專利名稱：：低毒性的人干擾素－α類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種降低人干擾素-α毒性的方法、低毒性的人干擾素-α類似物以及這些類似物在治療上的應(yīng)用。參考文獻Ausubel，F(xiàn).M.，等，現(xiàn)代分子生物學(xué)手冊，JohnWiley&Sons公司，Media，PA(1988)。Benoit，P.等，免疫學(xué)雜志150(3)707(1993)。Bonnem，E.M.等，生物應(yīng)答調(diào)節(jié)子雜志3580(1984)。Davis，G.L.等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志3211501(1989)DeMaeyer，E.，等，干擾素和其它的調(diào)控細胞分裂素，JohnWileyandSons，NewYork(1988)Dianzani，F(xiàn).，干擾素研究專題，5/92109(1992)Dusheiko，G.M.，等，血液學(xué)期刊3(Supl.2)S199(1986)Eaton，M.A.W.等，美國專利第4,719,180號，1988年1月12日注冊Finter，N.B.，等，藥物42(5)749(1991)Francis，M.L.，等，愛滋病研究和人反轉(zhuǎn)錄病毒，8(2)199(1992)Kashima，H.，等，喉鏡98334(1988)Maniatis，T.，等，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室(1982)Martin，E.W.，藥物分配藥劑產(chǎn)品分配和闡述的實用指南(Hoover，J.E.，Ed.)第八版，Mack出版公司，Easton，PA.，(1976)Oldlam，R.K.，醫(yī)院實踐2071(1985)Pearson，W.R.andLipman，D.J.，美國科學(xué)院院報852444-2448(1988)Pearson，W.R..，酶學(xué)方法18363-98(1990)Pontzer，C.H.，等，癌癥研究515304(1991)Quesada，J.R.，等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志31015(1984)Yoshio，T.，等，美國專利4,849,350，1989年6月18日注冊。本發(fā)明的背景干擾素(IFNs)被分為兩大類I型干擾素，包括IFNα、IFNβ、IFNω(即眾所周知的IFNαII)；II型干擾素，現(xiàn)在稱為IFNγ(DeMaeyer等的綜述，1988)。椐估計，在人中至少有17對IFNα非等位基因，2對IFNβ非等位基因和一個IFNγ基因。已表明IFNα抑制多種細胞的增殖，尤其對血液惡性腫瘤譬如毛細胞性白血病十分有效(Quesada，等，1984)。而且，這些蛋白對多種惡性腫瘤的抑制活性，如多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病、輕度淋巴瘤、卡波氏肉瘤、慢性髓性白血病、腎細胞癌、泌尿膀胱癌以及卵巢癌(Bonnem，等，1984；Oldham，1985)。對于在某些自身免疫病和感染性疾病的發(fā)生中干擾素和干擾素受體所起的作用，也已有研究(Bonnem，等，1993)。在治療各種病毒性感染中，IFNα也發(fā)揮著重要作用(Finter，等，1991)。IFNα在針對人乳頭瘤病毒感染、乙肝病毒和丙肝病毒感染(Finter，等1991；Kashima，等1988；Dushiko，等1986；Davis，等1989)的疾病中表現(xiàn)出生物活性。但是顯然，IFNα的毒性限制了其使用在治療癌癥和病毒性疾病中產(chǎn)生了一系列副作用，如發(fā)熱、打寒顫、厭食、消瘦以及乏力(Pontzer，等，1991；Oldham，1985)這些副作用常需要(I)降低干擾素的使用劑量，從而限制了干擾素的療效，或(II)使病人無法使用干擾素。這些毒性大大降低了此類抗病毒和抗腫瘤蛋白在用于虛弱患者的疾病治療作用。本發(fā)明概述一方面，本發(fā)明包括了降低人IFNα(HuIFNα)毒性的方法。此方法包括在成熟的人IFNα的第19，20，22，24，和27位上取代一個或多個的氨基酸，將取代過的IFNα加入人單核細胞培養(yǎng)物中，從而明顯降低對此細胞的特異毒性。在人成熟的IFNα的第1-27位的大多數(shù)氨基酸殘基保持不變。在一個實施方案中，此方法包括以非保守性的氨基酸取代第19，20，22，24和27位中一個或多個氨基酸。在不同的實施方案中，此取代還可包括，但不局限于用III類氨基酸，尤其是Asp來取代第19位氨基酸；用IV類氨基酸，尤其是Arg來取代第20位氨基酸；用III類氨基酸，尤其是Asn來取代第22位氨基酸；用IV類氨基酸，尤其是His來取代第27位氨基酸；在另一個實施方案中，此取代還可包括用V類氨基酸，尤其是Leu來取代第24位氨基酸。在另一個實施方案中，本方法包括用SEQIDNO2所定義的9-mer序列取代成熟的人IFNα第19-27位殘基序列，尤其是，成熟的人IFNα第9-27位的殘基序列為SEQIDNO1。9-mer的SEQIDNO2相應(yīng)于成熟的綿羊IFNτ中第19-27位殘基序列，并包括成熟的人IFNα中所不同的第19，20，22，24，27位的殘基。在另一個實施方案中，本方法包括用SEQIDNO4所述的17-mer序列取代成熟的人IFNα的第11-27位殘基序列，尤其是，成熟的人IFNα第11-27位殘基序列為SEQIDNO3。17-merSEQIDNO4相應(yīng)于成熟的綿羊τ干擾素的第11-27位的殘基序列并包括成熟的人IFNα中所不同的第11，13，14，16，19，20，22，24，27位的殘基。在另一個實施方案中，本方法包括用SEQIDNO6所述的22-mer序列取代成熟的人IFNα6-27位殘基序列，尤其是，成熟的人IFNα的第6-27位殘基序列為SEQIDNO5。22-merSEQIDNO6相應(yīng)于成熟的綿羊IFNτ中第6-27位殘基序列并包括成熟的人IFNα中所不同的第6，7，8，11，13，14，16，19，20，22，24，27位的殘基。在相關(guān)的方面，本發(fā)明包括一種降低人IFNα毒性的方法。此方法包括用氨基酸來取代一個或多個成熟的人IFNα19，20，22，24，和27位上的氨基酸，將經(jīng)取代的IFNα加入人單核細胞培養(yǎng)物中后，可以明顯降低對此細胞的特異毒性，而其中成熟的人IFNα的第28-166位氨基酸序列基本不變。在一個實施方案中，所說的取代是指用SEQIDNO8定義的27-mer序列取代人IFNα1-27位殘基序列，尤其是指成熟的人IFNα1-27位殘基序列為SEQIDNO7，27-merSEQIDNO8相應(yīng)于成熟的綿羊IFNτ中1-27位殘基序列并包括成熟的人IFNα中所不同的第2，4，5，6，7，8，11，13，14，16，19，20，22，24，27位的殘基。在另一個方面，本發(fā)明包括應(yīng)用于治療人疾病中的低毒性的人IFNα類似物。這種類似物含有成熟的人IFNα，其中的第19，20，22，24，27位上一個或多個位點的氨基酸被取代，而大多數(shù)1-27位上的氨基酸還是天然的IFNα的氨基酸殘基。相對于天然的人IFNα，這種類似物具有能顯著地降低其毒性的特性，這一點可通過它能提高單核細胞培養(yǎng)物的成活率的實驗來證明。在一個實施方案中，此類似物包括在第9，20，22，27位的一個或多個位點上非保守型氨基酸的取代。在不同的實施方案中，這些被取代的氨基酸可以包括，但不局限于用III類氨基酸，尤其是Asp來取代第19位氨基酸；用IV類氨基酸，尤其是Arg來取代第20位氨基酸；用III類氨基酸，尤其是Asn來取代第22位氨基酸；用IV類氨基酸，尤其是His來取代第27位氨基酸；在另一個實施方案中，此取代還可包括用V類氨基酸，尤其是Leu來取代第24位氨基酸。在一個實施方案中，此類似物包括用9-mer序列SEQIDNO2來取代成熟的人IFNα的第19-27位殘基片段。在另一個實施方案中，此類似物包括用17-mer序列SEQIDNO4來取代成熟的人IFNα的第11-27位殘基片段。在又一個實施方案中，此類似物包括用22-mer序列SEQIDNO6來取代成熟的人IFNα的第6-27位殘基片段。在相關(guān)的方面，本發(fā)明包括用于人疾病治療中的低毒性人IFNα類似物，這種類似物含有成熟的人IFNα，其中的第19，20，22，24，27位上一個或多個位點的氨基酸被取代，而大多數(shù)的第28-166位上的氨基酸并沒有改變。相對于天然的人IFNα，這種類似物具有能顯著地降低其毒性的特性，這一點可通過它能提高單核細胞培養(yǎng)物的成活率的實驗來證明。在一個實施方案中，此類似物包括用27-mer序列SEQIDNO8來取代成熟的人IFNα的第1-27位殘基片段。本發(fā)明進一步還包括一種抑制腫瘤細胞生長的方法。在此方法中，以能夠有效地抑制病毒在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制的濃度，將上述類型的低毒性人IFN類似物與腫瘤細胞作用。這種低毒性的IFNα類似物質(zhì)可以作為任何可接受的藥學(xué)配方中的一部分。被低毒性人IFN類似物所抑制的腫瘤細胞可包括，但不局限于以下細胞癌細胞，造血干細胞瘤細胞，白血病細胞，淋巴瘤細胞，黑色素瘤細胞。在一個實施方案中，這些腫瘤細胞是類固醇敏感腫瘤細胞，例如，乳腺腫瘤細胞。在本發(fā)明的另一個方面，低毒性的上述類型IFN類似物，被用于抑制病毒復(fù)制的方法中。在本方法中，以能夠有效地抑制病毒復(fù)制的濃度，將被病毒感染的細胞用上述類型的低毒性IFN類似物處理。這種低毒性的IFNα類似物質(zhì)可以作為任何可接受的藥學(xué)配方中的一部分。RNA和DNA病毒均可被該低毒性人IFNα所抑制。范例性的RNA病毒包括貓白血病病毒，綿羊進行性肺炎病毒，綿羊慢病毒，馬傳染性貧血病毒，牛免疫缺陷病毒visna-maedi病毒，山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)或丙肝病毒(HCV)。范例性的DNA病毒包括，乙肝病毒(HBV)。在另一個方面，本發(fā)明包括一種在患者需要此方法治療時所采取的治療自身免疫疾病的方法。在一個實施方案中，此自身免疫疾病是指多樣硬化。本方法包括，給患者施用藥物學(xué)藥效計量的上述類型低毒性人IFNα類似物。在另一個方面，本發(fā)明包括一種在患者需要此方法治療時所采取的治療慢性炎癥的方法。在一個實施方案中，此慢性炎癥是指潰瘍性結(jié)腸炎。本方法包括，給患者施用藥物學(xué)藥效計量的上述類型低毒性人IFNα類似物。在另一個方面，本發(fā)明還包括，在對靜脈注射IFNα敏感的任何病情下，通過口服上述的低毒性人IFNα類似物來治療的方法?；颊邇?yōu)選地攝入口服吸收的該類似物。閱讀下列關(guān)于本發(fā)明的詳細描述和附加的圖表，將會對本發(fā)明的各個方面及其特征有更為全面的理解。附圖的簡要描述圖1顯示了成熟的HuIFNα、成熟的OvIFNτ，和記作IFNα-N0至IFNα-N7的8個成熟的HuIFNα類似物的N端27個氨基酸的排列順序之間的對比。序列的簡要描述SEQIDNO1為mHuIFNα第19-27位殘基之間的氨基酸序列。SEQIDNO2為mOvIFNτ第19-27位殘基之間的氨基酸序列。SEQIDNO3為mHuIFNα第11-27位殘基之間的氨基酸序列。SEQIDNO4為mOvIFNτ第11-27位殘基之間的氨基酸序列。SEQIDNO5為mHuIFNα第6-27位殘基之間的氨基酸序列。SEQIDNO6為mOvIFNτ第6-27位殘基之間的氨基酸序列。SEQIDNO7為mHuIFNα第1-27位殘基之間的氨基酸序列。SEQIDNO8為mOvIFNτ第1-27位殘基之間的氨基酸序列。SEQIDNO9為成熟的HuIFNα的氨基酸序列(IFNα-d；Genbank收錄號NO.J00210，PIDg386796)SEQIDNO10為成熟的IFNα類似物IFNα-N0的氨基酸序列。SEQIDNO11為成熟的IFNα類似物IFNα-N1的氨基酸序列。SEQIDNO12為成熟的IFNα類似物IFNα-N2的氨基酸序列。SEQIDNO13為成熟的IFNα類似物IFNα-N5的氨基酸序列。SEQIDNO16為成熟的IFNα類似物IFNα-N6的氨基酸序列。SEQIDNO17為成熟的IFNα類似物IFNα-N7的氨基酸序列。SEQIDNO18為成熟的OvIFNτ的氨基酸序列(oTP-1；Genbank收錄號NO.Y00287；PIDg1358)SEQIDNO19為合成的編碼IFNα-N0的核苷酸序列。SEQIDNO20為接頭1的核苷酸序列。SEQIDNO21為接頭2的核苷酸序列。SEQIDNO22為片段N1的核苷酸序列，正向鏈SEQIDNO23為片段N1的核苷酸序列，反向鏈SEQIDNO24為片段N2的核苷酸序列，正向鏈SEQIDNO25為片段N2的核苷酸序列，反向鏈SEQIDNO26為片段N3的核苷酸序列，正向鏈SEQIDNO27為片段N3的核苷酸序列，反向鏈SEQIDNO28為片段N4的核苷酸序列，正向鏈SEQIDNO29為片段N4的核苷酸序列，反向鏈SEQIDNO30為片段N5的核苷酸序列，正向鏈SEQIDNO31為片段N5的核苷酸序列，反向鏈SEQIDNO32為片段N6的核苷酸序列，正向鏈SEQIDNO33為片段N6的核苷酸序列，反向鏈SEQIDNO34為片段N7的核苷酸序列，正向鏈SEQIDNO35為片段N7的核苷酸序列，反向鏈。本發(fā)明的詳細描述I.定義α干擾素(IFNα)是指，干擾素蛋白家族中任何一個與SEQIDNO9所述的成熟IFNα具有大于70％，或優(yōu)選的大于80％，或更加優(yōu)選的大于90％的氨基酸相同性的成員。氨基酸向同性可以運用例如LALIGN程序并使用其缺省參數(shù)來確定。該程序可以在FASTA1.7版本的序列比照程序中找到(PearsonandLipman1988；Pearson，1990；本程序可以從WilliamR.Pearson處獲得，生物化學(xué)系，440信箱，約旦會堂，Charlottesville，VA)。作為代表性的，IFNα至少具有如下這些特性中的一項(a)抗病毒特性；(b)抗細胞增殖特性；以及(3)可被核酸或病毒的誘導(dǎo)的特性。優(yōu)選的IFNα來自人。干擾素τ(IFNτ)是指，干擾素蛋白家族中任何一個與SEQIDNO18所述的成熟IFNτ具有大于70％，或優(yōu)選的大于80％，或更加優(yōu)選的大于90％的氨基酸相同性的成員。作為代表的，IFNτ具有如下一組特性中的至少一項(a)在胚胎/胎兒時期由滋養(yǎng)外胚層細胞/胎盤表達，(b)抗黃體解體特性，(c)抗病毒特性，以及(d)抗細胞增殖特性。優(yōu)選的IFNτ為羊和牛IFNτ?！俺墒斓鞍住笔侵?，去除前導(dǎo)序列的IFN蛋白。成熟的IFN蛋白序列從完整IFN氨基酸序列的Cys24殘基開始，其相應(yīng)于成熟蛋白序列的Cys1。一個多核苷酸序列或片段“衍生自”另一個多核苷酸序列或片段是指，一個多核苷酸序列或片段含有與作為其來源的另一個多核苷酸序列相同的序列。例如，一個細菌質(zhì)粒含有一個“衍生自”所需的人基因的插入片段，這是指，該插入的多核苷酸序列與該所需的人基因的多核苷酸序列相同。類似的，一個多肽序列或片段“衍生自”另一個多肽序列或片段是指，一個多肽序列或片段含有與作為其來源的另一個多肽序列或片段相同的氨基酸序列。對于兩個氨基酸序列來說，百分比相同性是指在兩個序列進行最佳對比且“缺空”不作補償時，兩個序列之間相同殘基的百分數(shù)。換句話說，如果必須將一個“缺空”插入到第一個序列中以使其與第二個序列達到最佳對比，那么百分比同一性僅僅計入那些存在可以與其相對齊的氨基酸殘基(即，計算方法不計入一個序列中與另一個序列中“缺空”對齊的氨基酸)。最佳對比是指可以給出最大百分比相同性數(shù)值的對比方式。這種對比操作可以使用“GENEWORKS”程序來完成。另外，對比操作可以使用局部對比程序LALIGN并使用1作為ktup數(shù)值，使用缺省參數(shù)及缺省PAM而完成?！氨Ｊ匦匀〈笔侵敢活愔械囊粋€氨基酸被同一類中的另一個氨基酸取代，這里的“類”是由普通生理化學(xué)氨基酸側(cè)鏈特性以及自然界里存在的同源蛋白高取代頻率(使用標準Dayhoff頻率交換矩陣確定)而定義的。如上文所述中劃分的氨基酸側(cè)鏈的六大類包括第I類(Cys)；第II類(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；第III類(Asn，Asp，Gln，Glu)；第IV類(His，Arg，Lys)；第V類(Ile，Leu，Val，Met)以及第VI類(Phe，Tyr，Trp)。例如，一個Asp被另一個第III類殘基中的諸如Asn，Gln，或Glu取代，是一個保守取代?！胺潜Ｊ匦匀〈笔侵敢活愔械陌被岜涣硪活愔械哪硞€氨基酸所取代；例如，第II類殘基的Ala被一個第III類中的殘基，諸如Asp，Asn，Glu或Gln所取代?！爸委煛币环N疾病是指施用有治療作用的物質(zhì)以減輕疾病的癥狀和/或減輕疾病的嚴重程度。II.低毒性的人IFNα類似物本發(fā)明是基于HuIFNα的毒性可以在成熟HuIFNα的第19，20，22，24及27位氨基酸引入氨基酸取代后顯著的降低這個發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上的。圖1顯示了成熟HuIFNα(SEQIDNO9)N端前27個氨基酸殘基及成熟的OvIFNτ(SEQIDNO18)，其中不相同的殘基以黑體字標出。HuIFNα類似物含有按照實施例1中所述制備出的OvIFNτ的各種取代。每個HuIFNα類似物的第1-27位在圖1中以黑體字表示出來。每一個類似物的第28-166位氨基酸保留了原來的HuIFNα殘基(例如，SEQIDNO9中的28-166位殘基)。HuIFNα類似物，記作IFNα-N0至IFNα-N7(SEQIDNO10至SEQIDNO17)，其毒性在實施例2和3中測定。與HuIFNα溫育的肝細胞表現(xiàn)出顯著的活力降低(表1，實施例2)。相對之下，如本專利申請所述，細胞和IFNα類似物IFNα-N0溫育后未表現(xiàn)出活力的實質(zhì)性降低。類似物IFNα-N1至IFNα-N7按照實施例3中所述測定毒性。外周血單核細胞(PBMCs)和不同量的OvIFNτ或其類似物IFNα-N0在七天的溫育中未表現(xiàn)出活力的實際降低。PBMCs和類似物-N1或-N3以與HuIFNα類似的劑量溫育表現(xiàn)出顯著的活力的降低。從而類似物-N1及-N3在2，4，5，6，7，8，11，13及14位的取代在降低HuIFNα毒性方面是相對無效的。細胞IFNα-N4溫育所獲得的活力水平在與HuIFNα及OvIFNτ溫育的結(jié)果之間。因此在第16，19及20位上增加的取代在降低HuIFNα毒性方面具有部分效力。PBMCs和IFNα類似物IFNα-N5及IFNα-N6及IFNα-N7在七天的溫育過程中未表現(xiàn)出實質(zhì)上活力的降低(表2)。這三個類似物保持了OvIFNτ的低毒性并且進而確定出了與降低HuIFNα毒性相關(guān)的位點。更加引人注目的是，類似物IFNα-N7僅包含在第19，20，22，24和27位的五個取代。其他表現(xiàn)出低毒性的類似物，-N0，-N5以及-N6，包含有這些及其它位點的取代(圖1)。類似物IFNα-N4，在這個實驗中表現(xiàn)出中等水平的毒性，缺乏位置22，24及27的取代。根據(jù)本發(fā)明，所得數(shù)據(jù)闡明了第19，20。22，24及27位殘基在決定這些蛋白毒性上有著顯著的作用。更特別的是，本發(fā)明計劃構(gòu)建在第19，20，22，24及27位包含了一個或幾個取代的HuIFNα類似物，而余下的氨基酸主要為HuIFNα原來的殘基。該類似物經(jīng)過所述的毒性測定具有降低了的毒性，同時具有天然人IFNα的相關(guān)的治療特性。優(yōu)選的取代包擴如下的一個或幾個成熟HuIFNα第19位氨基酸可以被取代為成熟OvIFNτ上的Asn22或同類殘基中的Asp，Gln或Glu；成熟HuIFNα第19位氨基酸可以被取代為成熟OvIFNτ上的Arg20或同類殘基中的Val或Met；成熟HuIFNα第27位氨基酸可以被取代為成熟OvIFNτ上的His27或同類殘基中的Arg，或Lys。這些取代在不顯著降低HuIFNα治療特性的同時有效地降低了HuIFNα的毒性。其它實例性的含有位點取代而具有低毒性HuIFNα類似物的序列包括，如SEQIDNO2，SEQIDNO4，以及SEQIDNO6所給出的序列。最為優(yōu)選的實施方案是在第19-27位區(qū)域中不同于OvIFNτ的取代的HuIFNα類似物。例如，成熟人IFNα(SEQIDNO1)的第19-27位氨基酸取代為成熟OvIFNτ(SEQIDNO2)的第19-27為氨基酸，形成一個成熟人IFNα剩余序列不變，而第19，20，22，24及27位上發(fā)生改變的構(gòu)建。該實例相應(yīng)于類似物IFNα-N7(SEQIDNO17)。應(yīng)當理解的是，雖然上述的低毒性人IFNα類似物是“成熟”蛋白，即，它們是從完整干擾素序列的殘基Cys24開始(相應(yīng)于成熟蛋白Cys1)的，但是，本發(fā)明也包含帶有前導(dǎo)序列的IFNα類似物，即，開始于起始的甲硫氨酸。在這些人IFNα類似物中，前導(dǎo)序列可以來源于人IFNα，綿羊IFNτ或其它I型干擾素。如上文中所指出的，本發(fā)明的HuIFNα類似物的最重要的優(yōu)點是，相對于天然人IFNα，它具有低毒性。該HuIFNα類似物可以具有與天然人IFNα相同的生物學(xué)活性。III.重組及合成技術(shù)人工合成編碼HuIFNα類似物IFNα-N0基因的構(gòu)建方法如實施例1A所述。簡要的說，成熟的HuIFNα氨基酸序列在N端的前27個氨基端中包含所有15個OvIFNτ取代(SEQIDNO10)，將其逆向翻譯成Pichiapastoris密碼子偏愛性的核酸。核酸序列的不同位置被加入五個限制性內(nèi)切酶位點。此合成基因序列被分割為四個核苷酸片段。各個獨立的片段分別有150個堿基對大小，通過寡核苷酸相繼連接構(gòu)建在一起。這些片段被序次克隆入一個細菌載體并產(chǎn)生編碼IFNα-N0(SEQIDNO19)的基因。將此合成基因克隆入pPICZ-α載體中并在Pichiapastoris中表達。編碼類似物IFNα-N1至IFNα-N7的合成的基因也如實施例1A所述利用寡核苷酸序次連接而構(gòu)建。合成基因在Pichia中的表達(實施例1B)獲得重組HuIFNα類似物的大量生產(chǎn)。重組HuIFNα類似物表現(xiàn)出與同一Pichiapastoris系統(tǒng)表達的重組OvIFNτ類似的抗病毒活性(實施例1C)。IV.實用性A.抗病毒特性I型干擾素表現(xiàn)出有效的抗病毒特性。相對于IFNα降低的IFNτ毒性似可以歸結(jié)于在成熟蛋白N端前27個氨基酸殘基中的非保守氨基酸。這些氨基酸殘基被IFNα相應(yīng)位置上的氨基端氨基酸取代似乎表現(xiàn)出在HuIFNα類似物I型干擾素抗病毒活性保留的同時降低了的細胞毒性。因而，含有本發(fā)明的低毒性HuIFNα類似物的配方可用于抗病毒復(fù)制。本發(fā)明中低毒性HuIFNα類似物可以用于影響母體及胎兒的免疫關(guān)系，例如，防止母體內(nèi)病毒(如HIV)傳染到發(fā)育中的胎兒。人干擾素類似物由于其本質(zhì)上相對于異體蛋白的低抗原反應(yīng)對于人疾病治療中尤其有效。B.抗細胞增殖特性I型干擾素展現(xiàn)出有效的抗細胞增殖活性。如上所述低毒性的人IFNα類似物可以用于抑制細胞生長，同時又不具有其它現(xiàn)在已知的干擾素相關(guān)的副作用。含有本發(fā)明的低毒性HuIFNα類似物的配方可用于抑制，預(yù)防或減慢腫瘤生長。C.免疫系統(tǒng)紊亂利用本發(fā)明的方法可以治療的疾病包括自身免疫病、炎癥、增殖性及高增殖性疾病，以及免疫介導(dǎo)的皮膚表現(xiàn)。特別的，本發(fā)明所述的方法對于治療免疫系統(tǒng)的高敏感性有優(yōu)勢。I型、或速發(fā)/過敏高敏感性，是由于肥大細胞對于變應(yīng)原(如花粉)發(fā)生脫顆粒，包括哮喘，過敏性鼻炎(枯草熱)，蕁麻疹，過敏性休克以及其它基于過敏基礎(chǔ)的疾病。II型、或自身免疫性高敏感性，是由于針對人體自身細胞上假想“抗原”的抗體造成。III型高敏感性是由于抗原抗體免疫復(fù)合物滯留在多種組織中并且引發(fā)進一步的免疫反應(yīng)，且可以造成血清病，過敏性肺泡炎，以及有些時候在疫苗加強接種后發(fā)生的大腫脹。IV型高敏感性是由于致敏T細胞釋放淋巴因子，可以造成炎癥反應(yīng)，接觸性皮炎，麻疹的紅疹以及對某些藥物的“過敏”反應(yīng)。這些造成某些個體高敏感性的機制迄今為止還沒有很好的解釋，但是可能包括基因及體外雙方面的因素。例如，細菌、病毒或藥物對于那些已經(jīng)具有自身免疫紊亂遺傳易感性的個體觸發(fā)其自身免疫反應(yīng)可能起著重要作用。有證據(jù)表明某些類型的高敏感性可能與其它類型相關(guān)。例如，那些患有某些特定過敏疾病的個體也對自身免疫紊亂更為敏感。自身免疫紊亂可以被大體分為主要局限在特定器官或可以影響到全身的兩種類型。器官特異性紊亂(以及被影響器官)包括多發(fā)性硬化(髓磷脂包裹在神經(jīng)突觸上)，I型糖尿病(胰腺)，喬本氏甲狀腺炎(甲狀腺)，惡性貧血(胃)，艾迪生氏病(腎上腺)，重癥肌無力(神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿受體)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(關(guān)節(jié))，葡萄膜炎(眼)，銀屑病(皮膚)，格林-巴利綜合征(神經(jīng)細胞)以及Grave’s病(甲狀腺)。系統(tǒng)性自身免疫病包含系統(tǒng)性紅斑狼瘡及皮肌炎。其它高反應(yīng)性紊亂的實施例包括哮喘，濕疹，遺傳性過敏性皮炎，接觸性皮炎，其它濕疹性皮炎，脂溢性皮炎，鼻炎，扁平苔癬，天皰瘡，大皰性天皰瘡，大皰性表皮松解癥，血管神經(jīng)性水腫，血管炎，紅皮病，皮膚嗜酸細胞增多癥，斑禿，動脈粥樣硬化，原發(fā)性硬化性膽管炎以及腎病綜合癥。相關(guān)疾病包括腸道炎癥，諸如Coeliac病，直腸炎，嗜酸細胞增多性胃腸炎，肥大細胞增生，炎性腸病，克隆氏病及潰瘍性結(jié)腸炎以及食物相關(guān)性過敏癥。自身免疫性疾病最適于使用本發(fā)明所述的方法治療，包括多發(fā)性硬化，I型(胰島素依賴型)糖尿病，紅斑狼瘡，肌萎縮性側(cè)索硬化，克隆氏病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，口腔炎，哮喘，葡萄膜炎，過敏癥以及銀屑病。含有本發(fā)明中所述低毒性HuIFNα類似物的藥劑可以被用于治療并且如上所述減輕自身免疫紊亂的癥狀。D.藥學(xué)組合物本發(fā)明中所述低毒性人IFNα類似物可以按照周知的制備藥學(xué)應(yīng)用組合物的方法來配制。含有干擾素或干擾素類復(fù)合物的配方以前已有描述(例如，Martin，1976)。總體來說，為了利于有效地給藥，應(yīng)將本發(fā)明的物質(zhì)配制成組合物，從而將有效量的干擾素類似物聯(lián)合與適當?shù)妮d體。用于這些治療的組合物可有多種形式，有固態(tài)，半固態(tài)，及液態(tài)制劑，例如片劑，丸劑，粉劑，溶液或懸浮液，脂質(zhì)體，栓劑，可注射的溶液。優(yōu)選的形式取決于所需的給藥和治療應(yīng)用方式。這些組合物優(yōu)選地包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的并為傳統(tǒng)藥劑學(xué)所接受的載體和佐劑。本發(fā)明優(yōu)選以單位劑量為組合物的形式，通常每天一次或多次給病人服用。低毒性的人IFNα類似物或相關(guān)多肽也可以任何藥劑學(xué)認可的劑型給病人服用，包括口服，吸入，鼻腔噴入，腹腔、靜脈、肌肉、病損內(nèi)、或皮下注射。特別是用于其它干擾素化合物的組合物和方法可用于運送這些類似物。本發(fā)明中IFNα類似物的一個基本優(yōu)點是極低的細胞毒性。正因為這種低毒性，才可能給予比普通使用的其它干擾素(例如天然人IFNα)化合物濃度更高的干擾素類似物。這樣本發(fā)明的低毒性HuIFNα類似物，預(yù)期以5×104至20×106單位/每天到500×106單位/每天的劑量給予病人。在一個優(yōu)選的實施方案中，劑量是約20×106單位每天。高劑量在全身給藥的治療中是優(yōu)選的。本發(fā)明的組合物和方法當然也可與其他方法聯(lián)合使用。一旦一個病人的狀況得到改善維持給藥劑量是必須的。其后根據(jù)藥效，給藥的劑量或次數(shù)或者兩者都可被降低至維持病人狀況的水平。當病況減輕至預(yù)期水平，治療應(yīng)當終止。然而為防治病癥復(fù)發(fā)，病人需要長時期給于間歇治療。本發(fā)明的IFNα類似物依照標準程序可治療多種癌癥和病毒疾病，其中包括以前其他干擾素顯示有效的疾病。例如，F(xiàn)inter等，1991；Dianzani，1992；Francis，等，1992，和美國專利4,885,166和4,975,276。然而正如上文所述，本發(fā)明的IFNα類似物具有獨一的特性和優(yōu)點，包括其無毒治療這些病癥的特點。E.治療皮膚病皮膚病可使用本發(fā)明的干擾素類似物進行病損內(nèi)治療。給藥的方法及待治病損的大小和嚴重程度決定配方和劑量。優(yōu)選的方法包括真皮內(nèi)和皮下注射。向大病損內(nèi)多點注射是可行的，一個病人皮膚上的幾個病損可以同時治療。給藥的方法可由本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員決定。為維持已減輕的病癥而設(shè)計的配方可以減少給藥次數(shù)。F.全身治療全身治療和其他治療方法是等效的。多點靜脈注射、皮下和/或肌肉注射是可行的，用移植的方法治療的病例中，為維持已減輕的病癥而設(shè)計的配方特別有用。病人可以通過可植入的皮下門(portals)，庫(reservoirs)或泵(pumps)得到治療。G.局域治療用本發(fā)明的低毒性IFNα類似物局域治療特定器官的癌癥是有效的。治療通過動脈輸入完成?？梢允褂猛饪苹蜓茉煊凹夹g(shù)植入導(dǎo)液管直接治療感染器官。一個與導(dǎo)液管相連的的皮下門可以用于慢性病的治療，或者也可以使用可填充的移植泵。下列的實施例旨在進一步解釋本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。材料與方法限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，T4多聚核苷酸激酶，TaqDNA聚合酶，和購自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)或PromegaBiotech(Madison，WI)的小牛腸磷酸酶這些試劑的使用是根據(jù)廠商的說明進行的。如測序反應(yīng)，使用“SIQUENASEDNAII”測序試劑盒(美國生物化學(xué)公司，ClevelandOH)。免疫印記和其他試劑購自Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)或FisherScientific(Needham，MA)。硝酸纖維素濾器購自Schleicher和Schuell(Keene，NH)。人工合成的寡聚核苷酸接頭和引物由可購買的自動寡聚核苷酸合成儀合成(例如ABI模式380B-02DNA合成儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA))。另外可定購設(shè)計好的寡聚核苷酸，例如從SyntheticGenetics(SanDiego，CA)購買。CDNA合成試劑盒和隨機引物標記試劑盒購自Bochringer-MannheimBiochemical(BMB，Indianapolis，IN)。編碼多肽的寡聚核苷酸序列既可通過標準的寡聚核苷酸合成方法直接合成，也可在大編碼序列的實施例中，通過克隆包括相應(yīng)編碼序列的多個首尾相接的寡聚核苷酸片段的系列步驟合成(Yoshio，等，1989；Eaton，等，1988)。寡聚核苷酸編碼序列可以通過標準的重組程序得到表達(Maniatis，等，1982；Ausubel等1988)。也可通過標準的體外技術(shù)直接合成肽段(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCityCA)。重組人IFNα從BiosourceInternational(Camarillo，CA)。除非另有說明，蛋白濃度根據(jù)廠家說明由bicinchoninicacidassay試劑盒(Pierce，RockfordIL)測定。用于本研究的所有組織培養(yǎng)基質(zhì)，絲氨酸重復(fù)抗原和IFNs經(jīng)秧鶴變形細胞裂解物分析確定是內(nèi)毒素陰性的(AssociatesofCapeCod，WoodsHole，MA)，敏感水平為0.07ng/ml。實施例1HuIFNα類似物的克隆和表達A.合成的編碼HuIFNα類似物基因的構(gòu)建N端前27個氨基酸位置(SEQIDNO10)由15OvIFNτ取代的HuIFNα的氨基酸序列是由Pichiapastori最適密碼子反譯得到。在核苷酸序列的全長結(jié)構(gòu)中，編輯加入五個限制酶切位點。合成的基因序列分為四個核苷酸片段。每個片段約長150個堿基對，是通過寡核苷酸的序列連接構(gòu)建的。將這些片段依次克隆到細菌G2載體以合成編碼IFNα-N0(SEQIDNO19)的基因。然后從細菌載體上切下此合成基因連入pPICZ-α載體的XhoI/NotI位點，在Pichiapastoris中表達。編碼類似物IFNαN1-IFNαN7的合成基因也可通過寡核苷酸的有序連接構(gòu)建而成。上文描述的pPICZ-α/IFNα-N0結(jié)構(gòu)用XbaI和BstEII消化，然后將復(fù)性的寡核苷酸接頭1(SEQIDNO20)和接頭2(SEQIDNO21)連入這些位點形成中間過渡載體結(jié)構(gòu)。此步驟去除相應(yīng)于IFNα-N0N端的核苷酸序列，代之以下文的核苷酸片段。中間過渡載體用XhoI和EcoRI消化。將由寡核苷酸有序連接而成的下述核苷酸片段連入中間載體的XhoI/EcoRI位點，在pPICZ-α載體上形成IFNα-N1-IFNα-N7類似物。IFNα-N1正向N1片段SEQIDNO22反向N1片段SEQIDNO23IFNα-N2正向N2片段SEQIDNO24反向N2片段SEQIDNO25IFNα-N3正向N3片段SEQIDNO26反向N3片段SEQIDNO27IFNα-N4正向N4片段SEQIDNO28反向N4片段SEQIDNO29IFNα-N5正向N5片段SEQIDNO30反向N5片段SEQIDNO31IFNα-N6正向N6片段SEQIDNO32反向N6片段SEQIDNO33IFNα-N7正向N7片段SEQIDNO34反向N7片段SEQIDNO35B.在Pichia中表達HuIFNα類似物為了表達重組干擾素類似物，利用載體上的XhoI和NotI限制性內(nèi)切酶位點將基因的編碼序列插入pPICZ-α表達載體(Initrogen，SanDiego，CA)中。pPICZ-α表達載體提供多種元件以實現(xiàn)表達和重組干擾素的純化。例如該載體有一個包含甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶(AOX)啟動子的表達盒。甲醇生長酵母細胞中，約5％的polyA+RNA來于AOXI基因。此外該載體上還有來源于釀酒酵母α因子前期肽的分泌信號序列，它可介導(dǎo)蛋白分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中。該載體還可用Shble基因(Streptoalloteichushindustanusble基因)編碼的Zeocin抗生素篩選重組細菌和酵母。編碼HuIFNα類似物的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入X-33野生型Pichiapastoris株大量培養(yǎng)。按照Invitrogen的程序培養(yǎng)并誘導(dǎo)重組酵母菌落。收集上清，用0.8/0.2mm孔徑大小的acrodisc濾器(GelmanScience，AnnArbor，MI)過濾除菌，并利用Centriplus-10濃縮器(Amicon，Inc.，Beverly，MA)以磷酸緩沖鹽(PBS)交換緩沖液。此法獲得的重組HuIFNα類似物顯示了與在Pichiapastoris體系中表達的重組OvIFNτ相似的抗病毒活力。C.抗病毒定量分析利用比色分析定量干擾素蛋白的抗病毒活力。用補充有10％胎牛血清(FBS)和抗生素的Eagle’sMEM在96孔平板上培養(yǎng)MadinDarby牛腎(MDBK)細胞，使生長至匯合的程度。棄去培養(yǎng)基，并用滅菌的PBS洗細胞一次。用補充有2％FBS和抗生素的Eagle’sMEM作為稀釋液，樣品分為三份加入孔中，分行向每孔加入100ul10倍稀釋液和2倍稀釋液。加入干擾素樣品，于37℃培養(yǎng)細胞18小時。重組HuIFNαA(BiosourceIntl.)作為標準干擾素對照。向測試細胞中加入100ul囊狀口腔病毒(VSV)，再于37℃培養(yǎng)48小時。從每孔中除去100ul培養(yǎng)基，換以100ul0.2％中性紅溶液(Gibco-BRL)，于37℃保溫1小時。棄去所有培養(yǎng)基，用PBS輕柔的洗細胞兩次，再加入100ul酸性乙醇(50％乙醇，1％乙酸)。用Bio-KineticsReader(Bio-TekInstrument，WinooskiVT)讀得已溶解的染料的A550。用下述公式算出保護百分數(shù)一個抗病毒單位(U)定義為50％保護。實施例2干擾素在肝細胞中的體外毒性HuIFNc和IFNα類似物IFNα-N0(SEQIDNO10；圖1)的體外毒性用普通人肝細胞比較。在購自CloneticsCorporation(SanDiego，CA)并鋪有基質(zhì)膠的96孔板上鋪一層匯合的肝細胞。第二天，用100ul補充有0.1uM生理鹽水，0.1uM地塞米松，50ug/ml慶大霉素，50ng/ml兩性霉素B的改良WilliamsE培養(yǎng)基(CloneticsCorp.)取代孔中的培養(yǎng)基。然后用2000U/ml至128,000U/ml的HuIFNα或IFNα-N0處理細胞。經(jīng)過4，6，或7天的培養(yǎng)后，向每個孔中加入10ul的四唑鹽WST-1(4-3-(4-吲哚苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑并-1-3-苯二磺酸鹽)(BoehringerMannheim，IndianapolisIN)。存在于線粒體呼吸鏈中僅在活細胞中有活力的四唑鎓琥珀酸鹽還原酶系統(tǒng)將WST-l裂解成甲月簪?；罴毎陌俜謹?shù)由450nm的光吸收值確定，表示成無干擾素處理的細胞的百分數(shù)。結(jié)果示于表1。表中的值表示活細胞的代謝活力百分數(shù)，僅用培養(yǎng)基處理的活細胞的存活力是100％。表1用IFN樣品培養(yǎng)4，6或7天的初級正常人肝細胞的代謝活力百分數(shù)</tables>ND＝未做用HuIFNα培養(yǎng)的肝細胞有顯著的活力降低。相反地，用IFNα類似物IFNα-N0培養(yǎng)的細胞與未處理的細胞對照沒有本質(zhì)的活力損失。實施例3IFNα類似物在單核細胞中的體外毒性用外周血單核細胞(PBMC)對照HuIFNα，OvIFNτ和IFNα類似物IFNα-N0至IFNα-N7(SEQIDNO17；圖1)的體外毒性。整個血液的棕黃層部分用PBS1∶4稀釋，涂蓋于Nycoprep1.077(NycomedPharma，Oslo，Norway)。20℃600xg離心20分鐘，用移液槍吸取界面處的PBMC。用PBS洗細胞一次，以每孔2×105個細胞的濃度將細胞鋪于96孔板中。第二天用2000U/ml至128,000U/ml的IFNα，IFNτ或IFNα類似物處理細胞。培養(yǎng)七天后，每孔中加入四唑鎓鹽wST-1(BoehringerMannheim)。用450nm的光吸收測活細胞的百分數(shù)，表示為無干擾素處理的細胞的百分數(shù)。結(jié)果示于表2。表中的值表示活細胞的代謝活力百分數(shù)，僅用培養(yǎng)基處理的活細胞的存活力是100％。表2用IFNα樣品培養(yǎng)七天的人外周血單核細胞(PBMC)代謝活力百分數(shù)ND＝未做用HuIFNα培養(yǎng)的PBMCs活力有顯著降低，相反地，用rOvIFN-τ或人IFNα類似物IFNα-N0，IFNα-N5，IFNα-N6和IFNα-N7培養(yǎng)的細胞七天后活力無本質(zhì)降低。用IFNα類似物IFNα-N1，IFNα-N3培養(yǎng)的細胞有相似與HuIFNα培養(yǎng)細胞的活力下降。用IFNα類似物IFNα-N4培養(yǎng)的細胞相對HuIFNα培養(yǎng)細胞活力有小的下降。本發(fā)明已參照特殊的方法和實施例說明，但應(yīng)理解的是可不脫離本發(fā)明進行各種修改和變化。序列表<110>派普根公司，佛羅里達大學(xué)<120>低毒性的人干擾素-α類似物<130>5600-0301.41<140>待定<141>1998-10-20<150>US08/954,95<151>1997-10-20<150>US08/631,328<151>1996-04-12<160>35<170>FastSEQforWindows，3.0版<210>1<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>1AlaGlnMetSerArgIleSerProSer15<210>2<211>9<212>蛋白質(zhì)<213>綿羊<400>2AspArgMetAsnArgLeuSerProHis15<210>3<211>17<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>3AsnArgArgThrLeuMetLeuLeuAlaGlnMetSerArgIleSerPro151015Ser<210>4<211>17<212>蛋白質(zhì)<213>綿羊<400>4AlaArgGluAsnLeuLysLeuLeuAspArgMetAsnArgLeuSerPro151015His<210>5<211>22<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>5ThrHisSerLeuAspAsnArgArgThrLeuMetLeuLeuAlaGlnMet151015SerArgIleSerProSer20<210>6<211>22<212>蛋白質(zhì)<213>綿羊<400>6LysLeuMetLeuAspAlaArgGluAsnLeuLysLeuLeuAspArgMet151015AsnArgLeuSerProHis20<210>7<211>27<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>7CysAspLeuProGluThrHisSerLeuAspAsnArgArgThrLeuMet151015LeuLeuAlaGlnMetSerArgIleSerProSer2025<210>8<211>27<212>蛋白質(zhì)<213>綿羊<400>8CysTyrLeuSerArgLysLeuMetLeuAspAlaArgGluAsnLeuLys151015LeuLeuAspArgMetAsnArgLeuSerProHis2025<210>9<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人<400>9CysAspLeuProGluThrHisSerLeuAspAsnArgArgThrLeuMet151015LeuLeuAlaGlnMetSerArgIleSerProSerSerCysLeuMetAsp202530ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>10<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>鏈<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的類似物IFN-N0<400>10CysTyrLeuSerArgLysLeuMetLeuAspAlaArgGluAsnLeuLys151015LeuLeuAspArgMetAsnArgLeuSerProHisSerCysLeuMetAsp202530ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>11<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>鏈<222>(1)…(166)<223>成熟的Hu1FNα的類似物IFN-N1<400>10CysTyrLeuSerArgThrHisSerLeuAspAsnArgArgThrLeuMet151015LeuLeuAlaGlnMetSerArgIleSerProSerSerCysLeuMetAsp202530ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>12<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>鏈<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的類似物IFN-N2<4O0>10CysTyrLeuSerArgLysLeuMetLeuAspAsnArgArgThrLeuMet151015LeuLeuAlaGlnMetSerArgIleSerProSerSerCysLeuMetAsp202550ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>13<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>鏈<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的類似物IFN-N3<400>13CysTyrLeuSerArgLysLeuMetLeuAspAlaArgGluAsnLeuMet151015LeuLeuAlaGlnMetSerArgIleSerProSerSerCysLeuMetAsp202530ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleServalLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>14<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>鏈<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的類似物IFN-N4<400>14CysTyrLeuSerArgLysLeuMetLeuAspAlaArgGluAsnLeuLys151015LeuLeuAspArgMetSerArgIleSerProSerSerCysLeuMetAsp202530ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>15<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>鏈<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的類似物IFN-N5<400>15CysAspLeuProGluLysLeuMetLeuAspAlaArgGluAsnLeuLys151015LeuLeuAspArgMetAsnArgLeuSerProHisSerCysLeuMetAsp202530ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>16<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>鏈<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的類似物IFN-N6<400>16CysAspLeuProGluThrHisSerLeuAspAlaArgGluAsnLeuLys151015LeuLeuAspArgMetAsnArgLeuSerProHisSerCysLeuMetAsp202530ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>17<211>166<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220><221>鏈<222>(1)…(166)<223>成熟的HuIFNα的類似物IFN-N7<400>17CysAspLeuProGluThrHisSerLeuAspAsnArgArgThrLeuMet151015LeuLeuAspArgMetAsnArgLeuSerProHisSerCysLeuMetAsp202530ArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPheAspGlyAsnGlnPhe354045GlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGluLeuIleGlnGlnIle505560PheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAlaAlaTrpAspGluAsp65707580LeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGlnGlnLeuAsnAspLeu859095GluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGlyGluThrProLeuMet100105110AsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyrPheArgArgIleThr115120125LeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCysAlaTrpGluValVal130135140ArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSerThrAsnLeuGlnGlu145150155160ArgLeuArgArgLysGlu165<210>18<211>172<212>蛋白質(zhì)<213>綿羊<400>18CysTyrLeuSerArgLysLeuMetLeuAspAlaArgGluAsnLeuLys151015LeuLeuAspArgMetAsnArgLeuSerProHisSerCysLeuGlnAsp202530ArgLysAspPheGlyLeuProGlnGluMetValGluGlyAspGlnLeu354045GlnLysAspGlnAlaPheProValLeuTyrGluMetLeuGlnGlnSer505560PheAsnLeuPheTyrThrGluHisSerSerAlaAlaTrpAspThrThr65707580LeuLeuGluGlnLeuCysThrGlyLeuGlnGlnGlnLeuAspHisLeu859095AspThrCysArgGlyGlnValMetGlyGluGluAspSerGluLeuGly100105110AsnMetAspProIleValThrValLysLysTyrPheGlnGlyIleTyr115120125AspTyrLeuGlnGluLysGlyTyrSerAspCysAlaTrpGluIleVal130135140ArgValGluMetMetArgAlaLeuThrValSerThrThrLeuGlnLys145150155160ArgLeuThrLysMetGlyGlyAspLeuAsnSerPro165170<210>19<211>527<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(18)…(518)<223>IFN-N0的合成基因<400>19ctaggctcgagaagagatgttacttgtctagaaagttgatgttggacgcc50CysTyrLeuSerArgLysLeuMetLeuAspAla1510agagagaacttgaagttgttggatagaatgaacagactttctcctcac98ArgGluAsnLeuLysLeuLeuAspArgMetAsnArgLeuSerProHis152025tcttgtcttatggacagacacgacttcggtttcccacaagaagaattt146SerCysLeuMetAspArgHisAspPheGlyPheProGlnGluGluPhe303540gacggtaaccaattccaaaaggctccagctatctctgtcttgcacgag194AspGlyAsnGlnPheGlnLysAlaProAlaIleSerValLeuHisGlu455055ttgatccaacaaattttcaaccttttcactaccaaggactcctccgct242LeuIleGlnGlnIlePheAsnLeuPheThrThrLysAspSerSerAla60657075gcttgggacgaagatttgcttgacaagttctgtactgagctttaccaa290AlaTrpAspGluAspLeuLeuAspLysPheCysThrGluLeuTyrGln808590caattgaacgacttggaagcctgtgtcatgcaagaagagagagttgga338GlnLeuAsnAspLeuGluAlaCysValMetGlnGluGluArgValGly95100105gagacccctttgatgaacgctgattccattttggctgtcaagaagtac386GluThrProLeuMetAsnAlaAspSerIleLeuAlaValLysLysTyr110115120ttcagaagaattaccttgtaccttactgagaagaagtactctccatgt434PheArgArgIleThrLeuTyrLeuThrGluLysLysTyrSerProCys125130135gcttgggaggttgttagagctgaaattatgagatccttgtctthgtct482AlaTrpGluValValArgAlaGluIleMetArgSerLeuSerLeuSer140145150155actaaccttcaagaaagattgagaagaaaggagtaagcggccgcg527ThrAsnLeuGlnGluArgLeuArgArgLysGlu*160165<210>20<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>接頭1<400>20ctagaaagttgatggaattcgacg24<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>接頭2<400>21gttaccgtcgaattccatcaacttt25<210>22<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N1，正向鏈<400>22tcgagaagagatgttacctttctagaacccactccttggacaacagaagaaccttgatgt60tgctagcccaaatgtccagaatctccccttcctcttgtcttatggacagacacgacttcg120gtttcccacaagaag135<210>23<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N1，反向鏈<400>23aattcttcttgtgggaaaccgaagtcgtgtctgtccataagacaagaggaaggggagatt60ctggacatttgggctagcaacatcaaggttcttctgttgtccaaggagtgggttctagaa120aggtaacatctcttc135<210>24<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N2，正向鏈<400>24tcgagaagagatgttacttgtctagaaagttgatgttggacaacagaagaacccttatgc60tgctagctcaaatgtccagaatctctccatcctcttgtct100<210>25<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N2，反向鏈<400>25cgaagtcgtgtctgtccataagacaagaggatggagagattctggacatttgagctagca60gcataagggttcttctgttgtccaacatcaactttctagacaagtaacatctcttc116<210>26<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N3，正向鏈<400>26tcgagaagagatgttacttgtctagaaagttgatgttggacgctagagagaacttgatgc60tgctagctcaaatgtccagaatttccccttcttcttgtct100<210>27<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N3，反向鏈<400>27cgaagtcgtgtctgtccataagacaagaagaaggggaaattctggacatttgagctagca60gcatcaagttctctctagcgtccaacatcaactttctagacaagtaacatctcttc116<210>28<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N4，正向鏈<400>28tcgagaagagatgttacttgtctagaaagttgagtcttgacgctagagaaaacttgaagc60ttttggacagaatgtccagaatttccccatcctcttgtct100<210>29<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N4，反向鏈<400>29cgaagtcgtgtctgtccataagacaagaggatggggaaattctggacattctgtccaaaa60gcttcaagttttctctagcgtcaagcatcaactttctagacaagtaacatctcttc116<210>30<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N5，正向鏈<400>30tcgagaagagatgtgacttgccagaaaagcttatgttggacgccagagaaaacttgaaac60ttctagacagaatgaacagattgtctccacactcttgtcttatggacagacacgacttcg120gtttcccacaagaag135<210>31<211>135<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N5，反向鏈<400>31aattcttcttgtgggaaaccgaagtcgtgtctgtccataagacaagagtgtggagacaat60ctgttcattctgtctagaagtttcaagttttctctggcgtccaacataagcttttctggc120aagtcacatctcttc135<210>32<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N6，正向鏈<400>32tcgagaagagatgtgacttgcctgaaactcacagtctagacgccagagagaacttgaagc60ttttggacagaatgaacagattgtctccacactcttgtct100<210>33<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N6，反向鏈<400>33cgaagtcgtgtctgtccataagacaagagtgtggagacaatctgttcattctgtccaaaa60gcttcaagttctctctggcgtctagactgtgagtttcaggcaagtcacatctcttc116<210>34<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N7，正向鏈<400>34tcgagaagagatgtgacttgccagagacccactcccttgacaacagaagaactttgatgc60ttctagacagaatgaacagattgtccccacactcttgtct100<210>35<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>片段N7，反向鏈<400>35cgaagtcgtgtctgtccataagacaagagtgtggggacaatctgttcattctgtctagaa60gcatcaaagttcttctgttgtcaagggagtgggtctctggcaagtcacatctcttc11權(quán)利要求1.一種降低人IFNα的毒性的方法，所說的方法包括用能有效地降低培養(yǎng)的單核細胞中的人IFNα的特異毒性的氨基酸取代成熟的人IFNα序列的第19，20，22，24和27位的一個或多個氨基酸，而第1-27位的大多數(shù)氨基酸仍保持為天然的人IFNα的氨基酸。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的取代包括以非保守型氨基酸取代所說的成熟的人IFNα序列上的第19，20，22，24和27位的一個或多個氨基酸。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的取代包括下列的一種或多種(a)以III類氨基酸取代第19位的氨基酸，(b)以IV類氨基酸取代第20位的氨基酸，(c)以III類氨基酸取代第22位的氨基酸，(d)以V類氨基酸取代第24位的氨基酸，和(e)以IV類氨基酸取代第27位的氨基酸。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的取代包括下列的一種或多種(a)以Asp取代第19位的氨基酸，(b)以Arg取代第20位的氨基酸，(c)以Asn取代第22位的氨基酸，(d)以Leu取代第24位的氨基酸，和(e)以His取代第27位的氨基酸。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的取代通過選自下列一組中的一種取代而完成(a)以SEQIDNO2所定義的9-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第19-27位的氨基酸，(b)以SEQIDNO4所定義的17-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第11-27位的氨基酸，和(c)以SEQIDNO6所定義的22-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第6-27位的氨基酸。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中成熟的人IFNα序列第28-166位基本不變。7.一種用于人類治療的低毒性的IFNα類似物，包括具有一個或多個取代的氨基酸的成熟的人IFNα，其是按照權(quán)利要求1所述的方法取代所述氨基酸而制備的。8.如權(quán)利要求7所述的類似物，其中取代的氨基酸是在第19，20，22，和27位上的一個或多個非保守型氨基酸。9.如權(quán)利要求7所述的類似物，其中所說的取代包括下列的一種或多種(a)以III類氨基酸取代第19位的氨基酸，(b)以IV類氨基酸取代第20位的氨基酸，(c)以III類氨基酸取代第22位的氨基酸，(d)以V類氨基酸取代第24位的氨基酸，和(e)以IV類氨基酸取代第27位的氨基酸。10.如權(quán)利要求7所述的類似物，其中所說的取代包括下列的一種或多種(a)以Asp取代第19位的氨基酸，(b)以Arg取代第20位的氨基酸，(c)以Asn取代第22位的氨基酸，(d)以Leu取代第24位的氨基酸，和(e)以His取代第27位的氨基酸。11.如權(quán)利要求7所述的類似物，其中所說的取代通過選自下列一組中的一種取代而完成(a)以SEQIDNO2所定義的9-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第19-27位的氨基酸(b)以SEQIDNO4所定義的17-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第11-27位的氨基酸，和(c)以SEQIDNO6所定義的22-mer序列取代成熟的人IFNα序列上第6-27位的氨基酸。12.如權(quán)利要求7所述的類似物，其中成熟的人IFNα序列上第28-166位基本不變。13.一種抑制病毒復(fù)制的方法，包括將感染病毒的細胞與權(quán)利要求7所述的低毒性的人IFNα類似物在能夠有效地抑制病毒在所說的細胞內(nèi)復(fù)制的濃度下相接觸。14.一種抑制腫瘤細胞生長的方法，其中包括將腫瘤細胞與如權(quán)利要求7所述的低毒性的人IFNα類似物在能夠有效地抑制所說的腫瘤細胞生長的濃度下相接觸。15.一種治療需要治療的患者的自身免疫疾病的方法，包括對所說的患者施用有效量的如權(quán)利要求7所述的低毒性的人IFNα類似物。16.一種治療需要治療的患者的慢性炎癥的方法，包括對所說的患者施用有效量的如權(quán)利要求7所述的低毒性的人IFNα類似物。17.一種治療對靜脈注射IFNα產(chǎn)生敏感性的病情的方法，包括口服給予有效量的如權(quán)利要求7所述的低毒性的人IFNα類似物。全文摘要本發(fā)明描述了一種通過在多肽序列的N末端部分進行特定的氨基酸取代從而降低干擾素－α的細胞毒性的方法。本發(fā)明還描述了具有低細胞毒性的人干擾素－α類似物,以及這些低毒性人干擾素－α類似物在治療上的應(yīng)用。文檔編號C12N5/10GK1276797SQ98810368公開日2000年12月13日申請日期1998年10月20日優(yōu)先權(quán)日1997年10月20日發(fā)明者霍華德·M·約翰遜,卡羅爾·H·龐特澤,洛勒萊·H·維拉雷特,雅克利納·坎波斯申請人:派普根公司,佛羅里達大學(xué)