專利名稱：具有5－氨基酮戊酸合酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸的制作方法
背景技術(shù)：
脫輔基蛋白質(zhì)向血紅素蛋白的轉(zhuǎn)化取決于血紅素生物合成途徑提供的血紅素的可用性。血紅素蛋白的脫輔基蛋白質(zhì)形式與血紅素結(jié)合產(chǎn)生活性血紅素蛋白?；钚匝t素蛋白具有一種使血紅素蛋白對蛋白水解攻擊比脫輔基蛋白質(zhì)更穩(wěn)定的構(gòu)象。如果微生物產(chǎn)生的血紅素的量比產(chǎn)生的脫輔基蛋白質(zhì)的量更少，則該脫輔基蛋白質(zhì)積累，并遭受蛋白水解降解，從而降低活性血紅素蛋白的產(chǎn)量。
為了解決這一問題，Jensen顯示了向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入血紅素或含有血紅素的物質(zhì)可導(dǎo)致米曲霉(Aspergillus oryzae)產(chǎn)生的過氧化物酶產(chǎn)量的顯著增加(WO93／19195)。盡管發(fā)酵培養(yǎng)基中血紅素的添加導(dǎo)致血紅素蛋白產(chǎn)量的顯著增加，但這是不合適的、昂貴的，并且難以大規(guī)模實施。
細(xì)胞血紅素生物合成途徑中基因的超量表達(dá)提供了一種解決該問題的備擇方法。
已經(jīng)公開了構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)5-氨基酮戊酸合酶基因的克隆和測序(Bradshaw等人，1993，現(xiàn)代遺傳學(xué)(CurrentGenetics)2233501-507)。
本發(fā)明的一個目的在于提供具有5-氨基酮戊酸合酶活性的新多肽，及編碼該多肽的基因。
本發(fā)明也涉及編碼該多肽的分離的核酸序列，并涉及包含該核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及產(chǎn)生和應(yīng)用該多肽的方法。
圖2顯示pJRoy43的限制性酶切圖。
圖3顯示pJRoy44的限制性酶切圖。
圖4顯示pJRoy47的限制性酶切圖。
圖5顯示pAHemA的限制性酶切圖。
圖6顯示pJRoy54的限制性酶切圖。
圖7顯示pJRoy54HemA的限制性酶切圖。
發(fā)明詳述具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽術(shù)語“5-氨基酮戊酸合酶活性”在此定義為催化甘氨酸和琥珀酰CoA縮合形成5-氨基酮戊酸的合酶活性。對于本發(fā)明，按照Paveto等人，1989，綜合生物化學(xué)與生理學(xué)(Comp．Biochem．Physiol．)94B635-639改進(jìn)的、Wider de Xifra等人，1971，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochimica Biophysica Acta)235511-517所述的方法，測定5-氨基酮戊酸合酶活性，其中在pH7．5、25℃下測定甘氨酸和琥珀酰CoA向5-氨基酮戊酸的轉(zhuǎn)化。
在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有5-氨基酮戊酸合酶活性的分離的多肽，其具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列有一定程度同一性的氨基酸序列，至少約80％，優(yōu)選地至少約85％，更優(yōu)選地至少約90％，甚至更優(yōu)選地至少約95％，甚至最優(yōu)選地至少約97％(以下稱“同源多肽”)。在一個優(yōu)選實施方案中，同源多肽具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列相差5個氨基酸、優(yōu)選地4個氨基酸、更優(yōu)選地3個氨基酸、甚至更優(yōu)選地2個氨基酸、最優(yōu)選地1個氨基酸的氨基酸序列。對于本發(fā)明而言，通過Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，利用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc．，Madison，WI)，應(yīng)用同一性表和下列多重對比參數(shù)罰區(qū)間為10、罰長度為10，測定兩種氨基酸序列間同一性的程度。配對對比參數(shù)是Ktuple=1、罰區(qū)間=3、窗口=5、對角線=5。
優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位變體；或其片段，其中該片段具有5-氨基酮戊酸合酶活性。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位變體；或其片段，其中該片段具有5-氨基酮戊酸合酶活性。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成。
SEQ ID NO2的片段是從該氨基酸序列的氨基端和／或羧基端刪除一個或多個氨基酸的一種多肽。優(yōu)選地，一種片段含有至少460個氨基酸殘基、更優(yōu)選地至少500個氨基酸殘基、最優(yōu)選地至少540個氨基酸殘基。
等位變體表示占據(jù)相同染色體位點的一種基因的任何兩種或多種備擇形式。等位變異通過突變自然發(fā)生，可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(編碼的多肽中無變化)，或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體所編碼的多肽。
由于一個或多個氨基酸殘基的插入或缺失和／或一個或多個氨基酸殘基被不同氨基酸殘基的置換，同源多肽的氨基酸序列可能不同于SEQID NO2的氨基酸序列。優(yōu)選地，氨基酸變化只有微小性質(zhì)的變化，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和／或活性的保守性氨基酸置換；一般為1到約30個氨基酸的小量缺失；小量氨基端或羧基端延伸，如一個氨基端甲硫氨酸殘基；可達(dá)約20-25個殘基的小接頭肽；或者通過改變凈電荷或另一種功能如聚組氨酸序列段、抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域以便于純化的小量延伸。
保守性置換的實例在下列范圍之內(nèi)堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。一般不改變特定活性的氨基酸置換為本領(lǐng)域所知，描述于例如，H．Neurath和R．L．Hill，1979，《蛋白質(zhì)》(The Proteins)，Academic Press，紐約。最常發(fā)生的交換是Ala／Ser、Val／Ile、Asp／Glu、Thr／Ser、Ala／Gly、Ala／Thr、Ser／Asn、Ala／Val、Ser／Gly、Tyr／Phe、Ala／Pro、Lys／Arg、Asp／Asn、Leu／Ile、Leu／Val、Ala／Glu和Asp／Gly，以及相反的交換。
在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及具有5-氨基酮戊酸合酶活性的分離的多肽，其由在低度嚴(yán)格條件下、更優(yōu)選地在中度嚴(yán)格條件下、甚至更優(yōu)選地在高度嚴(yán)格條件下、最優(yōu)選地在極高度嚴(yán)格條件下可與一種核酸探針雜交的核酸序列所編碼，該核酸探針在相同條件下可與SEQ ID NO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交；或者編碼具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽片段的亞序列(J．Sambrook，E．F．Fritsch和T．Maniatus，1989，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)第2版，冷泉港，紐約)。SEQ ID NO1的亞序列可能是至少100個核苷酸或者優(yōu)選地至少200個核苷酸。此外，該亞序列可以編碼一種具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽片段。該多肽也可以是該多肽的等位變體或片段，其中該片段具有5-氨基酮戊酸合酶活性。
SEQ ID NO1的核酸序列或其亞序列，以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段，可用來按照本領(lǐng)域眾所周知的方法設(shè)計一種核酸探針，用以從不同屬或種的菌株中鑒定并克隆編碼具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽的DNA。特別地，按照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，這些探針能用于與目標(biāo)屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定并分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可能明顯短于完整的序列，但長度至少應(yīng)為15個、優(yōu)選地至少25個、更優(yōu)選地至少35個核苷酸。也可使用更長的探針。DNA和RNA兩種探針都能使用。為了檢測相應(yīng)的基因，探針一般被標(biāo)記(例如，用32p、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白標(biāo)記)。本發(fā)明涵蓋了這些探針。
因此，可篩查由這些其它生物制備的基因組DNA或cDNA文庫，篩選可與上述探針雜交并且編碼具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽的DNA?？赏ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳(或其它分離技術(shù))分離這些其它生物的基因組DNA或其它DNA?？蓪碓从谠撐膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移并固定于硝酸纖維素膜或其它合適的載體材料上。為了鑒定一個克隆或與SEQ ID NO1同源的DNA，在Southern印跡中使用載體材料。對于本發(fā)明而言，雜交表明，在低度到極高度嚴(yán)格條件下，該核酸序列可與對應(yīng)于SEQ ID NO1所示核酸序列、其互補(bǔ)鏈或其亞序列的核酸探針雜交。用X光膠片檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。
在一個優(yōu)選實施方案中，核酸探針是編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸序列或其亞序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，核酸探針是SEQ IDNO1。在另一個優(yōu)選實施方案中，核酸探針是大腸桿菌(Escherichiacoli)NRRL B-21855中所含質(zhì)粒pZL3-3中包含的核酸序列，其中該核酸序列編碼SEQ ID NO2的多肽。
對于長度至少為100個核苷酸的長探針，低度到極高度嚴(yán)格條件分別被定義為按照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，在5×SSPE、0．3％SDS、200μg／ml剪切并變性的鮭精DNA和對于低度、中度、高度和極高度嚴(yán)格性分別為25％、35％或50％的甲酰胺中，42℃預(yù)雜交和雜交。對于長度至少為100個核苷酸的長探針，最后用2×SSC、0．2％SDS將該載體物質(zhì)洗滌3次，每次15分鐘，洗滌溫度優(yōu)選地至少45℃(極低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選地至少50℃(低嚴(yán)格性)，更優(yōu)選地至少55℃(中嚴(yán)格性)，更優(yōu)選地至少60℃(中-高度嚴(yán)格性)，甚至更優(yōu)選地至少65℃(高嚴(yán)格性)，最優(yōu)選地至少70℃(極高嚴(yán)格性)。
對于長度為大約15個核苷酸到約70個核苷酸的短探針，嚴(yán)格條件被定義為按照標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，在比根據(jù)按照Bolton和McCarthy(1962，美國國家科學(xué)院院報(Proceedings of NationalAcademy of Sciences USA)481390)計算的Tm低5℃-10℃的溫度下，在每ml含0．9M NaCl、0．09M Tris-HCl pH7．6、6mM EDTA、0．5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉、0．1mMATP和0．2mg酵母RNA中預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌。
對于長度為大約15個核苷酸到約70個核苷酸的短探針，在比計算的Tm低5℃-10℃的溫度下，將載體物質(zhì)在6×SSC加0．1％SDS中洗一次15分鐘，并用6×SSC洗兩次，每次15分鐘。
在第三個實施方案中，本發(fā)明涉及與具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽有免疫化學(xué)同一性或部分免疫化學(xué)同一性的分離的多肽。通過眾所周知的Ouchterlony雙向免疫擴(kuò)散法經(jīng)免疫交叉反應(yīng)同一性試驗測定免疫化學(xué)性質(zhì)。特別地，按照Harboe和Ingild在N．H．Axelsen，J．Kroll和B．Weeks所編的《定量免疫電泳手冊》(AManual of Quantitative Immunoelectrophoresis)，Blackwell ScientificPublications，1973，第23章或者Johnstone和Thorpe，《實踐免疫化學(xué)》(Immunochemistry in Practice)，Blackwell ScientificPublications，1982(特別是第27-31頁)中所述的方法，通過免疫兔(或其它嚙齒類動物)制備一種抗血清，其所含的多克隆抗體是免疫活性的或者可與具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的表位相結(jié)合。具有免疫化學(xué)同一性的多肽是一種用特定免疫化學(xué)技術(shù)以相同方式如沉淀物的總?cè)诤?、相同的沉淀物形態(tài)學(xué)和／或相同的電泳遷移率與該抗血清反應(yīng)的多肽。Axelsen，Bock和Kroll在N．H．Axelsen，J．Kroll和B．Weeks所編的《定量免疫電泳手冊》，Blackwell ScientificPublications，1973，第10章中描述了對免疫化學(xué)同一性的進(jìn)一步解釋。具有部分免疫化學(xué)同一性的多肽是一種用特定免疫化學(xué)技術(shù)以部分相同的方式如沉淀物的部分融合、部分相同的沉淀物形態(tài)學(xué)和／或部分相同的電泳遷移率與抗血清反應(yīng)的多肽。Bock和Axelsen在N．H．Axelsen，J．Kroll和B．Weeks所編的《定量免疫電泳手冊》，Blackwell Scientific Publications，1973，第11章中描述了對部分免疫化學(xué)同一性的進(jìn)一步解釋。
抗體也可以是單克隆抗體。例如，可以按照E．Harlow和D．Lane于1988年編寫的《抗體實驗室手冊》(Antibodies，A LaboratoryManual)，冷泉港出版社，冷泉港，紐約的方法制備和使用單克隆抗體。
本發(fā)明的多肽具有至少20％、優(yōu)選地至少40％、更優(yōu)選地至少60％、甚至更優(yōu)選地至少80％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少100％的SEQ ID NO2的5-氨基酮戊酸合酶活性。
本發(fā)明的多肽可以從任何屬的微生物中獲得。
本發(fā)明的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，多肽可以是革蘭氏陽性菌多肽，如芽孢桿菌屬的種(Bacillus)的多肽，例如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽；或鏈霉菌屬的種(Streptomyces)的多肽，例如淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus)多肽；或是革蘭氏陰性菌多肽，例如大腸桿菌或假單胞菌(Pseudomonas)屬的種的多肽。
本發(fā)明的多肽可以是真菌多肽，更優(yōu)選地是酵母多肽，如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyvcromyccs)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia多肽；或者更優(yōu)選地是絲狀真菌多肽，如枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Magnaporthe、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix、脈孢霉屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌屬(Schizophyllum)、籃霉屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium或木霉屬(Trichoderma)多肽。
在一個優(yōu)選實施方案中，該多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis多肽。
在另一個優(yōu)選實施方案中，該多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉、Humicola insolens、柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉(Trichoderma viride)多肽。
在另一個優(yōu)選實施方案中，該多肽是桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarim crookwellense、黃色鐮孢(Fusarium culmorum)、禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、網(wǎng)狀鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusariumsulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum多肽。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)usarium venenatum細(xì)胞是Fusarium venenatum A3／5，其最初被保藏為禾谷鐮孢ATCC 20334，最近被Yoder和Christianson，1998，真菌遺傳學(xué)與生物學(xué)(FungalGenetics and Biology)2362-80和O’Donnell等人，1998，真菌遺傳學(xué)與生物學(xué)2357-67重新分類為Fusarium venenatum；以及Fusarium venenatum的分類學(xué)等同物，不管當(dāng)前的種名如何。在另一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)usarium venenatum細(xì)胞是如WO97／26330所公開的Fusarium venenatum A3／5或Fusarium venenatum ATCC20334的形態(tài)突變種。
應(yīng)當(dāng)理解，對于上述種，本發(fā)明包括完全的和不完全的兩種狀態(tài)，以及其它的分類學(xué)等同物，例如無性型，不管其種名如何。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可輕易地識別出適當(dāng)?shù)韧锏耐恍浴＠?，D．L．Hawksworth，P．M．Kirk，B．C．Sutton和D．N．Pegler(編者)，1995，于《Ainsworth和Bisby真菌詞典》(Ainsworth and Bisby’s Dictionaryof the Fungi)，第8版，CAB International，University Press，劍橋，英國第173-174頁闡述了鐮孢的分類學(xué)等同物。
這些種的菌株可在許多培養(yǎng)物保藏中心方便地為公眾所獲得，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)。
此外，可以使用上述探針從其它來源包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分離的微生物中鑒定并獲得這些多肽。從自然環(huán)境分離微生物的技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知。然后類似地通過篩查另一種微生物的基因組文庫或cDNA文庫可得到核酸序列。一旦用探針檢測到編碼該多肽的核酸序列，可利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的技術(shù)分離或克隆該序列(見，例如，Sambrook等人，1989，同上)。
此處所定義的“分離的”多肽是基本上不含其它非5-氨基酮戊酸合酶多肽的多肽，例如，經(jīng)SDS-PAGE測定，純度至少約20％、優(yōu)選地至少約40％、更優(yōu)選地約60％、甚至更優(yōu)選地約80％、最優(yōu)選地約90％、甚至最優(yōu)選地約95％。
本發(fā)明的核酸序列所編碼的多肽也包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一種多肽在該多肽或其片段的N端或C端處融合。融合多肽的產(chǎn)生方法是將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域中公知，包括連接編碼該多肽的編碼序列，使得它們符合讀框，并且融合多肽的表達(dá)受相同啟動子和終止子的控制。核酸序列本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列。在一個優(yōu)選實施方案中，該核酸序列如SEQ ID NO1所示。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該核酸序列是大腸桿菌NRRL B-21855所含質(zhì)粒pZL3-3中包含的序列。本發(fā)明也包括編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核酸序列，它由于遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO1不同。本發(fā)明也涉及SEQ ID NO1的亞序列，其編碼具有5-氨基酮戊酸合酶活性的SEQ ID NO2的片段。
除了自5’端和／或3’端缺失一個或多個核苷酸外，SEQ ID NO1的亞序列是SEQ ID NO1所含的核酸序列。優(yōu)選地，一種亞序列含有至少1380個核苷酸、更優(yōu)選地至少1500個核苷酸、最優(yōu)選地至少1620個核苷酸。
本發(fā)明也涉及在SEQ ID NO1的核酸序列中至少含有一個突變的突變核酸序列，其中該突變核酸序列編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
用來分離或克隆編碼一種多肽的核酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所周知，包括從基因組DNA中的分離、從cDNA的制備或其組合。例如，使用眾所周知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或為了檢測具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段對表達(dá)文庫的抗體篩查，能實現(xiàn)從這種基因組DNA中克隆本發(fā)明的核酸序列。見，例如，Innis等人，1990，《PCR方法與應(yīng)用指南》(PCRA Guide to Methods and Application)，Academic Press，紐約。也可使用其它核酸擴(kuò)增方法如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、連接的活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。核酸序列可從鐮孢屬菌株或另一種或相關(guān)生物中克隆，因此，例如，可能是該核酸序列多肽編碼區(qū)的等位變體或種屬變體。
此處使用的術(shù)語“分離的核酸序列”是指基本上不含其它核酸序列的核酸序列，例如，經(jīng)瓊脂糖電泳測定，純度至少約20％、優(yōu)選地至少約40％、更優(yōu)選地至少約60％、甚至更優(yōu)選地至少約80％、最優(yōu)選地至少約90％。例如，可通過基因工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得分離的核酸序列，該方法將核酸序列從其天然位置再定位到將再產(chǎn)生該序列的不同位點?？寺》椒砂ê芯幋a該多肽的核酸序列的目標(biāo)核酸片段的切割和分離、該片段向載體分子中的插入、以及該重組載體向宿主細(xì)胞中的摻入，在宿主細(xì)胞中該核酸序列的多拷貝或克隆將得到復(fù)制。該核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成的來源或其任一組合。
本發(fā)明也涉及編碼一種活性多肽的核酸序列，其與SEQ ID NOl的核酸序列有一定程度的同源性，同源性至少約為80％、優(yōu)選地約85％、更優(yōu)選地約90％、甚至更優(yōu)選地約95％、最優(yōu)選地約97％。對于本發(fā)明而言，通過Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美國國家科學(xué)院院報80726-730)，利用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc．，Madison，WI)，應(yīng)用同一性表和下列多重對比參數(shù)Ktuple=3、罰區(qū)間=3、窗口=20，測定兩種核酸序列間同一性的程度。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的修飾，可能是合成基本上類似于該多肽的多肽所必需的。術(shù)語“基本上類似于”該多肽是指該多肽的非天然存在的形式。這些多肽也許以某些基因工程方式與自其天然來源分離的多肽不同。例如，利用如定點誘變法合成在比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面有所不同的多肽變體可能是有意義的。根據(jù)作為SEQ IDNO1的多肽編碼部分例如其亞序列存在的核酸序列，和／或通過核苷酸置換的引入，可構(gòu)建類似的序列，該核苷酸置換的引入不會產(chǎn)生核酸序列所編碼的多肽的另一種氨基酸序列，但對應(yīng)于準(zhǔn)備用于產(chǎn)生酶的宿主生物的密碼子選擇偏好，或者該核苷酸置換的引入可能產(chǎn)生一種不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸置換的一般性描述，見，例如，F(xiàn)ord等人，1991，《蛋白質(zhì)表達(dá)與純化》(Protein Expression andPurification)295-107。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，這種置換能在分子功能的關(guān)鍵區(qū)之外進(jìn)行，而仍產(chǎn)生活性多肽?？砂凑毡绢I(lǐng)域公知的方法如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(見，例如，Cunningham和Wells，1989，科學(xué)(Science)2441081-1085)鑒定對于本發(fā)明的分離核酸序列所編碼的多肽的活性是必需的氨基酸殘基，因此，這些氨基酸殘基優(yōu)選地未遭置換。在后一種方法中，在分子中每一帶正電的殘基處均引入突變，測定得到的突變分子的5-氨基酮戊酸合酶活性，以鑒定對于分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點也能通過三維結(jié)構(gòu)分析來確定，三維結(jié)構(gòu)的測定技術(shù)如核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記(見，例如，de Vos等人，1992，科學(xué)255306-312；Smith等人，1992，分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBS Letters 30959-64)。
本發(fā)明也涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列，其在低度嚴(yán)格條件下、更優(yōu)選地中度嚴(yán)格條件下、甚至更優(yōu)選地高度嚴(yán)格條件下、最優(yōu)選地極高嚴(yán)格條件下可與一種核酸探針雜交，該核酸探針在相同條件下可與如此處所述的SEQ ID NO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈、或其等位變體及其亞序列雜交(Sambrook等人，1989，同上)。
本發(fā)明也涉及如下產(chǎn)生的分離的核酸序列(a)在低、中、高度或極高嚴(yán)格條件下，將一種DNA與SEQ ID NO1的序列或其互補(bǔ)鏈、或其編碼具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽片段的亞序列雜交；和(b)分離該核酸序列。產(chǎn)生突變核酸序列的方法本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生突變核酸序列的方法，包括向SEQ ID NO1的核酸序列或其亞序列中引入至少一個突變，其中該突變核酸序列編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段的多肽，該多肽具有5-氨基酮戊酸合酶活性。
向核酸序列中引入突變而使一種核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N核苷酸可以用本領(lǐng)域公知的任一方法通過定點誘變來完成。特別有用的是利用含有目的插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和兩個包含目標(biāo)突變的合成引物的方法。每一條與載體相對鏈互補(bǔ)的核苷酸引物，在利用Pfu DNA聚合酶的溫度循環(huán)中延伸。引物摻入后，即產(chǎn)生含有交錯切口的突變質(zhì)粒。溫度循環(huán)后，用對甲基化及半甲基化的DNA特異的DpnI處理產(chǎn)物，消化親代DNA模板，并篩選出含有突變的合成DNA。也可使用本領(lǐng)域所知的其它方法。核酸構(gòu)建體本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核酸序列的核酸構(gòu)建體，該核酸序列與一種或多種在與控制序列相適宜的條件下引導(dǎo)編碼序列在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)的控制序列有效連接。應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)包括參與多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
在此將“核酸構(gòu)建體”定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或經(jīng)修飾含有以自然界中不會存在的方式組合及并列的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體中含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的所有控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語表達(dá)盒同義。術(shù)語“編碼序列”在此定義為直接針對其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的部分核酸序列。編碼序列的邊界一般取決于核糖體結(jié)合位點(原核生物)或ATG起始密碼子(真核生物)和轉(zhuǎn)錄終止序列，ATG起始密碼子恰好位于mRNA 5’端開放閱讀框的上游，轉(zhuǎn)錄終止序列恰好位于mRNA 3’端開放閱讀框的下游。編碼序列可包括但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
可以以多種方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列，以準(zhǔn)備該多肽的表達(dá)。在插入到載體之前對核酸序列的操作可能是希望的或必需的，這取決于表達(dá)載體。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知。
在此將術(shù)語“控制序列”定義為包括為本發(fā)明多肽的表達(dá)所必需的或有利的所有組分。每種控制序列對于編碼多肽的核酸序列而言可以是自身的或外源的。這類控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號?？刂菩蛄锌删哂薪宇^，旨在引入特定的限制酶切位點，以便于控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)相連接。術(shù)語“有效連接”在此定義為一種構(gòu)型，其中一種控制序列被適當(dāng)?shù)刂糜谂cDNA序列編碼序列相關(guān)的位置，使得該控制序列引導(dǎo)多肽的產(chǎn)生。
控制序列可以是一種適當(dāng)?shù)膯幼有蛄校礊榱撕怂嵝蛄械谋磉_(dá)而由宿主細(xì)胞識別的一種核酸序列。啟動子序列中含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變型、截短型和雜合型啟動子，并可從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。
尤其在細(xì)菌宿主細(xì)胞中，引導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的實例是從下列基因中獲得的啟動子大腸桿菌lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xyl A和xyl B基因、原核生物的β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美國國家科學(xué)院院報753727-3731)以及tac啟動子(DeBoer等人，1983，美國國家科學(xué)院院報8021-25)。在《科學(xué)美國人》(Scientific American)，1980，24274-94中的“來源于重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”；和Sambrook等人，1989，同上中描述了更多的啟動子。
在絲狀真菌宿主細(xì)胞中引導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的實例是從編碼下列酶的基因中獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gla A)、米黑根毛霉脂酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96／00787)、NA2-tpi(一種雜合型啟動子，來源于編碼黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因)，及其突變型、截短型和雜合型啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子可獲自釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、釀酒酵母乙醇脫氫酶／甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2／GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8423-488描述了對酵母宿主細(xì)胞有用的其它啟動子。
控制序列也可以是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止序列，即由宿主細(xì)胞識別而終止轉(zhuǎn)錄的一種序列。終止序列與編碼多肽的核酸序列的3’端有效連接。在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子可從編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶的基因中獲得。
用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子可從編碼釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)或釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因中獲得。Romanos等人，1992，同上，描述了對酵母宿主細(xì)胞有用的其它終止子。
控制序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，即對于宿主細(xì)胞翻譯至關(guān)重要的mRNA的非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列的5’端有效連接。在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列可從編碼米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因中獲得。
適用于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列可從釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母乙醇脫氫酶／甘油醛-3磷酸脫氫酶基因(ADH2／GAP)中獲得。
控制序列也可以是聚腺苷酸化序列，即一種與核酸序列3’端有效連接的序列，在轉(zhuǎn)錄時它可被宿主細(xì)胞作為信號識別，向轉(zhuǎn)錄的mRNA上添加聚腺苷殘基。在所選宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列均可用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列可從編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸酯合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因中獲得。
Guo和Sherman，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)(Molecular CellularBiology)155983-5990描述了對酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列。
控制序列也可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基端相連接的氨基酸序列，該氨基酸序列能引導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。核酸序列編碼序列的5’端可固有地含有一種信號肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段在翻譯讀框內(nèi)天然連接。此外，編碼序列的5’端可含有一種對于編碼序列為外源的信號肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列不是正常地含有信號肽編碼區(qū)時，可能需要外源的信號肽編碼區(qū)。此外，外源信號肽編碼區(qū)可簡單地替換天然信號肽編碼區(qū)以獲得增強(qiáng)的多肽分泌。然而，能引導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。
對于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從芽孢桿菌NCIB 11837的產(chǎn)麥芽淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)或枯草芽孢桿菌prsA基因中獲得的信號肽編碼區(qū)。Simonen和Palva，1993，微生物學(xué)綜述(Microbiological Reviews)57109-137描述了更多的信號肽。
對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola insolens纖維素酶基因或柔毛腐質(zhì)霉脂酶基因中獲得的信號肽編碼區(qū)。
對酵母宿主細(xì)胞有用的信號肽可從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因中獲得。Romanos等人，1992，同上，描述了其它有用的信號肽編碼區(qū)。
控制序列也可以是前肽編碼區(qū)，其編碼一種位于多肽氨基端的氨基酸序列。得到的多肽被稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或者有時稱為酶原(zymogen))。多肽原通常無活性，通過從多肽原上催化或自催化地切割前肽可轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母α-因子基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因或嗜熱毀絲霉漆酶基因(WO95／33836)中獲得。
當(dāng)信號肽和前肽區(qū)兩者都存在于多肽的氨基端時，前肽區(qū)緊接多肽的氨基端，信號肽區(qū)緊接前肽區(qū)的氨基端。
加入能夠調(diào)節(jié)與宿主細(xì)胞生長有關(guān)的多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)序列也是所希望的。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是那些應(yīng)答化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而引起基因表達(dá)被打開或關(guān)閉的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可用TAKA α-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴(kuò)增的調(diào)節(jié)序列。在真核系統(tǒng)中，包括在氨甲蝶呤存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因和有重金屬時擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列將與調(diào)節(jié)序列有效連接。
本發(fā)明也涉及用于改變編碼本發(fā)明多肽的內(nèi)源基因表達(dá)的核酸構(gòu)建體。該構(gòu)建體可含有改變內(nèi)源基因表達(dá)所需的最小量的組分。在一個實施方案中，核酸構(gòu)建體優(yōu)選地含有(a)一種導(dǎo)向序列、(b)一種調(diào)節(jié)序列、(c)一種外顯子和(d)一種剪接供體位點。一旦向細(xì)胞中引入核酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體即通過同源重組在內(nèi)源基因位點處插入細(xì)胞基因組中。導(dǎo)向序列引導(dǎo)元件(a)-(d)向內(nèi)源基因中的整合，使得元件(b)-(d)與內(nèi)源基因有效連接。在另一個實施方案中，核酸構(gòu)建體含有(a)一種導(dǎo)向序列、(b)一種調(diào)節(jié)序列、(c)一種外顯子、(d)一種剪接供體位點、(e)一種內(nèi)含子和(f)一種剪接受體位點，其中導(dǎo)向序列引導(dǎo)元件(a)-(f)的整合，使得元件(b)-(f)與內(nèi)源基因有效連接。然而，構(gòu)建體也可含有其它組分，如選擇性標(biāo)記。
在這兩種實施方案中，這些組分的引入導(dǎo)致一種新轉(zhuǎn)錄單位的產(chǎn)生，其中內(nèi)源基因的表達(dá)被改變。實質(zhì)上，這種新轉(zhuǎn)錄單位是由導(dǎo)向構(gòu)建體引入的序列與內(nèi)源基因的融合產(chǎn)物。在一個內(nèi)源基因已改變的實施方案中，該基因被激活。在該實施方案中，用同源重組來替換、破壞或使與親代細(xì)胞的內(nèi)源基因正常連接的調(diào)節(jié)區(qū)失能，方法是插入能使基因以比相應(yīng)親代細(xì)胞更高的水平表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。使用本領(lǐng)域眾所周知的方法(見，例如，美國專利號5，641，670)，通過在構(gòu)建體中包含可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因，能進(jìn)一步擴(kuò)增活化的基因。在內(nèi)源基因已改變的另一個實施方案中，基因的表達(dá)降低。
導(dǎo)向序列可在內(nèi)源基因之內(nèi)、與基因直接鄰接、在上游基因之內(nèi)或在內(nèi)源基因的上游及距其一定距離處。能使用一種或多種導(dǎo)向序列。例如，環(huán)狀質(zhì)粒或DNA片段優(yōu)選地使用單個導(dǎo)向序列，而線性質(zhì)?；駾NA片段優(yōu)選地使用兩種導(dǎo)向序列。
構(gòu)建體的調(diào)節(jié)序列可包含一種或多種啟動子、增強(qiáng)子、支架附著區(qū)或基質(zhì)附著部位、負(fù)調(diào)節(jié)元件、轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點或這些序列的組合。
構(gòu)建體進(jìn)一步含有內(nèi)源基因的一種或多種外顯子。外顯子被定義為一種DNA序列，其被拷貝為RNA并存在于成熟mRNA分子中，使得外顯子序列與內(nèi)源基因的編碼區(qū)符合讀框。外顯子可任選地含有編碼一種或多種氨基酸和／或部分編碼一種氨基酸的DNA。此外，外顯子含有對應(yīng)于5’非編碼區(qū)的DNA。外源外顯子編碼一種或多種氨基酸和／或氨基酸的一部分時，設(shè)計核酸構(gòu)建體，使得在轉(zhuǎn)錄和剪接后閱讀框架與內(nèi)源基因的編碼區(qū)符合讀框，以使來源于第二種外顯子的mRNA部分的適當(dāng)讀框未改變。
構(gòu)建體的剪接供體位點引導(dǎo)一種外顯子與另一種外顯子的剪接。一般地，第一種外顯子位于第二種外顯子的5’，在第一種外顯子3’側(cè)重疊并位于其側(cè)翼的剪接供體位點識別在第二種外顯子5’側(cè)位于第二種外顯子側(cè)翼的剪接受體位點。象剪接供體位點一樣，剪接受體位點是引導(dǎo)一種外顯子與另一種外顯子剪接的序列。通過與剪接供體位點一起作用，剪接機(jī)制利用剪接受體位點來實現(xiàn)內(nèi)含子的去除。表達(dá)載體本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的核酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。上述多種核酸和控制序列可以連接在一起產(chǎn)生一種重組表達(dá)載體，該載體可包含一種或多種適宜的限制酶切位點，以便于編碼多肽的核酸序列在這些位點的插入或置換。此外，也可通過向合適的表達(dá)載體中插入核酸序列或含有該序列的核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的核酸序列。在構(gòu)建表達(dá)載體中，應(yīng)使編碼序列位于載體中，使得編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列有效連接。
重組表達(dá)載體可以是能方便地進(jìn)行重組DNA方法并能導(dǎo)致核酸序列表達(dá)的任何載體(例如質(zhì)?；虿《?。載體的選擇一般取決于載體與待引入載體的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可以是線性或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制性載體，即，作為一種染色體外實體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可含有保證自復(fù)制的任何元件。另外，載體也可以是這樣一種載體，當(dāng)引入宿主細(xì)胞后，它整合到基因組中并與所整合的染色體一起復(fù)制。此外，也可使用一種載體或質(zhì)粒或者兩種或多種載體或質(zhì)粒，它們一起含有被引入到宿主細(xì)胞基因組中的總DNA，或者可使用一種轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一種或多種使轉(zhuǎn)化細(xì)胞能得到輕易篩選的選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、原養(yǎng)型到營養(yǎng)缺陷型的轉(zhuǎn)變等等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實例是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或是賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。適用于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記可以選自但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸酯合酶)、以及來源于其它種的相當(dāng)物。優(yōu)選的用于曲霉屬細(xì)胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有這樣一種元件，其使載體能向宿主細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合或使載體在細(xì)胞中不依賴于細(xì)胞基因組自主復(fù)制。
對于向宿主細(xì)胞基因組中的整合而言，載體可依賴編碼多肽的核酸序列，或用于載體通過同源或非同源重組穩(wěn)定整合到基因組中的載體的任何其它元件。此外，載體也可以含有通過同源重組引導(dǎo)向宿主細(xì)胞基因組中整合的另外的核酸序列。這些另外的核酸序列使載體能在染色體的精確位置處整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件優(yōu)選地應(yīng)含有足夠數(shù)量的與相應(yīng)靶序列高度同源的核酸，如100-1，500個堿基對，優(yōu)選地400-1，500個堿基對，最優(yōu)選地800-1，500個堿基對，來增加同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件也可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，也可通過非同源重組將載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
對于自主復(fù)制而言，載體可進(jìn)一步含有使載體能在所述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，以及允許在芽孢桿菌中復(fù)制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復(fù)制起點。在酵母宿主細(xì)胞使用的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點、ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合和ARS4與CEN6的組合。復(fù)制起點可以具有使其在宿主細(xì)胞內(nèi)的作用變成溫度敏感的突變(見，例如，Ehrlich，1978，美國國家科學(xué)院院報751433)。
可以將超過一個拷貝的本發(fā)明的核酸序列插入宿主細(xì)胞中來增強(qiáng)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。獲得核酸序列拷貝數(shù)增加的方法包括，將該序列的至少另一個拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中，或者使核酸序列含有可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因，通過在適當(dāng)選擇劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，能篩選出含有擴(kuò)增拷貝的選擇性標(biāo)記基因、并因而含有另外拷貝的核酸序列的細(xì)胞。
用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所周知(見，例如，Sambrook等人，1989，同上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的核酸序列的重組宿主細(xì)胞，其方便地用于多肽的重組產(chǎn)生。將含有本發(fā)明的核酸序列的載體引入宿主細(xì)胞中，使載體作為染色體整合體或作為如前所述的自復(fù)制的染色體外載體而保持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括由于復(fù)制期間發(fā)生突變而與親代細(xì)胞不同的親代細(xì)胞的任何子代。宿主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，如真核生物。
有用的單細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，如革蘭氏陽性菌，包括但不限于芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細(xì)胞，例如，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或者是革蘭氏陰性菌如大腸桿菌和假單胞菌屬的種。在一個優(yōu)選實施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿性芽孢桿菌。
向細(xì)菌宿主細(xì)胞中引入載體的實現(xiàn)方法可以是例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(見，例如，Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(xué)(MolecularGeneral Genetics)168111-115)、使用感受態(tài)細(xì)胞(見，例如，Young和Spizizin，1961，細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學(xué)雜志56209-221)、電穿孔法(見，例如，Shigekawa和Dower，1988，生物技術(shù)(Biotechniques)6742-751)或接合法(見，例如，Koehler和Thorne，1987，細(xì)菌學(xué)雜志1695771-5278)。
宿主細(xì)胞可以是真核生物如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細(xì)胞是一種真菌細(xì)胞。在此所用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等人所述，于《Ainsworth和Bisby真菌詞典》(Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi)，第8版，1995，CAB International，University Press，劍橋，英國)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人所述，1995，同上，第171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同上)。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細(xì)胞是一種酵母細(xì)胞。在此所用的“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenous yeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子孢子囊酵母(basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌類(Fungi Imperfecti)的酵母(芽酵母(Blastomycetes))。由于酵母的分類在將來可能改變，對于本發(fā)明而言，應(yīng)當(dāng)如《酵母的生物學(xué)及活性》(Biology and Activities of Yeast)(Skinner，F(xiàn)．A．，Passmore，S-M-和Davenport，R-R-所編，《應(yīng)用細(xì)菌學(xué)學(xué)會論文集系列號9》(Soc-App-Bacteriol．Symposium Series No．9)，1980)所述定義酵母。
在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或Yarrowia的細(xì)胞。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母、諾地酵母或Saccharomyces oviformis細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
在另一個更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細(xì)胞是一種絲狀真菌細(xì)胞。“絲狀真菌”包括真菌亞門(Eumycota)和卵菌亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等人所述，1995，同上)。絲狀真菌的特征在于由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲壁。營養(yǎng)生長是通過菌絲延伸，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞菌體的芽殖，而碳分解代謝可能是發(fā)酵的。
在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是但不限于枝頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢霉屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或木霉屬的種的細(xì)胞。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一種最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、黃色鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、網(wǎng)狀鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、腐皮鐮孢、擬枝孢鐮孢、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum細(xì)胞。在一個甚至最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌親代細(xì)胞是Fusarium venenatum(Nirenberg新種)細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Humicola insolens或柔毛腐質(zhì)霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是米黑毛霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是嗜熱毀絲霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是粗糙脈孢霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是產(chǎn)紫青霉細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞是Thielavia terrestris細(xì)胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，木霉屬細(xì)胞是Trichoderma harzianum、康寧木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉細(xì)胞。
可以通過包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁自身以一種已知方式再生的方法轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞。EP238023和Yelton等人，1984，美國國家科學(xué)院院報811470-1474中描述了適用于曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法。Malardier等人，1989，基因78147-156和WO96／00787描述了轉(zhuǎn)化鐮孢屬的種的合適方法?？梢杂肂ecker和Guarente在Abelson，J．N．和Simon，M．I．編的《酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)指南酶學(xué)方法》(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology)，194卷，182-187頁，Academic Press，紐約；Ito等人，1983，細(xì)菌學(xué)雜志153163；和Hinnen等人，1978，美國國家科學(xué)院院報751920中所述的方法轉(zhuǎn)化酵母。產(chǎn)生方法本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)其野生型形式能產(chǎn)生多肽的菌株，產(chǎn)生含有該多肽的上清液；和(b)回收該多肽。優(yōu)選地該菌株屬于鐮孢屬，更優(yōu)選地是Fusarium venenatum。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收該多肽。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞含有在SEQ IDNO1的核酸序列中至少具有一個突變的SEQ ID NO1的突變核酸序列，其中該突變核酸序列編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽；以及(b)回收該多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)引入了一種新轉(zhuǎn)錄單位的同源重組細(xì)胞，該轉(zhuǎn)錄單位包含調(diào)節(jié)序列、外顯子、和／或與編碼該多肽的內(nèi)源核酸序列第二種外顯子有效連接的剪接供體位點；以及(b)回收該多肽。該方法基于基因激活技術(shù)的應(yīng)用，例如，如美國專利號5，641，670所述。基因激活技術(shù)基于激活在細(xì)胞中通常不表達(dá)的基因，或提高在細(xì)胞中以極低水平表達(dá)的基因的表達(dá)。基因激活技術(shù)包括如下方法將含有調(diào)節(jié)序列、外顯子和／或剪接供體位點的外源DNA構(gòu)建體以這樣一種方式插入細(xì)胞的基因組DNA中，使得插入導(dǎo)致一種新轉(zhuǎn)錄單位的產(chǎn)生，該轉(zhuǎn)錄單位中調(diào)節(jié)序列、外顯子和／或剪接供體位點與內(nèi)源基因有效連接，并激活其表達(dá)。
在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，用本領(lǐng)域公知的方法在適于多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中通過搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞，這在合適的培養(yǎng)基中和使多肽能表達(dá)和／或分離的條件下進(jìn)行。用本領(lǐng)域公知的方法在含有碳源和氮源和無機(jī)鹽的適當(dāng)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商處得到或根據(jù)公開的組成(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所公開的)制備。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可直接從培養(yǎng)基中回收該多肽。如果該多肽不分泌，則可從細(xì)胞裂解產(chǎn)物中回收。
可使用本領(lǐng)域公知的、對多肽特異的方法檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可用酶測定法檢測多肽的活性。測定5-氨基酮戊酸合酶活性的方法在本領(lǐng)域中公知。如前所述，按照Paveto等人，1989，同上改進(jìn)的、Widerde Xifra等人，1971，同上所述的方法測定5-氨基酮戊酸合酶活性。
得到的多肽可通過本領(lǐng)域公知的方法回收。例如，可用常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽，這些方法包括但不局限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
本發(fā)明的多肽可用本領(lǐng)域公知的多種方法純化，這些方法包括但不局限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度法(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(見，例如，《蛋白質(zhì)純化》(ProteinPurification)J．-C．Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，紐約，1989)。用途本發(fā)明也涉及應(yīng)用具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽的方法。
當(dāng)5-氨基酮戊酸合酶活性是宿主細(xì)胞中血紅素產(chǎn)生的限速步驟時，可用本發(fā)明的多肽提高宿主細(xì)胞產(chǎn)生的血紅素蛋白的產(chǎn)量，這是通過在宿主細(xì)胞中超量表達(dá)編碼具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽的核酸序列。該方法包括(a)向能產(chǎn)生血紅素蛋白的宿主細(xì)胞中引入一個或多個拷貝的編碼具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽的核酸序列，其中該核酸序列與能引導(dǎo)多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū)有效連接；(b)在適于血紅素蛋白和多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞；和(c)從細(xì)胞的營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收血紅素蛋白(見WO97／47746)。
本發(fā)明也可用于異源多肽的產(chǎn)生。該方法包括(a)向細(xì)胞的呼吸缺陷型突變體中引入含有編碼本發(fā)明多肽的第一種核酸序列和第二種核酸序列的核酸構(gòu)建體，其中第一種核酸序列在表達(dá)后補(bǔ)救了呼吸缺陷，而第二種核酸序列編碼一種異源多肽；(b)在適于第一種和第二種核酸序列表達(dá)的需氧條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有第一種和第二種核酸序列的細(xì)胞；和(c)回收該異源多肽(見WO98／41640)。
下列實施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，不應(yīng)把它們看作是限制本發(fā)明的范圍。
痕量金屬溶液每升由14．3g ZnSO4·7H2O、2．5g CuSO4·5H2O、0．5gNiCl2、13．8g FeSO4、8．5g MnSO4和3．0g檸檬酸組成。
RA孢子形成培養(yǎng)基每升由50g琥珀酸、12．1g NaNO3、1g葡萄糖、20ml 50×Vogels和0．5ml 10mg／ml NaMoO4貯存液組成，pH調(diào)節(jié)為6．0。
YEG培養(yǎng)基每升由5g酵母提取物和20g葡萄糖組成。
YEPG培養(yǎng)基每升由10g酵母提取物、20g蛋白胨和20g葡萄糖組成。
STC由0．8M山梨糖醇、25mM Tris pH 8、25 mM CaCl2組成。
SPTC由40％PEG 4000、0．8M山梨糖醇、25mM Tris pH 8、25mMCaCl2組成。
M400培養(yǎng)基(pH 6．0)每升由50g麥芽糖糊精、2g MgSO4·7H2O、2g KH2PO4、4g檸檬酸、8g酵母提取物、2g尿素、0．5ml痕量金屬溶液和0．5g CaCl2組成。
COVE痕量金屬溶液每升由0．04g NaB4O7·10H2O、0．4gCuSO4·5H2O、1．2g FeSO4·7H2O、0．7g MnSO4·H2O、0．8g Na2MoO2·2H2O和10g ZnSO4·7H2O組成。
基本培養(yǎng)基覆蓋物(pH 6．5)每升由6．0g NaNO3、0．52g KCl、1．52gKH2PO4、1ml COVE痕量金屬溶液、20ml 50％葡萄糖、2．5ml 20％MgSO4·7H2O、20ml生物素貯存液和20g低熔點瓊脂糖組成。
生物素貯存液由5mg生物素溶于100ml 50％乙醇中組成。
基本培養(yǎng)基平板(pH 6．5)由6．0g NaNO3、0．52g KCl、1．52gKH2PO4、1．0ml COVE痕量金屬溶液、20g Nobel瓊脂(Difco)、20ml50％葡萄糖、20ml甲硫氨酸(50g／l)、20ml生物素(200mg／l)、2．5ml20％MgSO4·7H2O和1．0ml mg／ml鏈霉素組成。實施例1禾谷鐮孢株ATCC 20334基因組DNA的提取將禾谷鐮孢(=Fusarium venenatum)株ATCC 20334在25ml 0．5％酵母提取物-2％葡萄糖(YEG)培養(yǎng)基中于30℃和250轉(zhuǎn)／分下培養(yǎng)72小時。然后通過微孔布(Calbiochem，La Jolla，CA)過濾收集菌絲體，用25ml 10mM Tris-1mM EDTA(TE)緩沖液洗一次。從菌絲體中排出多余的緩沖液，隨后冷凍于液氮中。用電動咖啡研磨機(jī)將冷凍的菌絲體研磨成細(xì)粉末，將粉末加入一次性塑料離心管中的20ml TE緩沖液和5ml 20％w／v十二烷基硫酸鈉(SDS)中。輕輕顛倒混合物數(shù)次確保其混勻，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，v／v／v)抽提兩次。加入乙酸鈉(3M溶液)至終濃度為0．3M，隨后加入2．5倍體積的冰預(yù)冷的乙醇沉淀核酸。然后將管以15，000×g離心30分鐘沉淀核酸。使沉淀風(fēng)干30分鐘，之后重懸浮于0．5ml TE緩沖液中。加入不含DNase的核糖核酸酶A至濃度為100mg／ml，在37℃下溫育該混合物30分鐘。然后加入200mg／ml濃度的蛋白酶K，將混合物在37℃下再溫育1小時。最后，如前所述，用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，v／v／v)抽提該混合物兩次，之后用乙酸鈉和乙醇沉淀DNA。在真空下干燥DNA沉淀，將其重懸浮于TE緩沖液中，貯存于4℃直到進(jìn)一步使用。實施例2質(zhì)粒pGAGa5的構(gòu)建通過連接來源于含有鐮孢株ATCC 20334基因組DNA的擴(kuò)增反應(yīng)物的PCR片段，構(gòu)建質(zhì)粒pGAGa5。該擴(kuò)增反應(yīng)物含有下列成分50ng基因組DNA、100μM每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)、50pmol引物hemADeg5’5’-GTITGGTGYTCIAAYGAYTAYCT-3’(SEQ ID NO3)和hemADeg3’5’-CCNACNGCRTGNACYTCRTC-3’(SEQ ID NO4)、2單位TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)和1×Taq DNA聚合酶緩沖液(Perkin-Elmer公司，Branehburg，NJ)。在Perkin-Elmer熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)中溫育該反應(yīng)物，程序設(shè)定為30循環(huán)，每次循環(huán)95℃1分鐘、53℃1分鐘和72℃90秒鐘。用含有40mM Tris-乙酸-1mM EDTA二鈉(TAE)緩沖液的1．1％低熔點瓊脂糖凝膠(FMC，Rockland，ME)電泳后，經(jīng)切割分離450bp的PCR產(chǎn)物，按照使用說明書將其亞克隆到pCRII載體(Invitrogen，San Diego，CA)中，產(chǎn)生pGAGa5。實施例3鐮孢DNA文庫和5-氨基酮戊酸合酶(hemA)克隆的鑒定按照使用說明書，用噬菌體克隆載體λZipLox(Life Technologies，Gaithersburg，MD)構(gòu)建鐮孢株ATCC 20334的基因組DNA文庫，其中用大腸桿菌Y1090ZL作為宿主用于重組噬菌體的平板接種和純化，大腸桿菌DH10Bzip用于單個pZL1-hemA克隆的切割。用Tsp509I部分消化如實施例1所述制備的總細(xì)胞DNA，在含有50mM Tris-50mM硼酸鹽-1mM EDTA二鈉(TBE)緩沖液的1％瓊脂糖凝膠中按大小分級分離。切下以4-7kb大小遷移的DNA片段，用Prep-a-Gene試劑(BioRad Laboratories，Hereules，CA)從凝膠中洗脫。將洗脫的DNA片段與EcoRI酶切并去磷酸化的λZipLox載體臂連接，并用商業(yè)化包裝提取物(Stratagene，La Jolla，CA)包裝連接混合物。在大腸桿菌Y1090ZL細(xì)胞中平板接種并擴(kuò)增包裝的DNA文庫。未擴(kuò)增的基因組DNA文庫含有1×106pfu／ml。
將由7×104個噬菌斑得到的噬菌體DNA轉(zhuǎn)移到雙份圓形NytranPlus膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH)上，用洋地黃毒苷(DIG)標(biāo)記的探針探查，該探針是通過鐮孢株ATCC 20334基因組DNA的PCR擴(kuò)增從實施例3所述的質(zhì)粒pGAGa5中制備的。該擴(kuò)增反應(yīng)物含有下列組分1×DIG探針合成混合物(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、50pmole引物hemA5’38 5’-CCATACTTGTCGGCAAG-3’(SEQ ID NO5)和引物hemA3’4235’-GAACGACTACCTTGGC-3’(SEQ ID NO6)、2單位Taq DNA聚合酶和1×Taq DNA聚合酶緩沖液。在Perkin-Elmer熱循環(huán)儀中溫育該反應(yīng)物，程序設(shè)定為30循環(huán)，每次循環(huán)95℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘。以2ng／ml的濃度向雜交緩沖液中加入變性探針，與預(yù)雜交膜溫育過夜。在42℃下，在5×SSE、0．1％肌氨酰、0．2％SDS、1％Genius封閉劑(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和30％甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。以5×SSC-0．1％SDS洗膜兩次，隨后以2×SSC-0．1％SDS洗兩次。每次洗滌在室溫下進(jìn)行15分鐘。使洗過的膜在室溫下暴露于Kodak X-OMAT AR膠片大約2小時，隨后根據(jù)使用說明書用Konica QX-70自動膠片處理機(jī)顯影。純化初級噬菌斑，并第二次篩選。鑒定出三個克隆并按照使用說明書(Bethesda ResearchLaboratories，Inc．，Gaithersburg，MD)切割為pZL衍生物。這些pZL衍生物被命名為pZL1-3、pZL3-3和pZL12-1，發(fā)現(xiàn)其含有3．8kb的區(qū)域。實施例4鐮孢5-氨基酮戊酸合酶(hemA)基因的表征按照下列方法對實施例3所述的pZL3-3進(jìn)行DNA測序。利用染料終止子化學(xué)的引物步移技術(shù)(Giesecke等人，1992，病毒學(xué)方法雜志(Journal of Virology Methods)3847-60)，使用M13反向(-48)及M13正向(-20)引物(New England Blolabs，Beverly，MA)和對所測序的DNA獨特的引物，用Applied Biosysterms 373A型自動DNA測序儀(Applied Biosystems，Inc．，F(xiàn)oster City，CA)對其兩條鏈進(jìn)行DNA測序。
克隆基因的核苷酸序列顯示出一種如

圖1所示的1922個核苷酸的開放閱讀框(SEQ ID NO1)，它被兩個推定的短內(nèi)含子所隔斷。該核苷酸序列編碼分子量為65kDa的588個氨基酸的預(yù)測蛋白質(zhì)。
圖1顯示了鐮孢株ATCC 20334基因產(chǎn)物的推斷氨基酸序列(SEQID NO2)?？偟膩碚f，推斷的氨基酸序列與構(gòu)巢曲霉hemA基因有73％的同一性(Bradshaw等人，1993，同上)，與釀酒酵母HEM1基因有57％的同一性(Urban-Grimal，1986，歐洲生物化學(xué)雜志(European Journal of Biochemistry)156511-519)，其中通過Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，利用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc．，Madison，WI)，應(yīng)用同一性表和下列多重對比參數(shù)罰區(qū)間為10、罰長度為10，測定其同一性。配對對比參數(shù)是Ktuple=1、罰區(qū)間=3、窗口=5、對角線=5。實施例5pΔHemA的構(gòu)建構(gòu)建質(zhì)粒pΔHemA，使之含有hemAΔ∷amdS等位基因。
首先構(gòu)建質(zhì)粒pJRoy47，使之含有構(gòu)巢曲霉amdS基因，該基因側(cè)翼為用來易于重組和去除amdS標(biāo)記的224bp同向重復(fù)序列。用BamHI和SalI消化pNEB193(New England Biolabs，Beverly，MA)，并用Qiaquick Gel提取試劑盒(Qiagen，Inc．，Chatsworth，CA)凝膠純化。將兩種寡核苷酸Bam／Swa／Sal接頭3和Bam／Swa／Sal接頭4(如下所示)重懸浮于水中，至濃度為50pmol每μl，混勻，加熱至50℃10分鐘，然后緩慢冷卻。
Bam／Swa／Sal接頭35’-GATCGATTTAAAT-3’(SEQ ID NO7)Bam／Swa／Sal接頭45’-TCGAATTTAAATC-3’(SEQ ID NO8)將該寡核苷酸連接于BamHI和SalI限制酶切的上述pNEB193中，產(chǎn)生質(zhì)粒pJRoy43(圖2)。
為了產(chǎn)生重復(fù)片段，用以下所示引物對進(jìn)行兩個PCR反應(yīng)。
引物對1
重復(fù)Oligo 15’-GCGAATTCATATTTAAATGCCGACCAGCAGACGGCCCTCG-3’(SEQ ID NO9)重復(fù)Oligo 25’-GCGATATCATGATCTCTCTGGTACTCTTCG-3’(SEQ ID NO10)引物對2重復(fù)Oligo 35’-GCGATATCATCGACCAGCAGACGGCCCTCG-3’(SEQ ID NO11)重復(fù)Oligo 45’-GCGTTTAAACATGATCTCTCTGGTACTCTTCG-3’(SEQ ID NO12)擴(kuò)增反應(yīng)物(50μl)含有下列組分50ng pJaL493(WO98／41640)、50pmol重復(fù)Oligo 1和50pmol重復(fù)Oligo 2或50pmol重復(fù)Oligo 3和50pmol重復(fù)Oligo 4、5μl 2．5mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP、1×Taq聚合酶緩沖液(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)和5單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)。在Perkin-Elmer480型熱循環(huán)儀中溫育該反應(yīng)物，程序設(shè)定如下第1個循環(huán)，95℃5分鐘、55℃2分鐘和72℃5分鐘；第2-30個循環(huán)，每次循環(huán)95℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘；及4℃的浸泡循環(huán)。在TAE緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠上電泳得到的224bp片段，并用Qiaquick凝膠提取試劑盒凝膠純化。然后用EcoRV和EcoRI消化這些片段，彼此連接，再用Qiaquick凝膠提取試劑盒凝膠純化。
質(zhì)粒pJRoy43和含有重復(fù)序列的片段都用SwaI和PmeI消化，并連接在一起，產(chǎn)生pJRoy44(圖3)。
然后用EcoRV消化質(zhì)粒pJRoy44，用QiaQuick凝膠提取試劑盒凝膠純化。將含有構(gòu)巢曲霉amdS基因的2．7kb平端NsiI限制酶切片段連接于EcoRV消化的pJRoy44中，產(chǎn)生pJRoy47(圖4)。
通過用PmeI、ScaI和SwaI限制酶切pJRoy47獲得含有側(cè)翼為224bp同向重復(fù)序列的構(gòu)巢曲霉amdS基因的3．2kb片段，其用來便于重組和amdS標(biāo)記的去除。用QiaQuick凝膠提取試劑盒凝膠純化該平端DNA片段。
將純化的DNA片段克隆到用NruI限制酶切(除去包含起始密碼子的hemA ORF的1616bp片段)的實施例4所述的pZL3-3中，連接后產(chǎn)生pAHemA(圖5)。對含有缺失的hemA基因區(qū)測序，以確定hemAΔ∷amdS等位基因的性質(zhì)。序列測定表明，hemA缺失去除了編碼序列，并破壞了該基因的讀框。實施例6用pΔHemA對Fusarium venenatum的轉(zhuǎn)化用pΔHemA轉(zhuǎn)化Fusarium venenatum CC1-3(MLY-1)，鐮孢株ATCC 20334的一種形態(tài)突變體(Wiebe等人，1992，真菌學(xué)研究(Mycol．Research)951284-1288)，以用hemAΔ∷amdS缺失等位基因替換野生型hemA基因。
通過將10個從添加有2．5％瓊脂糖和2．5mM硝酸鈉的1×Vogels培養(yǎng)基平板(2．5％Nobel瓊脂)中獲得的孢塞(plug)接種于含有500mlRA孢子形成培養(yǎng)基的搖瓶中，并在28℃、150轉(zhuǎn)／分下溫育2-3天，產(chǎn)生Fusarium venenatum MLY-3的孢子。通過微孔布(Calbiochem，San Diego，CA)收集孢子，用Sorvall RC-5B離心機(jī)(E．I．DuPont DeNemours和Co．，Wilmington，DE)以7000轉(zhuǎn)／分離心。沉淀的孢子用無菌蒸餾水洗兩次，重懸浮于少量水中，然后用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。
通過將Fusarium venenatum MLY-3的4×107個孢子接種于100mlYEPG培養(yǎng)基中，并在24℃和150轉(zhuǎn)／分下溫育16小時，制備原生質(zhì)體。培養(yǎng)物用Sorvall RT 6000D(E．I．DuPont De Nemours和Co．，Wilmington，DE)以3500轉(zhuǎn)／分離心7分鐘。沉淀用30ml 1M MgSO4洗兩次，重懸浮于15ml 5mg／mlNOVOZYME 234TM(批號PPM 4356，Novo Nordisk A／S，Bagsvaerd，丹麥)的1M MgSO4溶液中。在24℃和150轉(zhuǎn)／分下溫育培養(yǎng)物直到原生質(zhì)體形成。向原生質(zhì)體消化物中加入體積為35ml的2M山梨糖醇，以2500轉(zhuǎn)／分離心混合液10分鐘。重懸浮沉淀，用STC洗兩次，以2000轉(zhuǎn)／分離心10分鐘沉淀原生質(zhì)體。用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)原生質(zhì)體，重懸浮于8∶2∶0．1的STC∶SPTC∶DMSO溶液中至終濃度為2×107個原生質(zhì)體每毫升。將原生質(zhì)體在Nalgene Cryo 1℃冷凍容器(VWR Scientific，Inc．，SanFrancisco，CA)中控制速度地冷凍后，貯存于-80℃。
在冰上融化冷凍的Fusarium venenatum MLY-1的原生質(zhì)體。用濃度為2×107個原生質(zhì)體每ml的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使200μl原生質(zhì)體與40lμg pΔHemA加5μl肝素(5mg每ml STC)混合，在冰上溫育30分鐘。加入2ml SPTC，在室溫下再溫育原生質(zhì)體20分鐘。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)物中加入基本培養(yǎng)基覆蓋物(50ml)，然后將該反應(yīng)物平板接種于兩個添加有5mM 5-氨基酮戊酸的基本培養(yǎng)基平板上。通過在缺少5-氨基酮戊酸的基本培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)初級轉(zhuǎn)化子12天，確定5-氨基酮戊酸營養(yǎng)缺陷型。
此轉(zhuǎn)化產(chǎn)生超過100個菌落。對在缺少5-氨基酮戊酸的基本培養(yǎng)基上30個初級轉(zhuǎn)化子的篩選得到19個勉強(qiáng)出現(xiàn)生長的菌株。選擇10個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern分析。
如實施例1所述制備此10個轉(zhuǎn)化子中每一個的基因組DNA(10μg)，并用EcoRV限制酶切消化。通過應(yīng)用TAE緩沖液的1％瓊脂糖凝膠電泳分離該片段。用TurboBlot裝置(Schleicher & Schuell，Keene，NH)按照使用說明書將DNA轉(zhuǎn)移到10×SSC中的Nytran Plus-尼龍膜上。在Hybaid恒溫箱(Labnet，Woodbridge，NJ)中，在5×SSE、0．1％肌氨酰、0．02％SDS、1％Genius封閉劑(Genius DIG發(fā)光檢測試劑盒，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和50％甲酰胺中，將該膜于65℃預(yù)雜交2小時。通過應(yīng)用如下所示的引物3-3243U和3for．1從pΔHemA中PCR擴(kuò)增DNA片段，制備基于缺失hemA基因5’側(cè)翼區(qū)的DIG標(biāo)記探針。
3-32435’-CCCTTCTAGGCAAGTCTATGG-3’(SEQ ID NO13)3for．l5’-CCGCAGCATGGCCGCAACTTG-3’(SEQ ID NO14)該擴(kuò)增反應(yīng)物(50μl)含有下列組分50ng pΔHemA、50pmol 3-3243U引物、50pmol 3for．l引物、5μl DIG標(biāo)記的dATP、1×DIG探針合成混合物(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、dCTP、dGTP和dTTP、1×Taq聚合酶緩沖液(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)和5單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer公司，Branchburg，NJ)。在Perkin-Elmer 480型熱循環(huán)儀中溫育該反應(yīng)物，程序設(shè)定如下第1個循環(huán)，95℃5分鐘、55℃ 2分鐘和72℃5分鐘；第2-30個循環(huán)，每次循環(huán)95℃1分鐘、55℃ 1分鐘和72℃1分鐘；及4℃的浸泡循環(huán)。在用TAE緩沖液的1．5％瓊脂糖凝膠上分離反應(yīng)產(chǎn)物，從凝膠上切下300bp的產(chǎn)物帶，并用Qiaex II(Qiagen，Chatsworth，CA)按使用說明書純化。
首先將純化探針以4ng／ml的濃度在沸水浴中加熱10分鐘使之在水中變性，然后加入上述雜交液中。65℃雜交過夜后，在室溫下以2×SSC、0．1％SDS洗膜10分鐘，隨后在68℃下以0．5×SSC、0．1％SDS洗兩次15分鐘。然后將洗過的膜用2×SSC漂洗，用Genius DIG發(fā)光檢測試劑盒根據(jù)使用說明書顯影，并暴露于Kodak Xomat AR膠片大約1小時。
轉(zhuǎn)化子的Southern分析顯示，4個轉(zhuǎn)化子只含有hemAΔ∷amdS等位基因，6個含有野生型和hemAΔ∷amdS兩種等位基因。對4個只含有hemAΔ∷amdS等位基因的轉(zhuǎn)化子中的兩個進(jìn)行孢子分離，然后進(jìn)行Southern分析(如上所述)，以證實hemAΔ∷amdS等位基因的存在和野生型等位基因的缺如。Southern分析顯示，這兩種轉(zhuǎn)化子都只含有hemAΔ∷amdS等位基因。選擇其中一個被命名為Fusariumvenenatum 46-3的轉(zhuǎn)化子作為hemA突變宿主菌株。實施例7補(bǔ)加5-氨基酮戊酸對致死性hemA缺失表型的拯救通過補(bǔ)加5-氨基酮戊酸測定5-氨基酮戊酸拯救hemA缺失表型的能力。
用水制備250mM 5-氨基酮戊酸(卟啉產(chǎn)物，Logan UT)貯存液，0．22微米過濾除菌，在暗處貯存于-20℃，在使用或傾注之前加入制備的培養(yǎng)基中。向基本培養(yǎng)基瓊脂或YEG液體培養(yǎng)基中加入濃度為0．005mg／ml-0．3mg／ml的5-氨基酮戊酸。在28℃下，將Fusariumvenenatum 46-3在這些培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。YEG液體培養(yǎng)基以200轉(zhuǎn)/分搖動。
結(jié)果顯示，當(dāng)加到基本培養(yǎng)基瓊脂中時，低至30μM(5．0μg／ml)的5-氨基酮戊酸濃度足以拯救營養(yǎng)缺陷表型。在液體YEG培養(yǎng)基中的生長需要略高的濃度(可達(dá)1mM)。實施例8pJRoy54HemA的構(gòu)建構(gòu)建質(zhì)粒pJRoy54HemA，使之含有野生型hemA等位基因和一種表達(dá)盒，該表達(dá)盒引導(dǎo)編碼被稱為LIPOLASETM(Novo Nordisk A／S，Bagsvaerd，丹麥)的Thermomyces lanuginosus(柔毛腐質(zhì)霉)脂酶的異源基因表達(dá)。特別地，通過用BamHI消化pZL3-3并用Klenow酶補(bǔ)平凹缺末端，獲得含有包括天然啟動子與終止子的Fusariumvenenatum hemA基因的3．5kb片段。用QiaQuick凝膠提取試劑盒凝膠純化該平端DNA片段。
構(gòu)建pJRoy54，使之含有一種包含由尖鐮孢SP387啟動子和終止子控制的LIPOLASETM基因的表達(dá)盒。首先用平端切割酶HindII限制酶切質(zhì)粒pNEB193，并用Qiaquick凝膠提取試劑盒凝膠純化。然后如WO96／00787所述獲得由尖鐮孢SP387啟動子和終止子控制的平端LIPOLASETM表達(dá)盒，連接于pNEB193中產(chǎn)生質(zhì)粒pJRoy54(圖6)。
將純化的含有Fusarium venenatum hemA基因的3．5kb片段克隆到PmeI消化的pJRoy54中產(chǎn)生pJRoy54HemA(圖7)。對該質(zhì)粒的測序證實了hemA基因的存在。實施例9應(yīng)用pJRoy54HemA的轉(zhuǎn)化按照實施例6所述的方法用從Fusarium venenatum 46-3制備的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用50μg pJRoy54HemA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，平板接種于缺乏5-氨基酮戊酸的基本培養(yǎng)基上，在室溫下溫育。轉(zhuǎn)化的菌落在10天溫育后變得明顯。應(yīng)用pJRoy54HemA獲得7個轉(zhuǎn)化子，而在“無DNA”的對照平板上，即用Fusarium venenatum 46-3作為對照，無菌落出現(xiàn)。
發(fā)現(xiàn)這7個轉(zhuǎn)化子是5-氨基酮戊酸原養(yǎng)型。按照實施例6所述的方法從全部7個轉(zhuǎn)化子(稱為HL1-7)中分離DNA并進(jìn)行Southern分析。結(jié)果表明，它們除了hemA缺失等位基因之外還含有至少一個拷貝的完整hemA基因。該數(shù)據(jù)證實，用野生型hemA基因轉(zhuǎn)化能拯救hemA缺失表型。
另外，轉(zhuǎn)化子HL1-7在含有25ml M400培養(yǎng)基的125ml搖瓶中28℃生長7天。按照下列方法測定脂酶活性。使用前通過將貯存底物(每ml DMSO 10μl對硝基苯丁酸酯)1∶5稀釋于MC緩沖液(3mMCaCl2-0．1M MOPS pH7．5)中制備測定底物。標(biāo)準(zhǔn)LIPOLASE(NovoNordisk A／S，Bagsvaerd，丹麥)含有1000LU／ml 50％甘油-0．66mMCaCl2-33mM Tris pH7．5，貯存于-20℃。標(biāo)準(zhǔn)LIPOLASE在使用前用MC緩沖液1／100稀釋。用MC緩沖液稀釋肉湯樣品，并將稀釋肉湯樣品的100μl等份移液至96孔微量滴定皿中，隨后加入100μl稀釋的底物。記錄隨時間變化的405nm處的吸光度。計算相對于LIPOLASE標(biāo)準(zhǔn)的肉湯脂酶單位／ml(LU／ml)。所有轉(zhuǎn)化子都在第7天產(chǎn)生脂酶活性。生物材料的保藏下列生物材料已按照布達(dá)佩斯條約的條款保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心，1815 University Street，Peoria，Illinois，61604，并給予下列保藏號保藏物保藏號 保藏日期大腸桿菌DH5αpZL3+3NRRL B-218551997年10月20日此處描述并申請專利保護(hù)的本發(fā)明在范圍上不受此處公開的具體實施方案的限制，因為這些實施方案只是作為本發(fā)明幾個方面的例證。任何等同的實施方案都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實際上，通過前面的描述，除此處所示及所述的之外，本發(fā)明的許多修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員也都是顯而易見的。這些修改也處于附加的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。在沖突時，本公開內(nèi)容包括定義將控制。
此處引用了許多參考文獻(xiàn)，其公開內(nèi)容完全引入作為參考。
序列表<110>Gambetta，Greg<120>具有5-氨基酮戊酸合酶活性的多肽和編碼該多肽的核酸<130>5399．204-WO<160>12<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>3853<212>DNA<213>鐮孢屬<400>1gaattcatcg tacgagacgg ttggtataaa gccgagagca gagtattttg gacgtgggga 60tatctgagtt tgacattttg agatacctat gaagagacga gctaaaggat tgatcataaa 120gtacattgcc aatactactt actgtacaat taggtttttt tgtgacttgt tcattgtaag 180acacttgtcc gcctttcgat aaccattcaa caatactcaa ccaatgggtg taaagctgtc 240aagggtctaa aggctaaaag tacgactgca acgtgcatga acagaacgag ccaatcaagg 300gcaatgtatt tctctacagc cgtccctgag tttgactcgg gcggtttcgt ccctgtacga 360ttgccgagcg ttgtacgtgc ggactttgga actcaaggtt gcgggccgca gcatggccgc 420aacttgacaa tctttttcgc cgaggtcatt ctgtttccga gtttttttta ttttatgttg 480agttaataag agggtcagga cttcaactag tcagttagtt cgtttatgcg gaaacgttta 540cggcggttgt agatacagaa agtaaatcaa cgggtcaaac gcttcacgtg tcagatcatt 600atttacaaac cccgctgtct aggccttaca gccagcatcg gggcctgcat ggcgacaaga 660atgtaccata gacttgccta gaaggggaaa tttgagcgga gttagttgag aagaacagaa 720gaaaatggac ggaatcgaaa cggaagtaat ttatgggtca atgaccgacc gttcttgccg 780agccatggac caccgactta ttcaatcctc tctttacggt catctatcta ccgctttatt 840atcctccttc ttcatatttt ccctccttct tctttttcct ttttacactc aacctcaacc 900tcaacccgcc tctcctcact tgcaaaagct caattgcttt tgcttcgcct cgcttgttcg 960ctctcgcgat cgagtgtaag cccctcgctt ttttttttat tcacctggca tatttgcccc1020tccaagttca aactaccacg ttttgcccct ctggttcgct ttacgaaagc attgctatcg1080caacttgacc tgtgccacca aatacacgta acaatggatg ctgttcttcg ccagtccaag1140gccatgtgcc cttttatgaa gacggccact cccgccactc tgcgcgcctt gtcaacttcg1200tctcgcgccc ttccggctcc tgcctcgcca tgtggaggca ccatgtcgaa gctgcagctt1260cttggtcagc gatgccccgt catgggtaag gcatggctgt tcagaccgcc aagaaccgcg1320ctgctggctc tgttcgtgcc ttctccaacc actccaagac tggaaaggcc aagattcata1380cttccagcaa caaggaggct cgtgctgttg aacgcccact cttcgaaggc cgcgacaatg1440gtatgttcga atcccagtaa aatctgttta cttctttccg tcacttgatt gtatctaatc1500ttgcgcccag ctcctcctgg tattcacgcg aaccgaaagg ccgcatccgc atccccaacc1560gcttccgctg ccgccgctgg cttccaatct cctggcaaat tcgactatga aaccttttac1620aacactgagc tcgagaagaa acacaaggat aaatcctacc gttacttcaa caatatcaac1680cgtttggcaa aggagtttcc gcgtgcacac atgtctgaca aggaggatcg agtaactgtc1740tggtgcgcca acgactacct tggcatgggc cgcaatcccc atgttctcaa cacgatgcac1800aaaaccttgg aggaatatgg tgctggtgcg ggcggtactc gaaacatctc tggtcacaac1860aagcacgccg ttgagctgga ggctacactg gccaagcttc acgccaagga tagcgctctt1920gtgttcagct cttgctatgt tgccaacgac gcaaccctgg cgacactcgg cagcaagttg1980cccgaatgcg ttattctttc cgatagcttg aaccacgcct ctatgatcca gggaatccga2040cactctggca ccaagaagat tgttttcaag cacaacgatg tgcaggacct cgaggccaag2100ctggcttcgc tacccctaca cgtgcctaag atcatagctt tcgagtcggt gtacagtatg2160tgcggctcca ttggtcctat tgaggaaatc tgtgatcttg ccgacaagta tggcgccatc2220acttttcttg atgaagtcca tgccgtcggc atgtacggtc ttcatggtgc tggtgttgct2280gagcaccttg actgggaagc ccatgccaac ggtgcccttc gcgggaccat catggaccga2340atcgacatta tcactggtac tctgggcaag gcgtacggtt gcgtcggtgg ctatatcgct2400ggtagcgcca agttcattga cgtgatccga tcgttggccc ccggcttcat cttcactact2460tctttgcctc ctgctaccat ggctggtgcc caaacctcta ttgagtacca gatggagtac2520gatggcgacc gacgactcca gcagctgcac actcgtgctg tcaaggaggc tatgaacgct2580cgcgacatcc ctgtcatccc caatccctct cacatcattc ctgtactagt tggcaacgcc2640gagaccgcca aggcggcttc cgacatgctt ctcaacgact acggaattta tgtccaatcc 2700atcaactacc ccaccgttcc agttggtcag gagcgtcttc gcatcacccc tacccccggc 2760catgtcaagg agtaccgcaa ccagcttgtc gaggctgttg atgagatctg gactcgcctc 2820aacatcaagc gaacctccga ctgggctgcc gagggtggct ttattggtgt cggcgaggag 2880agcaacgtac agaaccctct ttggactgac aagcaactca acgttgagca ggctacgaag 2940gagatcaagg ccaccggtca agccgccaat ggtattactg aggcgcttct cgagcttgag 3000attaagcaat cctccgaggt cgctactgct gcttaagcgt aagatatact cagcacctta 3060cgcgcactgc catcataggt gaaagatgag cagttccagt tcacttctat gataaccatt 3120ttgagatatc ttttatcatt tatgctatcc attggatatg taaattgaat tatttttacg 3180tccattacca catgacgtgg tatatggagc aactgcaact tttagtctct ccactatttc 3240tgtgatgtta atgaaatgct gctctcatga cacctgacca atttgtatgg aaacgatact 3300ctgacattgt tgcattttaa accggaacaa tgttttgccg ataatgaagt gaggaaggtt 3360gcagggatga ccggcctcca cagaaccgga gcaacggcga gatttcgagg cccgggtccg 3420tttctagtga caggatccct gcatatcaac aacttcagac cagtcaaaga gcgctcgaga 3480cgaccagggt caacagaata ttgatcaatg tctgggatgt cgccgttttt caactccgtc 3540tccttttcaa actgctcaat ctctgtgaga caagcacact cagataccta agtcgtgaca 5600agatgagtcc tggctcagct caagctaaga acaaggggcc caaagcatgc acaacatgcg 3660ctaaggctaa ggcaagatgc gtccccggcc ctcttgggag cctcaagtgc gacaggtaag 3720tcatgataat tggttcattt ttgggaatat cttgatggct tgcgtttaat cgtcgccgta 3780ccaggcttgt cttgtaccat atacatatgt ggtgtgagtt ggtggagagg tacatatgct 3840gacattagaa ttc3853<210>2<211>588<212>PRT<213>鐮孢屬<400>2Met Asp Ala Val Leu Arg Gln Ser Lys Ala Met Cys Pro Phe Met Lys1 5 10 15Thr Ala Thr Pro Ala Thr Leu Arg Ala Leu Ser Thr Set Ser Arg Ala20 25 30Leu Pro Ala Pro Ala Set Pro Cys Gly Gly Thr Met Set Lys Leu Gln35 40 45Leu Leu Gly Gln Arg Cys Pro val Met Ala Thr Arg Arg Leu Val Leu50 55 60Leu Asn Ala His Ser Set Lys Ala Ala Thr Met Val Cys Ser Asn Pro65 70 75 80Thr Pro Pro Gly Ile His Ala Asn Arg Lys Ala Ala Ser Ala Ser Pro85 90 95Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Gly Phe Gln Ser Pro Gly Lys Phe Asp100 105 110Tyr Glu Thr Phe Tyr Asn Thr Glu Leu Glu Lys Lys His Lys Asp Lys115 120 125Ser Tyr Arg Tyr Phe Asn Asn Ile Asn Arg Leu Ala Lys Glu Phe Pro130 135 140Arg Ala His Met Ser Asp Lys Glu Asp Arg Val Thr Val Trp Cys Ala145 150 155 160Asn Asp Tyr Leu Gly Met Gly Arg Asn Pro His Val Leu Asn Thr Met165 170 175His Lys Thr Leu Glu Glu Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Gly Thr Arg Asn180 185 190Ile Ser Gly His Asn Lys His Ala Val Glu Leu Glu Ala Thr Leu Ala195 200 205Lys Leu His Ala Lys Asp Ser Ala Leu Val Phe Ser Ser Cys Tyr Val210 215 220Ala Asn Asp Ala Thr Leu Ala Thr Leu Gly Ser Lys Leu Pro Glu Cys225 230 235 240Val Ile Leu Ser Asp Sar Leu Asn His Ala Sar Met Ile Gln Gly Ile245 250 255Arg His Ser Gly Thr Lys Lys Ile Val Phe Lys His Asn Asp val Gln260 265 270Asp Leu Glu Ala Lys Leu Ala Ser Leu Pro Leu His Val Pro Lys Ila275 280 285Ile Ala Phe Glu Ser Val Tyr Ser Met Cys Gly Ser Ile Gly Pro Ile290 295 300Glu Glu Ile Cys Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Ala Ile Thr Phe Leu305 3l0 315 320Asp Glu Val His Ala Val Gly Met Tyr Gly Leu His Gly Ala Gly Val325 330 335Ala Glu His Leu Asp Trp Glu Ala His Ala Asn Gly Ala Leu Arg Gly340 345 350Thr Ile Met Asp Arg Ile Asp Ile Ile Thr Gly Thr Leu Gly Lys Ala355 360 365Tyr Gly Cys Val Gly Gly Tyr Ila Ala Gly Sar Ala Lys Phe Ile Asp370 375 380Val Ile Arg Ser Leu Ala Pro Gly Phe Ile Phe Thr Thr Ser Leu Pro385 390 395 400Pro Ala Thr Met Ala Gly Ala Gln Thr Ser Ile Glu Tyr Gln Met Glu405 410 415Tyr Asp Gly Asp Arg Arg Leu Gln Gln Leu His Thr Arg Ala Val Lys420 425 430Glu Ala Met Asn Ala Arg Asp Ile Pro Val Ile Pro Asn Pro Ser His435 440 445Ile Ile Pro Val Leu Val Gly Asn Ala Glu Thr Ala Lys Ala Ala Ser450 455 460Asp Met Leu Leu Asn Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Gln Ser Ile Asn Tyr465 470 475 480Pro Thr Val Pro Val Gly Gln Glu Arg Leu Arg Ile Thr Pro Thr Pro485 490 495Gly His Val Lys Glu Tyr Arg Asn Gln Leu Val Glu Ala Val Asp Glu500 505 510Ile Trp Thr Arg Leu Asn Ile Lys Arg Thr Ser Asp Trp Ala Ala Glu515 520 525Gly Gly Phe Ile Gly Val Gly Glu Glu Ser Asn Val Gln Asn Pro Leu530 535 540Trp Thr Asp Lys Gln Leu Asn Val Glu Gln Ala Thr Lys Glu Ile Lys545 550 555 560Ala Thr Gly Gln Ala Ala Asn Gly Ile Thr Glu Ala Leu Leu Glu Leu565 570 575Glu Ile Lys Gln Ser Ser Glu Val Ala Thr Ala Ala580 585<210>3<211>23<212>DNA<213>鐮孢屬<400>3gtntggtgyt cnaaygayta yct 23<210>4<211>20<212>DNA<213>鐮孢屬<400>4ccnacngcrt gnacytcrtc 20<210>5<211>17<212>DNA<213>鐮孢屬<400>5ccatacttgt cggcaag17<210>6<211>16<212>DNA<213>鐮孢屬<400>6gaacgactac cttggc 16<210>7<211>13<212>DNA<213>鐮孢屬<400>7gatcgattta aat13<210>8<211>13<212>DNA<213>鐮孢屬<400>8tcgaatttaa atc 13<210>9<211>40<212>DNA<213>鐮孢屬<400>9gcgaattcat atttaaatgc cgaccagcag acggccctcg40<210>10<211>30<212>DNA<213>鐮孢屬<400>10gcgatatcat gatctctctg gtactcttcg30<210>12<211>30<212>DNA<213>鐮孢屬<400>11gcgatatcat cgaccagcag acggccctcg30<210>12<211>32<212>DNA<213>鐮孢屬<400>12gcgtttaaac atgatctctc tggtactctt cg 3權(quán)利要求
1．一種具有5-氨基酮戊酸合酶活性的分離的多肽，其選自(a)一種多肽，其具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少80％同一性的氨基酸序列；(b)由一種核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在高度嚴(yán)格條件可與(ⅰ)SEQ ID NO1的核酸序列或(ⅱ)其互補(bǔ)鏈或其至少100個核苷酸的亞序列雜交；(c)(a)或(b)的等位變體；和(d)(a)、(b)或(c)的一種片段，其中該片段具有5-氨基酮戊酸合酶活性。
2．權(quán)利要求1的多肽，其具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有80％同一性的氨基酸序列。
3．權(quán)利要求2的多肽，其具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有85％同一性的氨基酸序列。
4．權(quán)利要求3的多肽，其具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有90％同一性的氨基酸序列。
5．權(quán)利要求4的多肽，其具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有95％同一性的氨基酸序列。
6．權(quán)利要求5的多肽，其具有與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有97％同一性的氨基酸序列。
7．權(quán)利要求1的多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
8．權(quán)利要求1的多肽，它由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段組成。
9．權(quán)利要求8的多肽，它由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成。
10．權(quán)利要求2的多肽，它從鐮孢屬菌株中獲得。
11．權(quán)利要求10的多肽，它從Fusarium venenatum株中獲得。
12．權(quán)利要求1的多肽，它由一種核酸序列編碼，該核酸序列在高度嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈、或其至少100個核苷酸的亞序列雜交。
13．權(quán)利要求12的多肽，它由一種在高度嚴(yán)格條件下可與SEQ IDNO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼。
14．權(quán)利要求12的多肽，它從鐮孢屬菌株中獲得。
15．權(quán)利要求14的多肽，它從Fusarium venenatum株中獲得。
16．權(quán)利要求1的多肽，它由一種核酸序列編碼，該核酸序列在極高嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈、或其至少100個核苷酸的亞序列雜交。
17．權(quán)利要求16的多肽，它由一種在極高嚴(yán)格條件下可與SEQ IDNO1的核酸序列或其互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼。
18．權(quán)利要求16的多肽，它從鐮孢屬菌株中獲得。
19．權(quán)利要求18的多肽，它從Fusarium venenatum株中獲得。
21．權(quán)利要求1的多肽，它由大腸桿菌NRRL B-21855所含質(zhì)粒pZL3-3中包含的核酸序列所編碼。
22．權(quán)利要求1的多肽，其具有至少20％的SEQ ID NO2的5-氨基酮戊酸合酶活性。
23．一種多肽，其具有與權(quán)利要求1的多肽相同的5-氨基酮戊酸合酶活性。
24．一種分離的核酸序列，其包含編碼權(quán)利要求1的多肽的核酸序列。
25．一種分離的核酸序列，其包含在SEQ ID NO1的核酸序列中至少具有一個突變的核酸序列，其中該突變核酸序列編碼一種具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
26．一種分離的核酸序列，其產(chǎn)生方法是通過(a)在高度嚴(yán)格條件下將DNA與SEQ ID NO1的序列或其互補(bǔ)鏈或其至少100個核苷酸的亞序列雜交；和(b)分離該核酸序列。
27．權(quán)利要求26的分離的核酸序列，其產(chǎn)生方法是通過(a)在極高嚴(yán)格條件下將DNA與SEQ ID NO1的序列或其互補(bǔ)鏈或其至少100個核苷酸的亞序列雜交；和(b)分離該核酸序列。
28．一種核酸構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求24的核酸序列，該核酸序列與一種或多種引導(dǎo)多肽在適當(dāng)表達(dá)宿主中產(chǎn)生的控制序列有效連接。
29．一種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求28的核酸構(gòu)建體。
30．一種包含權(quán)利要求28的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
31．一種產(chǎn)生突變核酸序列的方法，包括(a)向SEQ ID NO1的核酸序列中引入至少一個突變，其中該突變核酸序列編碼一種具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽；和(b)回收該突變核酸序列。
32．一種由權(quán)利要求31的方法產(chǎn)生的突變核酸序列。
33．一種產(chǎn)生多肽的方法，其包括(a)培養(yǎng)含有編碼該多肽的權(quán)利要求32之突變核酸序列的菌株，產(chǎn)生含有該多肽的上清液；和(b)回收該多肽。
34．一種產(chǎn)生權(quán)利要求1的多肽的方法，其包括(a)培養(yǎng)一種菌株，產(chǎn)生含有該多肽的上清液；和(b)回收該多肽。
35．一種由權(quán)利要求34的方法產(chǎn)生的多肽。
36．一種產(chǎn)生權(quán)利要求1的多肽的方法，其包括(a)在適于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含含有編碼該多肽的核酸序列的核酸構(gòu)建體；和(b)回收該多肽。
37．一種由權(quán)利要求36的方法產(chǎn)生的多肽。
38．一種產(chǎn)生多肽的方法，其包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞含有在SEQ ID NO1的核酸序列中至少有一個突變的SEQ ID NO1的突變核酸序列，其中該突變核酸序列編碼一種具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽，和(b)回收該多肽。
39．一種由權(quán)利要求38的方法產(chǎn)生的多肽。
40．一種產(chǎn)生權(quán)利要求1的多肽的方法，其包括(a)在有利于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)引入了一種新轉(zhuǎn)錄單位的同源重組細(xì)胞，該轉(zhuǎn)錄單位包含調(diào)節(jié)序列、外顯子和／或與編碼該多肽的內(nèi)源核酸序列第二種外顯子有效連接的剪接供體位點；和(b)回收該多肽。
41．一種由權(quán)利要求40的方法產(chǎn)生的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有5－氨基酮戊酸合酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明也涉及包含該核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞,以及產(chǎn)生和應(yīng)用該多肽的方法。
文檔編號C12P13/00GK1281511SQ98811274
公開日2001年1月24日 申請日期1998年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月17日
發(fā)明者G·A·加姆伯塔 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司