專利名稱：葡萄樹的抗細(xì)菌性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明背景本發(fā)明涉及植物的抗病性。
葡萄是世界上廣泛種植的果樹作物，并且，用傳統(tǒng)方法育種很困難(Mullins等，生物技術(shù)81041-1045，1990)。為了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因葡萄栽培種，業(yè)已做出了相當(dāng)大的努力。最近，用胚胎發(fā)生愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，業(yè)已在葡萄栽培種轉(zhuǎn)化方面取得成功。業(yè)已獲得了下列植物的轉(zhuǎn)基因植物根莖栽培種Rupestris St．George(沙地葡萄(Vitis rupestris)，Mullins等，生物技術(shù)81041-1045，1990)，Richter110(沙地葡萄×冬葡萄(Vitis herlandieri)，LeGall等，植物科學(xué)102161-170，1994；Krastanova等，植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14550-554，1995)，41B(冬葡萄×沙地葡萄，Mauro等，植物科學(xué)11297-106，1995)，以及接穗栽培種Chancellor(葡萄，Kikkert等，植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)15311-316，1996)，Thompson Seedless(歐洲葡萄，Scorza等，美國園藝科學(xué)協(xié)會雜志，121616-619，1996)，和Superior Seedless(歐洲葡萄，Perl等，植物科學(xué)104193-200，1996)。導(dǎo)入所述葡萄栽培種的很多基因業(yè)已包被了葡萄病毒的蛋白基因，包括葡萄樹扇葉病毒(Mauro等，1995；Krastanova等，植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14550-554，1995)，葡萄樹色素花葉病毒(LeGall等，植物科學(xué)102161-170，1994)，和番茄環(huán)斑病毒(Scorza等，美國園藝科學(xué)協(xié)會雜志121616-619，1995)。另外，已報(bào)道了用編碼裂解肽，Shiva-1的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Scorza等，美國園藝科學(xué)協(xié)會雜志，121616-619，1995)。所述技術(shù)以及其它技術(shù)的應(yīng)用提供了在葡萄上通過工程方法產(chǎn)生抗病性的基礎(chǔ)；例如，培育能夠抵抗害蟲(例如，昆蟲和線蟲)侵害和病原性微生物(例如，真菌，細(xì)菌和病毒)侵害的轉(zhuǎn)基因葡萄植物。
在葡萄上發(fā)現(xiàn)的一種微生物誘導(dǎo)的病害是冠癭病。它是由農(nóng)桿菌(一種土壤寄居性格蘭氏陰性細(xì)菌)引起的病害。該細(xì)菌能長時(shí)間存在于土壤中的植物碎片上，該細(xì)菌具有最廣泛的宿主范圍，可以是任何植物的病原體。這種細(xì)菌能在植物的根、冠、干、和莖上誘導(dǎo)冠癭或植物腫瘤。
農(nóng)桿菌屬是通過拷貝并轉(zhuǎn)移腫瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒的一個(gè)片段(被稱為轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA))到植物細(xì)胞中，并整合到植物細(xì)胞基因組上而導(dǎo)致冠癭。T-DNA向植物細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)移取決于各種毒力(vir)基因的表達(dá)，這些基因同樣位于Ti質(zhì)粒上。一種毒力蛋白VirD2是位點(diǎn)專一性內(nèi)切酶，它在與VirD1蛋白結(jié)合之后，能識別左側(cè)和右側(cè)T-DNA臂序列的‘底鏈’并形成缺口(Stachel等，EMBO雜志，6857-863，1987)。VirD2蛋白被共價(jià)結(jié)合在所述缺口鏈的5’末端(Ward和Warnes，科學(xué)242927-930，1988)。然后，該單鏈T-DNA(ss T-DNA)被排出植物細(xì)胞(Tinland等，Proc．Natl．Acad．Sci．918000-8004，1994，Yusibov等，Proc．Natl．Acad．Sci．912994-2998，1994)。
目前，對將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞核中的假設(shè)是，ss T-DNA是由VirE2蛋白的分子包被的，業(yè)已證實(shí)該蛋白能結(jié)合ss T-DNA。包被過的T-DNA被稱為T-復(fù)合體，該復(fù)合體被認(rèn)為通過由VirB蛋白形成的一個(gè)孔輸送到植物細(xì)胞中。T-復(fù)合體可以利用植物蛋白途徑進(jìn)入細(xì)胞核；包括將具有細(xì)胞核定位信號的蛋白輸送到細(xì)胞核。VirD2和VirE2都是將T-DNA適當(dāng)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞核中所必需的。因此，T-復(fù)合體從農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，在這里T-DNA整合到植物基因組上。
農(nóng)桿菌屬的T-DNA編碼多種參與生長素和細(xì)胞分裂素生物合成途徑的酶。受感染的細(xì)胞會過量產(chǎn)生植物激素--生長素和細(xì)胞分裂素，導(dǎo)致快速和失控的細(xì)胞分裂，并形成冠癭或植物腫瘤。冠癭的形成會妨礙水分和養(yǎng)分在植物中的流動(dòng)。受感染的植物通常會變得不能結(jié)實(shí)，并且，更容易受不利環(huán)境條件的影響。這種病害對諸如葡萄的果樹作物特別有危害。
葡萄的冠癭病幾乎都是由葡萄農(nóng)桿菌(A．vitis)引起的，并在很小的程度上由根瘤農(nóng)桿菌(A．tumefaciens)引起。所述細(xì)菌感染葡萄樹的莖干上受傷的部位，并導(dǎo)致冠癭的形成。細(xì)菌能在葡萄樹的木質(zhì)部中存活，并通過受感染的繁殖材料擴(kuò)散。農(nóng)桿菌屬感染對葡萄園形成階段幼小葡萄樹的危害特別大；快速生長的冠癭能夠在一個(gè)季節(jié)將幼小的葡萄樹環(huán)剝(Agrios，植物病理學(xué)，第3版，學(xué)術(shù)出版社，1998)。受感染的葡萄樹會降低產(chǎn)量和生產(chǎn)能力。
本發(fā)明概述一般來說，本發(fā)明的特征是一種在植物上(例如，諸如葡萄屬的葡萄樹)上產(chǎn)生對細(xì)菌病原體的抗性的方法。該方法一般包括以下步驟(a)用一個(gè)毒力(vir)基因或其抗病原體片段轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b)再生所述植物細(xì)胞，以便提供分化的植物；和(c)選擇表達(dá)所述vir基因或其抗病原體片段的轉(zhuǎn)化植物，其中，所述vir基因或其抗病原體片段的表達(dá)能產(chǎn)生對植物細(xì)菌病原體的抗性。一般來說，將T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物中的方法是通過存在于農(nóng)桿菌屬的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)或根瘤誘導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒上的vir片段編碼的基因產(chǎn)物介導(dǎo)的?？捎糜诒景l(fā)明的代表性vir基因包括，但不限于virE2和virD2。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將vir基因或其抗病原體片段整合到植物的基因組中。所述vir基因優(yōu)選為virE2、virD2或這兩者；或是突變體(例如，抗-病原體vir基因片段，如編碼諸如virE2缺失B、virE2缺失C、或virE2缺失E的Vir蛋白的缺失的基因)。能介導(dǎo)增強(qiáng)對冠癭病的抗性的vir序列被認(rèn)為可用于本發(fā)明。在本文中，術(shù)語“片段”在用于表達(dá)核酸分子序列時(shí)表示至少5個(gè)連續(xù)的核苷酸，優(yōu)選至少10個(gè)連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選至少20-30個(gè)連續(xù)的核苷酸，最優(yōu)選至少40-80或更多個(gè)連續(xù)的核苷酸?？梢陨a(chǎn)vir基因(例如，virE2或virD2)的天然片段或合成片段，隨后按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法將其整合到任何標(biāo)準(zhǔn)植物表達(dá)載體(例如，本文所披露的載體)上?？梢园凑諛?biāo)準(zhǔn)方法(例如，本文所披露的方法)測定所述vir基因片段(例如，編碼virE2基因的缺失B、缺失C、缺失D或缺失E的vir基因)在植物中表達(dá)時(shí)產(chǎn)生對細(xì)菌性植物病原體的抗性的能力。能產(chǎn)生植物細(xì)菌病原體抗性的片段被稱為“抗病原體片段”。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植物是葡萄樹或葡萄樹的部分(例如，體細(xì)胞胚、接穗、或根莖)；所述細(xì)菌病原體是葡萄農(nóng)桿菌或根瘤農(nóng)桿菌；而對葡萄農(nóng)桿菌或根瘤農(nóng)桿菌的抗性能減弱冠癭的形成或所述細(xì)菌在受感染的植物上的生長。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述vir基因(或其抗病原體片段)源于農(nóng)桿菌屬(例如，葡萄農(nóng)桿菌、根瘤農(nóng)桿菌、毛根農(nóng)桿菌)的腫瘤誘導(dǎo)(Ti)或根誘導(dǎo)(Ri)質(zhì)粒。所述Ti質(zhì)粒的例子包括，但不限于胭脂氨酸、vitopine、章魚氨酸、章魚氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／農(nóng)桿氨酸、succinamopine、或農(nóng)桿氨酸型Ti質(zhì)粒。所述vir基因序列或抗病原體片段是按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的。
本文所披露的方法可用于在多種葡萄樹(例如，葡萄、雜交葡萄、和Euvitis和Muscadinia亞屬的所有成員)上產(chǎn)生對細(xì)菌病原體(例如，葡萄農(nóng)桿菌或根瘤農(nóng)桿菌)的抗性或耐性或這兩者，所述葡萄樹包括接穗和根莖栽培種。典型的接穗栽培種包括，但不限于被稱為鮮食葡萄或葡萄干的品種以及用于生產(chǎn)葡萄汁和葡萄酒的品種，如Cabernet Franc，Cabernet Sauvignon，Chardonnay(例如，CH01，CH02，CH Dijon)，Merlot，Pinot Noir(PN，PN Dijon)，Semillon，White Riesling，Lambrusco，Thompson Seedless，AutumnSeedless，Niagrara Seedless，和Seval Blanc。可用于本發(fā)明的根莖栽培種包括，但不限于沙地葡萄Constantia，沙地葡萄St．George，加州葡萄(Vitis caiifornia)，谷地葡萄(Vitisgirdiana)，圓葉葡萄(Vitis rotundifolia)，圓葉葡萄Carlos，Richter 110(冬葡萄×沙地葡萄；“11OR”)，101-14 Millarderet de Grasset(河岸葡萄(Vitis riparia)×沙地葡萄；“101-14Mgt”)，Teleki 5C(冬葡萄×河岸葡萄)，Courderc 3309(河岸葡萄×沙地葡萄；“C3309”)，Riparia Gloire de Montpellier(河岸葡萄)，5BB Teleki(選擇性Kober，冬葡萄×河岸葡萄)，S04(冬葡萄×沙地葡萄)，41B Millardet(歐洲葡萄×冬葡萄)，Ramsey(Vitis champinii)，K5140(Vitis．Champinii×河岸葡萄)，和039-16(歐洲葡萄×圓葉葡萄)。
本發(fā)明的特征還在于由本文所披露的任何轉(zhuǎn)基因葡萄樹或葡萄樹部分產(chǎn)生的接穗、根莖、體細(xì)胞或合子胚胎、細(xì)胞、或種子，例如，本發(fā)明的特征是用編碼Vir蛋白或其抗病原體片段的核酸分子轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物，其中，所述核酸分子的表達(dá)能產(chǎn)生對細(xì)菌病原體(例如葡萄農(nóng)桿菌或根瘤農(nóng)桿菌)的抗性。本發(fā)明還包括用能產(chǎn)生對細(xì)菌病原體的抗性的核酸分子(例如，virE2缺失B轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，通過將該轉(zhuǎn)基因與植物表達(dá)控制片段可操作地連接進(jìn)行定位表達(dá))轉(zhuǎn)化過的葡萄細(xì)胞。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法(例如本文所披露的方法)用所述葡萄細(xì)胞再生根莖、接穗、體細(xì)胞胚胎、或種子。
“定位表達(dá)”表示將所述DNA分子定位于靠近指導(dǎo)該序列轉(zhuǎn)錄的DNA序列處。
“表達(dá)控制區(qū)域”是指足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的任何序列。在本發(fā)明中包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，所述元件足以使得啟動(dòng)子依賴型基因表達(dá)可以控制細(xì)胞、組織、或器官特異性基因表達(dá)，或者能夠用外部信號或制劑(例如，光線、病原體、創(chuàng)傷、應(yīng)激或激素誘導(dǎo)型元件或組成型元件)誘導(dǎo)的元件；所述元件可以位于天然基因的5’或3’區(qū)域或加工進(jìn)轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。
“可操作地連接”是指一個(gè)基因和一個(gè)調(diào)控序列的連接使得當(dāng)合適的分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)結(jié)合于該調(diào)控序列上時(shí)基因能夠表達(dá)。
“植物細(xì)胞”是指由半透性膜包圍并含有質(zhì)體的任何自身繁殖的細(xì)胞。在本文中，植物細(xì)胞是從(但不限于)種子、懸浮培養(yǎng)物、胚胎、分生組織部位、愈傷組織、原生質(zhì)體、葉片、根、芽、體細(xì)胞和合子胚胎、以及生殖或營養(yǎng)組織或器官的任何部分獲得的細(xì)胞。
“植物部分”是指從完整的植物或植物細(xì)胞獲得的一部分、片段、或器官。典型的植物部分包括，但不限于體細(xì)胞胚胎、葉片、果實(shí)、接穗、和根莖。
“轉(zhuǎn)基因的”是指包括一個(gè)DNA序列的任何細(xì)胞，該DNA序列通過人工方法插入一種細(xì)胞，并成為由該細(xì)胞形成的生物(整合的或染色體外的)的基因組的部分。在本文中，轉(zhuǎn)基因生物通常是指轉(zhuǎn)基因葡萄樹或葡萄樹部分，而所述DNA(例如轉(zhuǎn)基因)是通過人工方法插入所述植物細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)區(qū)室中。所述轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因葡萄樹或葡萄樹部分優(yōu)選能表達(dá)至少一個(gè)vir核酸序列(例如，vir基因或其抗病原體片段，如源于葡萄農(nóng)桿菌菌株CG450的virE2缺失B)。在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物可以表達(dá)一種以上的vir序列或vir序列的組合(例如，源于不同Ti質(zhì)粒的vir核酸序列，如胭脂氨酸、vitopine、章魚氨酸、章魚氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／農(nóng)桿氨酸、succinamopine、或農(nóng)桿氨酸型Ti或Ri質(zhì)粒)。
“轉(zhuǎn)基因”是指通過人工方法插入一種細(xì)胞，并成為由該細(xì)胞形成的生物的一部分(整合到其基因組上或者保持在染色體外)的任何DNA片段。所述轉(zhuǎn)基因可以包括對轉(zhuǎn)基因生物來說為部分或完全異源(即外源)的基因，或者可以是與該生物的內(nèi)源基因同源的基因。
“對植物細(xì)菌病原體的抗性”是指在轉(zhuǎn)基因葡萄(或葡萄部分或細(xì)胞、種子或其體細(xì)胞胚胎)上對病原體(例如，葡萄農(nóng)桿菌或根瘤農(nóng)桿菌)的抗性水平高于相對于對照葡萄(例如非轉(zhuǎn)基因葡萄樹)的抗性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在轉(zhuǎn)基因葡萄樹上對病原體的抗性水平至少比對照葡萄樹的抗性水平高5-10％(優(yōu)選20％、30％、或40％)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，對所述病原體的抗性比對照葡萄樹高50％、60％、更優(yōu)選75％或90％；最優(yōu)選比對照葡萄樹高100％的抗性。所述抗性水平是用常規(guī)方法測定的。例如，對農(nóng)桿菌屬的抗性水平可以通過比較轉(zhuǎn)基因葡萄樹的物理特征(例如，植物高度和重量，或通過比較病害癥狀，例如，推遲的冠癭形成，變小的冠癭，或莖干減弱的畸形)或通過比較在所述植物上存活的病原體群體(例如，通過測定轉(zhuǎn)基因植物和對照植物上農(nóng)桿菌屬的系統(tǒng)性群體)。
如上文所述，業(yè)已發(fā)現(xiàn)vir核酸序列virE2缺失B的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因葡萄樹產(chǎn)生對由農(nóng)桿菌屬細(xì)菌導(dǎo)致的冠癭病的抗性。因此，由于沒有其它能有效控制葡萄上的農(nóng)桿菌的方法，本發(fā)明為葡萄種植者提供了多種重要的改進(jìn)和優(yōu)點(diǎn)。例如，通過證實(shí)所述序列能有效抗冠癭病的形成，本發(fā)明提供了一種預(yù)防所述病害的有效并且經(jīng)濟(jì)的方法。所述預(yù)防能減弱或降低對傳統(tǒng)措施的需要，例如，化學(xué)處理，葡萄種植者通常用這種方法來控制農(nóng)桿菌屬的蔓延，并在葡萄園中提供對導(dǎo)致這種病害的病原體的抗性的預(yù)防作用。另外，由于表達(dá)vir核酸序列或抗病原體片的葡萄植物不太容易受農(nóng)桿菌屬(例如，葡萄農(nóng)桿菌和根瘤農(nóng)桿菌)的影響，并因此不太容易受冠癭病的影響，本發(fā)明還提供了較高的產(chǎn)量效率，以及改善的品質(zhì)、顏色、香味、和葡萄產(chǎn)量。另外，由于本發(fā)明降低了對化學(xué)預(yù)防葡萄樹病原體的必要性，它有利于保護(hù)葡萄園種植的環(huán)境。
通過閱讀下面的說明書及其優(yōu)選實(shí)施方案和權(quán)利要求書可以了解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。
詳細(xì)說明首先說明附圖。
附1是表示T-DNA片段的部分圖譜的示意圖，該片段含有受串接的CaMV35S啟動(dòng)子控制的virE2缺失B轉(zhuǎn)基因。
圖2用源于根瘤農(nóng)桿菌菌株A6的virE2缺失B基因轉(zhuǎn)化101-Mgt的柱形圖，所得到的若干轉(zhuǎn)基因品系與對照植物相比具有抗性。
概述用根瘤農(nóng)桿菌和葡萄農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳學(xué)研究，以便鑒定可用于增強(qiáng)葡萄植物對病原體感染的抗性的Vir蛋白產(chǎn)物(例如，virE2基因的缺失突變體)。用根瘤農(nóng)桿菌菌株C58(該菌株攜帶胭脂氨酸型Ti質(zhì)粒)、根瘤農(nóng)桿菌菌株A6(該菌株攜帶章魚氨酸型Ti質(zhì)粒)、和葡萄農(nóng)桿菌菌株CG450(該菌株攜帶vitopineTi質(zhì)粒)制備突變型virE2缺失B轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體(Citovsky等，科學(xué)2561802-1806，1992)。virE2缺失B基因編碼缺少215個(gè)羧基末端氨基酸的VirE2蛋白。這種截短缺少了VirE2蛋白的單鏈T-DNA(ssT-DNA)結(jié)合域。然后用一個(gè)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化葡萄根莖(例如Courderc3309(河岸葡萄×沙地葡萄；“C3309”)，101-14Millarder et DE Grasset(河岸葡萄×沙地葡萄；“101-14Mgt”，和Richter110(冬葡萄×沙地葡萄；“110R”)，以及煙草(例如，Nicotiana benthamiana)，該轉(zhuǎn)化體能表達(dá)virE2基因的缺失B(

圖1)。制備表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，隨后評價(jià)對冠癭病的抗病性。
下面的實(shí)施例只是用于說明本發(fā)明的目的的，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。
virE2缺失B轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體和農(nóng)桿菌屬菌株按如下方法制備virE2缺失B基因構(gòu)建體。virE2缺失B基因是突變型virE2基因，缺少編碼ssDNA結(jié)合基序的片段(Citovsky等，科學(xué)2561802-1805，1992)。所述基因是從根瘤農(nóng)桿菌菌株C58和根瘤農(nóng)桿菌菌株A6獲得的，所述菌株分別具有胭脂氨酸和章魚氨酸型Ti質(zhì)粒。virE2缺失B基因還可以從攜帶vitopine型Ti質(zhì)粒的葡萄農(nóng)桿菌菌株CG450制備。由根瘤農(nóng)桿菌菌株C58和葡萄農(nóng)桿菌菌株CG450DNA擴(kuò)增virE2缺失B基因，使用引物5'nop(5’-TACTTACCATGGATCCGAAGGCCAAGGC；序列1)，該引物與胭脂氨酸virE2基因的5’編碼區(qū)相同， 和3’nop(5’-TCTTGACCATGGCTATCGATTCTCGCCGGCGGAACTC；序列2)，與相同基因的1000-1020號核苷酸位置雜交。由根瘤農(nóng)桿菌菌株A6擴(kuò)增章魚氨酸型virE2缺失B突變型，使用寡聚體引物5’oct(與章魚氨酸型virE2基因的5’區(qū)相同)和3’oct(互補(bǔ)于從翻譯起始密碼子開始的927-951號核苷酸位置)。
按如下方法進(jìn)行源于不同Ti質(zhì)粒的virE2缺失B基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。用每一種寡聚體引物各0．5微克按照生產(chǎn)商的說明(Perkin-Eller Cetus)擴(kuò)增virE2缺失B基因。PCR循環(huán)為在92℃下1分鐘(變性)，在50℃下1分鐘(退火)，和在72℃下2分鐘(聚合)。直接加樣，并在1．2％的瓊脂糖凝膠上分離。從凝膠中提取分離的virE2缺失B片段，乙醇沉淀，并溶解在20微升蒸餾水中。然后用限制性酶NcoI消化凝膠分離的突變型基因片段，并直接克隆到NcoI消化過的植物表達(dá)載體pEPT8上。因此，rirE2編碼序列的表達(dá)是由融合在表達(dá)載體pEPT8的苜?；ㄈ~病毒(AIMV)的5’非翻譯前導(dǎo)序列上的雙CaMV35S啟動(dòng)子控制的。用HindIII從所述構(gòu)建體上切除所述表達(dá)框，并連接到用相同的酶裂解過的植物轉(zhuǎn)化載體pBIN19上。按照標(biāo)準(zhǔn)方法通過電穿孔將所得到的轉(zhuǎn)化載體pBIN19-EPT8-virE2-C58(圖1)、pBIN19-EPT8-virE2-A6、和pBIN19-EPT8-virE2-CG450轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌菌株C58sZ707中。
用virE2缺失B轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化葡萄和煙草用下面的農(nóng)桿菌屬共培養(yǎng)方法，用virE2缺失B轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化C3309、101-14Mgt、和110R的胚胎發(fā)生愈傷組織。
能夠產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的胚胎發(fā)生愈傷組織是按照標(biāo)準(zhǔn)方法用培養(yǎng)的花藥培育的。簡單地講，通過Rajasekaran和Mullins的方法用根莖克隆C3309、101-14Mgt、和110R的花藥開始愈傷組織培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志30399-407，1979)。在春天和夏初從大田生長的植物上在開花之前采集芽，從團(tuán)塊中取出，并在70％乙醇中進(jìn)行表面消毒1-2分鐘。將所述芽轉(zhuǎn)移到1％次氯酸鈉中浸泡15分鐘，然后在消毒雙蒸餾水中漂洗3次。在無菌條件下將半透明的黃色花藥從花芽中切除。在無菌條件下剝離花藥并以每個(gè)培養(yǎng)皿40或50個(gè)花藥的密度鋪平板在起始培養(yǎng)基上。在28℃下在黑暗中培養(yǎng)花藥。在30天內(nèi)形成胚胎發(fā)生愈傷組織。
在28℃下在震蕩培養(yǎng)器上LB培養(yǎng)基中生長用于轉(zhuǎn)化的含有virE2缺失B轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的根瘤農(nóng)桿菌的過夜培養(yǎng)物。以3000rpm的速度離心細(xì)菌5分鐘，并重新懸浮在MS液體培養(yǎng)基(A600nm下OD0．4-0．5)，將具有球形或心形胚胎的愈傷組織浸泡在細(xì)菌懸浮液中15分鐘，吸水干燥，并轉(zhuǎn)移到含有乙酰丁香酮(100μM)的HMG培養(yǎng)基上。在28℃下在黑暗中培養(yǎng)胚胎發(fā)生愈傷組織和所述細(xì)菌48小時(shí)。然后在添加了頭孢噻腭(300微克／毫升)和羧卞青霉素(400微克／毫升)的MS液體中洗滌所述植物材料2-3次。將所述材料轉(zhuǎn)移到含有相同抗生素的HMG培養(yǎng)基中1-2次。2周之后，將胚胎發(fā)生愈傷組織從含有20或40毫克／升卡那霉素和300毫克／升頭孢噻腭，加200毫克／升羧卞青霉素的HMG培養(yǎng)基上，以便選擇轉(zhuǎn)基因胚胎。在選擇培養(yǎng)基上生長3-4個(gè)月，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到不含卡那霉素的HMG、MGC、或MSE上。在大約4個(gè)月之后，將所有材料轉(zhuǎn)移到不含抗生素的培養(yǎng)基上。在下胚軸形成之后將胚胎轉(zhuǎn)移到不含抗生素的發(fā)根培養(yǎng)基上。
將未轉(zhuǎn)化過的愈傷組織生長在含或不含卡那霉素的相同培養(yǎng)基上作為對照，以便證實(shí)抗生素選擇的效率，和所述材料的再生能力。煙草的轉(zhuǎn)化用葉片轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草植物N．tabacum和N．benthamiana(Horsch等，科學(xué)2271229，1985)。二元載體pBINl9-EPT8-virE2-C58和pBINl9-EPT8-virE2-A6與葡萄轉(zhuǎn)化中所使用的相同(圖1)。從所述葉片再生芽，從原始的外殖體上切除，并讓其在含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基上長根。讓煙草植物自交，并將R1代用于抗性分析。
轉(zhuǎn)基因植物的鑒定回收轉(zhuǎn)基因植物，并通過常規(guī)NPTII-ELISA鑒定?；厥辙D(zhuǎn)基因煙草的轉(zhuǎn)基因C3309、101-14Mgt、和110R植物和品系。按下述方法從選擇的植物的幼小葉片中提取總DNA，并通過常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測所述轉(zhuǎn)基因的存在。在大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植物中觀察到相當(dāng)于virE2缺失B轉(zhuǎn)基因的1．020kb PCR產(chǎn)物。
通過Southern印跡雜交進(jìn)一步分析選擇的轉(zhuǎn)基因C3309植物的基因拷貝數(shù)，使用1．0kbvirE2缺失B基因作為探針。易感的和抗性植物具有較少的轉(zhuǎn)基因拷貝(1-4)。通過下面所述的Northern印跡分析檢測virE2缺失B基因mRNA的含量。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因抗性植物所表達(dá)的virE2缺失B mRNA的含量高于易感植物的。
對于上述分析來說，按照Krastanova等所述方法從植物中分離總DNA(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14550-554，1995)。按上述方法對總的植物基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用45℃的退火溫度而不是50℃。對于Southern印跡雜交來說，用HandIII、PstI、和KpnI消化20微克的DNA，在1％的瓊脂糖TBE凝膠上對總的基因組DNA進(jìn)行電泳，并吸印到Nytran濾膜上(Schleicher和Schuell，Keene，NH)，按照生產(chǎn)商的說明。在80℃的烘箱中干燥所述印跡1小時(shí)，然后按照Sambrook等所述方法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，N．Y．1989)。用購自Gibco BRL(Gaithersburg，MD)的RadPrime DNA標(biāo)記系統(tǒng)構(gòu)建32PdCTP-標(biāo)記的探針。用與提取DNA相同的方法從轉(zhuǎn)基因植物中提取RNA，在-20℃下用2M氯化鋰沉淀總核酸過夜，以便選擇總的RNA。按照Sambrook等披露的方法在變性甲醛凝膠上對RNA(20微克)進(jìn)行電泳(同上)，并吸印到Nytran-N上，并用與Southern印跡相同的探針進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。
抗病性按以下方法測定葡萄植物的轉(zhuǎn)基因品系對冠癭病的抗性。按照Pu和Goodman披露的方法接種葡萄莖節(jié)間(生理學(xué)和分子植物病理學(xué)41241-254，1992)，用于該實(shí)驗(yàn)的接種物是根瘤農(nóng)桿菌菌株C58或根瘤農(nóng)桿菌菌株A6。在28℃下在PDA培養(yǎng)基上生長細(xì)菌48小時(shí)，如果合適的話可以含有抗生素．對于接種來說，將細(xì)菌重新懸浮在無菌雙蒸餾水(A600nm=0．1)，對于C58來說大約為1×108cfu／ml。將5微升接種物或其稀釋液涂在切割的葡萄節(jié)間上，并在接種后(dpi)7天、14天、和21天觀察所述植物上腫瘤的形成。
用根瘤農(nóng)桿菌菌株C58或A6接種的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ找恢碌乇憩F(xiàn)出腫瘤形成。在易感植物上，偶爾會在7dpi觀察到冠癭形成，不過，通常在大約10dpi出現(xiàn)，并且在14dpi容易觀察到。分析一級轉(zhuǎn)化體，并發(fā)現(xiàn)某些一級轉(zhuǎn)化體能抑制冠癭形成。接種過的某些芽能夠形成腫瘤。如果與未轉(zhuǎn)化的芽相比冠癭受到50％或50％以上的抑制即可將該植物統(tǒng)計(jì)為抗性的。
業(yè)已制備了對冠癭具有抗性的品系C3309、101-14Mgt、和110R。在圖2中示出了在用根瘤農(nóng)桿菌菌株A6接種轉(zhuǎn)基因101-14Mgt(表達(dá)virE2缺失B轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因是由根瘤農(nóng)桿菌菌株A6制備的)之后對冠癭形成的抗性的典型結(jié)果。
另外，能表達(dá)源于根瘤農(nóng)桿菌菌株C58的virE2缺失B轉(zhuǎn)基因的葡萄根莖C3309由大約45％的植物表現(xiàn)出對冠癭病的顯著抗性(表1，見下文)。
表1通過接種根瘤農(nóng)桿菌菌株C58評價(jià)表達(dá)virE2缺失B轉(zhuǎn)基因的葡萄根莖C3309轉(zhuǎn)基因品系對冠癭的抗性
在體外用根瘤農(nóng)桿菌菌株C58的細(xì)菌懸浮液(大約107cfu／ml)接種每一個(gè)植物的15-20個(gè)芽的切片。如果在接種之后6天所述芽接種物形成冠癭的比率低于40％就認(rèn)為該植物是抗性的。來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏难?00％的形成冠癭。
按如下方法分析煙草對冠癭病的抗性。讓轉(zhuǎn)基因煙草植物生長到6厘米大小，然后用10微升農(nóng)桿菌屬菌株CG49或K306的過夜培養(yǎng)懸浮液接種所述植物。在2-3周之后檢查植物的腫瘤形成。
還評價(jià)了由農(nóng)桿菌菌株C58(攜帶胭脂氨酸型Ti質(zhì)粒)和根瘤農(nóng)桿菌菌株A6(攜帶章魚氨酸型Ti質(zhì)粒)制備的表達(dá)virE2缺失B基因的煙草品系對冠癭病的抗性。用葡萄農(nóng)桿菌菌株CG49(攜帶胭脂氨酸型Ti質(zhì)粒)或葡萄農(nóng)桿菌菌株K306(攜帶章魚氨酸型Ti質(zhì)粒)接種所述植物。該實(shí)驗(yàn)的典型結(jié)果在下面的表2中示出。
表2用葡萄農(nóng)桿菌菌株CG49(攜帶胭脂氨酸型Ti質(zhì)粒)和葡萄農(nóng)桿菌菌株K306(攜帶章魚氨酸型Ti質(zhì)粒)接種能表達(dá)來自根瘤農(nóng)桿菌菌株C58(攜帶胭脂氨酸型Ti質(zhì)粒)和根瘤農(nóng)桿菌菌株A6(攜帶章魚氨酸型Ti質(zhì)粒)的virE2缺失B轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因N．benthamiana的典型抗性資料。
通過Northern印跡測定virE2表達(dá)，+號的個(gè)數(shù)表示所述信號的強(qiáng)度。用大約為107cfu／ml和大約106cfu／ml的病原體濃度接種植物。0=在接種位點(diǎn)無冠癭或膨脹。0．5=在接種位點(diǎn)有有限的小的冠癭；而3=在接種位點(diǎn)有很大的冠癭。所有非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锒寄苄纬?-3級的冠癭。
在接種葡萄農(nóng)桿菌屬菌株CG49或葡萄農(nóng)桿菌菌株k306時(shí)，能表達(dá)源于根瘤農(nóng)桿菌菌株A6的章魚氨酸virE2缺失B轉(zhuǎn)基因或源于根瘤農(nóng)桿菌菌株C58的胭脂氨酸virE2缺失B轉(zhuǎn)基因的煙草品系表現(xiàn)出在冠癭病方面有大約50％的減弱(表2，出處同上)。分離vir基因或其抗病原體片段任何Ri或Ti質(zhì)粒(例如，胭脂氨酸、vitopine、章魚氨酸、章魚氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／農(nóng)桿氨酸、succinamopine、或農(nóng)桿氨酸型Ti質(zhì)粒)均可用作vir基因或其抗病原體片的分子克隆的核酸來源。例如，vir基因(例如，virE2或virD2)的分離包括分離編碼具有vir-相關(guān)結(jié)構(gòu)、特性、或活性的蛋白的DNA序列。根據(jù)所披露的有關(guān)virE2的(例如，參見GenBank保藏號2773266，138480，138481，95134，77949，737146，39124，154801和154727)和virD2核苷酸和氨基酸序列(例如，參見GenBank保藏號138464，138463，138465，95129，95128，77931，95077，737141，39000，154829和154796)，可以用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)方法和技術(shù)分離vir編碼序列。
在一種具體實(shí)施例中，本文所披露的vir序列可以與常規(guī)核酸雜交篩選方法一起使用。所述雜交技術(shù)和篩選方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，例如，參見Benton和Davis，科學(xué)196180，1977；Grunstein和Hogness，Proc．Natl．Acad．Sci．USA72396l，1975；Ausubel等，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，Wiley Interscience，紐約；Berger和Kimmel，分子克隆技術(shù)指南，1987，學(xué)術(shù)出版社，紐約；和Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，紐約，1989。在一種具體實(shí)施例中，可將virE2或virD2核苷酸序列的全部或部分(由Citovsky披露，見下文)用作探針篩選重組Ti質(zhì)粒DNA文庫中具有與virE2或virD2基因相同的序列的基因。通過噬斑或菌落雜交用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測雜交序列，例如，下文所披露的方法。
另外，使用vir基因的氨基酸序列的全部或一部分及其遺傳密碼，人們可以方便地設(shè)計(jì)vir-專一性寡核苷酸探針，包括vir簡并寡核苷酸探針(即，特定氨基酸序列的所有可能編碼序列的混合物)。所述寡核苷酸可以基于DNA鏈的序列和vir序列的任何合適部分。提供了設(shè)計(jì)和制備所述探針的一般方法，例如，參見Ausubel等，1996，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，Wiley Interscience，紐約和Berger和Kimmel，分子克隆技術(shù)指南，1987，學(xué)術(shù)出版社，紐約。所述寡核苷酸可用于vir基因分離，將其用作探針能夠與vir互補(bǔ)序列雜交，或者用作引物用于各種擴(kuò)增技術(shù)，例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆方法(例如，本文所披露的方法)，如果需要，可將不同寡核苷酸探針的組合用于篩選重組DNA文庫。所述寡核苷酸可以用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行可檢測的標(biāo)記，并用于檢測來自重組DNA文庫的濾膜復(fù)制體。按照本領(lǐng)域已知方法制備重組DNA文庫，例如，參見Ausubel等(同上)，或可以從商業(yè)渠道獲得。一旦鑒定了vir核苷酸序列，就按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行克隆和操作，并用于構(gòu)建本文所披露的植物表達(dá)載體。
植物轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建除了用virE2缺失B基因轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化葡萄植物之外，還可以通過用野生型virE2基因或其它virE2突變型基因，例如，缺失C(減弱多肽ssT-DNA和NSE1結(jié)合活性，例如，通過缺失virE2基因的228-244號氨基酸)或缺失D(減弱多肽ssT-DNA和NSE2結(jié)合活性)轉(zhuǎn)化所述植物還可以獲得對農(nóng)桿菌屬感染的抗性。VirE2缺失C突變的一個(gè)例子包括生產(chǎn)編碼缺少228-244號氨基酸的VirE2蛋白的轉(zhuǎn)基因(Citovsky等，科學(xué)2561802-1806，1992)。VirE2缺失D突變的一個(gè)例子包括生產(chǎn)編碼缺少296-3lO號氨基酸的VirE2蛋白的轉(zhuǎn)基因(Citovsky等，同上)。還可以用virD2野生型或virD2突變型基因轉(zhuǎn)化葡萄植物，以便產(chǎn)生對農(nóng)桿菌屬腫瘤形成能力的抗性。VirD2基因上的突變還能減弱農(nóng)桿菌屬ssT-DNA的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)(例如，能夠抑制T-DNA鏈輸入植物細(xì)胞核的突變，能夠增強(qiáng)細(xì)胞核定位信號的活性的突變，或能防止VirD2蛋白與T-鏈結(jié)合的突變)。
當(dāng)獲得了編碼所需要的野生型或突變型vir基因的DNA序列時(shí)，將所述序列插入合適的植物轉(zhuǎn)化載體上，用于轉(zhuǎn)化葡萄植物。公眾可以獲得多種適于穩(wěn)定或染色體外感染植物細(xì)胞或建立轉(zhuǎn)基因植物的載體；如披露于下列文獻(xiàn)中的載體Pouwels等(同上)，Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)。用于構(gòu)建所述細(xì)胞系的方法披露于諸如Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)的文獻(xiàn)中?？捎糜谠谄咸褬渲斜磉_(dá)轉(zhuǎn)基因的載體的例子還披露于以下文獻(xiàn)中Scorza等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14589-592，1995)，Baribault等(實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志411045-1049，1990)，Mullins等(生物技術(shù)81041-1045，1990)，Nakano等(實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志45649-656，1994)，Kikker等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)15311-316，1995)，Krastanova等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)1550-554，1995)，Scorza等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14589-592，1994)，Scorza等(美國園藝科學(xué)協(xié)會雜志121616-619，1996)，Martinelli等(理論應(yīng)用遺傳學(xué)88621-628，1994)和Legall等(植物科學(xué)102161-170，1994)。
通常，植物表達(dá)載體包括(1)一個(gè)受5’和3’表達(dá)控制序列的轉(zhuǎn)錄控制的克隆基因(例如，野生型或突變型vir基因)和(2)一個(gè)顯性選擇標(biāo)記。如果需要，所述植物表達(dá)載體還可以包括一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控序列(例如，能產(chǎn)生誘導(dǎo)型或組成型、病原體或創(chuàng)傷誘導(dǎo)、環(huán)境或發(fā)育調(diào)控、或細(xì)胞或組織專一性表達(dá)的序列)，一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)RNA加工信號，一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，和／或一個(gè)聚腺苷酸化信號。
在其組成部分中，將編碼野生型或突變型vir基因的DNA序列與具有能夠在宿主葡萄樹細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始控制片段的DNA構(gòu)建體結(jié)合。一般來說，該構(gòu)建體通常包括能夠在植物中起作用的調(diào)控區(qū)，該調(diào)控區(qū)能夠改變野生型或突變型Vir蛋白的產(chǎn)生，如本文所披露的。所述序列、突變序列、或其片段的5’末端可以與一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)接合，例如，天然存在于植物結(jié)構(gòu)基因的5’上游區(qū)的序列。有多種轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可供使用，這些轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以提供組成型或誘導(dǎo)型調(diào)控。
對于需要發(fā)育、細(xì)胞、組織、激素、或環(huán)境表達(dá)的應(yīng)用來說，合適的5’上游非編碼區(qū)是從其它基因獲得的，例如，從在分生組織發(fā)育、種子發(fā)育、胚胎發(fā)育、葉片發(fā)育、莖發(fā)育、和蔓發(fā)育期間調(diào)節(jié)的基因獲得。
還可以在本發(fā)明DNA構(gòu)建體上提供轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)可以從常規(guī)的基因來源(例如，NOS或35S CaMV終止子)任何常見轉(zhuǎn)錄終止區(qū)提供。所述轉(zhuǎn)錄終止區(qū)優(yōu)選還包括至少1-3kb的獲得該終止區(qū)的結(jié)構(gòu)基因的3’序列。具有野生型或突變型vir基因，如用于表達(dá)的感興趣的DNA序列的植物表達(dá)構(gòu)建體可用于多種葡萄樹上。所述遺傳工程植物可用于多種商業(yè)和農(nóng)業(yè)目的。重要的是，本發(fā)明可應(yīng)用于所有葡萄樹或葡萄樹部分，并可方便地應(yīng)用于任何新的或改進(jìn)的葡萄轉(zhuǎn)化或再生方法。
所述表達(dá)結(jié)構(gòu)至少包括一個(gè)可操作地連接于至少一個(gè)野生型或突變型vir基因序列上的啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明，一種有用的植物啟動(dòng)子的例子是花葉病毒啟動(dòng)子，例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子能夠在大多數(shù)植物組織中進(jìn)行高水平表達(dá)，并且所述啟動(dòng)子的活性不取決于由病毒編碼的蛋白。CaMV是35S和19S啟動(dòng)子的來源。在轉(zhuǎn)基因植物的大多數(shù)組織中，CaMV35S啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子(例如，參見Odell等，自然313810，1985)。CaMV啟動(dòng)子在單子葉植物中也具有高度活性(例如，參見Dekeyser等，植物細(xì)胞2591，1990；Terada和Shimamoto，分子基因遺傳學(xué)220389，1990)。另外，通過CaMV35S啟動(dòng)子的重復(fù)還可以進(jìn)一步加強(qiáng)該啟動(dòng)子的活性(即提高2-10倍)(例如，參見Kay等，科學(xué)2361299，1987；Ow等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA844870，1987；和Fang等，植物細(xì)胞1141，1989，和McPherson和Kay，US5，378，142)。
其它有用的植物啟動(dòng)子包括，但不限于胭脂氨酸合成酶(NOS)啟動(dòng)子(An等，植物生理學(xué)88547，1988)，章魚氨酸合酶啟動(dòng)子(Fromm等，植物細(xì)胞1977，1989)，水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Wu和McElroy，WO91／09948)，環(huán)化酶啟動(dòng)子(Chappell等，WO96／36697)和木薯脈花葉病毒啟動(dòng)子(Verdaguer等，植物分子生物學(xué)311129-1139，1996)?？捎糜诒景l(fā)明的進(jìn)一步的代表性啟動(dòng)子包括，但不限于鴨柘草黃斑病毒(commelina yellow mettle virus7)啟動(dòng)子，甘蔗badna病毒啟動(dòng)子，稻tungro Bacilliform病毒啟元件，玉米條紋病毒元件，和小麥矮化病毒啟動(dòng)子。
對某些用途來說，可能需要在合適的組織中，在合適的水平上或在合適的發(fā)育時(shí)間生產(chǎn)野生型或突變型vir序列。為此，有一類基因啟動(dòng)子各自具有其自身的體現(xiàn)在其調(diào)節(jié)序列上的獨(dú)特特征，被證實(shí)能調(diào)節(jié)對諸如環(huán)境、激素和／或發(fā)育因素的誘導(dǎo)信號的反應(yīng)。所述啟動(dòng)子包括，但不限于決定熱調(diào)控基因表達(dá)的基因啟動(dòng)子(例如，參見Callis等，植物生理學(xué)88965，1988；Takahashi和Komeda，分子基因遺傳學(xué)219365，1989；和Takahashi等，植物雜志2751，1992，光調(diào)控的基因表達(dá)(例如，豌豆rbcS-3A，由Kuhlemeier等披露，植物細(xì)胞1471，1989；玉米rbcS啟動(dòng)子，由Schaffner和Sheen披露，植物細(xì)胞3997，1991；存在于豌豆中的葉綠素a／b-結(jié)合蛋白基因，由Simpson等披露，EMBO雜志42723，1985；Arabssu啟動(dòng)子；或稻rbs啟動(dòng)子)，激素調(diào)控的基因表達(dá)(例如，源于小麥Em基因的脫落酸(ABA)效應(yīng)序列，由Marcotte等披露，植物細(xì)胞969，1989；ABA誘導(dǎo)型HVA1和HVA22，和rd29A啟動(dòng)子，由Straub等在大麥和擬南芥屬上披露，植物細(xì)胞6617，1994和Shen等，植物細(xì)胞7295，1995；和創(chuàng)傷誘導(dǎo)的基因表達(dá)(例如，由Siebertz等披露的wunI，植物細(xì)胞1961，1989)，器官特異性基因表達(dá)(例如，塊莖特異性儲存蛋白基因，由Roshal等披露，EMBO雜志61155，1987；和源于玉米的23-kDa玉米醇溶蛋白基因，由Schernthaner等披露，EMBO雜志71249，1988；或法國菜豆β-菜豆蛋白基因，由Bustos等披露，植物細(xì)胞1839，1989)，或病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如，PR-1，prp-1或β-1，3葡糖醛酸酶啟動(dòng)子，真菌誘導(dǎo)型小麥wirla啟動(dòng)子和線蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，TobRB7-5A和Hmg-1，分別來源于煙草和歐芹)。
還可以選擇性地包括RNA加工信號，例如，內(nèi)含子，業(yè)已證實(shí)內(nèi)含子對于有效的RNA合成和積累來說是重要的(Callis，基因和發(fā)育，1∶1183，1987)。RNA剪接序列的定位對植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平有很大影響。另一方面，一個(gè)內(nèi)含子可以位于轉(zhuǎn)基因上vir基因序列(或其片段)的上游或下游，以便調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平。
除了上述5’調(diào)控序列之外，所述表達(dá)載體還可以包括一般位于植物基因的3’區(qū)域的調(diào)控區(qū)(Thornburg等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA84744，1987；An等，植物細(xì)胞1115，1989)。例如，在所述表達(dá)載體上可以包括3’終止子區(qū)，以便增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性。所述終止子區(qū)之一可以源于馬鈴薯的PⅠ-Ⅱ終止子區(qū)。另外，其它常用的終止子源于章魚氨酸或胭脂氨酸合酶信號。
所述植物表達(dá)載體通常還含有一個(gè)顯性選擇標(biāo)記基因，用于識別被轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞?？捎糜谥参锵到y(tǒng)的選擇基因包括編碼抗生素抗性基因的基因，例如，編碼對潮霉素、卡那霉素、博萊霉素、G418、鏈霉素、壯觀霉素的抗性的基因。還可將光合作用所需要的基因在光合缺陷型品系中用作篩選標(biāo)記。最后，還可將編碼除草劑抗性的基因用作選擇標(biāo)記；有用的除草劑抗性基因包括編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的bar基因，該基因能產(chǎn)生對廣譜性除草劑BASTA(Hoechst AG，法蘭克福，德國)的抗性。
另外，如果需要所述植物表達(dá)構(gòu)建體可以含有一種修飾過的或完全合成的可翻譯的vir基因序列(或其片段)該基因序列已經(jīng)被改變以便增強(qiáng)該基因在植物中的性能。
分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是，基因表達(dá)水平不僅取決于啟動(dòng)子、RNA加工信號、和終止子元件的組合，而且取決于這些元件是如何被用于提高選擇標(biāo)記基因表達(dá)水平的。
葡萄樹轉(zhuǎn)化和再生在構(gòu)建所述植物表達(dá)載體時(shí)，可以用若干標(biāo)準(zhǔn)方法將所述載體導(dǎo)入植物宿主，以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。所述方法包括(1)農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(根瘤農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌)(例如，參見Lichtenstein和Fuller遺傳工程，第6卷，PWJRigby著，倫敦，學(xué)術(shù)出版社，1987；和Lichtenstein，C．P．，和Draper，J，參見DNA克隆，第2卷，D．M．Glover著，牛津，IRI出版社，1985))，(2)粒子輸送系統(tǒng)(例如，參見Gordon-Kamm等，植物細(xì)胞2603(1990)；或Biorad技術(shù)公報(bào)1687，同上)，(3)顯微注射方法(例如，參見Green等，同上)，(4)聚乙二醇(PEG)方法(例如，參見Draper等，植物細(xì)胞生理學(xué)，23；451，1982；或例如，Zhang和Wu，理論應(yīng)用遺傳學(xué)76835，1988)，(5)脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝入(例如，參(例如，參見Freeman等，植物細(xì)生理學(xué)，251353，1984)，(6)電穿孔方法(例如，參見Gelvin等，同上；Dekeyser等，同上；Fromm等，自然31979l，1986；Sheen植物細(xì)胞21027，1990；或Jang和Sheen植物細(xì)胞61665，1994)，和(7)渦旋方法(例如，參見Kindle同上)。轉(zhuǎn)化方法對本發(fā)明來說并不重要。能進(jìn)行有效轉(zhuǎn)化的任何方法都可以使用。用于轉(zhuǎn)化葡萄的某些典型方法披露于以下文獻(xiàn)中Scorza等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14589-592，1995，Baribault等，(實(shí)驗(yàn)植物雜志411045-1049，1990)，Mullins等(生物技術(shù)81041-1045，1990)，Nakano等(實(shí)驗(yàn)植物雜志45649-656，1994)，Kikkert等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)15311-316，1996)，Krastanova等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)1550-554，1995)，Scorza等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14589-592，1994)，Scorza等(美國園藝科學(xué)協(xié)會雜志121616-619，1996)，Martinelli等(理論應(yīng)用遺傳學(xué)88621-628，1994)，和Leqall等(植物科學(xué)102161-170，1994)。如果有比較新的方法可用于轉(zhuǎn)化葡萄的話，可以直接使用。
用于實(shí)施本發(fā)明的合適的植物包括，但不限于葡萄樹(例如，葡萄，雜交葡萄，和Euvitis和Muscadinia亞屬的所有成員)，包括接穗栽培種或根莖栽培種。接穗栽培種的例子包括，但不限于被稱作鮮食葡萄或葡萄干的品種，以及用于釀酒的葡萄，如CabernetFranc，Cabernet Sauvignon，Chardonnay(例如，CH01，CH02，CHDijon)，Merlot，Pinot Noir(PN，PN Dijon)，Semillon，WhiteRiesling，Lambrusco，Thompson Seedless，Autumn Seedless，Niagrara Seedless，和Seval Blanc．可以使用的其它接穗栽培種包括通常被稱作鮮食葡萄或葡萄干的栽培種，如Alden，Almeria，AnabE-Shahi，Autumn Black，Beauty Seedless，Black Corinth，Black Damascus，Black Malvoisie，Black Prince，Blackrose，Bronx Seedless，Burgrave，Calmeria，Campbell Early，Canner，Cardinal，Catawba，Christmas，Concord，Dattier，Delight，Diamond，Dizmar，Duchess，Early Muscat，Emerald Seedless，Emperor，Exotic，F(xiàn)erdinand de Lesseps，F(xiàn)iesta，F(xiàn)lame Seedless，F(xiàn)lame Tokay，Gasconade，Gold Himrod，Hunisa，Hussiene，Isabella，Italia，July Muscat，Khandahar，Katta，Kourgane，Kishmishi，Loose Perlette，Malaga，Monukka，Muscat ofAlexandria，Muscat Flame，Muscat Hamburg，New York Muscat，Niabell，Niagara，Olivette Blanche，Ontario，Pierce，Queen，Red Malaga，Ribier，Rish Baba，Romulus，Ruby Seedless，Schuyler，Seneca，Suavis(IP 365) ，Thompson Seedless， 和Thomuscat。它們還包括被用于葡萄酒生產(chǎn)的品種，如Aleatico，Alicante Bouschet，Aligote，Alvarelhao，Aramon，Baco blanc(22A)，Burger，Cabernet Franc，Cabernet，Sauvignon，Calzin，Carignane，Charbono，Chardonnay，Chasselas dore，Chenin blanc，Clairette blanche，Early Burgundy，Emerald Riesling，F(xiàn)eherSzagos，F(xiàn)ernao Pires，F(xiàn)lora，F(xiàn)rench Colombard，F(xiàn)resia，F(xiàn)urmint，Gamay，Gewurztraminer，Grand noir，Gray Riesling，GreenHungarian，Green Veltliner，Grenache，Grillo，Helena，Inzolia，Lagrein，Lambrusco de Salamino，Malbec，Malvasia bianca，Mataro，Melon，Merlot，Meunier，Mission，Montua de Pilas，Muscadelle du Bordelais，Muscat blanc，Muscat Ottonel，MuscatSaint-Vallier，Nebbiolo，Nebbiolo fino，Nebbiolo Lampia，OrangeMuscat，Palomino，Pedro Ximenes，Petit Bouschet，Petite Sirah，Peverella，Pinot noir，Pinot Saint-George，Primitivo di Gioa，Red Veltliner，Refosco，Rkatsiteli，Royalty，Rubired，RubyCabernet，Saint-Emilion，Saint Macaire，Salvador，Sangiovese，Sauvignon blanc，Sauvignon gris，Sauvignon vert，Scarlet，Seibel 5279，Seibel 9110，Seibel 13053，Semillon，Servant，Shiraz，Souzao，Sultana Crimson，Sylvaner，Tannat，Teroldico，Tinta Madeira，Tinto cao，Tourega，Tramier，Trebbiano Toscano，Trousseau，Valdepenas，Viognier，Walschriesling，WhiteRiesling，和Zinfandel。
可用于本發(fā)明的根莖栽培種包括，但不限于，沙地葡萄Constantia，沙地葡萄St．George，加州葡萄，谷地葡萄，圓葉葡萄，圓葉葡萄Carlos，Richter 11O(冬葡萄×沙地葡萄)，101-14 Millarder et de Grasset(河岸葡萄×沙地葡萄)，Teleki 5C(冬葡萄×河岸葡萄)，3309 Courderc(河岸葡萄×沙地葡萄)，Riparia Gloire de Montpellier(河岸葡萄)，5BB Teleki(選擇性Kober，冬葡萄×河岸葡萄)，SO4(冬葡萄×沙地葡萄)，41BMillardet(歐洲葡萄×冬葡萄)，和039-16(歐洲葡萄×圓葉葡萄)。可以使用的其它根莖栽培種包括Couderc1202，Couderc 1613，Couderc 1616，Dog Ridge，F(xiàn)oex 33EM，F(xiàn)reedom，Ganzin 1(A x R#1)，Harmony，Kober 5BB，LN33，Millardet＆de Grasset 41B，Millardet& de Grasset 420A，Millardet & de Grasset 101-14，Oppenheim4(SO4)，Paulsen 775，Paulsen 1045，Pualsen 1103，Richter 99，Richter 110，Riparia Gloire，Ruggeri 225，Saint-George，SaltCreek，Teleki 5A，沙地葡萄Constantia，加州葡萄，和谷地葡萄。
一般來說，在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移和表達(dá)轉(zhuǎn)基因的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是常規(guī)方法，并且，業(yè)已成為在植物中進(jìn)行基因表達(dá)研究和生產(chǎn)農(nóng)業(yè)上或商業(yè)上感興趣的改進(jìn)的植物品種的主要工具。
用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以按照標(biāo)準(zhǔn)植物組織培養(yǎng)技術(shù)從單細(xì)胞、愈傷組織、或葉片再生。本領(lǐng)域眾所周知，幾乎來自任何植物的各種細(xì)胞、組織、和器官均能成功地培養(yǎng)再生完整植株；所述技術(shù)披露于以下文獻(xiàn)中Vasil同上；Green等，同上；Weissbach和Weissbach，同上；和Gelvin等，同上。用于由轉(zhuǎn)化的材料再生葡萄植物的典型方法披露于以下文獻(xiàn)中。Scorza等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14589-592，1995，Baribault等，(實(shí)驗(yàn)植物雜志411045-1049，1990)，Mullins等(生物技術(shù)81041-1045，1990)，Nakano等(實(shí)驗(yàn)植物雜志45649-656，1994)，Kikkert等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)15311-316，1996)，Krastanova等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)1550-554，1995)，Scorza等(植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)14589-592，1994)，Scorza等(美國園藝科學(xué)協(xié)會雜志121616-619，1996)，Martinelli等(理論應(yīng)用遺傳學(xué)88621-628，1994)，和Leeall等(植物科學(xué)102161-170，1994)。
在一種具體實(shí)施方案中，將受35S CaMV啟動(dòng)子和胭脂氨酸合酶終止子控制并攜帶選擇標(biāo)記(例如，卡那霉素抗性)的克隆的vir轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體(例如，基于胭脂氨酸、vitopine、章魚氨酸、章魚氨酸／南瓜氨酸、leucinopine／農(nóng)桿氨酸、succinamopine、或農(nóng)桿氨酸型Ti質(zhì)粒的virE2編碼序列或基于存在于Ri質(zhì)粒上的該編碼序列的virE2、virD2、virE2缺失B、virE2缺失C、或virE2缺失E突變)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌屬。用含有載體的農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化葡萄樹是按照Scorza等所述方法進(jìn)行的(美國園藝科學(xué)協(xié)會雜志121616-619，1996)。在含有卡那霉素的植物組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)周之后選擇推測的轉(zhuǎn)化體。然后將卡那霉素抗性植物材料放置在不含激素的植物組織培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)根。
然后按照標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)篩選表達(dá)所述選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物對所述轉(zhuǎn)基因DNA的遺傳。與相同的轉(zhuǎn)基因形成的其它轉(zhuǎn)基因植物相比，每一個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因植物及其轉(zhuǎn)基因后代是統(tǒng)一的。在大多數(shù)情況下，轉(zhuǎn)基因DNA整合導(dǎo)植物基因組DNA中是偶然的。并且其整合位點(diǎn)能顯著影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平和組織和發(fā)育模式。因此，通常將多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系用于篩選每一個(gè)轉(zhuǎn)基因，以便鑒定并選擇具有最合適的表達(dá)形式的植物。
評價(jià)轉(zhuǎn)基因品系的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平。首先測定RNA水平上的表達(dá)，以便鑒定并定量陽性表達(dá)植株。使用RNA分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，所述技術(shù)包括PCR擴(kuò)增分析，使用為了僅僅擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因RNA模板而設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，以及使用轉(zhuǎn)基因?qū)Ｒ恍蕴结樀娜芤弘s交分析(例如，參見Ausubel等，同上)。然后用上述方法分析陽性RNA植株對農(nóng)桿菌感染和冠癭形成的抗性。收集能表達(dá)virE2基因(或virD2基因)或其片段并相對于對照植物具有對冠癭病抗性的轉(zhuǎn)化的葡萄樹，并將其用于本發(fā)明。
在本說明書中所提到的所有文獻(xiàn)和專利申請都以相同的程度收作本文的參考文獻(xiàn)，就如同每一件獨(dú)立的文件或?qū)＠暾埍粚ｉT和分別指明收作參考文獻(xiàn)一樣。
序列表&#60110&#62康乃爾研究基金公司&#60120&#62葡萄樹的抗細(xì)菌性&#60130&#6207678／030WO2&#60150&#6260／062，246&#60151&#621997-10-17&#60160&#622&#60170&#62FastSEQ for windows Version3．0&#60210&#621&#60211&#6229&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62合成引物&#60400&#621tacttaccat ggatccgaag gccgaaggc
&#60210&#622&#60211&#6237&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62合成引物&#60400&#622tcttgaccat ggctatcgat tctcgccggc ggaactc
權(quán)利要求
1．一種提供對能感染葡萄樹或葡萄樹部分的植物細(xì)菌病原體的抗性的方法，該方法包括以下步驟(a)用一個(gè)能在葡萄植物細(xì)胞中表達(dá)的vir基因或其抗病原體片段轉(zhuǎn)化葡萄植物細(xì)胞；(b)由所述葡萄植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分；和(c)選擇表達(dá)所述vir基因或其抗病原體片段的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段的表達(dá)能產(chǎn)生對植物細(xì)菌病原體的抗性。
2．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原體片段被整合到轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分的基因組中。
3．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述vir基因是virE2。
4．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述vir基因是virD2。
5．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述抗病原體基因片段是virE2缺失B。
6．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分是葡萄屬的一員。
7．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分是體細(xì)胞胚胎，接穗、或根狀莖。
8．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述細(xì)菌病原體是農(nóng)桿菌屬。
9．如權(quán)利要求8的方法，其中，所述農(nóng)桿菌屬是葡萄農(nóng)桿菌。
10．如權(quán)利要求8的方法，其中，所述農(nóng)桿菌屬是根瘤農(nóng)桿菌。
11．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原體片段的表達(dá)能減弱在所述轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分上形成冠癭。
12．如權(quán)利要求1的方法，其中，所述vir基因或其抗病原體片段源于Ti質(zhì)粒。
13．一種用vir基因或其抗病原體片段轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段在所述轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分中的表達(dá)提供了對植物細(xì)菌病原體的抗性。
14．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段被整合到所述轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分的基因組中。
15．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因是virE2。
16．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因是virD2。
17．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述抗病原體基因片段是virE2缺失B。
18．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述葡萄樹或葡萄樹部分是葡萄屬的一員。
19．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述葡萄樹部分是體細(xì)胞胚胎、接穗、或根莖。
20．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述細(xì)菌病原體是農(nóng)桿菌屬。
21．如權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述農(nóng)桿菌屬是葡萄農(nóng)桿菌。
22．如權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述農(nóng)桿菌屬是根瘤農(nóng)桿菌。
23．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段的表達(dá)能減弱冠癭在所述轉(zhuǎn)基因葡萄樹或葡萄樹部分上的形成。
24．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分，其中，所述vir基因或其抗病原體片段源于Ti質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及用vir基因或其抗病原體片段轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分,其中,所述vir基因或其抗病原體片段在轉(zhuǎn)基因葡萄樹或轉(zhuǎn)基因葡萄樹部分中的表達(dá),可以產(chǎn)生對植物細(xì)菌病原體(例如,葡萄農(nóng)桿菌)的抗性。
文檔編號C12N15/84GK1282374SQ98812278
公開日2001年1月31日 申請日期1998年10月15日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月17日
發(fā)明者T·J·布爾, D·貢薩爾維斯, S·Z·龐 申請人:康乃爾研究基金會有限公司