專利名稱：：新豬環(huán)病毒、疫苗及診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種引起PMWS綜合癥(豬多系統(tǒng)性消瘦綜合癥，也稱為斷乳后多系統(tǒng)性消瘦綜合癥)的新型豬環(huán)病毒株(porcinecircovirus簡(jiǎn)稱為PCV)，涉及檢測(cè)其的試劑和方法，涉及免疫接種方法及疫苗，和涉及制備這些試劑和疫苗的方法。最初，在豬腎細(xì)胞系PK/15中檢測(cè)到PCV為非細(xì)胞致病性污染物。此病毒與幼禽貧血病毒(簡(jiǎn)稱為CAV)和PBFDV病毒(PscittacineBeakandfeatherdiseaseVirus)被分類為環(huán)病毒科(Circocuridae)。此病毒為小型無(wú)被膜病毒(從15-24nm)，共同特征為含有1.76-2.31kb的環(huán)狀單鏈DNA形式的基因組。最初認(rèn)為該基因組編碼一種約30kDa的多肽(Todd等人，病毒學(xué)文獻(xiàn)(ArchVirol)，1991，117；129-135)。然而，最近的工作顯示其更為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄(MeehanB.M.等人，1997，78221-227)。此外，在三種類型已知環(huán)病毒之間的核苷酸序列或共同抗原決定簇中無(wú)明顯同源性。一直認(rèn)為來(lái)源于PK/15細(xì)胞的PCV無(wú)致病性。其序列由MeehanB.M.等人，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)，1997，78221-227可知。直到最近有人意識(shí)到PCV株可能為致病性的，與PMWS綜合癥相關(guān)(GupiP.S.Nayar等人，加拿大獸醫(yī)雜志(Can.Vet.J.)，1997，38385-387；ClarkE.G.，美國(guó)豬應(yīng)用協(xié)會(huì)進(jìn)展(Proe.Am.Assoc.SwinePrac.)，1997；499-501)。Nayar等人利用PCR技術(shù)從患有PMWS綜合癥的豬中檢測(cè)到PCVDNA。此前，尚未有野生型PCV毒株被分離和純化。在加拿大、美國(guó)和法國(guó)檢出的PMWS綜合癥臨床上的特征為體重逐漸下降，出現(xiàn)諸如呼吸急促、呼吸困難和黃疸的臨床表現(xiàn)。從病理學(xué)角度而言，這些癥狀是淋巴細(xì)胞或肉芽腫浸潤(rùn)、淋巴結(jié)病的臨床表現(xiàn)，和更罕見的肝炎、淋巴細(xì)胞性或肉芽腫性腎炎(ClarkE.G.，美國(guó)豬應(yīng)用協(xié)會(huì)進(jìn)展1997；499-501；LaSemaineVeterinaireNo.26，LaSemaineVeterinaire增刊，1996(834)；LaSemaineVeterinaire1997(857)54；GupiP.S.Nayar等人，加拿大獸醫(yī)雜志，1997，38385-387)。本申請(qǐng)人從肺或神經(jīng)節(jié)樣本中成功分離了五種新PCV毒株，此后稱為根據(jù)本發(fā)明的環(huán)病毒，其中這些樣本獲自位于加拿大、美國(guó)(加利福尼亞)和法國(guó)(Brittany)的農(nóng)場(chǎng)。已經(jīng)從患有PMWS綜合癥的豬的損傷處檢出這些病毒，而在健康豬中未檢出。此外，本申請(qǐng)人測(cè)定了這些毒株中的4株之基因組序列，即從加拿大、美國(guó)獲得的毒株以及從法國(guó)獲得的兩株毒株。在核苷酸水平上這些毒株相互之間顯示出強(qiáng)烈的同源性，超過(guò)96％；而與PK/15毒株之間同源性較低，約76％。因此，認(rèn)為新毒株為一種新型豬環(huán)病毒的代表，此處稱為II型，I型由PK/15代表。因此，本發(fā)明的主題為分離的或純化制品形式的如上述的II型豬環(huán)病毒。本發(fā)明涉及可從患有PMWS綜合癥病豬中的生理學(xué)樣本或組織，尤其是損傷組織樣本中分離的，尤其是依照實(shí)施例所述的方法分離的任何豬環(huán)病毒，特別是涉及II型環(huán)病毒。本發(fā)明的主題更具體的是五種毒株的純化制品，其已保藏在ECACC(歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心，應(yīng)用微生物及研究中心，PortonDown，Salisbury，WiltshireSP40JG，英國(guó))保藏號(hào)V97100219(此處稱為Imp.1008PCV)；保藏號(hào)V97100218(此處稱為Imp.1010PCV)；保藏號(hào)V97100217(此處稱為Imp.999PCV)；于1997年10月2日(星期四)保藏，以及保藏號(hào)V98011608(此處稱為Imp.1011-48285)；保藏號(hào)V98011609(此處稱為Imp.1011-48121)；于1998年1月16日(星期五)保藏。本發(fā)明涉及從患病豬分離的豬環(huán)病毒，和/或與本發(fā)明毒株具有顯著血清學(xué)相似性的環(huán)病毒，和/或在嚴(yán)格條件下可與本發(fā)明的毒株交叉雜交的環(huán)病毒，所述嚴(yán)格條件是指例如不能與PCVPK/15毒株雜交。從患有PMWS綜合癥的豬中的生理學(xué)樣本或組織，尤其是損傷組織樣本中分離的病毒株可有利地在細(xì)胞系中增殖，尤其是豬腎細(xì)胞系，特別是無(wú)污染物(如PCV以及瘟病毒、豬腺病毒和豬細(xì)小病毒)的PK/15細(xì)胞中，用于其復(fù)制或具體地產(chǎn)生抗原，包括完整抗原(如病毒)和/或抗原亞單位(如多肽)。非常明顯而出人意料的是，已證明這些分離物在PK/15細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)量很大，這無(wú)疑對(duì)病毒或抗原，尤其是對(duì)滅活疫苗的產(chǎn)生十分有利。本發(fā)明的主題還涉及環(huán)病毒制品，其中在體外培養(yǎng)的細(xì)胞特別是細(xì)胞系(如PK/15細(xì)胞)傳代后分離環(huán)病毒，所述細(xì)胞或細(xì)胞系被至少一種根據(jù)本發(fā)明的環(huán)病毒感染，或者被可從患有PMWS綜合癥的豬的生理學(xué)樣本或從組織樣本(尤其是損傷組織)中分離的任一種豬環(huán)病毒感染。本發(fā)明的主題還包括培養(yǎng)物提取物或上清液，任選地，其通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化，以及通常任一種獲自體外培養(yǎng)物的抗原性制品。本發(fā)明的主題還涉及免疫活性組分和含有至少一種上述抗原的疫苗。其可為基于減毒活體全病毒的免疫活性組分，或用這些活性組分制備的疫苗?？筛鶕?jù)常規(guī)方法進(jìn)行減毒，例如，通過(guò)在細(xì)胞上進(jìn)行傳代，優(yōu)選在豬細(xì)胞特別是細(xì)胞系(如PK/15細(xì)胞)上傳代，例如從50至150次，特別是約100次水平的傳代。這些疫苗一般包括獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑，任選地，獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑，以及任選地一種冷凍干燥穩(wěn)定劑。這些疫苗優(yōu)選地包含103-106TCID50。其可是免疫活性組分，或基于根據(jù)本發(fā)明環(huán)病毒抗原的滅活狀態(tài)的疫苗。這些疫苗還包括獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑，以及任選地獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑。根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)，滅活根據(jù)本發(fā)明的環(huán)病毒以及可能存在的組分。滅活優(yōu)選地通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行，如通過(guò)使抗原接觸一種化學(xué)藥劑，如甲醛(福爾馬林)、多聚甲醛、β-丙醇酸內(nèi)酯、乙撐亞胺或其衍生物。滅活優(yōu)選的方法為此處所述的接觸化學(xué)藥劑，特別是接觸乙撐亞胺或β-丙醇酸內(nèi)酯。優(yōu)選地，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法，根據(jù)本發(fā)明的滅活疫苗可添加佐劑有利地以乳液形式提供，例如油包水或水包油型。也可根據(jù)佐劑性質(zhì)將常規(guī)佐劑化合物摻入活性組分中?？捎玫淖魟┲?，以舉例的方式，包括但不限于氫氧化鋁、皂甙(如Quillaja皂甙或QuilA；參見“疫苗設(shè)計(jì)，亞單位疫苗劑佐劑方法”，1995，MichaelF.Powel和MarkJ.Newman編，Plennum出版社，New-York及London，210頁(yè))、Avridine(疫苗設(shè)計(jì)，148頁(yè))、DDA(溴化二甲基雙十八烷基銨，疫苗設(shè)計(jì)，157頁(yè))、聚磷腈(疫苗設(shè)計(jì)，204頁(yè))、或備擇的基于礦物油、角鯊?fù)?例如SPT乳液，疫苗設(shè)計(jì)，147頁(yè))、角鯊烯(例如MF59，疫苗設(shè)計(jì)，183頁(yè))的水包油型乳液，或基于可代謝油(優(yōu)選根據(jù)WO-A-9420071)的油包水型乳液，以及US-A-5,422,109中所述的乳液。也可選擇佐劑的組合，例如Avridine或DDA與一種乳液組合。這些疫苗優(yōu)選地包含103-106TCID50?；钜呙缱魟┛蛇x自那些用于滅活疫苗的佐劑，優(yōu)選乳液?？稍谟糜跍缁钜呙缰兴镜哪切┤橐哼€包括WO-A-9416681中所述的那些乳液。至于冷凍干燥穩(wěn)定劑，其以舉例方式可為SPGA(Bovarnik等人，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacterioligy)，59，509，950)、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖)、蛋白質(zhì)(白蛋白或酪蛋白)，或這些化合物的衍生物，或如堿金屬磷酸鹽的緩沖液。此外，申請(qǐng)人獲得了分離株中4個(gè)的基因組，鑒定為SEQIDNO1-4和任選地SEQIDNo6。因此，本發(fā)明的主題是含有這些序列之一的部分或全部的DNA片段。不言而喻，本發(fā)明自然涵蓋了等同序列，即不改變所述序列的功能或菌株特異性的序列，或由該序列編碼的多肽之菌株特異性的序列。當(dāng)然，由于密碼子簡(jiǎn)并性造成的差異也包括在內(nèi)。本發(fā)明也涵蓋了這樣的等同序列，它們?cè)诟叨葒?yán)格條件下可與上述序列雜交，和/或與本發(fā)明的毒株有高度同源性，且屬于上述II型環(huán)病毒組。借助適當(dāng)載體，這些序列及其片段可有利地用于多肽的體外或體內(nèi)表達(dá)。特別是，已經(jīng)鑒定了在II型環(huán)病毒基因組序列上的可用于此方面的開放閱讀框架，其形成了根據(jù)本發(fā)明的DNA片段。本發(fā)明涉及含有至少一個(gè)這些開放閱讀框架(相應(yīng)于氨基酸序列)的任何多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種基本上由ORF4、ORF7、ORF10或ORF13組成的蛋白質(zhì)。為了在體外表達(dá)亞單位，作為一種表達(dá)方法可優(yōu)選使用大腸桿菌或桿狀病毒(US-A-4,745,051)。將編碼序列或其片段整合入桿狀病毒基因組(如，桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒AcNPV)，將后者在昆蟲細(xì)胞中增殖，如草地夜蛾(SpodopterafrugiperdaSf9)(保藏號(hào)ATCCCRL1711)。也可在真核細(xì)胞如酵母(如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO、BHK)中表達(dá)亞單位。本發(fā)明的主題也涉及可通過(guò)這些表達(dá)方法制備，然后任選地根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)純化的多肽。本發(fā)明還涉及一種亞單位疫苗，其包括在獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑之中的至少一種如此獲得的多肽，或其片段，以及任選地獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑。為了用于制備重組活體疫苗的體內(nèi)表達(dá)，在允許該多肽表達(dá)的條件下將編碼序列或其片段插入一種合適的表達(dá)載體。至于合適的載體，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的技術(shù)可使用活病毒，優(yōu)選地能在豬中增殖、對(duì)豬無(wú)致病性(天然無(wú)致病性或賦予此性質(zhì))。尤其是可使用豬皰疹病毒如假狂犬病病毒、豬腺病毒、皰疹病毒、痘病毒屬，特別是牛痘病毒、禽痘病毒、犬痘病毒和豬痘病毒。也可使用質(zhì)粒DNA作為載體(WO-A-9011092，WO-A-9319813，WO-A-9421797，WO-A-9520660)。因此，本發(fā)明主題也涉及如此制備的載體和重組活體疫苗或質(zhì)粒疫苗(多核苷酸或DNA疫苗)，此外，疫苗包括獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑。根據(jù)本發(fā)明的疫苗(活體減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗和質(zhì)粒疫苗)可包括一種或多種(2或3種)根據(jù)本發(fā)明環(huán)病毒之中的一種或多種的一種或多種活性組分(抗原)。對(duì)于每一上述疫苗類型，本發(fā)明也提供了針對(duì)豬環(huán)病毒的免疫接種與針對(duì)其它豬疾病(特別是可與PMWS綜合征相關(guān)的疾病)的免疫接種的聯(lián)合免疫接種疫苗。因此，根據(jù)本發(fā)明的疫苗，特別是滅活疫苗可包含相應(yīng)于其它豬病原體的效價(jià)。這些其它豬病原體中，優(yōu)選地包括PRRS(豬生殖和呼吸綜合征)(本領(lǐng)域技術(shù)人員可參見WO-A-93/07898，WO-A-94/18311，F(xiàn)R-A-2709966；C.chareyre等人，第15屆IPVS大會(huì)論文集，Birmingham，英國(guó)，1998年7月5-9日，139頁(yè)；此處引入作為參考)和/或豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumonia)(本領(lǐng)域技術(shù)人員可參見EP-A-597852；EP-A-550477；EP-A-571648；O.Martinon等人，157，284和285頁(yè)以及G.Reynaud等人，150頁(yè)，均在上述第15屆IPVS大會(huì)論文集，此處引入作為參考)。其它可能感興趣的疫苗可包括大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、大腸桿菌、豬萎縮性鼻炎以及偽狂犬病(Aujeszky病)、豬霍亂、豬流感。本發(fā)明的主題還涉及一種方法，從而可在豬中誘導(dǎo)針對(duì)本發(fā)明環(huán)病毒的免疫反應(yīng)。該方法特別是一種在豬中有效的方法。該方法可向豬一次或多次施用上述疫苗。也可在同一免疫接種方案中聯(lián)合上述數(shù)種類型的疫苗。該方法不僅可向成年豬施用，也可向幼豬或懷孕雌豬施用。對(duì)后者的免疫接種可對(duì)新生豬賦予被動(dòng)免疫(母本抗體)。本發(fā)明還提供了在豬中診斷根據(jù)本發(fā)明的環(huán)病毒的可能性。因此，本發(fā)明的主題還包括利用下述試劑的診斷試驗(yàn)和與其相關(guān)的方法。對(duì)不同環(huán)病毒序列的了解使得確定共同序列成為可能，這使其可制備能識(shí)別所有已知豬環(huán)病毒的反應(yīng)物片段。為了進(jìn)行特異性診斷，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能選擇這樣的序列片段，其相應(yīng)于與對(duì)應(yīng)的PK/15環(huán)病毒序列沒(méi)有或幾乎沒(méi)有同源性的區(qū)域。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可通過(guò)序列比較選擇符合其意愿的反應(yīng)物片段。第一種反應(yīng)物片段存在于此處公開的序列及其片段中，其可特別地在周知的雜交或PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)中用作探針或引物。第二種反應(yīng)物片段存在于由來(lái)自病毒的這些序列編碼的多肽或在載體幫助下表達(dá)的多肽(見上)，或根據(jù)傳統(tǒng)用于肽合成的技術(shù)通過(guò)化學(xué)途徑合成的多肽。第三種和第四種反應(yīng)物片段分別存在于多克隆和單克隆抗體，其可根據(jù)傳統(tǒng)方法從病毒提取多肽或片段、或由DNA序列編碼的多肽或其片段制備。這第二、三和四種反應(yīng)物片段可用于本發(fā)明主題的診斷方法，其中對(duì)獲自待測(cè)豬的生理學(xué)液體樣本(血液、血漿、血清等)或組織樣本(神經(jīng)中樞、肝臟、肺、腎等)進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)搜尋檢測(cè)抗原自身或針對(duì)該抗原的抗體，檢驗(yàn)是否存在特異于根據(jù)本發(fā)明環(huán)病毒的抗原。根據(jù)本發(fā)明的抗原和抗體可用于任何已知的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。然而，優(yōu)選地在可由獸醫(yī)、飼養(yǎng)者或牲畜主現(xiàn)場(chǎng)直接使用的技術(shù)中使用這些抗原和抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用多種實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)，因此可有利地改造這些抗原和/或抗體以適于作為診斷試劑的應(yīng)用?？稍诒景l(fā)明的框架中優(yōu)選使用的診斷技術(shù)為蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光、ELISA和免疫層析。就免疫層析的使用而言，專業(yè)人士可特別參見Robertf.Zurk等人，臨床化學(xué)(Clin.Chem.)，31/7，1144-1150(1985)，以及下列專利或?qū)＠暾?qǐng)WO-A-88/08534、WO-A-91/12528、EP-A-291176、EP-A-299428、EP-A-291194、EP-A-284232、US-A-5120643、US-A-5030558、US-A-5266497、US-A-4740468、US-A-5266497、US-A-4855240、US-A-5451504、US-A-5141850、US-A-5232035和US-A-5238652。因此，優(yōu)選通過(guò)間接試驗(yàn)(通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)或通過(guò)替換)在樣本中檢測(cè)特異性抗體。為此，使用抗原自身，或保留了抗體識(shí)別位點(diǎn)的該抗原片段作為檢測(cè)試劑?？捎欣厥褂眠^(guò)氧化物酶標(biāo)記或特定標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，優(yōu)選用膠體金。也期望在特異于該抗原的標(biāo)記抗體的幫助下檢測(cè)樣本中的抗原本身。標(biāo)記有利地為如上所述。對(duì)于特異于可特別用于競(jìng)爭(zhēng)或替換的抗原之抗體，或特異于用來(lái)檢測(cè)抗原自身的抗體，應(yīng)理解為特異于抗原的多克隆抗體或單克隆抗體、這些抗體的片段，優(yōu)選為Fab或F(ab)’2片段。本發(fā)明的另一方面是特異于根據(jù)本發(fā)明的抗原的單克隆或多克隆抗體，這些抗體可特別用作診斷試劑，在生理學(xué)液體樣本或組織樣本中檢測(cè)抗原，或者甚至在這樣的樣本或樣品中檢測(cè)抗體。本發(fā)明還包括這些抗體的免疫功能性片段，特別是Fab和F(ab)’2片段?？贵w可通過(guò)常規(guī)技術(shù)制備?？商貏e參見“抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，1988，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，美國(guó)，或J.W.Goding?！皢慰寺】贵w原理與實(shí)踐”，學(xué)院出版社，其內(nèi)容此處引入作為參考。也可特別的以自知方法進(jìn)行小鼠脾細(xì)胞與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞的融合，其中小鼠用抗原或至少一種該抗原的片段免疫過(guò)。本發(fā)明的主題還包括一種特異于抗原的單克隆或多克隆抗體(特別是小鼠或兔抗體)制品，其優(yōu)選為純或基本上純，或甚至為粗品。本發(fā)明還可以確定目標(biāo)表位，特別是基于此處描述的DNA序列，確定是否存在免疫用的表位或診斷用的表位。從根據(jù)本發(fā)明的環(huán)病毒基因組的DNA序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)已知方法，例如一種適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)程序或PEPSCAN確定表位。表位是蛋白質(zhì)的免疫決定區(qū)域，是暴露在蛋白質(zhì)表面的區(qū)域。由此，其可通過(guò)抗體識(shí)別，因而可特別用于診斷領(lǐng)域，用于診斷目的之抗體制備或者用于可用作診斷試劑的相應(yīng)肽的制備。一個(gè)表位至少是具有8-9個(gè)氨基酸的肽。通常優(yōu)選最少為13-25個(gè)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員因此可使用一種或多種這些技術(shù)以及其它可能的技術(shù)，發(fā)現(xiàn)可用于診斷目的的肽或抗體的表位。本發(fā)明的主題還包括診斷試劑盒，其中含有該抗原和/或特異于該抗原的多克隆或單克隆抗體。特別是相應(yīng)于上述診斷技術(shù)的診斷試劑盒。以下，本發(fā)明將以非限制性實(shí)施方案結(jié)合附圖更詳細(xì)的進(jìn)行描述，其中圖1.Imp.1011-48121株的基因組DNA序列。圖2.Imp.1011-48285株的基因組DNA序列。圖3.Imp.999株的基因組DNA序列。圖4.Imp.1010株的基因組DNA序列。圖5.根據(jù)圖1-4的4個(gè)序列與PCVPK/15株序列的比較。圖6.在1997年10月3日法國(guó)首次遞交的文件中的Imp.999株的基因組DNA序列。圖7.圖6序列與PK/15株序列的比較。序列表SEQIDSEQIDNO1Imp.1011-48121株的基因組DNA序列。SEQIDNO2Imp.1011-48285株的基因組DNA序列。SEQIDNO3Imp.999株的基因組DNA序列。SEQIDNO4Imp.1010株的基因組DNA序列。SEQIDNO5PCVPK/15株基因組的DNA序列。SEQIDNO6在1997年10月3日法國(guó)首次遞交的文件中的Imp.999株的基因組DNA序列。實(shí)施例實(shí)施例1豬環(huán)病毒株的培養(yǎng)及分離從法國(guó)、加拿大和美國(guó)小豬的肺和淋巴結(jié)收集組織樣本。這些小豬均顯示典型的斷乳后多系統(tǒng)消瘦綜合癥的臨床癥狀。為便于病毒分離，尸檢后立即將組織樣本于-70℃冷凍。為了病毒分離，在含有Earle鹽(EMEM，BioWhittaker英國(guó)有限公司，Wokingham，英國(guó))、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的基本培養(yǎng)基(MEM-SA培養(yǎng)基)中，通過(guò)利用無(wú)菌馬達(dá)和杵將組織樣本與無(wú)菌沙研磨，制備含有約15％組織樣本的懸浮液。然后將此研磨制品加入MEM-SA，4℃下于3000g離心30分鐘，收獲上清液。在接種細(xì)胞培養(yǎng)物之前，100μl體積的氯仿加入各個(gè)2ml上清液中，室溫下連續(xù)混合10分鐘。然后將此混合物轉(zhuǎn)移入微量離心管中，3000g離心10分鐘，收獲上清液。將此上清液用作病毒分離實(shí)驗(yàn)的接種物。所有的病毒分離研究均在PK/15細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行，該培養(yǎng)物已知無(wú)豬環(huán)病毒(PCV)、瘟病毒、豬腺病毒和豬細(xì)小病毒污染(AllanG.等人，初乳停斷小豬的豬環(huán)病毒實(shí)驗(yàn)性感染的病原體及豬胎材料的檢查，獸醫(yī)微生物(Vet.Microbiol.)，1995，44，49-64)。根據(jù)下列技術(shù)進(jìn)行豬環(huán)病毒的分離通過(guò)從生長(zhǎng)至鋪滿的培養(yǎng)物用胰蛋白酶(胰蛋白酶-依地酸混合物)消化分離PK/15細(xì)胞單層，以終濃度約400,000個(gè)細(xì)胞/ml加入含有15％胎牛血清無(wú)瘟病毒污染的MEM-SA培養(yǎng)基(＝MEM-G培養(yǎng)基)。然后將此細(xì)胞懸浮液的10ml等份與2ml上述接種物等份混合，最終將混合物以6ml等份培養(yǎng)于兩個(gè)25cm2的Falcon燒瓶中。在含10％CO2的氛圍中37℃培養(yǎng)18小時(shí)。培養(yǎng)后，用300mMD-葡糖胺(Cat#G48175，Sigma-Aldich化學(xué)有限公司，Poole，英國(guó))處理半鋪滿單層的培養(yǎng)液(TischerI.等人，病毒學(xué)文獻(xiàn)，1987，9639-57)，然后37℃繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。后一培養(yǎng)結(jié)束后，每個(gè)接種物的兩個(gè)Falcon燒瓶之一經(jīng)過(guò)連續(xù)3次凍/融循環(huán)。所剩Falcon燒瓶之PK/15細(xì)胞用胰蛋白酶-依地酸溶液處理，重懸于20mlMEM-G培養(yǎng)基中，以約400,000個(gè)細(xì)胞/ml濃度接種入75cm2的Falcon中。通過(guò)加入經(jīng)過(guò)凍/融循環(huán)獲得的相應(yīng)裂解物5ml，“超感染”新鮮接種的燒瓶培養(yǎng)物。實(shí)施例2用于通過(guò)免疫熒光或原位雜交檢測(cè)豬環(huán)病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物樣本的制備收集5ml超感染的懸浮液，接種入直徑55mm的帶有無(wú)菌無(wú)脂玻璃蓋玻片的培養(yǎng)皿。在燒瓶中及玻璃蓋玻片上的培養(yǎng)物于37℃培養(yǎng)，如實(shí)施例1所述用葡糖胺處理。用葡糖胺處理后24-48小時(shí)收集玻璃蓋玻片上的培養(yǎng)物，用丙酮室溫下固定10分鐘，或用10％緩沖的甲醛固定4小時(shí)。固定后，所有玻璃蓋玻片在硅膠上于-70℃儲(chǔ)存，直至用于原位雜交研究和免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記研究。實(shí)施例3通過(guò)原位雜交檢測(cè)PCV的技術(shù)對(duì)從患病豬收集的且用甲醛固定的組織進(jìn)行原位雜交，也對(duì)固定于玻璃蓋玻片上之為了病毒分離(見實(shí)施例2)接種的細(xì)胞培養(yǎng)物制品進(jìn)行原位雜交。使用相應(yīng)于PK/15豬環(huán)病毒(PCV)以及相應(yīng)于傳染性禽貧血病毒(CAV)的完整基因組探針。使用質(zhì)粒pPCV1作為PCV的特異性病毒DNA來(lái)源，其中含有以單一1.7千堿基對(duì)(kbp)插入片段形式克隆的PCV基因組復(fù)制形式(MeehanB.等人，豬環(huán)病毒DNA基因組序列與植物環(huán)病毒的親和性，普通病毒學(xué)雜志，1997，78221-227)。使用含有2.3kbp復(fù)制形式的禽環(huán)病毒病毒CAV之類似質(zhì)粒pCAA1作為陰性對(duì)照。使用兩個(gè)質(zhì)粒各自的甘油儲(chǔ)藏原種用于根據(jù)堿裂解技術(shù)制備和純化質(zhì)粒(SambrookJ.等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，1989)，使其可用作模板制備探針。從上述純化的質(zhì)粒以及根據(jù)供應(yīng)商說(shuō)明使用市售非放射性標(biāo)記試劑盒(DIGDNA標(biāo)記試劑盒，BoehringerMannheim，Lewes，英國(guó))從隨機(jī)六核苷酸引物制備代表PCV和CAV完整基因組的環(huán)病毒探針(每個(gè)探針1μg)。在用于原位雜交前將地高辛標(biāo)記的探針加入體積為50-100μl的無(wú)菌水中。制備包埋在石蠟中用甲醛固定的患豬組織樣本以及用甲醛固定的感染細(xì)胞培養(yǎng)物制品，用于按如下技術(shù)檢測(cè)PCV核酸從包埋于石蠟中的組織切下厚度為5μm的切片，除去石蠟，在濃度遞減的連續(xù)乙醇溶液中再水合。用甲醛固定的組織切片和細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃下于0.5％蛋白酶K之0.05MTris-HCl溶液中(含有5mMEDTA，pH7.6)分別溫育15分鐘和5分鐘。然后將載玻片置于1％甘氨酸的無(wú)菌蒸餾水溶液中30秒，用0.01MPBS緩沖液(磷酸緩沖鹽液，pH7.2)洗滌兩次，最后用無(wú)菌蒸餾水洗滌5分鐘。將其空氣干燥，與探針接觸。每一組織/探針制品加蓋潔凈無(wú)脂玻璃蓋玻片，置于90℃爐中10分鐘，然后與冰塊接觸1分鐘，最后于37℃培養(yǎng)18小時(shí)。將制品短暫浸入2X檸檬酸鈉(SSC)緩沖液(pH7.0)，以去除保護(hù)性玻璃蓋玻片，然后于2XSSC緩沖液中洗滌兩次5分鐘，最后于PBS緩沖液中洗滌兩次5分鐘。經(jīng)過(guò)洗滌后，將制品浸入0.1M馬來(lái)酸、0.15MNaCl(pH1.5)(馬來(lái)酸緩沖液)10分鐘，然后于37℃在1％封閉試劑(Cat.#1096176，BoehringerMannheim，英國(guó)，Lewis，EastSussex，英國(guó))的馬來(lái)酸緩沖液溶液中溫育20分鐘。然后，制品與稀釋于封閉緩沖液中的抗地高辛單克隆抗體1/250溶液(BoehringerMannheim)37℃下溫育1小時(shí)，于PBS中洗滌，最后與生物素?；剐∈竺庖咔虻鞍卓贵w37℃下溫育30分鐘。制品在PBS中洗滌，通過(guò)用0.5％過(guò)氧化氫的PBS溶液室溫下處理20分鐘封閉內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性。再次用PBS洗滌制品，用即配即用的3-氨基-9-二乙基咔唑(AEC)底物處理(CambridgeBioscience，Cambridge，英國(guó))。最終用自來(lái)水洗滌后，將制品用蘇木精復(fù)染，在自來(lái)水中“變藍(lán)”，用封固液(GVAMount，CambridgeBioscience，Cambridge，英國(guó))封固于顯微鏡玻璃蓋玻片上。實(shí)驗(yàn)對(duì)照包括了在獲自患病豬和非患病豬的樣本上使用非相關(guān)陰性探針(CAV)和陽(yáng)性探針(PCV)。實(shí)施例4通過(guò)免疫熒光檢測(cè)PCV的技術(shù)使用1/100稀釋的成體豬血清集合通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)(IIF)進(jìn)行丙酮固定的所有細(xì)胞培養(yǎng)物制品的初次篩選。該血清集合包含來(lái)自北愛(ài)爾蘭的25只成體豬的血清，其中已知含有針對(duì)多種豬病毒(包括PCV、豬細(xì)小病毒、豬腺病毒和PRRS病毒)的抗體。通過(guò)將稀釋于PBS中的血清37℃下接觸細(xì)胞培養(yǎng)物1小時(shí)，進(jìn)行IIF技術(shù)，然后在PBS中洗滌兩次。再用1/80稀釋的與熒光素異硫氰酸結(jié)合的兔抗豬免疫球蛋白抗體PBS溶液染色細(xì)胞培養(yǎng)物1小時(shí)，用PBS洗滌，在紫外光下顯微鏡觀察之前用甘油緩沖液封固。實(shí)施例5對(duì)患病豬組織原位雜交的結(jié)果使用由獲自法國(guó)、加拿大和加利福尼亞小豬的用甲醛固定的組織的PCV基因組探針進(jìn)行原位雜交，其中小豬患有多系統(tǒng)消瘦綜合癥，結(jié)果顯示在數(shù)個(gè)研究的損傷組織中存在與損傷相關(guān)的PCV核酸。當(dāng)對(duì)獲自非病患豬的組織使用PCV探針時(shí)或者對(duì)患病豬使用CAV探針時(shí)未觀察到信號(hào)。在浸潤(rùn)入加利福尼亞小豬肺部損傷中的大量單核細(xì)胞之胞漿和細(xì)胞核中檢出PCV核酸。在肺細(xì)胞、支氣管和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞以及在微動(dòng)脈、小囊突和淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞中也證實(shí)PCV核酸的存在。在患病法國(guó)豬中，在大量濾泡淋巴細(xì)胞和淋巴結(jié)竇狀(小管)內(nèi)單核細(xì)胞的胞漿中也存在PCV核酸。在臨時(shí)合胞體中也存在PCV核酸。根據(jù)這些檢測(cè)結(jié)果，選擇加利福尼亞豬肺、法國(guó)豬腸系膜淋巴結(jié)和加拿大豬器官用于分離新型豬環(huán)病毒株。實(shí)施例6新型豬環(huán)病毒株細(xì)胞培養(yǎng)物及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果在用獲自法國(guó)小豬(Imp.1008株)、加利福尼亞小豬(Imp.999株)和加拿大小豬(Imp.1010株)接種的細(xì)胞培養(yǎng)物中未觀察到致細(xì)胞病變效應(yīng)，這些豬顯示多系統(tǒng)消瘦的臨床癥狀。然而，獲自接種細(xì)胞培養(yǎng)物的制品的免疫標(biāo)記在用丙酮固定及用豬多克隆血清集合染色后，利用加利福尼亞小豬肺(Imp.999株)、法國(guó)小豬腸系膜淋巴結(jié)(Imp.1008株)、和加拿大小豬器官(Imp.1010株)接種的培養(yǎng)物的大量細(xì)胞中顯示核熒光。實(shí)施例7豬環(huán)病毒基因組DNA的提取利用感染的PK/15細(xì)胞培養(yǎng)物(10只75cm2Falcon)制備新型豬環(huán)病毒毒株的復(fù)制形式(見實(shí)施例1)，該細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)72-76小時(shí)后收獲，用葡糖胺處理，如CAV復(fù)制形式克隆時(shí)所述(Todd.D等人，利用克隆DNA探針斑點(diǎn)雜交檢測(cè)禽貧血病毒，臨床微生物雜志，1991，29933-939)。根據(jù)改進(jìn)的Hirt技術(shù)提取這些復(fù)制形式的雙鏈DNA(HirtB.從感染細(xì)胞培養(yǎng)物中選擇性提取多病毒DNA，分子生物學(xué)雜志，1967，36365-369)，如Molitor所述(MolitorT.W.等人，豬細(xì)小病毒DNA兩種病毒分離物的基因組及復(fù)制形式的表征，病毒學(xué)，1984，137241-254)。實(shí)施例8豬環(huán)病毒Imp.999株基因組復(fù)制形式的限制性圖譜依供應(yīng)商說(shuō)明，用S1核酸酶(Amersham)處理根據(jù)Hirt技術(shù)提取的DNA(1-5μg)，然后用多種限制酶(BoehringerMannheim，英國(guó)，Lewis，EastSussex，英國(guó))酶切此DNA，如Todd等人所述，在存在溴乙錠時(shí)于1.5％瓊脂糖凝膠上電泳分離酶切產(chǎn)物(禽貧血病毒的純化和生化表征，普通病毒學(xué)雜志，1990，71819-823)。從Imp.999株培養(yǎng)物提取的DNA具有單一EcoRI位點(diǎn)、兩個(gè)SacI位點(diǎn)，不含有任何PstI位點(diǎn)。因此，此限制性圖譜不同于PCVPK/15毒株的限制性圖譜，該毒株中含有PstI位點(diǎn)，而不含有任何EcoRI位點(diǎn)。實(shí)施例9豬環(huán)病毒Imp.999株基因組的克隆用限制性酶EcoRI酶切PCVImp.999毒株雙鏈復(fù)制形式產(chǎn)生的約1.8kbp限制性片段，使用Qiagen市售試劑盒(QIAEXII凝膠提取試劑盒，Cat#20021，QIAGENLtd.，Crawley，WestSussex，英國(guó))在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳分離酶切產(chǎn)物(見實(shí)施例3)。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)(SambrookJ.等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，1989)，將此EcoRI-EcoRI限制性片段與已經(jīng)用相同限制性酶消化并去磷酸化的載體pGEM-7(Promega，醫(yī)學(xué)供應(yīng)公司，都柏林，愛(ài)爾蘭)連接。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109宿主菌株(Stratagene，LaJolla，美國(guó))。還將PCVImp.999毒株EcoRI-EcoRI限制性片段克隆入載體pBlueScriptSK+的EcoRI位點(diǎn)(Stratagene，LaJolla，美國(guó))。在每一宿主菌株獲得的克隆中，篩選了含有期望片段大小的至少兩個(gè)克隆。然后培養(yǎng)所得克隆，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備和純化技術(shù)，以小體積(2ml)或大體積(250ml)純化含有完整Imp.999毒株基因組的質(zhì)粒。實(shí)施例10PCVImp.999毒株基因組DNA(雙鏈復(fù)制形式)的序列測(cè)定根據(jù)Sanger雙脫氧核苷酸技術(shù)使用測(cè)序試劑盒“AmpliTaqDNA聚合酶FS”(Cat#402070PEAppliedBiosystems，Warrington，英國(guó))以及依制造商說(shuō)明用AppliedBiosystemsABI373A自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)定兩個(gè)EcoRIImp.999克隆(克隆pGEM-7/2和克隆pGEM-7/8)的核苷酸序列。用M13“正向”和“反向”通用引物進(jìn)行初步測(cè)序反應(yīng)。根據(jù)“DNA步行”技術(shù)進(jìn)行如下測(cè)序反應(yīng)。由LifeTechnologies(InchinnanBusinessPark，Paisley，英國(guó))合成下列序列測(cè)定所需的寡核苷酸。用MacDNASIS3.2版軟件裝配產(chǎn)生的序列并分析(Cat#22020101，Appligene，Durham，英國(guó))。通過(guò)由“國(guó)家生物工程信息中心”服務(wù)器(NCBI，Bethesda，MD，美國(guó))可得的BLAST序列對(duì)比工具分析開放閱讀框架。最初從克隆pGEM-7/8獲得的完整序列(EcoRI-EcoRI片段)(SEQIDNO6)示于圖6。其任意地從EcoRI位點(diǎn)中的G之后開始，從核苷酸角度而言存在幾個(gè)不確定的地方。然后優(yōu)化序列測(cè)定，SEQIDNO3(圖3)給出了此毒株的總序列，其任意地從EcoRI位點(diǎn)開始，即G為第一個(gè)核苷酸。采用類似方法獲得其它三種根據(jù)本發(fā)明的分離物之序列(見SEQIDNO1、2和4，以及圖1、2和4)。這四個(gè)毒株的基因組大小為Imp.1011-481211767核苷酸Imp.1011-482851767核苷酸Imp.9991768核苷酸Imp.10101768核苷酸實(shí)施例11PCVImp.999毒株序列分析當(dāng)從Imp.999毒株產(chǎn)生的序列用于同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中含有的序列進(jìn)行同源性測(cè)試時(shí)，僅檢測(cè)出與PK/15株(保藏號(hào)Y09921和U49186)序列在核酸水平上有約76％的同源性(見圖5)。在氨基酸水平，與數(shù)據(jù)庫(kù)的6相序列翻譯同源性測(cè)試(在NCBI服務(wù)器上的BLAST序列對(duì)比工具)可證實(shí)與相應(yīng)于理論上的BBTV病毒之復(fù)制酶的開放閱讀框架有94％同源性，其類似于由GenBankU49186序列編碼的植物環(huán)病毒(GenBank鑒定號(hào)1841515)。其它數(shù)據(jù)庫(kù)中含有的序列與從PCVImp.999毒株產(chǎn)生的序列無(wú)明顯的同源性。收集自患有多系統(tǒng)消瘦綜合癥的加利福尼亞小豬損傷組織之培養(yǎng)的Imp.999毒株所產(chǎn)生的序列分析清楚表明，此病毒分離物是一種新型豬環(huán)病毒株。實(shí)施例12序列的比較分析與PCVPK/15株序列進(jìn)行4株新PCV毒株核苷酸序列的序列比較(圖5)。建立考慮了4株新毒株和已有PK/15毒株的同源性矩陣。結(jié)果如下1Imp.1011-481212Imp.1011-482853Imp.9994Imp.10105PK/1512345兩株法國(guó)毒株Imp.1011-48121與Imp.1011-48285的同源性超過(guò)99％(0.9977)。兩株北美毒株Imp.999與Imp.1010之間的同源性也大于99％(0.9949)。法國(guó)毒株與北美毒株之間的同源性略大于96％。所有這些毒株與PK/15的同源性在75％-76％之間。由此可推知，根據(jù)本發(fā)明的毒株代表了一種不同于由PK/15株代表的類型的新豬環(huán)病毒類型。從顯示PMWS綜合癥的豬分離的這一新類型稱為II型豬環(huán)病毒，PK/15代表I型。雖然它們事實(shí)上分離自十分不同的地理區(qū)域，屬于此II型的毒株之間顯示明顯的同源性。實(shí)施例13由新PCV毒株基因組編碼的蛋白質(zhì)的分析認(rèn)為Imp.1010分離物的核苷酸序列是與多系統(tǒng)消瘦綜合癥相關(guān)的其它環(huán)病毒毒株的代表。用BLAST序列對(duì)比工具以及MacVecter6.0軟件程序組合(牛津分子組，牛津OX44GA，英國(guó))，詳細(xì)分析此序列(Altschul等人，分子生物學(xué)雜志，1990，215403-410)。在此序列(環(huán)狀基因組)上可檢測(cè)到體積大于20個(gè)氨基酸的13個(gè)開放閱讀框架(ORF)。這13個(gè)ORF為每個(gè)ORF的起始和終止位點(diǎn)參見圖4(SEQIDNO4)的1010毒株基因組。ORF1-13的界限與999毒株相同。它們1011-48121毒株及1011-48285毒株中ORF的界限也與999毒株中相同，除了ORF3和13ORF31432-1539，有義，108nt，35aaORF13314-1377，反義705nt，234aa。13個(gè)ORF中，4個(gè)與位于克隆病毒PCVPK/15的基因組之類似ORF具有明顯同源性。分析了所有與多系統(tǒng)消瘦綜合癥有關(guān)的環(huán)病毒分離物基因組上的每個(gè)開放閱讀框架。這4個(gè)ORF如下</tables>每個(gè)ORF的起始和終止位置參見圖4(SEQIDNO4)的序列。ORF的大小(以核苷酸計(jì)＝nt)包括終止密碼子。PCVImp.1010與PCVPK-15分離株的基因組排列之間的比較鑒定了兩種病毒基因組中保守的4個(gè)ORF。下表為觀察到的同源性程度</tables>在ORF4Imp.1010與ORF1PK-15之間觀察到最大序列相同性(86％同源性)。由于此蛋白質(zhì)可能參與了病毒DNA復(fù)制，且為病毒復(fù)制的關(guān)鍵，預(yù)計(jì)有這樣的同源性(Meehan等人，普通病毒學(xué)雜志，1997，78221-227；Mankertz等人，普通病毒學(xué)雜志，1998，79381-384)。在ORF13Imp.1010與ORF2PK-15之間序列相同性不甚強(qiáng)(66.4％同源性)，但這兩個(gè)ORF各自的確存在高度保守的N-末端基本區(qū)域，其與CAV禽環(huán)病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)之N-末端區(qū)域相同(Meehan等人，病毒學(xué)文獻(xiàn)，1992，124301-319)。此外，在ORF7Imp.1010與ORF3PK-15之間以及ORF10Imp.1010與ORF4PK-15之間觀察到許多差異。每個(gè)情況中，當(dāng)與PCVPK-15的ORF3及ORF4比較時(shí)，Imp.1010分離株的ORF7和ORF10的C-末端存在缺失。在ORF7/ORF3以及ORF10/ORF4的N-末端區(qū)域水平上觀察到最大序列同源性，分別為61.5％同源性(在重疊水平)和83％同源性(在重疊水平)。由于豬環(huán)病毒基因組特別緊密，其基因組排列似乎相當(dāng)復(fù)雜。主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)可能由位于豬環(huán)病毒基因組相同鏈上的數(shù)個(gè)閱讀框架剪接產(chǎn)生。因此，上表中的任一開放閱讀框架(ORF1-ORF13)可代表所有或部分由II型豬環(huán)病毒編碼的抗原性蛋白質(zhì)，因此可能是一種可用于特異性診斷和/或用于免疫接種的抗原。因此，本發(fā)明涉及任一包含至少一種上述ORF的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種基本上由ORF4、ORF7、ORF10或ORF13組成的蛋白質(zhì)。實(shí)施例14由新毒株克隆的PCV基因組的傳染特性根據(jù)由Meehan等人所述的技術(shù)，將含有Imp.999分離株的完整基因組(復(fù)制形式)的質(zhì)粒pGEM-7/8轉(zhuǎn)染入PK/15細(xì)胞(用禽貧血病毒感染的細(xì)胞之病毒DNA的表征克隆的復(fù)制形式的序列分析及克隆的基因組片段的轉(zhuǎn)染能力，病毒學(xué)文獻(xiàn)，1992，124301-309)。對(duì)非污染的PK/15細(xì)胞上轉(zhuǎn)染后的第一次傳代細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光分析(見實(shí)施例4)，顯示克隆pGEM7/8的質(zhì)粒能誘導(dǎo)傳染性PCV病毒的產(chǎn)生。含有傳染性PCV遺傳物質(zhì)的克隆的獲得，允許為制備經(jīng)修飾的PCV病毒(在豬中減毒的或缺陷型的)對(duì)病毒基因組進(jìn)行任何有用的操作，其中經(jīng)修飾的PCV病毒可用于制備減毒或重組疫苗，或用于制備用作診斷試劑盒的抗原。實(shí)施例15體外培養(yǎng)制備PCV抗原根據(jù)如實(shí)施例1的相同方法進(jìn)行非污染PK/15細(xì)胞的培養(yǎng)和病毒操作。在37℃培養(yǎng)4天后經(jīng)胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)后，收集感染細(xì)胞。以每ml中400,000個(gè)感染的細(xì)胞接種下一代細(xì)胞。實(shí)施例16病毒抗原的滅活病毒培養(yǎng)結(jié)束后，收集感染的細(xì)胞，用超聲波(BransonSonifier)或借助轉(zhuǎn)子-定子型膠體磨(UltraTurrax，IKA)裂解細(xì)胞。懸浮液在3700g下離心30分鐘。用0.1％乙撐亞胺于37℃下滅活病毒懸液18小時(shí)，或用0.5％β-丙醇酸內(nèi)酯于28℃滅活24小時(shí)。如果在滅活前病毒滴度不足，利用300kDa截流分子量的膜通過(guò)超濾濃縮病毒懸浮液(MilliporePTMK300)。滅活的病毒懸浮液儲(chǔ)存于5℃。實(shí)施例17以基于礦物油的乳液形式制備疫苗根據(jù)如下配方制備疫苗滅活豬環(huán)病毒懸浮液250mlMontanideISA70(SEPPIC)750ml分開單獨(dú)對(duì)水相和油相過(guò)濾除菌。通過(guò)借助Silverson渦輪乳化機(jī)混合和勻漿化組分制備乳液。一只疫苗劑量含有約107.5TCID50。對(duì)皮內(nèi)施用，一只疫苗劑量體積為0.5ml，對(duì)肌內(nèi)途徑給藥為2ml。實(shí)施例18可代謝性油基乳液形式的疫苗制備根據(jù)下列配方制備疫苗滅活豬環(huán)病毒懸浮液200mlDehymulsHRE7(Henkel)60mlRadia7204(Oleofina)740ml分開單獨(dú)對(duì)水相和油相過(guò)濾除菌。借助Silverson渦輪乳化機(jī)混合和勻漿化組分制備乳液。一只疫苗劑量含有約107.5TCID50。對(duì)于肌內(nèi)途徑給藥，一只疫苗劑量體積為2ml。實(shí)施例19與美國(guó)和法國(guó)PCV病毒株有關(guān)及與污染有超免疫血清(PCV-T)的PK/15的間接免疫熒光結(jié)果，以及從PK/15制備的單克隆抗體F99表和從加拿大株(PCV-C)制備的超免疫血清*在間接免疫熒光中產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的血清或單克隆抗體的最終稀釋度之倒數(shù)。權(quán)利要求1.II型豬環(huán)病毒的純化制品。2.豬環(huán)病毒的純化制品，其選自保藏于ECACC保藏號(hào)為V97100219、V97100218、V97100217、V98011608、V98011609的制品。3.由細(xì)胞產(chǎn)生且從細(xì)胞培養(yǎng)物中體外分離的豬環(huán)病毒制品，其中所述細(xì)胞已用一種豬環(huán)病毒感染，該病毒能從患有PMWS綜合癥的豬的生理學(xué)樣本或組織樣本，特別是損傷組織中分離出。4.根據(jù)權(quán)利要求3的豬環(huán)病毒制品，其從豬腎細(xì)胞系中產(chǎn)生并分離。5.根據(jù)權(quán)利要求4的豬環(huán)病毒制品，其從未經(jīng)PCV污染的PK/15細(xì)胞中產(chǎn)生并分離。6.一種培養(yǎng)物提取物或上清液，其收集自用根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)病毒感染的細(xì)胞之體外細(xì)胞培養(yǎng)物。7.一種抗原性制品，其收集自用根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)病毒感染的細(xì)胞之體外細(xì)胞培養(yǎng)物。8.一種疫苗，其包含根據(jù)權(quán)利要求7的抗原性制品，或根據(jù)權(quán)利要求6的培養(yǎng)物上清液或提取物，包含豬環(huán)病毒作為抗原。9.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗，其特征在于疫苗包括在獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑中的減毒活完整抗原，以及任選地獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑和任選地冷凍干燥穩(wěn)定劑。10.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗，其特征在于抗原為滅活的，且疫苗還包含獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑，以及任選地獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑。11.一種DNA片段，其含有選自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4和SEQIDNO6的序列。12.一種DNA片段，其含有選自O(shè)RF1-13的ORF。13.根據(jù)權(quán)利要求12的DNA片段，其特征在于含有選自O(shè)RF4、ORF7、ORF10和ORF13的ORF。14.一種多肽，其由根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的DNA片段編碼。15.一種體外表達(dá)載體，包括整合入其基因組中的根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的DNA序列或片段，以使其可在體外表達(dá)。16.根據(jù)權(quán)利要求15的表達(dá)載體，其特征在于其選自大腸桿菌和桿狀病毒。17.一種由根據(jù)權(quán)利要求15或16的表達(dá)載體產(chǎn)生的，任選地經(jīng)純化的多肽。18.一種亞單位疫苗，包括在獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑中的至少一種根據(jù)權(quán)利要求14或17的多肽，以及任選地獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑。19.一種體內(nèi)表達(dá)載體，包括整合入其基因組中的根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的DNA片段，以使其可在體內(nèi)表達(dá)。20.根據(jù)權(quán)利要求19的表達(dá)載體，其特征在于其選自能在豬中復(fù)制而不會(huì)使該動(dòng)物致病的活病毒和質(zhì)粒。21.根據(jù)權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其特征在于病毒載體選自豬皰疹病毒，如假狂犬病病毒；豬腺病毒；痘病毒屬，特別是牛痘病毒，禽痘病毒，犬痘病毒和豬痘病毒。22.一種活體或質(zhì)粒疫苗，其特征在于其包括在獸醫(yī)學(xué)可接受的載體或稀釋劑中的一種根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)的表達(dá)載體。23.根據(jù)權(quán)利要求8-10、18和22中任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于其包含如權(quán)利要求1-4中定義的數(shù)種豬環(huán)病毒抗原。24.根據(jù)權(quán)利要求8-10、18、22和23中任一項(xiàng)的疫苗，其特征在于還包含至少一種相應(yīng)于另一種豬病原體的其它效價(jià)。25.根據(jù)權(quán)利要求24的疫苗，其特征在于包含至少一種下列的其它效價(jià)PRRS、豬肺炎支原體、大葉性肺炎放線桿菌、大腸桿菌、萎縮性鼻炎、偽狂犬病、豬霍亂和豬流感。26.根據(jù)權(quán)利要求24的疫苗，其特征在于包含至少一種選自PRRS和豬肺炎支原體的其它效價(jià)。27.一種探針或引物，其包含全部或部分根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的序列。28.一種從根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的環(huán)病毒、根據(jù)權(quán)利要求14或17的多肽或其片段制備的多克隆或單克隆抗體。29.一種檢測(cè)豬環(huán)病毒的方法，其中，在待測(cè)豬生理學(xué)液體或組織樣本中進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)試圖檢測(cè)抗原本身或針對(duì)抗原的抗體進(jìn)行抗原存在與否的測(cè)試。全文摘要本發(fā)明涉及一種從肺或神經(jīng)節(jié)樣本中分離的新型豬環(huán)病毒株,所述樣本獲自患有斷乳后多系統(tǒng)性消瘦綜合癥(PMWS)的牲畜。本發(fā)明涉及這些毒株的純化制品、減毒疫苗或滅活疫苗、重組活體疫苗、質(zhì)粒疫苗和亞單位疫苗,以及診斷試劑和診斷方法。本發(fā)明還涉及可用于在體外表達(dá)載體中制備亞單位疫苗的DNA片段,或者整合入病毒或質(zhì)粒型體內(nèi)表達(dá)載體中的序列。文檔編號(hào)C12N15/34GK1278301SQ9881065公開日2000年12月27日申請(qǐng)日期1998年10月1日優(yōu)先權(quán)日1997年10月3日發(fā)明者G·阿蘭,B·密罕,E·克拉克,J·埃利斯,D·海尼斯,L·哈薩德,J·哈丁,C·E·薩勒雷,G·E·薩普斯,F·麥克內(nèi)雷申請(qǐng)人:梅瑞爾公司,貝爾法斯特皇后大學(xué),薩斯喀徹溫大學(xué)