專利名稱：用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的懸浮包裝細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的懸浮包裝細(xì)胞系及其在生產(chǎn)感染性的無復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體方面的應(yīng)用。
病毒由編碼病毒基因的基因組和病毒衣殼組成，在逆轉(zhuǎn)錄病毒中衣殼可由一些被膜包圍。
識別逆轉(zhuǎn)錄病毒要區(qū)分順式元件5′-LTR、3′-LTR、包裝序列Psi、正鏈引物結(jié)合位點與負(fù)鏈引物結(jié)合位點，以及反式元件gag(衣殼蛋白)、pol(反轉(zhuǎn)錄酶)和env(被膜蛋白)。反式元件可由病毒基因組上的外源基因代替；然而這樣的病毒將依賴于稱為輔助病毒的病毒，這種輔助病毒既可以是完整的具感染性的病毒，也可以是非感染性的例如無包裝序列的病毒。包含這種非感染性的輔助病毒和/或一種或多種輔助病毒的輔助基因的細(xì)胞，稱之為包裝細(xì)胞系，其中輔助病毒基因可為瞬時表達的、游離的或整合到基因組中的基因。因此，包裝細(xì)胞系并不釋放有復(fù)制能力的感染性的病毒顆粒。如果輔助基因來自不同的輔助病毒，那么所形成的載體可稱作嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；這個過程稱為假型(pseudoty ping)。通常使用的這種嵌合包裝系統(tǒng)有例如攜帶親嗜性MoMuLv病毒的gag-pol基因和兼嗜性4070Ampho病毒的env基因的GP+env Am12(Markowwitz，D.G等，Trans.Assoc.Am.Physicians 101(1988)212-218)。甚至可能在包裝細(xì)胞系中出現(xiàn)來自幾種病毒(甚至帶有遺傳修飾的env基因)的env基因混合物。
包裝細(xì)胞系也可以包含不完整的分節(jié)段形式的病毒輔助基因組，這種情況下可稱為含割裂病毒基因組的包裝細(xì)胞系，這種變異具有更大的安全性來抵抗通過重組事件不期望地釋放具有感染性和復(fù)制能力的病毒。
然而，如果包裝細(xì)胞系經(jīng)除順式元件外還攜帶外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，那么這些病毒基因組便可作為具感染性但無復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被包裝和釋放。這種細(xì)胞系可稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系。
所有過去制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系都是以貼壁細(xì)胞即貼于表面生長的細(xì)胞為基礎(chǔ)的基于貼壁細(xì)胞NIH3T3的包裝細(xì)胞系GP+E86和GP+envAm12可見Markowitz.D.G.等在Trans.Assoc.Am.Physicians 101(1988)212-218中的描述。Miller，A.D.等在分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.and cell Biol.)，6(1986)2895-2902中描述了基于貼壁細(xì)胞NIH3T3的包裝細(xì)胞系PA317。Miller，A.D.等在病毒學(xué)雜志(J.Virol.)，65(1991)2220-2224中描述了基于NIH3T3細(xì)胞的GALV包裝細(xì)胞系PG13。Danos，O.等在美國國家科學(xué)院院報(PNAS USA)，85(1988)6460-6464中描述了基于NIH-3T3細(xì)胞的包裝細(xì)胞系ΨCre和ΨCrip。
Rigg，R.J.等在病毒學(xué)(Virology)218(1996)290-295中描述了基于一種人細(xì)胞系的包裝細(xì)胞系Propack-A。Cosset，F(xiàn).-L.等在病毒學(xué)雜志，69(1995)7430-7436中描述了基于一種人纖維瘤細(xì)胞系(HT1080)的包裝細(xì)胞系FLY A13和FLY RD18?；贒17和其它狗貼壁細(xì)胞系的包裝細(xì)胞系可見WO92/05266的描述。
通常描述的細(xì)胞系大多也是貼壁生長。貼壁細(xì)胞系的一個優(yōu)點在于它容易操作。因而貼壁細(xì)胞相對容易克隆，并且可使用病毒尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒，即經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后直接克隆選擇細(xì)胞是可能的。單個克隆可以容易地通過挑選進行識別、計數(shù)并分離。死細(xì)胞簡單地因脫落而不可能被誤認(rèn)為活細(xì)胞，為變換培養(yǎng)基僅僅需要簡單地通過吸管除去上清液且加入新鮮培養(yǎng)基。接種和維持細(xì)胞通常并不關(guān)鍵，因為貼壁細(xì)胞形成細(xì)胞克隆，并在組織單元中相互刺激生長。轉(zhuǎn)移細(xì)胞時，對于貼壁細(xì)胞需要額外的胰蛋白酶處理以分散細(xì)胞，但通常并不關(guān)鍵。
懸浮生長的細(xì)胞需要一系列不同的方法以進行克隆和轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗。因而克隆選擇需要使用固定添加劑如軟瓊脂，用稱作有限稀釋的方法系列稀釋細(xì)胞，直到理論上每個容器只有一個細(xì)胞，或者使用表面標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物(如GFP)，使得可通過FAC分選器直接選擇重組細(xì)胞?；罴?xì)胞和死細(xì)胞只能通過染色區(qū)分。變換培養(yǎng)基總是需要離心步驟。
過去并不知道懸浮生長的細(xì)胞系可作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞系。到目前為止也沒有實驗描述已建立的貼壁生長的包裝細(xì)胞系可轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L。
令人驚奇的是，本發(fā)明證明確實可能將貼壁包裝細(xì)胞系加以改變以適應(yīng)懸浮生長，并且所得懸浮包裝細(xì)胞系能夠生產(chǎn)高滴度的病毒。此外證明，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝基因質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，可從經(jīng)典的懸浮細(xì)胞系(例如人紅細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562、大鼠肝癌細(xì)胞系N1-S1和大鼠淋巴瘤細(xì)胞系C58)制備生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的懸浮生長細(xì)胞系，即這些細(xì)胞系釋放能轉(zhuǎn)導(dǎo)其它細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。
除了已提到的懸浮細(xì)胞需要其它克隆培養(yǎng)技術(shù)這點與貼壁細(xì)胞的差異外，生產(chǎn)懸浮包裝細(xì)胞系的技術(shù)流程與多次描述的制備貼壁包裝細(xì)胞系方法相似，都是通過導(dǎo)入單獨不能形成感染性病毒的輔助序列(一段或優(yōu)選斷裂形式)來制備。
一旦生產(chǎn)出懸浮包裝細(xì)胞系，便可以通過用相容逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)獒尫鸥腥拘缘珶o復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的懸浮生產(chǎn)細(xì)胞系(例如，一種兼嗜性包裝細(xì)胞系，其包含來源于一種親嗜性包裝細(xì)胞系的載體)，并且優(yōu)選地可通過用一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實現(xiàn)轉(zhuǎn)變。
過去并不知道完全懸浮生長的哺乳動物細(xì)胞系可作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞系。過去也沒有已知的方法可將建立的貼壁生長的包裝細(xì)胞系完全轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L。
本發(fā)明的目的是提供用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體懸浮生長的包裝細(xì)胞系，以及生產(chǎn)該包裝細(xì)胞系的方法及其用途。
本發(fā)明涉及一種完全懸浮生長的用于逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞系優(yōu)選地經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染。
本發(fā)明進一步的目的為一種生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，其特征為將用上述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的懸浮生長細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)，將細(xì)胞與細(xì)胞上清液分離，并從上清液中分離載體。
包裝細(xì)胞系可理解為一種哺乳動物細(xì)胞系，它包含制備病毒顆粒所必需的gag、pol和env基因(輔助基因)，而不包含具有功能活性的包裝序列(Ψ)。這種細(xì)胞系單獨不能形成包含基因組RNA的病毒顆粒。
具有功能活性的包裝序列可理解為逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中一段功能上導(dǎo)致RNA基因組包裝的區(qū)域。它的功能可以通過全部或部分缺失或突變而被失活。
根據(jù)本發(fā)明，可優(yōu)選地從貼壁生長的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系通過至少三個月時間逐步將貼壁包裝細(xì)胞系改變?yōu)檫m應(yīng)懸浮生長，從而生產(chǎn)完全懸浮生長的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系(甚至較長時間，如幾天，無需生長需要的不溶性基質(zhì)(細(xì)胞粘附的管壁或微載體))。所述步驟包括連續(xù)減少培養(yǎng)基中胎牛血清含量直至無血清，反復(fù)用胰蛋白酶或/和DNase處理細(xì)胞，使用懸浮細(xì)胞系專用的培養(yǎng)基(如DMF024A)，優(yōu)選地采用適于懸浮細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞的組織培養(yǎng)瓶(Sarstedt)，在一個振搖器上持續(xù)振搖培養(yǎng)瓶，細(xì)胞濃度在5×104和1×106個細(xì)胞/毫升(因此與貼壁培養(yǎng)相比較必須更加頻繁地分散細(xì)胞)。
根據(jù)本發(fā)明的完全懸浮生長并由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系，可優(yōu)選地通過如下方法生產(chǎn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)懸浮細(xì)胞系，以共轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)導(dǎo)表面標(biāo)記的方式通過有限稀釋和/或加入固定添加劑選擇轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并分離以此方式所選擇的根據(jù)本發(fā)明的懸浮細(xì)胞。懸浮細(xì)胞系優(yōu)選地為逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系。為了生產(chǎn)懸浮生長的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系，優(yōu)選地將一種逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系轉(zhuǎn)變成一種懸浮生長的細(xì)胞系，該逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系貼壁生長且由編碼輔助序列的核酸和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，或由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，上述轉(zhuǎn)變采用的方法為連續(xù)減少培養(yǎng)基的血清含量，直至基本上不含血清，反復(fù)用胰蛋白酶和DNase處理使細(xì)胞脫離支持物，在此過程中細(xì)胞濃度維持在5×104至1×106個細(xì)胞/毫升的范圍內(nèi)。這一方法的實施特別優(yōu)選經(jīng)過一段較長時間，優(yōu)選為至少三個月。在另一優(yōu)選的實施方案中，通過有限稀釋和/或加入固定添加劑，以共轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)導(dǎo)表面標(biāo)記的方式選擇轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
令人驚奇的是結(jié)果表明，盡管經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)以后經(jīng)歷幾個月大規(guī)模的長期操作，以這種方式處理的完全懸浮生長的包裝細(xì)胞系仍能生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒。
同樣令人驚奇的是，通過用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，經(jīng)如有限稀釋的分離步驟(其可將細(xì)胞稀釋至實際每一容器懸液中只有單個細(xì)胞)，或采用固定添加劑例如鋪上層瓊脂或甲基纖維素(Metho Cult H4100/干細(xì)胞技術(shù))，或以細(xì)胞表面標(biāo)記的方式分選細(xì)胞，從而能夠?qū)⑦@種完全懸浮生長的包裝細(xì)胞系克隆，由此形成的完全懸浮生長的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系能夠與貼壁逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系同等程度地生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
與用攪拌式發(fā)酵罐或高密度透析培養(yǎng)方法培養(yǎng)的貼壁逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系相比較，以這種方式生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系容許更為簡單的大規(guī)模培養(yǎng)。
此外，分離載體病毒的方法也不相同。對于貼壁逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，僅僅需要移出包含逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)上清液，并且盡管并非絕對必要，但為了安全的原因仍然總是要實行無菌過濾的步驟；而對于完全懸浮生長的逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)細(xì)胞系，更小更輕的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒是通過過濾和離心步驟或至少兩次離心步驟與較大較重的生產(chǎn)細(xì)胞系分離的。
包含治療基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被用作逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)?；蚰孓D(zhuǎn)錄病毒載體。為了防止在懸浮生產(chǎn)細(xì)胞系生產(chǎn)過程中釋放有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這些載體不包含象gag、pol、env這樣的包裝序列。治療相關(guān)基因通常插在5′-LTR和3′-LTR之間，并且較為便利的是含有新霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。
無復(fù)制能力(復(fù)制缺陷)的載體可理解為不包含逆轉(zhuǎn)錄病毒基因功能(gag、env、pol)因而不能獨立形成病毒顆粒的載體。然而，載體通常包含包裝功能(psi)。為了形成感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，可用復(fù)制缺陷型DNA載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含穩(wěn)定形式之基因功能gag、env和pol(作為游離體或整合到基因組中)的包裝細(xì)胞系。由于gag、env的功能，形成RNA轉(zhuǎn)錄物，其被包裝入病毒顆粒。這些病毒顆粒為復(fù)制缺陷型的，因為它們包含的RNA基因組并不攜帶逆轉(zhuǎn)錄病毒基因功能?？s略詞MoMuLV MoLoney鼠白血病病毒Fcs 胎牛血清ΔLNGFR 低親和力神經(jīng)生長因子受體，其細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域缺失(參見WO95/06723)SV40-P/ESV40的啟動子/增強子單元neoR新霉素抗性基因pBR322 大腸桿菌基礎(chǔ)載體質(zhì)粒T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶大小CMV-P/E CMV啟動子/增強子單元(參見例如EP-B0173177)TK-P單純皰疹胸苷激酶啟動子poly-A 聚腺苷酸化位點hygR潮霉素抗性基因gpt gpt選擇基因pUC19 基礎(chǔ)載體pUC20 基礎(chǔ)載體5′LTR MoMuLV MoMuLV的5′長末端重復(fù)序列cfu 集落形成單位本發(fā)明由以下實施例和公開發(fā)表的文獻進一步闡明，其范圍源于專利的權(quán)利要求書。描述的方法應(yīng)理解為還可描述甚至經(jīng)過修飾的發(fā)明主題的實施例。實施例1 改變貼壁逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系使之適應(yīng)懸浮生長貼壁包裝細(xì)胞系FLY A13(兼嗜性env，來自MoMuLV)和FLYRD18(env來自貓內(nèi)源性病毒RD114)(Cosset，F(xiàn)-L.等，病毒學(xué)雜志，69(1995)7430-7436)都基于人纖維瘤系HT1080，其通過以下方法步驟經(jīng)改變以適應(yīng)為懸浮生長a)改變貼壁包裝細(xì)胞系以適應(yīng)懸浮生長I.連續(xù)并緩慢減少培養(yǎng)基中的胎牛血清，時間大約5個月；10％FCS-＞5％-＞2.5％-＞2％-＞1％-＞0.5％-＞無血清II.使用用于懸浮細(xì)胞系的培養(yǎng)基III.使用用于懸浮細(xì)胞系的培養(yǎng)瓶(Sarstedt)IV.在振搖器上連續(xù)緩和振搖培養(yǎng)瓶V.維持培養(yǎng)需要經(jīng)常分離由胰蛋白酶和DNase酶處理形成的細(xì)胞團塊，并經(jīng)常分散以保持懸浮。細(xì)胞濃度總是關(guān)鍵因素(5×104-1×106個細(xì)胞/毫升)，即絕不能太高或太稀。b)瞬時培養(yǎng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測定懸浮生長的包裝細(xì)胞系與相應(yīng)的貼壁生長的包裝細(xì)胞系就生產(chǎn)性質(zhì)進行比較。
為此，用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染所有細(xì)胞系，并測定瞬時培養(yǎng)物的逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。材料*逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLΔNSN(6853bp)[-5′LTR MoMuLV-Ψ-ΔLNGFR-SV40-P/E-neoR-3′LTRMoMuLV-pBR322-質(zhì)粒部分-]*轉(zhuǎn)染試劑DOSPER；每次每份混合物加20μgDOSPER(制造商Boehringer Mannheim GmbH，GER)*質(zhì)粒DNA濃度50μg DNA/混合物/質(zhì)粒方法第1天接種用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞貼壁細(xì)胞6×105細(xì)胞/盤，在60mm培養(yǎng)皿上懸浮細(xì)胞3×105細(xì)胞/毫升；在用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中(T25，Sarstedt，豎式的)；總量2毫升。溫和振搖，37℃下5％CO2中培養(yǎng)懸浮細(xì)胞過液。第2天變換培養(yǎng)基(對于懸浮細(xì)胞采用離心和重懸方法)，制備DNA/DOSPER混合物，逐滴加在細(xì)胞上(每種情況下100μlDNA/DOSPER混合物)。
37℃、5％CO2溫育5～6小時，隨后加入培養(yǎng)基。第3天轉(zhuǎn)染24小時后移出上清液，離心(只對于懸浮細(xì)胞系)、過濾(0.45μm濾器)，然后在NIH3T3細(xì)胞上滴定滴度(G418選擇)。
滴度結(jié)果約10-14天后。滴度貼壁細(xì)胞系 FLY A138×105cfu/ml2×105cfu/mlFLY RD18過去沒有測定過轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋〉募?xì)胞系FLY A132.4×103cfu/mlFLY RD181×102cfu/ml結(jié)果變?yōu)閼腋∩L的包裝細(xì)胞系從理論上講能夠生產(chǎn)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。滴度的差異是由于在轉(zhuǎn)染和滴度測定時的實驗條件不同，例如懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不同，以及無胎牛血清培養(yǎng)基和有胎牛血清培養(yǎng)基中的逆轉(zhuǎn)錄病毒的穩(wěn)定性和感染性不同。實施例2經(jīng)兩個輔助質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒三重轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞后逆轉(zhuǎn)錄病毒的生產(chǎn)一種貼壁細(xì)胞系和幾種懸浮生長細(xì)胞系在瞬時三重轉(zhuǎn)染制備時比較了其形成感染性逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的能力。使用的細(xì)胞系貼壁細(xì)胞系(對照) NIH3T3(鼠纖維瘤)懸浮細(xì)胞系 K562(人紅細(xì)胞白血病細(xì)胞系)N1-S1(大鼠肝癌)C58(大鼠淋巴瘤)材料a)輔助質(zhì)粒*gag-pol表達質(zhì)粒pGAPOGPT(10202bp)[-CMV-P/E-gag-pol-polyA-SV40-P/E-gpt-polyA-pUC19-質(zhì)粒部分-]*ENV表達質(zhì)粒pENVCHT(7933bp)[-TK-P-hygR-polyA-CMV-P/E-env(兼嗜性)-IpolyA-pUC20-質(zhì)粒部分-]b)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒*逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLΔNSN(6853bp)[-5′LTR MoMuLV-Ψ-ΔLNGFR-SV40-P/E-neoR-3′LTRMoMuLV-pBR322-質(zhì)粒部分-]*轉(zhuǎn)染試劑DOSPER(BM)；每次20μgDOSPER/混合物*質(zhì)粒DNA濃度50μg DNA/混合物/質(zhì)粒方法第1天接種用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞貼壁細(xì)胞(NIH3T3)6×105細(xì)胞/盤，在60mm培養(yǎng)皿中懸浮細(xì)胞3×105細(xì)胞/ml；T25培養(yǎng)瓶中(用于懸浮細(xì)胞，豎式)；總量2ml，37℃、5％CO2溫和振搖懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。第2天變換培養(yǎng)基(對于懸浮細(xì)胞采用離心和重懸方法)，制備DNA/DOSPER混合物，逐滴加在細(xì)胞上(每例100μlDNA/DOSPER混合物)。
37℃、5％CO2溫育5～6小時，隨后加入培養(yǎng)基。第3天三重轉(zhuǎn)染24小時后除去上清液，離心(僅適于懸浮細(xì)胞系)、過濾(0.45μm濾器)并在NIH3T3細(xì)胞上滴定滴度(G418選擇)大約10～14天以后滴定結(jié)果。在NIH3T3上的滴定結(jié)果(G418抗性集落數(shù)目)NIH3T3(貼壁對照細(xì)胞)每1.4ml病毒上清液中3個集落(滴度2cfu/ml)K562每0.8ml病毒上清液中6個集落(滴度7.5cfu/ml)N1-S1每2ml病毒上清液中6個集落(滴度3cfu/ml)C58每2ml病毒上清液中1個集落(滴度0.5cfu/ml)參考文獻表Cosset，F(xiàn)-L.等，病毒學(xué)雜志，69(1995)7430-7436Danos，O.等，美國國家科學(xué)院院報，85(1988)6460-6464Markowitz，D.G.等，Trans.Assoc.Am.Physicians，101(1988)212-218Miller，A.D.等，病毒學(xué)雜志，65(1991)2220-2224Miller，A.D.等，分子細(xì)胞生物學(xué)，6(1986)2895-2902Rigg，R.J.等，病毒學(xué)，218(1996)290-295WO92/0526權(quán)利要求
1.完全懸浮生長的包裝細(xì)胞系。
2.完全懸浮生長的包裝細(xì)胞系，其用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。
3.生產(chǎn)完全懸浮生長的包裝細(xì)胞系的方法，該細(xì)胞系用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中一種懸浮細(xì)胞系用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，以共轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)導(dǎo)表面標(biāo)記的方式通過有限稀釋和/或加入固定添加劑選擇轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，分離以這種方式選擇的懸浮細(xì)胞。
4.生產(chǎn)懸浮生長的包裝細(xì)胞系的方法，其中將培養(yǎng)于含血清培養(yǎng)基的用編碼輔助序列的核酸和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的，或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的貼壁生長包裝細(xì)胞系轉(zhuǎn)化為懸浮生長細(xì)胞系，方法是通過連續(xù)減少培養(yǎng)基中的血清含量直到無血清，反復(fù)用胰蛋白酶和脫氧核糖核酸酶處理細(xì)胞以便細(xì)胞從支持物上脫離，其間懸液中的細(xì)胞濃度維持在5×104至1×106個細(xì)胞/ml的范圍內(nèi)。
5.按照權(quán)利要求4中所要求的方法，其中該方法進行至少3個月的時間。
6.按照權(quán)利要求4或5中所要求的方法，其中以共轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)導(dǎo)表面標(biāo)記的方式通過有限稀釋和/或加入固定添加劑選擇轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的完全懸浮生長的包裝細(xì)胞系。本發(fā)明還涉及一種從懸浮細(xì)胞系或貼壁生長細(xì)胞系生產(chǎn)上述細(xì)胞系的方法。
文檔編號C12N1/15GK1277631SQ98810550
公開日2000年12月20日 申請日期1998年10月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月25日
發(fā)明者S·希伯, S·考赫, T·古特亞爾, U·斯迪格曼斯, R·魯格 申請人:羅切診斷學(xué)有限公司