2序列。編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.1中所示。實(shí)施例2在釀酒酵母中來自婁地青霉IAM7254的β-呋喃果糖苷酶基因的表達(dá)表達(dá)來自婁地青霉的β-呋喃果糖苷酶基因的質(zhì)粒pYPEN01和pYPEN02按如下方法制備(圖1A、B、C和D)。
用EcoRI和SalI消化pYPR2831(H.Horiuchi等，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.)，54，1771-1779，1990)，然后用T4 DNA多聚酶使其末端變成平端。得到的片段與BamHI連接體(5’-CGGATCCG-3’)連接，用BamHI消化，接著靠自我連接得到載體pY2831，以便在酵母菌中表達(dá)。
接著，通過將包含實(shí)施例1中制備的β-呋喃果糖苷酶基因的大約4kbp的EcoRI DNA片段插入到質(zhì)粒pUC118中，得到質(zhì)粒pPRS01，由該質(zhì)粒制備單鏈DNA。用此單鏈DNA作為模板，SEQ ID No.8的合成DNA作為引物，β-呋喃果糖苷酶基因的翻譯區(qū)經(jīng)定點(diǎn)突變，以破壞BamHI位點(diǎn)，而不改變編碼氨基酸序列(pPRS 02)。
用質(zhì)粒pPRS02作模板，用SEQ ID Nos.9和10的合成DNA作引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，將β-呋喃果糖苷酶基因翻譯區(qū)的一部分以約1.8kbp BamHI片段制備，并插入到質(zhì)粒pY2831的BamHI位點(diǎn)以制備pYPEN01。因而，設(shè)計(jì)質(zhì)粒pYPEN01以制備包含SEQ ID No.1氨基酸序列的從1到565氨基酸序列的酶蛋白，此序列是跟隨分泌信號(hào)序列的成熟β-呋喃果糖苷酶。
此外，用質(zhì)粒pPRS02作模板，用SEQ ID Nos.9和11的合成DNA作引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，將包含β-呋喃果糖苷酶基因的翻譯區(qū)的DNA片段以約1.8kbp的BamHI片段制備，并將其插入質(zhì)粒pUC118的BamHI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pPRS03。從質(zhì)粒pPRS03中制備單鏈DNA。用此單鏈DNA為模板，SEQ ID No.12的合成DNA為引物，經(jīng)定點(diǎn)誘變除去了內(nèi)含子序列(pPRS04)。將β-呋喃果糖苷酶基因翻譯區(qū)以約1.8kbp的BamHI片段從質(zhì)粒pPRS04中制備，并將其插入質(zhì)粒pY2831的BamHI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pYPEN02。因而，設(shè)計(jì)出質(zhì)粒pYPEN02，以產(chǎn)生包含SEQ IDNo.1氨基酸序列的酶蛋白，此序列是跟隨分泌信號(hào)序列的β-呋喃果糖苷酶。
將質(zhì)粒pYPEN01和pYPEN02通過乙酸鋰方式(Ito，H.等人，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol)，153，163-168，1983)引入釀酒酵母MS-161(Suc-，ura3，trp1)得到轉(zhuǎn)化體。此轉(zhuǎn)化體在30℃下，在SD-Ura培養(yǎng)基(0.67％酵母氮基(Difrco)，2％葡萄糖和50μg/ml尿嘧啶)中培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)物以1％的最終濃度接種在生產(chǎn)培養(yǎng)基(0.67％酵母氮基(Difco)，2％葡萄糖，2％酪蛋白氨基酸和50μg/ml尿嘧啶)，在30℃下培養(yǎng)兩天。分析培養(yǎng)物上清液的β-呋喃果糖苷酶的活性60分鐘，以在10wt％蔗糖溶液中，在pH5.5，溫度40℃條件下1分鐘內(nèi)釋放的游離葡萄糖的數(shù)量(μmol)為單位計(jì)算。結(jié)果，具有質(zhì)粒pYREN01的轉(zhuǎn)化體顯示出4×10-4單位/毫升或更少的活性，而具有質(zhì)粒pYREN02的轉(zhuǎn)化體顯示出0.38單位/毫升的活性。實(shí)施例3來自短柄帚霉IFO4843的β-呋喃果糖苷酶翻譯區(qū)的確定由短柄帚霉IFO4843制備染色體DNA。用EcoRI完全消化大約20μg染色體DNA樣本，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收約10kbp的DNA片段。
使回收的約10kbp(約0.5μg)的DNA片段與1μg用HindIII和EcoRI消化的λDASH II載體連接，并用體外包裝試劑盒GIGAPACK IIGold(Stratagene L.L.C)包裝，然后將其引入大腸桿菌XL1-Blue MRA(P2)，制備文庫。
用實(shí)施例1中所用的約2kbpDNA片段作探針，用ECL直接DNA/RNA標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham International)進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，結(jié)果在約15000個(gè)斑點(diǎn)中有3個(gè)克隆呈現(xiàn)陽性。這些陽性克隆經(jīng)第二次篩選得到純化，以制備噬菌體DNA，然后用限制酶分析。結(jié)果表明所有的克隆都有大約10kbp的相同EcoRI片段。
用限制酶將這些約10kbp的EcoRI片段再分解得到小片段，以便選擇期望的DNA區(qū)域，然后將其亞克隆至質(zhì)粒載體pUC118或pUC119。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法從此亞克隆得到質(zhì)粒DNA，并用ALFred DNA測(cè)序儀(Pharmacia)測(cè)序如SEQ ID No.13中所示。
包含此序列從1722到1776的55個(gè)堿基的序列經(jīng)鑒定為內(nèi)含子，因?yàn)樗@示出絲狀真菌的典型內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。結(jié)果，將內(nèi)含子從SEQ ID No.13中刪除獲得作為編碼蛋白質(zhì)序列的SEQ ID No.4的序列。此編碼氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。實(shí)施例4釀酒酵母中來自短柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因的表達(dá)為了表達(dá)來自短母柄帚霉的β-呋喃果糖苷酶基因，按如下步驟(圖2A和B)制備質(zhì)粒pYSCOP01和pYSCOP02。
用在實(shí)施例3中制備的包含β-呋喃果糖苷酶基因的約10kbp的EcoRIDNA片段作為模板，SEQ ID Nos.14和15的合成DNA作引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)，將β-呋喃果糖苷酶基因的翻譯區(qū)之一部分以約18kbp的BamHI片段制備，并將其插入質(zhì)粒pY2831的BamHI位點(diǎn)，以制備pYSCOP01。因而，質(zhì)粒pYPEN01經(jīng)設(shè)計(jì)以產(chǎn)生一種酶蛋白，其包含SEQID No.3氨基酸序列中從1到574的氨基酸序列，它是跟隨分泌信號(hào)序列的成熟β-呋喃果糖苷酶。
下一步用包含β-呋喃果糖苷酶基因的約10kbp的EcoRI片段作模板，SEQ ID Nos.14和16的合成DNA作引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)，將包含β-呋喃果糖苷酶基因翻譯區(qū)的DNA片段以約1.9kbp的BamHI片段制備，并將其插入質(zhì)粒pUC118的BamHI位點(diǎn)，以制備質(zhì)粒pSCB01。從質(zhì)粒pSCB01制備出單鏈DNA。用它作模板，以SEQ ID No.17的合成DNA作引物，經(jīng)定點(diǎn)誘變除去內(nèi)含子序列(pSCB02)。從質(zhì)粒pSCB02將β-呋喃果糖苷酶基因的翻譯區(qū)以約1.9kbp的BamHI片段制備出來，并將其插入質(zhì)粒pY2831的BamHI位點(diǎn)，制備成質(zhì)粒pYSCOP02。因而，設(shè)計(jì)質(zhì)粒pYSCOP02以產(chǎn)生包含SEQ ID No.3氨基酸序列的酶蛋白，它是跟隨分泌信號(hào)序列的成熟β-呋喃果糖苷酶。
將質(zhì)粒pYSCOP01和pYSCOP02通過乙酸鋰方法引入短柄帚霉MS-161(Suc-、Ura3、trp1)得到轉(zhuǎn)化體。在30℃條件下，在SD-Ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體過夜。培養(yǎng)物以1％的最終濃度接種在生成培養(yǎng)基上，并在30℃下培養(yǎng)兩天。以實(shí)施例2所描述的相同方式分析培養(yǎng)物上清液的β-呋喃果糖苷酶活性。結(jié)果，具有質(zhì)粒pYSCOP01的轉(zhuǎn)化體顯示出4×10-4單位/毫升或更小的活性，而具有質(zhì)粒pYSCOP02的轉(zhuǎn)化體顯示出6.5×10-3單位/毫升的活性。
序列表<110>MEIJI SEIKA KAISHA，LTD.<120>β-呋喃果糖苷酶及其基因<130>116875-475<140><141>1998-9-10<150>JP/245154/1997<151>1997-9-10<160>17<170>Patentln Ver.2.0<210>1<211>603<212>PRT<213>婁地青霉IAM7254<220><221>成熟肽<222>(1)...(603)<400>Val Asp Phe His Thr Pro Ile Asp Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu1 5 10 15Ser Thr Leu Ala Asn Ala Ser Leu Phe Lys Thr Trp Arg Pro Arg Ala20 25 30His Leu Leu Pro Pro Ser Gly Asn Ile Gly Asp Pro Cys Gly His Tyr35 40 45Thr Asp Pro Lys Thr Gly Leu Phe His Val Gly Trp Leu Tyr Ser Gly50 55 60Ile Ser Gly Ala Thr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Lys Asp Leu Asn65 70 75 80Pro Asp Gly Ala Pro Ser Ile Val Ala Gly Gly Lys Asn Asp Pro Leu85 90 95Ser Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser Gly Ile Asp Gly Met Pro100 105 110Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Tyr Leu Pro Ile His Trp Ser Ile115 120 125Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Ser Tyr Asp130 135 140Gly Gly His Asn Phe Thr Lys Leu Asn Gln Gly Pro Val Ile Pro Thr145 150 155 160Pro Pro Phe Ala Leu Asn Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe165 170 175Gln Ser Pro Ile Leu Asp Lys Ser Val Asn Ser Thr Gln Gly Thr Trp180 185 190Tyr Val Ala Ile Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly Pro Cys Gln Phe195 200 205Leu Tyr Arg Gln Asn Asp Ala Asp Phe Gln Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly210 215 220Gln Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Thr Thr Trp Gly Lys Gly Asp Trp225 230 235 240Ala Gly Gly Trp Gly Phe Asn Phe Glu Val Gly Asn Val Phe Ser Leu
245 250 255Asn Ala Glu Gly Tyr Ser Glu Asp Gly Glu Ile Phe Ile Thr Leu Gly260 265 270Ala Glu Gly Ser Gly Leu Pro Ile Val Pro Gln Val Ser Ser Ile Arg275 280 285Asp Met Leu Trp Val Thr Gly Asn Val Thr Asn Asp Gly Ser Val Thr290 295 300Phe Lys Pro Thr Met Ala Gly Val Leu Asp Trp Gly Val Ser Ala Tyr305 310 315 320Ala Ala Ala Gly Lys Ile Leu Pro Ala Ser Ser Gln Ala Ser Thr Lys325 330 335Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Tyr Val Trp Leu Thr Gly Asp340 345 350Leu Phe Glu Gln Val Lys Gly Phe Pro Thr Ala Gln Gln Asn Trp Thr355 360 365Gly Ala Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Asn Val Arg Thr Ile Ser Asn370 375 380Val Val Asp Asn Glu Leu Ser Arg Glu Ser Leu Thr Ser Trp Arg Val385 390 395 400Ala Arg Glu Asp Ser Gly Gln Ile Asp Leu Glu Thr Met Gly Ile Ser405 410 415Ile Ser Arg Glu Thr Tyr Ser Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Phe Val420 425 430Glu Ser Gly Lys Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ala Val Pro Phe Asn Thr435 440 445Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr Ala Asn Ile Ser Phe Pro450 455 460Thr Ser Ala Arg Asp Ser Gly Ile Gln Ala Gly Phe Gln Val Leu Ser465 470 475 480Ser Ser Leu Glu Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu Ser485 490 495Ile Ile Val Asp Arg Ser Asn Thr Ser Ala Ala Ala Arg Thr Thr Ala500 505 510Gly Ile Leu Ser Asp Asn Glu Ala Gly Arg Leu Arg Leu Phe Asp Val515 520 525Leu Arg Asn Gly Lys Glu Gln Val Glu Thr Leu Glu Leu Thr Ile Val530 535 540Val Asp Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu545 550 555 560Gly Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Ala Asn Ser Thr Lys Ile Asn Phe565 570 575Phe His Asn Gly Val Gly Glu Ala Thr Phe Glu Asp Va Thr Val Phe580 585 590Glu Gly Leu Tyr Asp Ala Trp Pro Gln Arg Lys595 600<210>2<211>1809<212>DNA<213>婁地青霉IAM7254<220><221>成熟肽<222>(1)...(1809)<400>2gttgatttcc ataccccgat tgactataac tcggctccgc caaacctttc taccctggca 60aacgcatctc ttttcaagac atggagaccc agagcccatc ttctccctcc atctgggaac 120ataggcgacc cgtgcgggca ctataccgat cccaagactg gtctcttcca cgtgggttgg 180ctttacagtg ggatttcggg agcgacaacc gacgatctcg ttacctataa agacctcaat 240cccgatggag ccccgtcaat tgttgcagga ggaaagaacg accctctttc tgtcttcgat 300ggctcggtca ttccaagcgg tatagacggc atgccaactc ttctgtatac ctctgtatca 360tacctcccaa tccactggtc catcccctac acccggggaa gcgagacaca atccttggcc 420gtttcctatg acggtggtca caacttcacc aagctcaacc aagggcccgt gatccctacg 480cctccgtttg ctctcaatgt caccgctttc cgtgacccct acgttttcca aagcccaatt 540ctggacaaat ctgtcaatag tacccaagga acatggtatg tcgccatatc tggcggtgtc 600cacggtgtcg gaccttgtca gttcctctac cgtcagaacg acgcagattt tcaatattgg 660gaatatctcg ggcaatggtg gaaggagccc cttaatacca cttggggaaa gggtgactgg 720gccgggggtt ggggcttcaa ctttgaggtt ggcaacgtct ttagtctgaa tgcagagggg 780tatagtgaag acggcgagat attcataacc ctcggtgctg agggttcggg acttcccatc 840gttcctcaag tctcctctat tcgcgatatg ctgtgggtga ccggcaatgt cacaaatgac 900ggctctgtca ctttcaagcc aaccatggcg ggtgtgcttg actggggcgt gtcggcatat 960gctgctgcag gcaagatctt gccggccagc tctcaggcat ccacaaagag cggtgccccc1020gatcggttca tttcctatgt ctggctcact ggagatctat tcgagcaagt gaaaggattc1080cctaccgctc aacaaaactg gaccggggcc ctcttactgc cgcgagagct gaatgtccgc1140actatctcta acgtggtgga taacgaactt tcgcgtgagt ccttgacatc gtggcgcgtg1200gcccgcgaag actctggtca gatcgacctt gaaacaatgg gaatctcaat ttccagggag1260acttacagcg ctctcacatc cggctcatct tttgtcgagt ctggtaaaac gttgtcgaat1320gctggagcag tgcccttcaa tacctcaccc tcaagcaagt tcttcgtgct gacagcaaat1380atatctttcc cgacctctgc ccgtgactct ggcatccagg ctggtttcca ggttttatcc1440tctagtcttg agtctacaac tatctactac caattctcca acgagtccat catcgtcgac1500cgcagcaaca cgagtgctgc ggcgagaaca actgctggga tcctcagtga taacgaggcg1560ggacgtctgc gcctcttcga cgtgttgcga aatggaaaag aacaggttga aactttggag1620ctcactatcg tggtggataa tagtgtactg gaagtatatg ccaatggacg ctttgctcta1680ggcacttggg ctcggtcttg gtacgccaac tcgactaaaa ttaacttctt ccataacggc1740gtgggagaag cgacattcga agatgtgacg gtctttgaag gactgtatga tgcctggcca1800caaaggaag1809<210>3<211>613<212>PRT<213>短柄帚霉IFO4843<220><221>成熟肽<222>(1)...(613)<400>3Gln Pro Thr Ser Leu Ser Ile Asp Asn Ser Thr Tyr Pro Ser Ile Asp1 5 10 15Tyr Asn Ser Ala Pro Pro Asn Leu Ser Thr Leu Ala Asn Asn Ser Leu20 25 30Phe Glu Thr Trp Arg Pro Arg Ala His Val Leu Pro Pro Gln Asn Gln35 40 45Ile Gly Asp Pro Gys Met His Tyr Thr Asp Pro Glu Thr Gly Ile Phe50 55 60His Val Gly Trp Leu Tyr Asn Gly Asn Gly Ala Ser Gly Ala Thr Thr65 70 75 80Glu Asp Leu Val Thr Tyr Gln Asp Leu Asn Pro Asp Gly Ala Gln Met85 90 95Ile Leu Pro Gly Gly Val Asn Asp Pro Ile Ala Val Phe Asp Gly Ala100 105 110Val Ile Pro Ser Gly Ile Asp Gly Lys Pro Thr Met Met Tyr Thr Ser115 120 125Val Ser Tyr Met Pro Ile Ser Trp Ser Ile Ala Tyr Thr Arg Gly Ser130 135 140Glu Thr His Ser Leu Ala Val Ser Ser Asp Gly Gly Lys Asn Phe Thr145 150 155 160Lys Leu Val Gln Gly Pro Val Ile Pro Ser Pro Pro Phe Gly Ala Asn165 170 175Val Thr Ser Trp Arg Asp Pro Phe Leu Phe Gln Asn Pro Gln Phe Asp180 185 190Ser Leu Leu Glu Ser Glu Asn Gly Thr Trp Tyr Thr Val Ile Ser Gly195 200 205Gly Ile His Gly Asp Gly Pro Ser Ala Phe Leu Tyr Arg Gln His Asp210 215 220Pro Asp Phe Gln Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Pro Trp Trp Asn Glu Glu225 230 235 240Gly Asn Ser Thr Trp Gly Ser Gly Asp Trp Ala Gly Arg Trp Gly Tyr245 250 255Asn Phe Glu Val Ile Asn Ile Val Gly Leu Asp Asp Asp Gly Tyr Asn260 265 270Pro Asp Gly Glu Ile Phe Ala Thr Val Gly Thr Glu Trp Ser Phe Asp275 280 285Pro Ile Lys Pro Gln Ala Ser Asp Asn Arg Glu Met Leu Trp Ala Ala290 295 300Gly Asn Met Thr Leu Glu Asp Gly Asp Ile Lys Phe Thr Pro Ser Met305 310 315 320Ala Gly Tyr Leu Asp Trp Gly Leu Ser Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Lys325 330 335Glu Leu Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ser Gln Lys Ser Gly Ala Pro Asp340 345 350Arg Phe Val Ser Tyr Leu Trp Leu Thr Gly Asp Tyr Phe Glu Gly His355360 365Asp Phe Pro Thr Pro Gln Gln Asn Trp Thr Gly Ser Leu Leu Leu Pro370 375 380Arg Glu Leu Ser Val Gly Thr Ile Pro Asn Val Val Asp Asn Glu Leu385 390 395 400Ala Arg Glu Thr Gly Ser Trp Arg Val Gly Thr Asn Asp Thr Gly Val405 410 415Leu Glu Leu Val Thr Leu Lys Gln Glu Ile Ala Arg Glu Thr Leu Ala420 425 430Glu Met Thr Ser Gly Asn Ser Phe Thr Glu Ala Ser Arg Asn Val Ser435 440 445Ser Pro Gly Ser Thr Ala Phe Gln Gln Ser Leu Asp Ser Lys Phe Phe450 455 460Val Leu Thr Ala Ser Leu Ser Phe Pro Ser Ser Ala Arg Asp Ser Asp465 470 475 480Leu Lys Ala Gly Phe Glu Ile Leu Ser Ser Glu Phe Glu Ser Thr Thr485 490 495Val Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu Ser Ile Ile Ile Asp Arg Ser Asn500 505 510Ser Ser Ala Ala Ala Leu Thr Thr Asp Gly Ile Asp Thr Arg Asn Glu515 520 525Phe Gly Lys Met Arg Leu Phe Asp Val Val Glu Gly Asp Gln Glu Arg530 535 540Ile Glu Thr Leu Asp Leu Thr Ile Val Val Asp Asn Ser Ile Val Glu545 550 555 560Val His Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu Ser Thr Trp Val Arg Ser Trp565 570 575Tyr Glu Ser Ser Lys Asp Ile Lys Phe Phe His Asp Gly Asp Ser Thr580 585 590Val Gln Phe Ser Asn Ile Thr Val Tyr Glu Gly Leu Phe Asp Ala Trp595 600 605Pro Glu Arg Ala Arg610<210>4<211>1839<212>DNA<213>短柄帚霉IFO4843<220><221>成熟肽<222>(1)...(1839)<400>4caacctacgt ctctgtcaat cgacaattcc acgtatcctt ctatcgacta caactccgcc 60cctccaaacc tctcgactct tgccaacaac agcctcttcg agacatggag gccgagggca120cacgtccttc cgccccagaa ccagatcggc gatccgtgta tgcactacac cgaccccgag180acaggaatct tccacgtcgg ctggctgtac aacggcaatg gcgcttccgg cgccacgacc240gaggatctcg tcacctatca ggatctcaac cccgacggag cgcagatgat ccttccgggt300ggtgtgaatg accccattgc tgtctttgac ggcgcggtta ttcccagtgg cattgatggg360aaacccacca tgatgtatac ctcggtgtca tacatgccca tctcctggag catcgcttac420accaggggaa gcgagaccca ctctctcgca gtgtcgtccg acggcggtaa gaacttcacc480aagctggtgc agggccccgt cattccttcg cctcccttcg gcgccaacgt gaccagctgg540cgtgacccct tcctgttcca aaacccccag ttcgactctc tcctcgaaag cgagaacggc600acgtggtaca ccgttatctc tggtggcatc cacggtgacg gcccctccgc gttcctctac660cgtcagcacg accccgactt ccagtactgg gagtaccttg gaccgtggtg gaacgaggaa720gggaactcga cctggggcag cggtgactgg gctggccggt ggggctacaa cttcgaggtc780atcaacattg tcggtcttga cgatgatggc tacaaccccg acggtgaaat ctttgccacg840gtaggtaccg aatggtcgtt tgaccccatc aaaccgcagg cctcggacaa cagggagatg900ctctgggccg cgggcaacat gactctcgag gacggcgata tcaagttcac gccaagcatg960gcgggctacc tcgactgggg tctatcggcg tatgccgccg ctggcaagga gctgcccgct 1020tcttcaaagc cttcgcagaa gagcggtgcg ccggaccggt tcgtgtcgta cctgtggctc 1080accggtgact acttcgaggg ccacgacttc cccaccccgc agcagaattg gaccggctcg 1140cttttgcttc cgcgtgagct gagcgtcggg acgattccca acgttgtcga caacgagctt 1200gctcgcgaga cgggctcttg gagggttggc accaacgaca ctggcgtgct tgagctggtc 1260actctgaagc aggagattgc tcgcgagacg ctggctgaaa tgaccagcgg caactccttc 1320accgaggcga gcaggaatgt cagctcgccc ggatctaccg ccttccagca gtccctggat 1380tccaagttct tcgtcctgac cgcctcgctc tccttccctt cgtcggctcg cgactccgac 1440ctcaaggctg gtttcgagat cctgtcgtcc gagtttgagt cgaccacggt ctactaccag 1500ttttccaacg agtccatcat cattgaccgg agcaactcga gtgctgccgc cttgactacc 1560gatggaatcg acacccgcaa cgagtttggc aagatgcgcc tgtttgatgt tgtcgagggt 1620gaccaggagc gtatcgagac gctcgatctc actattgtgg ttgataactc gatcgttgag 1680gttcatgcca acgggcgatt cgctctgagc acttgggttc gttcgtggta cgagtcgtcc 1740aaggacatca agttcttcca cgatggcgac agcacggttc agttctcgaa catcaccgtc 1800tacgagggac tgtttgacgc ctggccggag cgggccagg 1839<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5caatgaagct caccactacc<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6atcccggtca atttctctcc<210>7<211>1809<212>DNA<213>婁地青霉IAM7254<220><221>CDS<222>(1)...(1694)<221>內(nèi)含子<222>(1695)...(1744)<221>CDS<222>(1745)...(1859)<400>1gttgatttcc ataccccgat tgactataac tcggctccgc caaacctttc taccctggca 60aacgcatctc ttttcaagac atggagaccc agagcccatc ttctccctcc atctgggaac120ataggcgacc cgtgcgggca ctataccgat cccaagactg gtctcttcca cgtgggttgg180ctttacagtg ggatttcggg agcgacaacc gacgatctcg ttacctataa agacctcaat240cccgatggag ccccgtcaat tgttgcagga ggaaagaacg accctctttc tgtcttcgat300ggctcggtca ttccaagcgg tatagacggc atgccaactc ttctgtatac ctctgtatca360tacctcccaa tccactggtc catcccctac acccggggaa gcgagacaca atccttggcc420gtttcctatg acggtggtca caacttcacc aagctcaacc aagggcccgt gatccctacg480cctccgtttg ctctcaatgt caccgctttc cgtgacccct acgttttcca aagcccaatt540ctggacaaat ctgtcaatag tacccaagga acatggtatg tcgccatatc tggcggtgtc600cacggtgtcg gaccttgtca gttcctctac cgtcagaacg acgcagattt tcaatattgg660gaatatctcg ggcaatggtg gaaggagccc cttaatacca cttggggaaa gggtgactgg720gccgggggtt ggggcttcaa ctttgaggtt ggcaacgtct ttagtctgaa tgcagagggg780tatagtgaag acggcgagat attcataacc ctcggtgctg agggttcggg acttcccatc840gttcctcaag tctcctctat tcgcgatatg ctgtgggtga ccggcaatgt cacaaatgac900ggctctgtca ctttcaagcc aaccatggcg ggtgtgcttg actggggcgt gtcggcatat 960gctgctgcag gcaagatctt gccggccagc tctcaggcat ccacaaagag cggtgccccc 1020gatcggttca tttcctatgt ctggctcact ggagatctat tcgagcaagt gaaaggattc 1080cctaccgctc aacaaaactg gaccggggcc ctcttactgc cgcgagagct gaatgtccgc 1140actatctcta acgtggtgga taacgaactt tcgcgtgagt ccttgacatc gtggcgcgtg 1200gcccgcgaag actctggtca gatcgacctt gaaacaatgg gaatctcaat ttccagggag 1260acttacagcg ctctcacatc cggctcatct tttgtcgagt ctggtaaaac gttgtcgaat 1320gctggagcag tgcccttcaa tacctcaccc tcaagcaagt tcttcgtgct gacagcaaat 1380atatctttcc cgacctctgc ccgtgactct ggcatccagg ctggtttcca ggttttatcc 1440tctagtcttg agtctacaac tatctactac caattctcca acgagtccat catcgtcgac 1500cgcagcaaca cgagtgctgc ggcgagaaca actgctggga tcctcagtga taacgaggcg 1560ggacgtctgc gcctcttcga cgtgttgcga aatggaaaag aacaggttga aactttggag 1620ctcactatcg tggtggataa tagtgtactg gaagtatatg ccaatggacg ctttgctcta 1680ggcacttggg ctcggtaagt ctctcttgtt tatggaagat tggtcaaaaa ctaaccgcat 1740gaaggtcttg gtacgccaac tcgactaaaa ttaacttctt ccataacggc gtgggagaag 1800cgacattcga agatgtgacg gtctttgaag gactgtatga tgcctggcca caaagggaag 1859<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8caactgctgg catcctcagt ga<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>9gcggatccat gaagctatca aatgcaatc<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>10gcggatcctt accgagccca agtgcc<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>11gcggatcctc acttcctttg tggccag<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>12gttggcgtac caagaccgag cccaagtgcc<210>13<211>1894<212>DNA<213>短柄帚霉IFO4843<220><221>CDS<222>(1)...(1721)<221>內(nèi)含子<222>(1722)...(1776)<221>CDS<222>(1777)...(1894)<400>13caacctacgt ctctgtcaat cgacaattcc acgtatcctt ctatcgacta caactccgcc 60cctccaaacc tctcgactct tgccaacaac agcctcttcg agacatggag gccgagggca120cacgtccttc cgccccagaa ccagatcggc 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權(quán)利要求
1.一種包含SEQ ID No.1氨基酸序列或其同系物的多肽。
2.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽的DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA，其包含SEQ ID No.2的核苷酸序列。
4.一種包含SEQ ID No.3氨基酸序列或其同系物的多肽。
5.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽的DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA，其包含SEQ ID No.4的核苷酸序列。
7.一種包含根據(jù)權(quán)利要求2、3、5或6所述的DNA的載體。
8.一種用根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
9.一種生產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的方法，其包括以下步驟培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，并從宿主和/或其培養(yǎng)物中收集β-呋喃果糖苷酶。
10.一種制備低聚果糖的方法，其包括將蔗糖與根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，或根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法獲得的β-呋喃果糖苷酶相接觸的步驟。
全文摘要
公開了一種新的β－呋喃果糖苷酶及其基因。包含序列表中SEQ ID No.1或3所示的氨基酸序列的多肽是具有β－呋喃果糖苷酶活性且具有高度轉(zhuǎn)移酶活性的一種酶,其能高效地產(chǎn)生低聚果糖。
文檔編號(hào)C12N15/54GK1276008SQ98810189
公開日2000年12月6日 申請(qǐng)日期1998年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月10日
發(fā)明者矢內(nèi)耕二, 中根公隆, 河野敏明 申請(qǐng)人:明治制果株式會(huì)社