專利名稱：誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有誘導(dǎo)含整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)的具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡特性的新型單克隆抗體，以及它們的片段、肽和低分子化合物，并涉及產(chǎn)生所述單克隆抗體的雜交瘤。該新型抗體可用作髓樣白血病和淋巴樣白血病的治療劑。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞集落刺激因子，例如重組粒細(xì)胞集落刺激因子(rG-CSF)，在現(xiàn)有技術(shù)中公知可作為刺激粒細(xì)胞分化和增殖的體液因子。根據(jù)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的報(bào)道顯示，rG-CSF的施用，不僅引起骨髓中髓細(xì)胞加速生成，而且導(dǎo)致脾臟外髓的血細(xì)胞顯著生成，并造成脾臟中包括造血干細(xì)胞在內(nèi)的所有造血祖細(xì)胞增殖。這種脾臟外髓血細(xì)胞生成的機(jī)制據(jù)信為rG-CSF的刺激改變了脾臟的造血微環(huán)境，促進(jìn)其血細(xì)胞生成的維持能力，因而誘導(dǎo)其血細(xì)胞生成。
為了闡明脾臟的造血功能，本發(fā)明人一直集中研究反復(fù)施用rG-CSF后的脾臟基質(zhì)細(xì)胞。發(fā)明人努力研究重組粒細(xì)胞集落刺激因子如何經(jīng)由基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)造血功能，并且通過(guò)反復(fù)施用rG-CSF建立了小鼠脾臟造血基質(zhì)細(xì)胞系(CF-1細(xì)胞)。發(fā)明者研究了造血基質(zhì)細(xì)胞的血細(xì)胞生成支持能力，確證其體外集落刺激能力和體內(nèi)的造血干細(xì)胞支持能力[血液(Blood)，80，1914(1992)]。
然而，盡管建立了一種脾基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系(CF-1細(xì)胞)，并且研究了它的細(xì)胞學(xué)特征，但能夠識(shí)別這些細(xì)胞表面抗原的特異抗體尚未制備，其特征更未見(jiàn)任何形式的闡述。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)前面提到的有關(guān)脾基質(zhì)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和現(xiàn)有研究結(jié)果，本發(fā)明人急切做出進(jìn)一步研究，旨在開(kāi)發(fā)能夠識(shí)別脾基質(zhì)細(xì)胞的特異抗體，應(yīng)用上述的脾基質(zhì)細(xì)胞系作為致敏抗原致力于制備單克隆抗體，最終成功獲得新型的單克隆抗體。
發(fā)明人進(jìn)一步研究了如上述方法獲得的單克隆抗體的特性，發(fā)現(xiàn)該單克隆抗體具有誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的性質(zhì)。這些單克隆抗體被命名為“BMAP-1抗體”，后面提及可參考此名。
發(fā)明人還研究了BMAP-1抗體識(shí)別的抗原，通過(guò)直接表達(dá)克隆發(fā)現(xiàn)該抗原是小鼠整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(小鼠IAP)(Genbank，保藏號(hào)Z25524)。
運(yùn)用小鼠整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)基因?qū)氲闹亟M細(xì)胞對(duì)BMAP-1抗體的作用進(jìn)行研究。特別地，通過(guò)常規(guī)方法將小鼠IAP基因?qū)氩槐磉_(dá)小鼠IAP的Jurkat細(xì)胞中，建立一種表達(dá)小鼠IAP的細(xì)胞系(重組Jurkat細(xì)胞)，并且BMAP-1抗體對(duì)表達(dá)小鼠IAP細(xì)胞的作用也通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)研究，且通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA分段獲得檢驗(yàn)(日本專利申請(qǐng)?zhí)朒EI9-67499)。
通過(guò)這些發(fā)現(xiàn)可以預(yù)計(jì)，針對(duì)人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(后面均為人IAP，氨基酸序列和堿基序列可見(jiàn)細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)，123，485-496，1993；也可見(jiàn)細(xì)胞科學(xué)雜志(J.Cell.Sci.)，108，3419-3425，1995)抗原的單克隆抗體應(yīng)具有誘導(dǎo)表達(dá)該抗原的具核血細(xì)胞(骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡的作用，發(fā)明人已努力制備了抗人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白抗原的單克隆抗體，并且成功獲得誘導(dǎo)表達(dá)該抗原的人具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的單克隆抗體。
換言之，本發(fā)明的目標(biāo)是提供具有誘導(dǎo)具核血細(xì)胞(骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡性質(zhì)的新型單克隆抗體、其抗體片段以及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，其中該具有血細(xì)胞含人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(人IAP)。
這種新型單克隆抗體可用作髓樣白血病和淋巴樣白血病的治療劑。
整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白已報(bào)道的功能有，與整聯(lián)蛋白αvβ3的β鏈結(jié)合以支持αvβ3與它的配體玻連蛋白(細(xì)胞生物學(xué)雜志，123，485-496(1993))之間的結(jié)合，通過(guò)嗜中性白細(xì)胞與血管內(nèi)皮粘附誘導(dǎo)Ca2+流入血管內(nèi)皮(生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，268，19931-19934(1993))，支持嗜中性白細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮遷移(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，92，3978-3982(1995))，但是尚未有公開(kāi)報(bào)道該整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白具有與具核血細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡相關(guān)的功能。
本發(fā)明的單克隆抗體是特異識(shí)別人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的抗體。因此該抗體表現(xiàn)出識(shí)別和鑒定人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的功能。
此外，本發(fā)明的單克隆抗體顯示出誘導(dǎo)含人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的具核血細(xì)胞(骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡的性質(zhì)。編程性細(xì)胞死亡是指細(xì)胞核染色質(zhì)DNA被剪切為核小體單元(稱作“序列梯形成”)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的現(xiàn)象，也稱為細(xì)胞自殺。
到目前為止，已知的具有誘導(dǎo)具核血細(xì)胞(骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡性質(zhì)的單克隆抗體包括抗-Fas抗體(細(xì)胞(Cell)，66，233-243，1991)、抗-CD43抗體(血液，86，502-511，1995)和抗-HLA家族Iα1結(jié)構(gòu)域抗體(血液，90，726-735，1997)，但是通過(guò)識(shí)別整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的本發(fā)明的抗體誘導(dǎo)具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的性質(zhì)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本發(fā)明的單克隆抗體可定義為包括任何能夠特異地識(shí)別整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白并具有誘導(dǎo)含整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的具核血細(xì)胞(骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡性質(zhì)的單克隆抗體。
本發(fā)明的抗體并不僅僅局限于可誘導(dǎo)一切具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的抗體。它們也包括那些誘導(dǎo)至少一種類型具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的抗體。特別是對(duì)于髓樣白血病的情況，抗體至少能夠誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡就足夠了。
更特別地，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)含整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)的具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的單克隆抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供誘導(dǎo)含整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的單克隆抗體之片段、肽和低分子化合物。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供產(chǎn)生這種單克隆抗體的雜交瘤。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種抗白血病劑，它包含一種可與IAP結(jié)合并促進(jìn)IAP作用，以誘導(dǎo)具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的物質(zhì)。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種抗白血病劑，其特征為該物質(zhì)是一種單克隆抗體。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種抗白血病劑，其特征為該物質(zhì)是單克隆抗體的片段、肽或一種低分子化合物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是電泳圖樣，顯示了利用從HL-60細(xì)胞系mRNA制備的cDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的人IAP條帶。從左至右依次為分子量標(biāo)記(M)、人IAP(1)和β-肌動(dòng)蛋白(2)。
圖2是用抗-CD47抗體顯示已表達(dá)人IAP的L1210細(xì)胞之人IAP的表達(dá)水平的圖。峰代表僅用對(duì)照pCOS1基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞。
圖3是用抗-CD47抗體顯示已表達(dá)人IAP的L1210細(xì)胞之人IAP的表達(dá)水平的圖。峰表示用人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞中人IAP的表達(dá)已顯著增加。
圖4是顯示免疫小鼠中抗體滴度的圖。左邊峰代表完整的L1210細(xì)胞。右邊峰代表經(jīng)人IAP轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞，表明用于細(xì)胞融合的小鼠血清很明顯地識(shí)別人IAP。
圖5的條形圖顯示用雜交瘤培養(yǎng)上清液對(duì)Jurkat細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖6的條形圖顯示用雜交瘤培養(yǎng)上清液對(duì)ARH77細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖7是顯示用作為對(duì)照的8G2培養(yǎng)上清液(經(jīng)PI染色分析)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡效果的圖。R1表示編程性細(xì)胞死亡的百分比(％)為7.43％。
圖8是顯示用7D2-E3培養(yǎng)上清液(經(jīng)PI染色分析)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡效果的圖。R1表示細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的百分比(％)為9.84％。
圖9是顯示用11C8培養(yǎng)上清液(經(jīng)PI染色分析)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡效果的圖。R1表示細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的百分比(％)為15.32％。
圖10是顯示用作為對(duì)照的8G2培養(yǎng)上清液(經(jīng)PI染色分析)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡效果的圖。M1表示細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的百分比(％)為6.94％。
圖11是顯示用11C8培養(yǎng)上清液(經(jīng)PI染色分析)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡效果的圖。M1表示細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的百分比(％)為12.16％。
圖12A是單色顯微照片，顯示了用作為對(duì)照的9C5培養(yǎng)上清液對(duì)KM-102和HL-60細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)編程性細(xì)胞死亡的分析結(jié)果(TUNEL方法)。編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞被染成黑色或棕色。核是用甲基綠染色的，放大倍數(shù)為100倍(100×)。
圖12B是彩色顯微照片，顯示了用作為對(duì)照的9C5培養(yǎng)上清液對(duì)KM-102和HL-60細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)編程性細(xì)胞死亡的分析結(jié)果(TUNEL方法)。編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞被染成黑色或棕色。核是用甲基綠染色的，放大倍數(shù)為100倍(100×)。
圖13A是黑白顯微照片，顯示了用11C8培養(yǎng)上清液對(duì)KM-102和HL-60細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)編程性細(xì)胞死亡的分析結(jié)果(TUNEL方法)。比圖12看到更多TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞被染成黑色或棕色。核是用甲基綠染色的，放大倍數(shù)為100倍(100×)。
圖13B是彩色顯微照片，顯示了用11C8培養(yǎng)上清液對(duì)KM-102和HL-60細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)編程性細(xì)胞死亡的分析結(jié)果(TUNEL方法)。比圖12看到更多TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞被染成黑色或棕色。核是用甲基綠染色的，放大倍數(shù)為100倍(100×)。
圖14是電泳圖，顯示了從雜交瘤系7D2-E3和11C8純化的IgG之SDS-PAGE分析結(jié)果。圖示為分子量標(biāo)記(M，M’)，非還原條件下的小鼠IgG(標(biāo)準(zhǔn)樣品)(1)、7D2-E3(2)、11C8(3)，還原條件下的小鼠IgG(標(biāo)準(zhǔn)樣品)(4)、7D2-E3(5)和11C8(6)。
圖15顯示了利用HL-60細(xì)胞以流式細(xì)胞術(shù)分析CD47表達(dá)的結(jié)果。
圖16顯示了利用Jurkat細(xì)胞以流式細(xì)胞術(shù)分析CD47表達(dá)的結(jié)果。
圖17顯示用mIgG(10μg/ml)作對(duì)照證明其誘導(dǎo)人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞(L1210-hIAP)編程性細(xì)胞死亡的效果(溫育時(shí)間72小時(shí))。
圖18顯示MABL-1(10μg/ml)誘導(dǎo)人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的效果(溫育時(shí)間72小時(shí))。
圖19顯示MABL-2(10μg/ml)誘導(dǎo)人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的效果(溫育時(shí)間72小時(shí))。
圖20顯示用mIgG(10μg/ml)作對(duì)照證明其誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的效果(溫育時(shí)間48小時(shí))。
圖21顯示MABL-1(10μg/ml)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的效果(溫育時(shí)間48小時(shí))。
圖22顯示MABL-2(10μg/ml)誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的效果(溫育時(shí)間48小時(shí))。
圖23顯示用mIgG(10μg/ml)作對(duì)照證明其誘導(dǎo)經(jīng)人IAP基因?qū)朕D(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞(L1210-hIAP)編程性細(xì)胞死亡的效果(溫育時(shí)間72小時(shí))。
圖24顯示MABL-2 Fab片段(10μg/ml)誘導(dǎo)人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的效果。
圖25是MABL-2抗體Fab片段的SDS電泳圖。
圖26顯示了經(jīng)MABL-2處理后明顯延長(zhǎng)的存活期。
圖27顯示了實(shí)施例5(2)的ELISA結(jié)果。
圖28顯示了經(jīng)MABL-2 F(ab′)2片段處理后明顯延長(zhǎng)的存活期。
圖29是MABL-1抗體和MABL-2抗體F(ab′)2片段SDS電泳圖。
圖30顯示了MABL-1和MABL-2治療組小鼠血清的人IgG水平顯著降低，證明了這些抗體的抗腫瘤效果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式單克隆抗體的制備本發(fā)明的單克隆抗體一般可按照以下方法制備。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)用人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白作為致敏抗原，用本領(lǐng)域中已知的免疫方法用該抗原免疫動(dòng)物，用本領(lǐng)域已知的細(xì)胞融合方法進(jìn)行細(xì)胞融合，和用本領(lǐng)域已知的克隆方法克隆從而獲得本發(fā)明的單克隆抗體。
更為特別地，本發(fā)明制備單克隆抗體的優(yōu)選方法是這樣一種方法，例如，其中小鼠白血病細(xì)胞系L1210重組細(xì)胞表達(dá)人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白，該細(xì)胞可用作致敏抗原，而用該致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物漿細(xì)胞(免疫細(xì)胞)與哺乳動(dòng)物如小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，克隆所得融合的細(xì)胞(雜交瘤)，從所得的克隆中篩選出能夠識(shí)別前面所述的細(xì)胞系并產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的克隆，進(jìn)而培養(yǎng)獲得目的抗體。
以上方法僅僅是本發(fā)明一種可能的實(shí)施例，例如，致敏抗原并不局限于前面所述的L1210重組細(xì)胞，也可以是人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)本身，或者可溶形式的人IAP；誘導(dǎo)具核血細(xì)胞(骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡的目的單克隆抗體可以按照如上述L1210重組細(xì)胞同樣的方法制備。
噬菌體展示技術(shù)也可以用作從抗體的cDNA文庫(kù)制備目的單克隆抗體的方法。
在制備單克隆抗體的方法中致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物并不特別限定，但優(yōu)先選擇的動(dòng)物應(yīng)考慮它們與用作細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞的相容性，小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等一般比較適宜。
優(yōu)選的是用一種標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行免疫。例如，表達(dá)人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的L1210重組細(xì)胞通過(guò)腹膜內(nèi)注射或類似方法施于動(dòng)物。更特別地，優(yōu)選地每間隔10天數(shù)次施用PBS或生理鹽水適當(dāng)稀釋的細(xì)胞懸液。末次施用細(xì)胞以后，優(yōu)選的提取脾細(xì)胞作為所用免疫細(xì)胞。
用作與免疫細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞，可采用本領(lǐng)域中已知的多種細(xì)胞系中任一種，如P3(P3X63Ag8.653)[免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)，123，1548(1978)]、P3-U1[微生物免疫學(xué)論題(CurrentTopics in Microbiology and Immunology，81，1-7(1978)]，NS-1[歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)，6，511-519(1976)]，MPC-11[細(xì)胞，8，405-415(1976)]，Sp2/0-Ag14[自然(Nature)，276，269-270(1978)]，F(xiàn)O[免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Meth.)，35，1-21(1980)]，S194[實(shí)驗(yàn)方法雜志(J.Exp.Med.)，148，313-323(1978)]和R210[自然，277，131-133(1979)]。
免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞融合可基本按照常規(guī)方法進(jìn)行，例如Milstein等人的方法[酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)，73，3-46(1981)]。
更特別地，例如細(xì)胞融合在一種含融合促進(jìn)劑的普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。例如，采用的融合促進(jìn)劑可以是聚乙二醇(PEG)、仙臺(tái)病毒(HVJ)等，如果需要也可適當(dāng)?shù)靥砑尤缍谆鶃嗧康淖魟┮栽黾尤诤闲?。免疫?xì)胞優(yōu)選地是采用1-10倍于骨髓瘤細(xì)胞的量。用作細(xì)胞融合的培養(yǎng)基可以是例如RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基等適合骨髓瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，或者其它普遍用于這類細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，并且也可與如胎牛血清(FBS)之類的血清添加劑結(jié)合使用。
進(jìn)行細(xì)胞融合時(shí)在培養(yǎng)基中徹底混勻預(yù)定量的免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入并混勻預(yù)熱至大約37℃的PEG溶液，其平均分子量約1,000-6,000，通常終濃度約30-60％(w/v)，然后加入適宜培養(yǎng)基，離心去除所得上清液。重復(fù)數(shù)次該步驟以產(chǎn)生目的雜交瘤。
通過(guò)在普通選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選雜交瘤，例如HAT培養(yǎng)基(一種包含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)基)。在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)足夠的時(shí)間，通常為幾天或幾星期，使所有除了目的雜交瘤以外的細(xì)胞(所有非融合細(xì)胞)死亡。通常運(yùn)用有限稀釋法篩選并單克隆產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤。
以這種方式制備的能產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤可在普通培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，也可以置于液氮中長(zhǎng)期保存。
為了從雜交瘤中獲得本發(fā)明的單克隆抗體，可采用任何適宜的方法，例如這樣的方法，按標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)雜交瘤并從培養(yǎng)上清液中獲得單克隆抗體；或另外一種方法，將雜交瘤施于相容的哺乳動(dòng)物中增殖，然后從其腹水液中獲得抗體。前面一種方法適合獲得高純度抗體，而后面一種方法適合大量生產(chǎn)抗體。
通過(guò)上述方法獲得的抗體可用如鹽析、凝膠過(guò)濾、親和層析等標(biāo)準(zhǔn)純化方法進(jìn)行高度純化。單克隆抗體片段本發(fā)明的單克隆抗體可以是上述的完整抗體，或者是其片段。也就是說(shuō)，它們可以是本發(fā)明的單克隆抗體的任何片段，所述片段能夠特異識(shí)別人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白并誘導(dǎo)含人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的具核血細(xì)胞(骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡。這些片段包括Fab、F(ab′)2、Fab′等等。這些片段可通過(guò)用諸如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶等酶消化獲得。所獲得片段的特性可以上述的同樣方式進(jìn)行確定。具有與單克隆抗體相同功能的肽和低分子化合物上述識(shí)別人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白并誘導(dǎo)具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的單克隆抗體，也包含同樣識(shí)別IAP和誘導(dǎo)具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的肽和低分子化合物。本發(fā)明單克隆抗體的性質(zhì)正如后面實(shí)施例中的具體描述，本發(fā)明的單克隆抗體特異識(shí)別人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白。
本發(fā)明的單克隆抗體也誘導(dǎo)含人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的具核血細(xì)胞(骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)編程性細(xì)胞死亡。
這些性質(zhì)可用于獲得治療髓樣白血病和淋巴樣白血病領(lǐng)域中有用的治療劑。
因此，將容易理解的是，一種特定系統(tǒng)的構(gòu)建，包括本發(fā)明的單克隆抗體作為特異識(shí)別能引起具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的抗原的抗體，區(qū)分和鑒定該抗原的用途，或者單克隆抗體作為髓樣白血病和淋巴樣白血病的治療劑這一特有性質(zhì)的用途，而對(duì)該系統(tǒng)的任意修飾和應(yīng)用，也都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。因?yàn)榫驮撓到y(tǒng)構(gòu)建而言，可通過(guò)運(yùn)用對(duì)本領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施?？拱籽└鶕?jù)本發(fā)明的抗白血病劑是基于如下事實(shí)可通過(guò)與本發(fā)明的或類似的抗體結(jié)合促進(jìn)IAP的作用。雖然對(duì)發(fā)明抗體的劑量并沒(méi)有特別的限制，其優(yōu)選范圍為5μg-500mg/kg。實(shí)施例現(xiàn)在通過(guò)以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的解釋；但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1(單克隆抗體的制備)(1)致敏抗原和免疫方法抗原致敏是用重組細(xì)胞系作為致敏抗原完成的，重組細(xì)胞系為人IAP基因轉(zhuǎn)染的且高效表達(dá)產(chǎn)物的L1210細(xì)胞。L1210來(lái)自DBA小鼠衍生的白血病細(xì)胞系(ATCC No.CCL-219，國(guó)家癌癥研究所雜志(J.Natl.CancerInst.)，10179-192，1949)。
人IAP基因是采用人IAP特異序列設(shè)計(jì)的引物(有義引物GCAAGCTTATGTGGCCCCTGGTAGCG，反義引物GCGGCCGCTCAGTTATTCCTAGG AGG)通過(guò)PCR擴(kuò)增的，模板cDNA由HL-60細(xì)胞系mRNA制備(Clontech Laboratories.Inc.)(圖1)。
將PCR產(chǎn)物亞克隆入pGEM-T克隆載體(Promega公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)JM109(TaKara Shuzo Co.Ltd.)，通過(guò)DNA測(cè)序儀(373ADNA Sequencer，ABI)鑒定插入DNA的核苷酸序列后，亞克隆至表達(dá)載體pCOS1。
表達(dá)載體pCOS1是由pEF-BOS(核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，18，5322，1990)衍變而來(lái)的，該載體通過(guò)亞克隆使用人延伸因子-1α作為啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的新霉素抗性基因而獲得。這種亞克隆人IAP的表達(dá)載體用于將基因?qū)隓MRIE-C(GIBCO/BRL)培養(yǎng)的L1210細(xì)胞系，并由遺傳霉素(終濃度1mg/ml，GIBCO/BRL公司)進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)入基因的L1210細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法克隆。
采用識(shí)別人IAP的抗-CD47抗體(PharMingen)對(duì)所獲得克隆的抗原表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，篩選出高水平表達(dá)的克隆作為致敏抗原的細(xì)胞(圖2，3)。培養(yǎng)重組L1210細(xì)胞采用含10％胎牛血清(FBS，Moregate Inc.)的Iscove改進(jìn)的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)(GIBCO/BRL)，在含5％CO2溫度為37℃的溫箱中傳代培養(yǎng)。
采用的免疫動(dòng)物為與L1210細(xì)胞屬同一株系的DBA/2小鼠(養(yǎng)殖于Charles River，日本)。用作致敏抗原的人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞，與終濃度200μg/ml的絲裂霉素C(Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd.)共溫育30分鐘，待細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)后，絲裂霉素C在PBS重懸之前被徹底洗去。
以約10天的間隔分3次將細(xì)胞腹膜內(nèi)注入小鼠，每次大約5×106個(gè)細(xì)胞。免疫3次后，眼框采血，血清用含1％BSA的PBS稀釋50倍，稀釋血清與用作致敏抗原的重組L1210細(xì)胞結(jié)合的情況通過(guò)FACScan(Becton Dickinson and company)(圖4)鑒定；具有最佳抗血清活性的小鼠在第4次免疫5天后腹膜內(nèi)注入1×107細(xì)胞加強(qiáng)免疫。末次免疫4天后，處死小鼠取出脾臟。(2)細(xì)胞融合取出的小鼠脾臟切成薄片后，分離的脾細(xì)胞離心并重懸于IMDM培養(yǎng)基，使其漂浮，徹底沖洗。另一方面，小鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3-U1(微生物與免疫學(xué)論題(Current topics in Microbiology and Immunology)，81，1-7(1978))培養(yǎng)于含10％胎牛血清(FBS，Moregate Inc.)的IMDM培養(yǎng)基，以相似方法用IMDM培養(yǎng)基沖洗后，在離心管中將1×107骨髓瘤細(xì)胞與5×107脾細(xì)胞混合，按標(biāo)準(zhǔn)方法(臨床實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)，42，458-462(1980))用聚乙二醇4000(NakaraiChemical co.，Ltd)進(jìn)行細(xì)胞融合。
所得融合的細(xì)胞重懸于含10％FBS和融合細(xì)胞生長(zhǎng)刺激劑(BM-condimed H1，Boehringer Mannheim Biochemicals)的IMDM培養(yǎng)基，分散至96孔板培養(yǎng)于含5％CO2的37℃溫箱。隨后幾天，細(xì)胞置于HAT選擇培養(yǎng)基，然后于含生長(zhǎng)刺激劑的10％FBS/IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)以維持其生長(zhǎng)。
為檢測(cè)這些融合細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)白血病細(xì)胞系的作用效果，用于融合細(xì)胞的培養(yǎng)基可用含10％FBS的IMDM培養(yǎng)基替換，以繼續(xù)培養(yǎng)維持其生長(zhǎng)。(3)篩選采用前面所述的融合細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行以下篩選。1初次篩選經(jīng)人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)基因轉(zhuǎn)染的小鼠脾基質(zhì)細(xì)胞系(CF-1)細(xì)胞(該重組細(xì)胞中亞克隆的質(zhì)粒與制備用作致敏抗原的表達(dá)人IAP的L1210細(xì)胞所用的質(zhì)粒相同)接種于96孔板過(guò)夜培養(yǎng)，每孔1×104細(xì)胞，然后用2％PLP(高碘酸-賴氨酸-低聚甲醛)固定制備ELISA板。沖洗后，板條用1％BSA溶液室溫封閉1小時(shí)，再次沖洗，加入每個(gè)雜交瘤培養(yǎng)上清液50μl室溫溫育1小時(shí)。
沖洗后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗小鼠IgG+A+M(H+L)(ZymedLaboratories Inc.)，再室溫溫育1小時(shí)。沖洗后，加入終濃度1mg/ml的SIGMA104底物(Sigma-Aldrich Corpration)，繼續(xù)室溫溫育，然后用微孔板閱讀儀(Model3550，Biorad Laboratories Inc.)測(cè)定比活性。
結(jié)果，初次篩選對(duì)2880孔雜交瘤中的2089孔進(jìn)行鑒定，其中187孔陽(yáng)性。室溫溫育1小時(shí)前每孔加入50μl小鼠IgG1作為陰性對(duì)照，50μl抗人CD47抗體(BD PharMingen)作為陽(yáng)性對(duì)照，終濃度3μg/ml。2二次篩選為了篩選雜交瘤產(chǎn)生的抗體是否特異識(shí)別人IAP，可用表達(dá)人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)的CF-1細(xì)胞對(duì)初次篩選判斷為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行ELISA檢測(cè)，該系統(tǒng)的陰性對(duì)照為僅轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pCOS1的CF-1細(xì)胞。
結(jié)果，初次篩選陽(yáng)性的187孔中21孔鑒定為陽(yáng)性。表1以ELISA中光吸收值形式顯示了與人IAP特異結(jié)合的7D2和11C8作為代表性范例。(表1)雜交瘤培養(yǎng)上清液與人IAP特異結(jié)合的ELISA分析表1<原始值> PBSαHCD47(3μg/ml)7D211C8CF1-pCOS1 0.1850.160 0.189 0.149CF1-hIAP-55-8 0.1920.456 0.568 0.812<差減值> PBSαHCD47(3μg/ml)7D211C8特異結(jié)合 0.0070.296 0.379 0.63三次篩選二次篩選中判斷為陽(yáng)性的克隆用Jurkat細(xì)胞(人T淋巴細(xì)胞系)和ARH77細(xì)胞(人骨髓瘤細(xì)胞系)進(jìn)行生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)。每孔100μl5×103Jurkat細(xì)胞和每孔1×104ARH77細(xì)胞接種于96孔板的每一孔中，細(xì)胞懸液中加入5或10μl雜交瘤培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)約2天后，通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。每孔加入5或10μl含10％FBS的IMDM培養(yǎng)基以及初次篩選為陰性克隆(8G2和9C5)的培養(yǎng)上清液作為對(duì)照。
圖5和6顯示4株代表克隆11C8、7D2-E3(7D2的亞克隆)、13F1和2F12的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的結(jié)果。(4)抗體特性1用ELISA系統(tǒng)檢測(cè)11C8、7D2-E3、13F1和2F12的培養(yǎng)上清液之免疫球蛋白類型特別地，表達(dá)人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)的CF-1細(xì)胞接種到96孔板以制備ELISA板，然后加入50μl每份培養(yǎng)上清液，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Zymed Laboratories Inc)或抗-小鼠IgM抗體(BiosourceIntl，Inc.)作為二抗進(jìn)行反應(yīng)，用微孔板閱讀儀測(cè)定活性。結(jié)果，11C8和7D2-E3鑒定為IgG，而13F1和2F12鑒定為IgM。2上述4個(gè)克隆中11C8和7D2-E3 2個(gè)克隆的DNA片段采用Jurkat細(xì)胞和HL-60細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FACScan，獲自Becton，Dickinsonand Company)分析。Jurkat細(xì)胞用來(lái)分析11C8和7D2-E3，HL-60細(xì)胞用來(lái)分析11C8。
Jurkat細(xì)胞和HL-60細(xì)胞分別種入12孔板，每孔2ml約4×104細(xì)胞，然后加入200μl 7D2-E3和11C8培養(yǎng)上清液。細(xì)胞培養(yǎng)2天后測(cè)定。加入等體積的8G2培養(yǎng)上清液作為對(duì)照。細(xì)胞從培養(yǎng)板上收集，在2ml冰冷的70％乙醇中4℃下200×g離心60分鐘固定細(xì)胞沉淀。離心細(xì)胞后用1mlPBS洗滌再重懸于0.5mlPBS。0.5ml細(xì)胞樣品中加入0.5mlRNase(I-A型，Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO，美國(guó)；1mg/ml溶于PBS)，然后與1ml二碘化丙錠(PI，Sigma，100μg/ml溶于PBS)溶液混合。混合的細(xì)胞在暗室中37℃溫育60分鐘后，暗室4℃保存，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。
如圖7-9和10-11所示，7D2-E3和11C8的培養(yǎng)上清液增加了Jurkat細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的比例，11C8的培養(yǎng)上清液增加了HL-60細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的比例。311C8培養(yǎng)上清液與HL-60細(xì)胞用于共培養(yǎng)系統(tǒng)，用人骨髓瘤基質(zhì)細(xì)胞系KM102作飼喂細(xì)胞層，以確定這些培養(yǎng)上清是否誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡。
特別地，KM102細(xì)胞接種于2孔的Lab-Tek Chamber玻片(NalgeNunc Intl。Corporation)，培養(yǎng)至亞鋪滿狀態(tài)，在上面接種1×105HL-60細(xì)胞，約培養(yǎng)1天，去除未粘附的HL-60細(xì)胞。然后同時(shí)加入上述培養(yǎng)上清液達(dá)終濃度10％，細(xì)胞培養(yǎng)2天。培養(yǎng)后，用10％福爾馬林固定細(xì)胞，誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡的HL-60細(xì)胞用TUNEL方法(Apop Tag plus，可獲自O(shè)ncor Inc.)檢測(cè)。如圖12和13所示，11C8培養(yǎng)上清液比9C5培養(yǎng)上清液增加更多的編程性細(xì)胞死亡HL-60細(xì)胞，9C5培養(yǎng)上清液是用作對(duì)照的人IAP非反應(yīng)活性的雜交瘤克隆的培養(yǎng)上清液。(5)抗體純化為了純化雜交瘤產(chǎn)生的抗體，將上述雜交瘤中產(chǎn)生IgG的克隆7D2-E3和11C8細(xì)胞系按照標(biāo)準(zhǔn)方法腹膜內(nèi)注入預(yù)先施用了降植烷的BALB/C/AnNCrj小鼠(雄性，購(gòu)自Charles River，日本)。幾星期后，抽取產(chǎn)生的腹水并按標(biāo)準(zhǔn)方法分離純化抗體。特別地，用Polos蛋白A塑料柱(Prceptive Biosystem Inc.)從所得腹水中純化抗體，用PBS(Dulbecco Inc.)透析，并用SDS-PAGE分析確定條帶。如圖14所示，在非還原和還原條件下，選用小鼠IgG(Cappel Inc.)標(biāo)準(zhǔn)樣作對(duì)照條帶的電泳證實(shí)7D2-E3和11C8克隆的IgG條帶，與小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)樣處于相同位置。
在本實(shí)施例中，將表達(dá)人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)的L1210細(xì)胞用作致敏抗原是為了舉例說(shuō)明，但是同樣可能用其它表達(dá)人IAP的細(xì)胞或人IAP本身作致敏抗原以相同方法制備單克隆抗體，并且也可能用噬菌體展示方法從抗體文庫(kù)中制備單克隆抗體；本發(fā)明并不局限于前面所述的單克隆抗體，而是包括一切具有與其性質(zhì)相似的單克隆抗體及一切產(chǎn)生那些單克隆抗體的雜交瘤。
此外，本發(fā)明中的這些單克隆抗體也包括人源化抗體、人抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、靈長(zhǎng)類動(dòng)物化抗體和由多種酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶等)消化抗體獲得的抗體片段。
本發(fā)明中產(chǎn)生抗人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)單克隆抗體的雜交瘤是一種新型的融合細(xì)胞，產(chǎn)生于親本細(xì)胞DBA小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞系P3-U1；抗-IAP抗體(鼠雜交瘤11C8-F8(11C8亞克隆)，命名為“MABL-1”)的保藏號(hào)為FERM BP-6100；抗-IAP抗體(鼠7D2-E3(7D2亞克隆)，命名為“MABL-2”)的保藏號(hào)為FERM BP6101，已于1997年9月1日保藏于作為公共微生物授權(quán)保藏單位的國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所、工業(yè)科學(xué)技術(shù)管理處和國(guó)際貿(mào)易工業(yè)部，位于日本1-3Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本。實(shí)施例2(MABL-1和MABL-2抗體的亞類鑒定)為鑒定以上獲得的MABL-1和MABL-2抗體的亞類，各取500μl調(diào)至100ng/ml的MABL-1和MABL-2點(diǎn)在同型試劑盒上(Stratagene)，結(jié)果MABL-1顯示為IgG1、κ，MABL-2顯示為IgG2a、κ。實(shí)施例3(表達(dá)人IAP的人白血病細(xì)胞)用識(shí)別人IAP的抗-CD47抗體(商業(yè)化產(chǎn)品)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IAP在不同人白血病細(xì)胞系中的表達(dá)。因?yàn)檎J(rèn)為人IAP與CD47(生物化學(xué)雜志，304，525-530，1994)相同，所以該抗體可用于檢測(cè)。采用的細(xì)胞系為Jurkat和HL-60細(xì)胞(K562細(xì)胞、ARH77細(xì)胞、Raji細(xì)胞和CMK細(xì)胞)。每份樣品使用2×105個(gè)細(xì)胞，終濃度5μg/ml的抗-CD47抗體與細(xì)胞溫育，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體(Becton Dickinson andCompany)用作二抗。小鼠IgG1抗體(Zymed Laboratories Inc.)用作對(duì)照。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖15(HL-60)和圖16(Jurkat)所示，證明兩種細(xì)胞均表達(dá)IAP。實(shí)施例4(體外編程性細(xì)胞死亡效果)(1)采用膜聯(lián)蛋白-V(Boehringer Mannheim)檢測(cè)抗體MABL-1和MABL-2對(duì)人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞和HL-60細(xì)胞之誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的活性。圖17-22顯示了膜聯(lián)蛋白-V的分析結(jié)果，圖中左下方區(qū)域的點(diǎn)表示活細(xì)胞，右下方區(qū)域的點(diǎn)表示編程性細(xì)胞死亡的細(xì)胞，右上方區(qū)域的點(diǎn)表示壞死細(xì)胞。用作對(duì)照的小鼠IgG(ZymedLaboratories Inc.)抗體和抗體MABL-1、MABL-2，濃度為10μg/ml，當(dāng)轉(zhuǎn)染有人IAP基因的4×103L1210細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)以及6×104Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，用膜聯(lián)蛋白-V進(jìn)行分析。如圖17-22所示，可觀察到細(xì)胞死亡。對(duì)于1×105HL-60細(xì)胞，采用10μg/ml的MABL-1，經(jīng)膜聯(lián)蛋白-V分析，同樣顯示了細(xì)胞死亡。(2)檢驗(yàn)了MABL-2抗體Fab片段誘導(dǎo)人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的活性。特別地，人IAP基因轉(zhuǎn)染的L1210細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)為4×103細(xì)胞，所用的MABL-2抗體Fab片段和對(duì)照小鼠IgG濃度為10μg/ml。細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后經(jīng)膜聯(lián)蛋白-V測(cè)定。結(jié)果觀察到相當(dāng)大量的細(xì)胞死亡(圖23，24)。實(shí)驗(yàn)使用的MABL-2抗體Fab片段是通過(guò)木瓜蛋白酶(Pierce Laboratories，Inc.)消化抗體并純化而獲得的。MABL-2抗體Fab片段采用SDS電泳分析(圖25)。實(shí)施例5(體內(nèi)編程性細(xì)胞死亡研究)(1)MABL-1和MABL-2(完整IgG)的藥效表達(dá)人IAP的KPMM2細(xì)胞(人骨髓瘤細(xì)胞系)移植入SCID小鼠，移植后第10天，MABL-1和MABL-2(完整IgG)分別各自以5μg/只和50μg/只的劑量單次靜脈注射(n＝5)；KPMM2移植后第28天，用ELISA檢測(cè)證實(shí)來(lái)源于KPMM2細(xì)胞的人IgG水平消失。并且測(cè)定了生存期。結(jié)果顯示用MABL-1和MABL-2處理組小鼠血相中人IgG水平明顯抑制，表明其抗腫瘤效果(圖30)存活期也顯示明顯延長(zhǎng)(圖26)。(2)MABL-1和MABL-2(F(ab′)2)的藥效經(jīng)胃蛋白酶消化和蛋白A(Pierce Laboratories，Inc.)純化制備的MABL-1和MABL-2抗體F(ab′)2片段，用于檢測(cè)除Fc區(qū)介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)以外的抗腫瘤效果。特別地，表達(dá)人IAP的KPMM2細(xì)胞(人骨髓瘤細(xì)胞系)移植入SCID小鼠，部分組在移植后第6天和第10天，靜脈注射MABL-1和MABL-2 F(ab′)2片段，劑量為100μg/只；部分組在移植后第6、8、10天注射MABL-1和MABL-2 F(ab′)2片段，劑量分別為10和30μg/只；移植后第30天用ELISA測(cè)定源自KPMM2的人IAP水平(圖27)。生存期測(cè)定直到移植細(xì)胞后90天。結(jié)果，在用MABL-1和MABL-2處理過(guò)的組發(fā)現(xiàn)血中人IgG水平有顯著抑制，該結(jié)果表明其抗腫瘤效果。生存期也得到顯著延長(zhǎng)(圖28)。圖29顯示了抗體MABL-1和MABL-2的F(ab′)2片段的SDS電泳圖。工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的單克隆抗體是這樣一種抗體，其是能特異識(shí)別人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白，以及能特異性誘導(dǎo)含整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的抗原。因此，該抗體可用于識(shí)別人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白并進(jìn)行區(qū)分和鑒定，同時(shí)也具有誘導(dǎo)具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的作用；這些性質(zhì)可用于制備治療髓樣白血病和淋巴樣白血病的領(lǐng)域中有用的治療劑。
序列表<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA<120> 誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡的單克隆抗體<130> CGS98-03PCT<160> 2<210> 1<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> PCR引物<400> 1GCAAGCTTAT GTGGCCCCTG GTAGCG 26<210> 2<211> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><230> PCR引物<400> 2GCGGCCGCTC AGTTATTCCT AGGAGG 2權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，其能誘導(dǎo)含整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)的具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡。
2.一種單克隆抗體的片段、肽或低分子化合物，其能誘導(dǎo)含整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(IAP)的具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡。
3.一種雜交瘤，其能產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1中的單克隆抗體。
4.一種抗白血病劑，包含能與IAP結(jié)合并刺激IAP作用以誘導(dǎo)具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的抗白血病劑，其中物質(zhì)為單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的抗白血病劑，其中物質(zhì)為單克隆抗體的片段、肽或低分子化合物。
全文摘要
一種單克隆抗體,其是特異識(shí)別人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的單克隆抗體,是能誘導(dǎo)含整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白的具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的抗原。因此,該抗體可用于特異性識(shí)別人整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白,并用于區(qū)分和鑒定這些蛋白質(zhì)。由于也具有誘導(dǎo)具核血細(xì)胞編程性細(xì)胞死亡的作用,上述抗體也可應(yīng)用于治療如髓樣白血病和淋巴樣白血病的領(lǐng)域中治療劑。
文檔編號(hào)C12N5/20GK1276798SQ98810343
公開(kāi)日2000年12月13日 申請(qǐng)日期1998年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月11日
發(fā)明者福島直, 宇野慎介 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社