專利名稱：：用于預(yù)防和治療接種的hiv－1tat或其衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗HIV、抗AIDS和抗與HIV感染有關(guān)的腫瘤和綜合征的預(yù)防性和/或治療性疫苗，所述疫苗單獨用HIVTat野生型或突變蛋白質(zhì)、肽或DNA或者與其他病毒產(chǎn)物(Nef，Rev，Gag)的蛋白質(zhì)、肽或DNA或者促進抗病毒免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合作為免疫原。本發(fā)明還涉及通過自身樹突細(xì)胞用Tat或其衍生物進行的免疫、粘膜免疫或者通過用抗-CD3和抗-CD28單克隆抗體共刺激擴展的外周血細(xì)胞的來自體內(nèi)(ex-vivo)免疫，還涉及用紅細(xì)胞或納米顆粒(nanoparticles)送遞上述免疫原。
背景技術(shù)：
：AIDS(獲得性免疫缺陷性綜合征)是由HIV(人免疫缺陷性病毒)引起的，其特征是免疫缺陷、腫瘤如卡波濟肉瘤(KS)和B細(xì)胞淋巴瘤、機遇性感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。由于AIDS在世界范圍內(nèi)廣泛傳播而且死亡率高，因此，公共健康的一個最重要的目的就是開發(fā)抗HIV或AIDS的預(yù)防性和/或治療性疫苗。過去和目前的大部分治療方法均使用病毒被膜或其亞單位作為免疫原，但是由于病毒被膜的高度變異性使得治療結(jié)果不能令人滿意(參考文獻162，112-貫穿于本說明書始終，在括號中提到了各種參考文獻，從而對與本發(fā)明有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)進行了更詳細(xì)的描述。在說明書結(jié)尾，權(quán)利要求書之前，可以找到每篇文獻的全部參考資料)。因此，作為另一種滅菌免疫，普遍的看法是它足以阻斷感染的發(fā)展和疾病的發(fā)作。此外，用HIV的DNA區(qū)作為免疫原可以產(chǎn)生免疫保護性反應(yīng)(參考文獻91，17)。由于公開的實驗數(shù)據(jù)，發(fā)明人相信，有必要生產(chǎn)一種利用env以外的病毒產(chǎn)物的疫苗。特別是，用作免疫原的病毒蛋白在HIV分離株中必須很保守，能夠誘發(fā)有效的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且必須對病毒有致命的功能。所述產(chǎn)物必須在非人靈長類(因為與種系發(fā)生上更遠(yuǎn)的動物相比，其免疫系統(tǒng)與人的更相近)模型中進行試驗，其中病毒感染后可發(fā)展成AIDS。HIV-1Tat蛋白質(zhì)具有作為用于疫苗的良好免疫原的所有特征該蛋白質(zhì)是保守的，免疫原性的并在病毒感染早期是必不可少的。此外，Tat不僅在病毒復(fù)制、感染傳播和進展中起關(guān)鍵作用，而且在AIDS-相關(guān)腫瘤，例如KS(是最常見的AIDS相關(guān)腫瘤)和HIV感染后發(fā)展的其他綜合征與癥狀的發(fā)作和進展中起關(guān)鍵作用。Tat是一種86-102個氨基酸的蛋白質(zhì)，氨基酸的多少取決于病毒株，由兩個外顯子編碼。Tat是在感染后不久產(chǎn)生的，位于核內(nèi)，然后通過與LTR中存在的“Tat-效應(yīng)元件”(TAR)相互作用，反式激活所有病毒基因的表達(參見文獻25)。Tat在HIV毒力中也起作用(參考文獻63、113、60，84)。第一外顯子的產(chǎn)物(氨基酸1至72)在不同的病毒分離株中是保守的(參考文獻112)并足以引起HIV-1產(chǎn)物的反式激活作用(參考文獻25)。它含有4個結(jié)構(gòu)域。酸性結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-21)對于Tat與細(xì)胞蛋白的相互作用是至關(guān)重要的；富含半胱氨酸的區(qū)域(氨基酸22-37)代表反式激活結(jié)構(gòu)域。該區(qū)域在主要分離株中是最保守的(參考文獻108)，用甘氨酸取代22位的半胱氨酸后消除了Tat反式激活HIV-LTR的能力(參考文獻166)。核心結(jié)構(gòu)域(氨基酸38-48)也是保守的并對于功能也是很重要的。用蘇氨酸取代賴氨酸41使Tat對HIVLTR的反式激活活性失活(參考文獻70)；富含精氨酸和賴氨酸的堿性結(jié)構(gòu)域(氨基酸49-57)對于Tat的核定位是必需的，而且與其RNA靶(TAR)特異性結(jié)合(參考文獻25)。此外，堿性區(qū)域使細(xì)胞外Tat與肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)結(jié)合(參考文獻26)。在所述堿性區(qū)中的突變可消除所述相互作用。Tat的羧基末端部分對于LTR反式激活作用不是必需的，但含有一個通常存在于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)，使Tat與整聯(lián)蛋白受體α5β1eαvβ3結(jié)合。這些相互作用介導(dǎo)Tat作用于AIDS-相關(guān)腫瘤和免疫、血管以及神經(jīng)系統(tǒng)(參考文獻11、42、170、25)。在T細(xì)胞的HIV-1急性感染期，或者tat基因轉(zhuǎn)染于COS-1細(xì)胞后，在細(xì)胞外環(huán)境中，不存在細(xì)胞死亡的條件下釋放Tat蛋白質(zhì)(參考文獻40、41、25)。由于細(xì)胞外Tat存在于被感染個體的血清(參考文獻164)和AIDS-KS損傷(參考文獻42)中，在體內(nèi)，也可從感染的細(xì)胞中釋放Tat。釋放后，一部分蛋白質(zhì)仍是可溶的形式，而一部分與ECM的HSPG結(jié)合。通過加入肝素可以以可溶形式回收與HSPG結(jié)合的Tat。與肝素的結(jié)合歸因于Tat堿性區(qū)；它防止了細(xì)胞外Tat的影響并保護蛋白質(zhì)不被氧化。我們利用該特性純化具有高生物活性的Tat(參考文獻26)。細(xì)胞外Tat可以被細(xì)胞內(nèi)化，可遷移到核內(nèi)并反式激活病毒基因的表達(參考文獻49、98、100、41)。通過Tat的RGD區(qū)與α5β1和αvβ3的結(jié)合而介導(dǎo)的胞吞作用(參考文獻10、42，Ensoli等，未公開的數(shù)據(jù))和/或與HSPG結(jié)合的堿性區(qū)使Tat內(nèi)化。Tat還可通過與細(xì)胞基因表達的調(diào)節(jié)有關(guān)的間接機制來激活病毒復(fù)制和病毒傳播，所述細(xì)胞基因在細(xì)胞存活的控制中、對可作用于病毒復(fù)制的炎癥細(xì)胞因子(IC)的表達起關(guān)鍵作用(參考文獻25)。除了在病毒復(fù)制的重要性之外，Tat在AIDS的發(fā)病機理中起重要作用。通過激活或阻遏細(xì)胞因子例如IL-2(參考文獻123、163、31)或者在細(xì)胞周期中起關(guān)鍵作用的基因(參考文獻145、169、164、173)，Tat能夠調(diào)節(jié)感染的和未感染的細(xì)胞的存活和增殖。Tat的抗-或前-細(xì)胞程序死亡作用取決于許多因素例如細(xì)胞類型、Tat被細(xì)胞表達或者加至細(xì)胞中的事實及其濃度(參考文獻40、41、171)。Tat是使KS在HIV-1感染的個體中高頻率發(fā)生和攻擊性增強的原因(參考文獻43、33)。KS是一種血管源腫瘤并且是HIV-感染個體中最常見的瘤形成。Tat誘導(dǎo)KS細(xì)胞和IC激活的內(nèi)皮細(xì)胞遷移、表達Ⅳ型膠原酶、侵入ECM以及增殖，所述機制對于血管生成和腫瘤發(fā)病是必需的過程(參考文獻40、41、42、2、46)。Tat的所述作用是由IC誘導(dǎo)的，因為它們刺激Tat受體α5β1和αvβ3的表達(參考文獻10)。Tat可模擬ECM蛋白例如纖連蛋白和玻連蛋白的作用，RGD區(qū)和堿性區(qū)對于細(xì)胞外Tat作用于KS細(xì)胞、血管生成作用和KS的進展均是必不可少的。在AIDS-KS損傷中，細(xì)胞外Tat體內(nèi)結(jié)合其受體的能力(參考文獻40)支持了Tat與AIDS-相關(guān)KS發(fā)作和維持有關(guān)的觀點。此外，tat基因的轉(zhuǎn)基因小鼠根據(jù)所述轉(zhuǎn)基因的表達水平而發(fā)展成KS或其他表型(參考文獻160、34)。據(jù)認(rèn)為，通過涉及bcl-2和細(xì)胞因子表達增加的機制(參考文獻122)，Tat在常見于血清陽性個體和tat-轉(zhuǎn)基因小鼠中的超增殖現(xiàn)象和B淋巴瘤的發(fā)病機理中起作用(參考文獻157)。其他證據(jù)證實Tat在癌形成中可能發(fā)揮作用(參考文獻72)。Tat還可激活病毒啟動子例如皰疹病毒的和在AIDS個體復(fù)活的其他病毒的啟動子的表達，加速機遇性感染的發(fā)作和進展(參考文獻25)。Tat似乎還能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元或者對血腦屏障有直接(通過堿性和RGD區(qū))的神經(jīng)毒性作用，通過誘導(dǎo)具有毒性作用的IC有間接神經(jīng)毒性作用(參考文獻25)。就針對Tat的免疫反應(yīng)而言，大量研究表明抗Tat抗體在體內(nèi)控制疾病的發(fā)展過程中起保護作用(參考文獻130、135、136、149、127)。此外，在體外，抗-Tat抗體不僅抑制Tat的內(nèi)化作用、Tat的跨細(xì)胞激活作用和病毒感染(參考文獻41、127)，而且還抑制小鼠中KS細(xì)胞的增殖和Tat誘導(dǎo)的KS細(xì)胞遷移以及KS樣損傷的形成(參考文獻40、41、42)。最后，我們的初步結(jié)果表明在AIDS-KS個體中沒有抗-Tat抗體，這說明所述個體不能阻斷細(xì)胞外Tat的活性。在感染初期，抗Tat細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的發(fā)展對于控制感染本身是至關(guān)重要的(參考文獻161、133、59)，而且在特異性抗-TatCTL的存在與疾病的進展之間存在負(fù)相關(guān)(參考文獻156)。所述結(jié)果是在對SIVmac接種的獼猴的研究中得到的(參考文獻91、158)。此外，在將Tat作為質(zhì)粒或者蛋白質(zhì)接種的不同種小鼠中所得的最新數(shù)據(jù)表明，可以誘導(dǎo)針對所述蛋白質(zhì)的體液和細(xì)胞反應(yīng)(參考文獻61)。但是，在數(shù)種小鼠間已觀察到變異性，而在非人靈長類中用相同的免疫原沒有得到那樣的結(jié)果(參考文獻124)。在小鼠中完成的疫苗試驗結(jié)果在非人靈長類模型中沒有重現(xiàn)性是經(jīng)常的，這可能是由于這兩個種之間的免疫系統(tǒng)不同，用相同的免疫原產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)，正如用HIVEnv蛋白質(zhì)所表明的。因此，用于人的候選疫苗必須在非人靈長類中進行試驗，而不能僅在較低等生物中進行試驗。發(fā)明人認(rèn)為其他病毒蛋白或其部分可與Tat結(jié)合而提高抗HIV的特異性免疫反應(yīng)，因此在針對腫瘤和其他疾病以及HIV感染相關(guān)癥狀的發(fā)作的接種中也是有益的。所述產(chǎn)物是HIV的Nef、Rev和Gag蛋白質(zhì)。Nef是另一種對疾病發(fā)展至關(guān)重要的病毒調(diào)節(jié)蛋白(參考文獻3、48、58)。Nef在感染后早期產(chǎn)生并釋放在細(xì)胞外環(huán)境中(Ensoli,未公開的數(shù)據(jù))。在SIVmac/獼猴系統(tǒng)中，Nef的存在與大量病毒復(fù)制和進展為AIDS有關(guān)(參考文獻71)。Nef比Tat的可變性高(參考文獻112)。Nef是一種免疫原性蛋白質(zhì)(參考文獻53、32、35、151)并且能夠誘導(dǎo)CTL(參考文獻16、36)。特別是已鑒定了一個Nef免疫顯性區(qū)(區(qū)域73-144)，在大多數(shù)HIV感染的患者中，由CTLs識別該區(qū)域。Rev是一種在感染期間早期產(chǎn)生的病毒調(diào)節(jié)蛋白(參考文獻51、119)并被釋放于細(xì)胞外環(huán)境中(Ensoli等，未公開的數(shù)據(jù))。Rev對于HIV復(fù)制和疾病的發(fā)展是必不可少的，由兩個外顯子編碼，與Tat-編碼區(qū)部分重疊。Rev是核蛋白(參考文獻44)，對于編碼晚期蛋白質(zhì)的病毒信使RNA的表達是必需的(參考文獻97)。Rev在HIV-1的各種病毒分離株間是高度保守的(參考文獻111)而且是免疫原性的。事實上，在人的自然感染過程中(參考文獻131)和小鼠接種后(參考文獻61)，Rev誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生，所述特異性抗體抗所述蛋白質(zhì)的兩個功能結(jié)構(gòu)域(參考文獻120)。在感染個體血清中的低水平抗-Rev抗體似乎與AIDS的發(fā)展有關(guān)(參考文獻131)。Rev可在人和猴中誘導(dǎo)CTL(參考文獻156、158)，并且已有報導(dǎo)，在感染過程早期，特異性抗-RevCTL反應(yīng)與疾病的發(fā)展成負(fù)相關(guān)(參考文獻156、158)。另一個病毒靶是gag基因，它是在感染過程晚期被表達的，并編碼一組殼體高免疫原性結(jié)構(gòu)蛋白(參考文獻18、147)。在感染的無癥狀期，抗-Gag抗體滴度高且穩(wěn)定，當(dāng)感染發(fā)展到成熟的AIDS時達到很低的水平，同時CD4+淋巴細(xì)胞減少且外周血中存在病毒(參考文獻174、73)。在人和靈長類中，Gag蛋白質(zhì)在感染過程早期誘導(dǎo)CTL活性(參考文獻103、168)，其存在與初期病毒血癥的控制和疾病的發(fā)展顯著相關(guān)(參考文獻175、6、134、167、92)。最后，p17和p24蛋白質(zhì)含有保持于不同HIV-1和HIV-2分離株中并由CTL識別的免疫顯性表位(參考文獻89、19、114、155、115)。發(fā)明人認(rèn)為，在抗-Tat疫苗的制劑中，可將細(xì)胞因子或其部分例如IL-12和IL-15或者其他免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子例如IFNα或IFNβ或者其他提高Tat免疫原性作用的蛋白質(zhì)用作佐劑。IL-12是一種由抗原呈遞細(xì)胞(APC)例如B和樹突細(xì)胞產(chǎn)生的強免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(參考文獻154)。IL-12在HIV感染后早期產(chǎn)生并具有誘導(dǎo)NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ的前炎癥作用，IFNγ激活吞噬細(xì)胞并促進Th1淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。IL-12在針對細(xì)菌、真菌、病毒引起的大量感染的抗性中起主要作用，而且表現(xiàn)高抗腫瘤活性。一些證據(jù)表明誘導(dǎo)免疫抑制的病毒例如HIV和麻疹病毒也可通過抑制IL-12產(chǎn)生的機制發(fā)揮作用(參考文獻57、50、144)。IL-15是由非淋巴組織、激活的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞(DC)表達的一種多效細(xì)胞因子(參考文獻125、66)。IL-15在NK活性的調(diào)節(jié)、T淋巴細(xì)胞的增殖和CTL活性中起重要作用(參考文獻67、24)。在不存在IL-2和功能CD4+T淋巴細(xì)胞的條件下，IL-15誘導(dǎo)抗HIV抗原的CTLs的表達(參考文獻68、1)。此外，與IL-2類似，IL-15誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性的淋巴細(xì)胞(“淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞”，LAK)的增加并刺激血清陽性患者的PBMCs中IFNγ的產(chǎn)生(參考文獻93)。IL-15激活單核細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，在炎癥過程的發(fā)作中起作用(參考文獻8)。最新的研究已表明，用包被有抗-CD3e抗-CD28單克隆抗體的順磁珠共刺激CD4+淋巴細(xì)胞決定HIV感染個體的淋巴細(xì)胞的對數(shù)和多克隆增加(參考文獻82)，而不會激活病毒復(fù)制和傳播。所述抗病毒活性是負(fù)調(diào)節(jié)CCR5(HIV-1親單核細(xì)胞株的共受體(參考文獻23))的表達和用抗CD3和抗CD28單克隆抗體誘導(dǎo)的高水平趨化因子(較低程度上)的結(jié)果(參考文獻132)。發(fā)明人認(rèn)為，在不存在病毒復(fù)制/傳播的條件下，可以增加HIV感染個體的自身淋巴細(xì)胞，這樣可以得到一種有效的來自體內(nèi)免疫(描述于在實施例中)，這對于開發(fā)抗Tat疫苗是非常有益的。在以產(chǎn)生有效抗病毒和抗腫瘤疫苗為目的的不同系統(tǒng)中，本發(fā)明人認(rèn)為在誘導(dǎo)針對Tat的免疫反應(yīng)中，樹突細(xì)胞的利用是關(guān)鍵。這是因為這些細(xì)胞在呈遞抗原時最有效，而且在不存在佐劑的條件下是唯一能刺激原初淋巴細(xì)胞的細(xì)胞(參考文獻150)。樹突細(xì)胞的使用代替了數(shù)種佐劑的功能，所述佐劑可誘導(dǎo)非特異性免疫反應(yīng)(天然免疫)，在存在抗原的條件下，所述非特異性免疫反應(yīng)反過來產(chǎn)生強的初級特異性反應(yīng)。由于HIV感染的傳播主要發(fā)生在粘膜水平(成人的生殖器和直腸粘膜，新生兒的口腔粘膜)，本發(fā)明人認(rèn)為在粘膜水平誘導(dǎo)保護性免疫是主要目的。最近，許多研究表明可以誘導(dǎo)粘膜免疫，局部的和全身性的均可。具體地講，已表明在誘導(dǎo)有效的粘膜免疫反應(yīng)方面，鼻和口途徑是最有效的，甚至可以在遠(yuǎn)端，例如生殖器粘膜(參考文獻138、118)中。具體地講，本發(fā)明人認(rèn)為使用經(jīng)修飾而表達上述病毒抗原的格氏鏈球菌(S.Gordonii)和乳桿菌屬(Lactobacillus)細(xì)菌可能是一種在猴和人中，在粘膜水平誘導(dǎo)或加強特異性免疫反應(yīng)的有效策略。事實上，這些細(xì)菌能夠在小鼠口腔和陰道粘膜中移生，并誘導(dǎo)局部和全身的抗在重組細(xì)菌表面上表達的異源抗原的特異性抗體反應(yīng)(參考文獻116、104、106、121、117、139、105、107)。最后，這些細(xì)菌作為活載體發(fā)揮作用，并可誘導(dǎo)對免疫系統(tǒng)的延長的刺激作用。此外，本發(fā)明人認(rèn)為可以用非復(fù)制型和非致病性重組病毒載體，例如單純性皰疹病毒1型(HSV-1)(參考文獻99)表達用于全身(皮內(nèi))和粘膜(口腔、陰道和鼻途徑)免疫的病毒蛋白。事實上，這些載體可以容納較大的外源序列(參考文獻52、64)，例如數(shù)個HIV基因(調(diào)節(jié)、輔助和結(jié)構(gòu)基因)。此外，皰疹載體還可以經(jīng)口、鼻或陰道途徑給藥(參考文獻176、75)。本發(fā)明人認(rèn)為可將Tat(蛋白質(zhì)或DNA)單獨地或與上述其他免疫原結(jié)合地利用新的送遞系統(tǒng)例如紅細(xì)胞或納米顆粒進行接種。具體地講，本發(fā)明人認(rèn)為可以送遞與自身紅細(xì)胞的膜結(jié)合的抗原(參考文獻95、96)。由于這些紅細(xì)胞僅在120天后，通過巨噬細(xì)胞、專職抗原呈遞細(xì)胞從血液中除去，因此，可將該特征用于疫苗。最后，另一種送遞方法是使用可以攜帶蛋白質(zhì)和DNA的納米顆粒(參考文獻27、172)。納米球體(nanospheres)是具有多種化學(xué)組成的聚合膠體顆粒，從10至1000nm不等?？蓪⒉煌奈镔|(zhì)(寡核苷酸、藥物、蛋白質(zhì)、肽、DNA)負(fù)載在其表面上或吸附在顆粒中，然后送遞到它們將被緩慢釋放的胞質(zhì)或細(xì)胞核中。這樣可以使用很少量的待送遞物質(zhì)?；谏鲜鼋Y(jié)果，本發(fā)明人認(rèn)為在存在或不存在佐劑的條件下，用Tat，單獨或者與其他病毒產(chǎn)物或者免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子結(jié)合或其部分進行免疫，可以阻斷在接種后暴露的個體中和感染的個體中的病毒復(fù)制，將感染保持在流產(chǎn)期(abortivephase)，這樣更容易通過免疫系統(tǒng)控制。因此，本發(fā)明人認(rèn)為以Tat為基礎(chǔ)的疫苗應(yīng)該能夠誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而足以阻斷或降低病毒的復(fù)制或傳播，由此能夠控制病毒復(fù)制并阻斷生產(chǎn)性感染、疾病的發(fā)展以及腫瘤和其他AIDS-相關(guān)綜合征和癥狀的發(fā)作。因此，可以將抗Tat疫苗用于預(yù)防和治療目的。事實上，抗Tat體液反應(yīng)可以中和細(xì)胞外Tat的作用，降低和限制感染，而細(xì)胞誘導(dǎo)的抗Tat及抗包封在疫苗制劑中的其他病毒蛋白質(zhì)的反應(yīng)可以破壞病毒感染的細(xì)胞，從而控制感染。這樣在沒有因病毒復(fù)制引起的不可逆損傷的情況下，給免疫系統(tǒng)一段必要的時間以發(fā)展出針對感染病毒的所有病毒組分的完全的反應(yīng)。已描述過用Tat作為免疫原(WO95/31999)。但是，該文獻公開了使用沒有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)；此外，在同一專利申請中，沒有給出有關(guān)“天然”Tat蛋白質(zhì)的生物活性的證據(jù)。另外，對于使用有生物活性的Tat蛋白質(zhì)有強烈的技術(shù)偏見，即認(rèn)為會提高感染個體中的病毒復(fù)制和/或在血清陰性或血清陽性個體中產(chǎn)生免疫抑制(A.TonelliAids,unvaccinopersperare.“LaRepubblica”,pag.10,24Oct.1998)。正如上述所表明的，盡管做了努力，但是迄今為止仍沒有開發(fā)出以Tat為基礎(chǔ)的抗HIV疫苗。本發(fā)明綜述本發(fā)明的目的之一是用作疫苗的Tat蛋白質(zhì)或Tat肽或TatDNA，Tat必須是生物活性形式。本發(fā)明另一目的是可用于人的蛋白質(zhì)或肽疫苗，所述疫苗用于預(yù)防或治療AIDS、AIDS-相關(guān)腫瘤和HIV-相關(guān)綜合征和癥狀，所述疫苗由按所述表達和純化的重組野生型Tat蛋白質(zhì)或其突變體(Seq.1-5)或者野生型或突變Tat肽(Seq.1-7)組成，單獨施用或者與T輔助破傷風(fēng)類毒素表位或者其他T輔助表位結(jié)合施用。本發(fā)明的另一目的是上述疫苗，與重組HIVNef,Rev和/或Gag蛋白質(zhì)或Nef,Rev和Gag肽組合，作為Tat/Nef,Tat/Rev,Tat/Gag融合蛋白或這些蛋白質(zhì)的部分施用。本發(fā)明的另一目的是上述疫苗，與免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子重組蛋白如IL-12、IL-15或者其他分子或其部分組合，能夠提高抗病毒免疫反應(yīng)，或者由Tat/IL-12，Tat/IL-15或者Tat/其他融合蛋白或其部分組成的疫苗，能夠提高抗病毒免疫反應(yīng)。本發(fā)明的另一目的是施用于人的DNA疫苗，用于預(yù)防或治療AIDS、AIDS-相關(guān)腫瘤和HIV相關(guān)綜合征和癥狀，所述疫苗由編碼野生型Tat或其突變體(Seq.1-5)的載體，或其部分組成，插入在表達質(zhì)粒載體pCVO或其他載體中。本發(fā)明的另一目的是DNA疫苗，如在4中描述的，與HIVrev,nef或gag基因或其部分組合，插入在pCVO載體中，或者是作為共表達tat/rev,tat/nef,tat/gag基因或其部分的載體施用的DNA疫苗。本發(fā)明的另一目的是上述DNA疫苗，與編碼IL-12和IL-15的DNA或編碼免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子或其部分的其他基因組合，插入在pCVO或其他載體中，或者作為共表達Tat/IL-12、Tat/IL-15或Tat/其他分子的載體或其部分施用的DNA疫苗，能夠提高抗病毒免疫反應(yīng)。本發(fā)明的另一目的是作為蛋白質(zhì)、肽和/或DNA的抗Tat疫苗，按上述單獨或組合用于通過來自體內(nèi)處理免疫接種自體樹突細(xì)胞。本發(fā)明的另一目的是作為蛋白質(zhì)、肽和/或DNA的抗Tat疫苗，按上述單獨或組合，用于粘膜免疫接種(鼻、口、陰道或直腸)。本發(fā)明的另一目的是作為蛋白質(zhì)、肽和/或DNA的抗Tat疫苗，按上述單獨或組合，用于來自體內(nèi)免疫接種來自感染個體的外周血細(xì)胞，所述血細(xì)胞通過用與順磁珠偶聯(lián)的抗CD3和抗CD28單克隆抗體共刺激來增加(expand)，然后再回輸給宿主。本發(fā)明的另一目的是上述作為蛋白質(zhì)、肽和/或DNA的抗Tat疫苗，與病毒復(fù)制抑制劑組合。本發(fā)明的另一目的是已描述過的抗Tat疫苗，與提高免疫反應(yīng)的佐劑組合。本發(fā)明的另一目的是抗Tat疫苗，按上述單獨或組合，通過特定的送遞系統(tǒng)，例如納米顆粒、皰疹載體、紅細(xì)胞、細(xì)菌或者可以施用上述疫苗所有組合的任何送遞系統(tǒng)施用。從本發(fā)明的詳細(xì)描述中，可以發(fā)現(xiàn)其他目的。附圖簡述圖1A.通過將細(xì)胞因子激活的內(nèi)皮細(xì)胞與抗整聯(lián)蛋白抗體預(yù)保溫，攝入10ng/ml羅丹明化(rhodaminated)Tat蛋白質(zhì)的抑制作用。圖1A.A組，與緩沖液預(yù)保溫，與BSA保溫的細(xì)胞。圖1A.B組，與緩沖液預(yù)保溫，與Tat保溫的細(xì)胞。圖1A.C組，與單克隆抗體CDw49e和CD29預(yù)保溫，與Tat保溫的細(xì)胞。圖1A.D組，與單克隆抗體CD51和CD61預(yù)保溫，與Tat保溫的細(xì)胞。圖1A.E組，與抗人Ⅷ因子抗體(對照抗體)預(yù)保溫，與Tat保溫的細(xì)胞。圖1B.通過cat試驗監(jiān)測的，純化Tat-cys22(Tat22)蛋白質(zhì)與野生型Tat蛋白質(zhì)的反式激活活性競爭的能力。圖2A.在用Tat蛋白質(zhì)接種的猴中，抗Tat特異性IgG的生產(chǎn)，用免疫酶檢測(ELISA)確定。用兩個皮下(sub-cute)接種重懸在250μl自體血清或250μlRIBI中的10或100μg重組Tat蛋白質(zhì)的猴子得到的結(jié)果。圖2B.在用Tat蛋白質(zhì)接種的猴中，抗Tat特異性IgG的生產(chǎn)，用免疫酶檢測(ELISA)確定。對照猴子(M3)的結(jié)果。圖3.在用圖2A和圖2B所述的100(M1)和10(M2)μg重組Tat蛋白質(zhì)接種的猴子血漿中，抗Tat抗體的滴度。圖4A.由圖2A和圖2B所述的100(M1)和10(M2)μg重組Tat蛋白質(zhì)注射的猴子的抗TatIgG識別的Tat表位圖譜。表示出對測試兩次的每種肽稀釋1∶50的血漿的平均結(jié)果。圖4B.根據(jù)圖4A的圖譜。列出了血漿中的抗體滴度，表示為在檢測仍是陽性的最高稀釋度的倒數(shù)。圖5.用Tat蛋白質(zhì)接種的猴子中，特異性抗Tat體液IgM反應(yīng)的分析，通過ELISA確定的。圖6.用Tat蛋白質(zhì)接種的猴子中，特異性抗TatIgG生產(chǎn)的分析，用ELISA檢測。圖7.存在圖6所述RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)的條件下，用重組Tat(10μg)接種的猴子血漿中，抗Tat抗體的滴度。圖8A.由按圖6所述接種的猴子的抗TatIgG識別的Tat表位。結(jié)果指1∶50稀釋的樣品并且是兩個孔的平均值。圖8B.根據(jù)圖8A的Tat表位。結(jié)果指圖8A所示的血漿滴度并表示為在檢測仍為陽性的最高血漿稀釋度的倒數(shù)。圖9.Tat特異性CTL的分析。圖10.用皮膚試驗分析對Tat的延遲超敏反應(yīng)。圖11A.在用TatDNA接種的猴中，對Tat的體液IgG反應(yīng)。所列的結(jié)果得自用200(M1)和500(M2)μgpCV-Tat質(zhì)粒接種的兩個猴子。圖11B.在用TatDNA接種的猴中，對Tat的體液IgG反應(yīng)。結(jié)果來自對照猴(M3)。圖12.在用200μgpCV-Tat皮內(nèi)(i.d.)接種的猴子M2的血漿中，抗Tat抗體的滴度。圖13.分析用1mgpCV-Tat接種的3只猴子(M9-M11)和用1mg對照載體pCV-0接種的1只對照猴子(M12)中，抗TatIgG的生產(chǎn)。圖14.Macacafascicularis的PBMC對用在順磁珠上的抗CD3和抗CD28單克隆抗體(抗-CD3/28珠)共刺激的增殖反應(yīng)動力學(xué)。圖15A.用抗-CD3/28珠共刺激對MacacafascicularisPBMC的抗病毒作用。猴MK193。圖15B.用抗-CD3/28珠共刺激對MacacafascicularisPBMC的抗病毒作用。猴MKD91。圖15C.用抗-CD3/28珠共刺激對MacacafascicularisPBMC的抗病毒作用。猴MK9301。圖15D.用抗-CD3/28珠共刺激對MacacafascicularisPBMC的抗病毒作用。猴MK9401。圖16A.從猴外周血得到的樹突細(xì)胞(DC)的功能特征。在同種異型混合的白細(xì)胞培養(yǎng)物(AMLR)的4天摻入3H-胸苷。圖16B.從猴外周血得到的樹突細(xì)胞的功能特征。用來自另一猴的T淋巴細(xì)胞攻擊按圖16A報導(dǎo)所得的APCs，例如DC和Mφ。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及以Tat作為活性物質(zhì)用于預(yù)防和/或治療HIV感染、HIV感染個體的AIDS發(fā)展和腫瘤及其他綜合征和癥狀的發(fā)展的疫苗。Tat或者野生型Tat呈其活性形式，或者更正確地說，是作為重組蛋白質(zhì)或肽或者DNA的生物活性形式(如下文解釋的)。更具體地講，本發(fā)明涉及以作為免疫原的HIV-1Tat為基礎(chǔ)的疫苗，作為DNA和/或重組蛋白質(zhì)或肽接種，單獨使用或者與其他基因或病毒基因產(chǎn)物(Nef,Rev,Gag)或其部分組合，或者與各種免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子(IL-12，IL-15)或者與編碼免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子的基因或其部分組合。將Tat、Nef、Rev、Gag和免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子作為重組蛋白、肽或融合蛋白的混合物(Tat/Nef、Tat/Rev、Tat/Gag、Tat/IL-12、Tat/IL-15)或者作為質(zhì)粒DNA施用。在本發(fā)明描述中，認(rèn)為野生型Tat”和“活性形式的Tat”與“生物活性Tat”是同義詞。根據(jù)本發(fā)明，“生物活性Tat”指皮摩爾至納摩爾濃度(從10ng/ml或更低至1μg/ml，優(yōu)選0．1ng/ml至100ng/ml)的蛋白質(zhì)能夠(ⅰ)進入并定位在活化的內(nèi)皮細(xì)胞或樹突細(xì)胞的核中，如在實施例1A中所測量的；(ⅱ)激活卡波濟肉瘤(KS)細(xì)胞的增殖、遷移和侵入和細(xì)胞因子激活的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白(參考文獻40，2)；(ⅲ)當(dāng)加入到感染細(xì)胞中時激活病毒復(fù)制，這是a)通過加入外源蛋白質(zhì)后，HLM-1細(xì)胞中Tat-缺陷型原病毒的獲救(參考文獻41)；b)通過反式激活HIV-1啟動子-報道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的HIV-1基因表達(參考文獻41)而度量的；(ⅳ)在存在血管生成因子或炎癥細(xì)胞因子的條件下，在小鼠中誘導(dǎo)KS樣損傷的發(fā)展(參考文獻42)。本發(fā)明人認(rèn)為作為生物活性Tat，必須應(yīng)具備(ⅰ)或(ⅱ)之一，優(yōu)選，應(yīng)具備這兩點，更優(yōu)選應(yīng)具備(ⅰ)或(ⅱ)或者同時具備這兩點以及(ⅲ)a)和/或(ⅲ)b)。當(dāng)具備(ⅰ)至(ⅳ)點時，可以得到最好的結(jié)果。Tat蛋白質(zhì)或者具有這些特征的Tat片段能夠體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和抗病毒免疫反應(yīng)。事實上，具有上述特征的生物活性Tat能夠結(jié)合特異性的細(xì)胞表面受體并經(jīng)這些受體而被攝入。Tat攝入對于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)是必需的。以前或正在進行的研究，與基于Tat的疫苗的發(fā)展有關(guān)，尚未利用具有上述特征的生物活性Tat蛋白質(zhì)。在實施例1中描述了獲得并處理本發(fā)明生物活性Tat的方法。還描述了利用自體樹突細(xì)胞的免疫接種方法，所述樹突細(xì)胞單獨用重組Tat蛋白質(zhì)或其肽，或者用重組蛋白質(zhì)或肽的混合物(Tat、Nef、Rev、Gag)或者用Tat蛋白質(zhì)與一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子，或其部分進行來自體內(nèi)處理，或者用僅含tat基因或還含有編碼Nef，Gag或Rev的病毒基因，或者tat和編碼免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子或其部分的基因的真核載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述樹突細(xì)胞。還描述了在粘膜水平誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法。將Tat或其肽，單獨或者與病毒蛋白和/或細(xì)胞因子組合，在粘膜水平接種以提高并誘導(dǎo)局部免疫反應(yīng)。還可用HIV-1Tat蛋白質(zhì)或其亞單位來自體內(nèi)免疫接種從感染個體外周血分離的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞。然后通過用抗CD3和CD28的單克隆抗體共刺激來體外擴增Tat抗原特異性細(xì)胞，然后再回輸。最后，還描述了在實施例中鑒定的Tat突變體用作免疫原，作為Tat野生型的替代物的用途。Tat突變體是ⅰ)在半胱氨酸區(qū)(cys22)和ⅱ)在核心區(qū)(lys41)，ⅲ)在RGD序列缺失的突變體；ⅳ)在賴氨酸41和RGD缺失的雙突變體。在治療接種的情況下，利用Tat突變或Tat肽(野生型或突變的蛋白質(zhì))的另一種方法是同時用病毒復(fù)制抑制劑和免疫原。在此，“病毒復(fù)制抑制劑”指目前已知的所有分子，或者此后將發(fā)現(xiàn)的能夠減少或阻斷HIV復(fù)制的分子(反轉(zhuǎn)錄酶的核苷和非核苷抑制劑，蛋白酶抑制劑，反義RNA，以及一般能夠阻斷HIV基因表達的所有分子)。如前所述，描述了不同的免疫接種方法，所述方法將Tat蛋白質(zhì)、肽和TatDNA與其他病毒基因或蛋白質(zhì)，或其部分，或者免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子或者編碼免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子的基因，或其部分組合。“其部分”指上述基因或蛋白質(zhì)的片段，其誘導(dǎo)完整基因或蛋白質(zhì)的相同免疫原性作用的效力已被說明。此外，由于佐劑在疫苗方案中的效力是已知的，因此，本發(fā)明涉及已知佐劑和此后將發(fā)現(xiàn)的佐劑的使用，所述佐劑與Tat(蛋白質(zhì)或DNA)以及與Tat和其他基因或病毒或細(xì)胞蛋白質(zhì)的組合一起施用。同樣，假定Tat(蛋白質(zhì)或DNA)以及Tat與其他基因或病毒或細(xì)胞蛋白質(zhì)的組合的不同送遞系統(tǒng)在誘導(dǎo)針對Tat的全身和局部免疫反應(yīng)(粘膜免疫)方面的效力。本發(fā)明人的結(jié)果(未公開過)表明只有生物活性形式的Tat蛋白質(zhì)能夠結(jié)合特異性的細(xì)胞受體并進入細(xì)胞。該特征是輔助細(xì)胞，而且更一般的是免疫細(xì)胞的免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，根據(jù)本發(fā)明人的結(jié)果，它在誘導(dǎo)比失活蛋白質(zhì)所能夠引發(fā)的免疫反應(yīng)強很多的免疫反應(yīng)方面是非常重要的。結(jié)果，與一些科學(xué)家建議的用失活Tat作為免疫原不同，本發(fā)明人利用生物活性形式的HIV-1Tat或其突變體誘導(dǎo)很強的抗HIV免疫反應(yīng)，能夠預(yù)防感染或者疾病的發(fā)展并可以在HIV-1感染的個體中進行有效的治療。根據(jù)本發(fā)明人的觀點，通過全身(肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下等)或局部(粘膜)途徑可以送遞疫苗。當(dāng)用細(xì)菌(見下文)作為送遞系統(tǒng)時，后一種途徑是優(yōu)選的?？砂慈缦路椒ㄉa(chǎn)疫苗。按照實施例1所述制備Tat，將Tat凍干并儲存。在使用時，可將其重懸在生物學(xué)可接受的流體，例如血清、血漿或其他級分中。本發(fā)明還包括含前述Tat的表達載體或Tat突變體的表達載體，或其部分的轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及經(jīng)培養(yǎng)表達Tat蛋白質(zhì)的細(xì)胞，分離所述Tat蛋白質(zhì)加以利用。所有具有與上述類似的或高于上述活性的Tat變體(包括所有HIV株型和亞型)均包括在本發(fā)明中。下面借助說明性而非限制性的具體實施例來描述本發(fā)明，其中將參考附圖。附圖的詳細(xì)描述圖1A．通過將細(xì)胞因子激活的內(nèi)皮細(xì)胞與抗整聯(lián)蛋白抗體預(yù)保溫，攝入10ng/ml羅丹明化Tat蛋白質(zhì)的抑制作用。將按照表2A注所述處理的細(xì)胞因子激活的人臍靜脈(HUVE)細(xì)胞在含緩沖液或抗體的無血清培養(yǎng)其中預(yù)保溫，然后在37℃，與10ng/ml羅丹明化Tat或者羅丹明化BSA保溫15分鐘。A組，與緩沖液預(yù)保溫，與BSA保溫的細(xì)胞。B組，與緩沖液預(yù)保溫，與Tat保溫的細(xì)胞。C組，與單克隆抗體CDw49e(抗-α5)和CD29(抗-β1)預(yù)保溫，與Tat保溫的細(xì)胞。D組，與單克隆抗體CD51(抗-αv)和CD61(抗-β3)預(yù)保溫，與Tat保溫的細(xì)胞。E組，與抗人Ⅷ因子抗體(對照抗體)預(yù)保溫，與Tat保溫的細(xì)胞。圖1B．通過cat試驗監(jiān)測的，純化Tat-cys22(Tat22)蛋白質(zhì)與野生型Tat蛋白質(zhì)的反式激活活性競爭的能力。將含HIV-1LTR-CAT報導(dǎo)基因(參考文獻148)的H3T1細(xì)胞與野生型Tat蛋白質(zhì)(100ng)單獨保溫，或者在有摩爾過量Tat-cys22蛋白質(zhì)(1μg)的條件下保溫。在轉(zhuǎn)染后48小時，按所述(參考文獻41)，通過確定胞質(zhì)提取物(相當(dāng)于200μg蛋白質(zhì))中的cat活性來確定Tat的HIV-1LTR反式激活活性和Tat-cys22蛋白質(zhì)與野生型Tat競爭的能力。標(biāo)明了在14C-氯霉素乙?；饔弥械陌俜直?％)。圖2．在用Tat蛋白質(zhì)接種的猴中，抗Tat特異性IgG的生產(chǎn)，用免疫酶檢測(ELISA)確定。(A)表示用兩個皮下接種重懸在250μl自體血清和250μlRIBI中的10或100μg重組Tat蛋白質(zhì)的猴子得到的結(jié)果；(B)表示對照猴子(M3)的結(jié)果。在0時和2、5、10、15、22、27、32和37周后，對猴接種。用10μgTat蛋白質(zhì)接種的猴子M2，在41周時評估抗Tat抗體，對猴子M3進行同樣的試驗。通過按下述制備和表征的ELISA評估接種動物血漿中是否存在抗Tat抗體。將Tat蛋白質(zhì)在PVC-96孔平板(在0．05M200μl碳酸鹽緩沖液pH9．6中，100ng/孔)中于4℃吸附12小時。用含吐溫20(0．05％)不含Ca++和Mg++的PBS1x(PBS-A)洗滌3次后，加入用200μl碳酸鹽緩沖液1∶50稀釋的血漿(雙份)，然后在37℃將平板保溫90分鐘。然后用PBS-Alx/吐溫0．05％洗滌孔，然后加入100μl與辣根過氧化物酶結(jié)合的二級抗體(用PBS-A1x/吐溫0.1％/BSA1％以1∶1000稀釋)，在室溫保溫90分鐘。將孔洗滌5次后，在室溫，30-45分鐘內(nèi)，加入100μl底物(ABTS1mM，Amersham)。用分光光度計(405nm)讀數(shù)。每個ELISA包括1∶200-1∶6400稀釋的抗Tat兔多克隆血清(陽性對照)，和以1∶50稀釋的預(yù)免疫血漿(陰性對照)。將截斷值計算為在所有用預(yù)免疫血漿的試驗中得到的陰性猴血漿的光嘧啶(O.D.)的平均值+3個標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)。所列的結(jié)果是兩個孔的平均值。＞2，7表明光密度值不按比例。圖3.在用圖2所述的100(M1)和10(M2)μg重組Tat蛋白質(zhì)接種的猴子血漿中，抗Tat抗體的滴度。按圖2所述完成ELisa，檢測的血漿(一式兩份)從1∶50至1∶25.600按比例稀釋。縱坐標(biāo)上的值表示在檢測仍為陽性的最高血漿稀釋度的倒數(shù)。計算每個稀釋度的截斷值，然后與來自所有試驗所有猴的預(yù)免疫血漿的平均O.D.+3S.D.相對應(yīng)。圖4.由圖2所述的100(M1)和10(M2)μg重組Tat蛋白質(zhì)注射的猴子的抗TatIgG識別的Tat表位圖譜。為了制作表位圖譜，用對應(yīng)于Tat氨基酸(aa)1-20、21-40、36-50、46-60、52-72、56-70、65-80、73-86的8個合成肽完成ELisa。在4℃，將各100μl的每種肽(10μg/ml，在PBS-A/0.1％BSA中)經(jīng)12小時吸附到PVC96孔平板上。然后洗滌平板并與100μlPBS-A/3％BSA在37℃保溫2小時。保溫后，用PBS-A/0.05％吐溫20洗滌平板，然后將用PBS-A和3％BSA稀釋的50μl血漿加到各孔中。然后按圖2所述繼續(xù)ELisa。在初次免疫接種后37周得到血漿。計算各肽和各血漿稀釋度的截斷值，與所有試驗中預(yù)免疫血漿的平均O．D．+3S.D.相對應(yīng)。(A)表示一式兩份各待測肽的1∶50稀釋的血漿的平均值；(B)表示(A)中所示血漿的抗體滴度，表示為在檢測仍是陽性的最高稀釋度的倒數(shù)。圖5．分析用Tat蛋白質(zhì)接種的猴子中，特異性抗TatIgM反應(yīng)并通過ELISA確定。給3只猴子(M1-3)皮下接種10μg重懸在250μl自體血清和250μlRIBI中的重組Tat蛋白；給3只猴子(M4-6)皮下接種10μg重懸在250μl自體血清和250μlAlum中的重組Tat蛋白；2只對照猴子用RIBI(250μl和250μl自體血清)(M7)或用Alum(250μl和250μl自體血清)(M8)皮下接種。在0時和2、6、11和15周后給猴子接種。在2、6、11和15周研究是否存在抗體。ELISA方法描述于圖2中。在這種情況下，以1∶100稀釋度檢測(一式兩份)動物血漿，用與辣根過氧化物酶結(jié)合的IgM山羊抗猴血清(以1∶1000稀釋的)作為二級抗體。將截斷值計算為預(yù)免疫血漿的O.D.值的平均值(+2S.D.)。結(jié)果是兩個孔的O.D.值(在405nm)的平均值減去截斷值(ΔO.D.405)。圖6.用Tat接種的猴子中，特異性抗TatIgG生產(chǎn)的分析，用ELISA檢測。給3只猴子(M1-3)接種10μg重懸在250μl自體血清和250μlRIBI中的重組Tat蛋白；給3只猴子(M4-6)接種10μg重懸在250μl自體血清和250μlAlum中的重組Tat蛋白；2只對照猴子用RIBI(250μl和250μl自體血清)(M7)或用Alum(250μl和250μl自體血清)(M8)接種。在0時和2、6、11、15、21、28和32周后給猴子接種。在36周，用16μg重懸在200μlISCOMs和300μlPBS中的Tat蛋白質(zhì)給猴子M1至M6接種。在40和44周評估抗體。在圖2中描述了ELISA方法和截斷值的確定方法。所列的結(jié)果指1∶50稀釋的樣品。＞2，7表示O.D.值不按比例。圖7.存在圖6所述RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)的條件下，用重組Tat(10μg)接種的猴子血漿中，抗Tat抗體的滴度。以檢測仍為陽性的最高血清稀釋度的倒數(shù)列出了每個血漿的結(jié)果。圖8.存在圖6所述RIBI(M1-M3)或Alum(M4-M6)的條件下，由用重組Tat蛋白質(zhì)(10μg)接種的猴子的抗TatIgG識別的Tat表位。在初次免疫接種后21周獲得血漿。在圖4中描述了ELisa方法和截斷值的確定。(A)中的結(jié)果指1∶50稀釋的樣品并且是兩個孔的平均值。(B)中的結(jié)果指(A)所示的血漿滴度并表示為在檢測仍為陽性的最高血漿稀釋度的倒數(shù)。圖9.Tat特異性CTL的分析。按表5所述完成檢測。所列的是按圖6所述，皮下注射10μgTat和RIBI的猴子M1在第36周的實例。方塊(對照)對應(yīng)于與未脈沖的BLCL靶細(xì)胞一起保溫的細(xì)胞；菱形對應(yīng)于與用Tat(1μg／250.000細(xì)胞)脈沖的BLCL靶細(xì)胞一起保溫的細(xì)胞。圖10.用皮膚試驗分析對Tat的延遲超敏反應(yīng)。將重懸在150μl含0.1％BSA的PBS中的Tat蛋白質(zhì)(5，1和0.2μg)或者其中重懸Tat的緩沖液皮內(nèi)(i.d.)接種于動物背部刮過的區(qū)域。在0時和24、48和72小時后給該區(qū)域拍照。對照猴子僅接種緩沖液。所列的是猴子M2(15周)的實例，按圖6所述，該猴子用10μgTat和RIBI接種。在皮膚試驗后48小時，對Tat的陽性反應(yīng)明顯。圖11.在用200μg重懸在150μlPBS-A中的pCV-Tat質(zhì)粒皮內(nèi)接種的1只猴子(M1)中，對Tat的體液IgG反應(yīng)，在靠近腋淋巴結(jié)的兩個位點接種；給1只猴子(M2)注射500μg重懸在250μlPBS-A中的pCV-Tat，在背部的兩個位點進行肌肉內(nèi)注射；對照猴子(M3)不接種TatDNA，但接受用Tat的重復(fù)皮膚試驗作為特異性的對照。在0時和5、10、15、22、27、32和37周后，用pCV-Tat給猴子注射。最后，在42周后，用重懸在200μlISCOMs和300μlPBS中的重組Tat蛋白質(zhì)(16μg)給猴子加強接種。在2、5、10、15、22、27、32、37、42、48和58周評估抗體。按圖2所述用ELisa分析血漿中(1∶50)的抗Tat抗體反應(yīng)。結(jié)果是兩個孔的平均OD值。(A)表示得自用200(M1)和500(M2)μgpCV-Tat質(zhì)粒接種的兩個猴子的結(jié)果。(B)表示對照猴子(M3)的結(jié)果。圖12.在用200μgpCV-Tat皮內(nèi)(i.d.)接種的猴子M2的血漿中，抗Tat抗體的滴度。圖2中描述了ELisa。將縱坐標(biāo)上的結(jié)果表示為在檢測仍為陽性的最高稀釋度的倒數(shù)。圖13.分析用1mgpCV-Tat接種的3只猴子(M9-M11)和用1mg對照載體pCV-O接種的1只對照猴子(M12)中，抗TatIgG的生產(chǎn)。將DNA重懸在1毫升PBS-A中，然后在背部的兩個位點進行肌肉內(nèi)注射。在0時和6、11、15、21、28和32周給猴子接種。在第36周，用16μg重懸在200μlISCOMs和300μlPBS中的重組Tat蛋白質(zhì)給猴子M9-M11加強接種。在2、6、11、15、21、28、32、36、40和44周評估是否存在抗Tat抗體。在圖2中描述了ELisa和截斷值的確定。圖14.Macacafascicularis的PBMC對用在順磁珠上的抗-CD3和抗-CD28單克隆抗體(抗-CD3/28珠)共刺激的增殖反應(yīng)動力學(xué)。用免疫磁測定法耗盡PBMC的CD8陽性亞種群。此后，將半數(shù)耗盡抗-CD8的淋巴細(xì)胞用PHA和IL-2(40U/ml)刺激，從第3天開始；讓剩余的部分粘附在抗-CD3/28-包被珠抗體上，由此得到CD8-耗盡的及CD3/28陽性淋巴細(xì)胞種群。從培養(yǎng)第10天開始，將IL-2(40U/ml)加至該細(xì)胞級分中。每2-3天計數(shù)細(xì)胞并確定其存活力。將珠細(xì)胞比例保持穩(wěn)定。記錄不同時間點的細(xì)胞數(shù)。圖15.用抗-CD3/28珠共刺激對MacacafascicularisPBMC的抗病毒作用。按實施例7所述刺激通過圖14中所述方法得到的4只猴子(圖15A至15B)的CD8-耗盡的和CD8-耗盡的CD3+/CD28+淋巴細(xì)胞。在0天，將兩種級分用0.1M.O.I.SIVmac251/63M體外感染。用PHA和IL-2(自第3天加入)，用抗-CD3/28珠(而不加入外源IL-2)進行刺激。按實施例7所述，通過感染后第6和12天確定細(xì)胞上清液中p27水平(ng/ml)來評估病毒生產(chǎn)。(亮灰色PHA+IL-2，深灰色在PBMCCD8-/CD3+/CD28+上的抗-CD3/28珠)。圖16.從猴外周血得到的樹突細(xì)胞(DC)的功能特征。(A)在同種異型混合的白細(xì)胞培養(yǎng)物(AMLR)的4天摻入3H-胸苷，與在Percoll梯度上分離并粘附在塑料上后，從MacacafascicularisPBMC得到的DC和巨噬細(xì)胞(Mφ)抗體呈遞功能(APC，確定為誘導(dǎo)同種異型T細(xì)胞的增殖)相比。除去未粘附的細(xì)胞，通過每3天加入GMCSF(200ng/ml)和IL-3(200單位/ml)誘導(dǎo)粘附細(xì)胞成熟成DC。除去一半培養(yǎng)基(RPMI，10％FCS)，然后每3天用新鮮培養(yǎng)基代替。6-7天后，觀察細(xì)胞因子-誘導(dǎo)的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，要求典型的DC表型(喪失粘附，成簇，伸出)，再通過確定典型的膜標(biāo)記物來確定(數(shù)據(jù)未給出)。單核細(xì)胞不用細(xì)胞因子誘導(dǎo)，在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述單核細(xì)胞，每3天替換培養(yǎng)基。細(xì)胞保持單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞特征，例如粘附。在第7天，用通過Ficoll和Percoll梯度和粘附純化的來自人血供體的T-淋巴細(xì)胞攻擊這兩種細(xì)胞種群，然后冷凍。用48孔平板完成細(xì)胞增殖試驗。用5000DC或Mφ(T∶APC比率=100∶1)刺激50萬T-淋巴細(xì)胞。培養(yǎng)4天，然后將固定份數(shù)的細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到96孔平板中，一式三份。加入1μCi3H-胸苷，經(jīng)16小時，用β計數(shù)器確定摻入前體的每分鐘計數(shù)(cpm)。(B)按上述有關(guān)人供體的報導(dǎo)，用來自另一猴的T淋巴細(xì)胞攻擊按圖16A報導(dǎo)所得的APCs，例如DC和Mφ。與Mφ相比，呈遞抗原的能力較高是DC的典型特征。將APCs以比例濃度加至T淋巴細(xì)胞中以便評估不同T∶APCs(DC或Mφ)比例得到的增殖反應(yīng)。下列實施例是說明性的，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實施例1.表達、純化并表征野生型Tat蛋白質(zhì)(ⅢB分離物)、突變的Tat蛋白質(zhì)和野生型Tat肽過去由于易于氧化、聚集和失活，因此在純化和保持Tat蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性方面遇到了許多困難。這是由于存在大量可形成分子內(nèi)-和分子間鍵，并由此改變了天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象的半胱氨酸殘基(參考文獻159、41)。已經(jīng)將Dr.J.F.DeLamarter和B.Allet(GlaxoInstituteforMolecularBiologyS.A.,Ginevra,Svizzera)提供的、已克隆在pL-syn載體中的cDNA或tat基因(Sep.1.實施例2)于在大腸桿菌中表達該蛋白質(zhì)。為了達到用Tat有效免疫以便用于疫苗的目的，本發(fā)明人認(rèn)為最重要的是得到在“本發(fā)明詳細(xì)描述”部分所述的生物活性Tat蛋白質(zhì)。因此，在本實施例和下文實施例1B、2和3中所述的生產(chǎn)和純化Tat的方法描述了得到生物活性Tat蛋白質(zhì)所必需的過程和控制，生物活性Tat蛋白質(zhì)是一種有效的免疫原以免受HIV感染、AIDS或者HIV-相關(guān)疾病的發(fā)展。用于得到活性蛋白質(zhì)的第一種方法是以高壓液相色譜和液體及離子交換色譜的連續(xù)步驟(參考文獻15、41)為基礎(chǔ)。用這些方法得到的蛋白質(zhì)純度高于95％，而且是活性蛋白質(zhì)(參考文獻41、42)。但是由于蛋白質(zhì)的氧化作用，每批之間沒有良好的重現(xiàn)性，而蛋白質(zhì)的氧化作用是商業(yè)Tat制備中的主要問題。由于我們觀察到Tat蛋白質(zhì)的堿性區(qū)對肝素有強親和性而且肝素可防止其氧化，因此，我們用肝素親和色譜并定義了一種新的Tat純化方法，如Chang等(參考文獻26)所述。用UltrasonicLiquidProcessor(ModelXL2020，HeatSystemInc)，放電3次，每次20秒，在40毫升溶解緩沖液(磷酸氫二鈉20mM，pH7.8；2.5％甘油；PMSF0.2mM；DTT5mM；甘露糖醇50mM；抗壞血酸10mM；氯化鈉500mM)中，對表達Tat的大腸桿菌細(xì)胞(10gr重)進行聲處理。將溶解產(chǎn)物以12000g離心30分鐘，然后將上清液與2毫升用溶解緩沖液預(yù)洗滌的肝素sepharose樹脂在室溫一起保溫1小時。將樹脂負(fù)載到玻璃柱上，然后用溶解緩沖液洗滌直到在洗滌介質(zhì)中檢測不到蛋白質(zhì)。用含2M氯化鈉的溶解緩沖液洗脫結(jié)合的物質(zhì)，然后以1毫升收集洗脫液。通過凝膠電泳(SDS-PAGE)分析洗脫蛋白質(zhì)的均勻性。在-70℃將純化的蛋白質(zhì)凍干保藏，在使用前重懸在脫氣緩沖液中。通過在HLM-1細(xì)胞中的病毒感染“獲救”試驗來評估根據(jù)上述方法得到的純化Tat蛋白質(zhì)的生物活性，所述HLM-1細(xì)胞衍生于Hela-CD4+細(xì)胞，含有tat基因缺陷型的原病毒，是按Sadaie等所述得到的(參考文獻140)。Ensoli等(參考文獻41)所述的病毒感染“獲救”試驗是指通過加入外源Tat蛋白質(zhì)(2μg/ml)在HLM-1細(xì)胞(2×105)中補足Tat表達的缺陷，然后通過確定在用試劑盒加入外源Tat蛋白質(zhì)48小時后，培養(yǎng)基中釋放的p24抗原來評估病毒復(fù)制。Chang等(參考文獻26)描述的“獲救”試驗的結(jié)果表明用本方法純化的Tat蛋白質(zhì)具有活性，而且與以前描述的方法(參考文獻40、41、42)相比，該純化方法就Tat的純度和生物活性而言，更好、更容易且更便宜。將上述純化的不同重組Tat制品在存在弗氏佐劑的條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)方法(參考文獻4)給小鼠和兔接種。在表1中列出免疫接種誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)的結(jié)果。表1分析用重組Tat蛋白質(zhì)免疫的小鼠和兔血清中的抗Tat特異性抗體反應(yīng)抗Tat抗體OD-ELISA／TatWestern印跡1∶5001∶10001∶2000兔0.6510.4000.175+小鼠0.5020.2400.150+用在大腸桿菌中生產(chǎn)的重組Tat蛋白質(zhì)按照標(biāo)準(zhǔn)免疫方法(參考文獻4)免疫接種小鼠和兔。使用3個稀釋度(1∶500-1∶2000)用ELISA分析免疫動物的血清中是否存在抗Tat抗體。所述結(jié)果是2個兔和3只小鼠在405nm讀數(shù)的平均值。此外，用重組Tat蛋白質(zhì)(100ng)通過Western印跡檢測血清。表1中的結(jié)果表明我們制備的重組Tat能夠在這兩種動物中誘導(dǎo)抗體反應(yīng)，正如用使用了重組Tat蛋白質(zhì)的ELISA和Western印跡所檢測的。所述抗體能夠抑制Tat的內(nèi)化和生物活性(參考文獻40、41、42)。用pL-syn載體和Tat蛋白質(zhì)的純化方法表達并純化實施例2所述Tat突變體。按上述對野生型Tat蛋白質(zhì)的描述，通過HLM-1細(xì)胞中的病毒感染“獲救”試驗、KS細(xì)胞和小鼠體內(nèi)增殖試驗測量突變和活化Tat蛋白質(zhì)的生物活性。此外，在存在野生型Tat(系列濃度)的條件下，檢測突變Tat蛋白質(zhì)以證明對病毒復(fù)制的陰性反式顯性(transdominant)作用。用pL-syn載體和純化方法表達并純化以下類型的融合蛋白Tat(野生型或其突變體)/IL-12或者Tat(野生型或其突變體)/IL-15或其部分或者Tat(野生型或其突變體)/其他分子(或其部分)，單獨或與其他病毒產(chǎn)物組合時，能夠提高對Tat的免疫反應(yīng)。利用實施例2和3中所述的序列和引物制備融合重組分子?；蛘?，用合成肽作為免疫原，所述合成肽對應(yīng)于Tat或者與Tat組合的其他病毒產(chǎn)物或者細(xì)胞因子的區(qū)域。Tat的肽序列是Pep.1.MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTPep.2.ACTNCYCKKCCFHCQVCFITPep.3.QVCFITKALGISYGRKPep.4.SYGRKKRRQRRRPPQPep.5.RPPQGSQTHQVSLSKQPep.6.HQVSLSKQPTSQSRGDPep.7.PTSQSRGDPTGPKETat突變體肽含有實施例2所述的突變Tat蛋白質(zhì)的相同氨基酸取代。將所述肽與代表破傷風(fēng)類毒素的通用T輔助表位的肽或者代表T輔助表位的其他肽組合使用(參考文獻77)。實施例1A·由整聯(lián)蛋白受體介導(dǎo)通過激活的內(nèi)皮細(xì)胞攝入皮摩爾濃度(10至100ng/ml)的生物活性Tat當(dāng)用炎癥細(xì)胞因子體外激活正常內(nèi)皮細(xì)胞時，它們變得對細(xì)胞外的Tat作用有反應(yīng)性，而且這是由于α5β1和αvβ3整聯(lián)蛋白的誘導(dǎo)(參考文獻9、10)。同樣，炎癥細(xì)胞因子(IC)或bFGF體內(nèi)提高整聯(lián)蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達，這樣當(dāng)將生物活性Tat同時或在bFGF后接種給小鼠時，可以產(chǎn)生協(xié)同的KS-促進作用(參考文獻42)。另外，IC-激活的內(nèi)皮細(xì)胞獲得APC功能。在本實施例中，表明用IC激活的內(nèi)皮細(xì)胞能夠更有效地攝入羅丹明化生物活性Tat，而且是由整聯(lián)蛋白受體介導(dǎo)的。由于很難觀察低濃度的冷Tat的內(nèi)化作用，因此，用羅丹明(rhodamin)標(biāo)記所述蛋白質(zhì)(參考文獻98)。在與未標(biāo)記的Tat相同的濃度范圍內(nèi)，羅丹明化Tat仍有KS細(xì)胞增殖的激活作用，這表明標(biāo)記方法不影響其生物學(xué)功能。按下列方法完成Tat攝入試驗按所述使人臍靜脈(HUVE)細(xì)胞生長并用IC處理5天(參考文獻9、46)。然后將細(xì)胞胰蛋白酶化處理，以0.5×105細(xì)胞／孔鋪在8孔玻片(NuncInc.,Naperville,IL)上，然后在含15％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中，存在IC的條件下保溫18小時。加入無血清培養(yǎng)基(SF,RPMI,1％BSA,0.1％抗生素，兩性霉素)，然后在4℃，將玻片預(yù)保溫2小時。將含系列稀釋的羅丹明化Tat的新鮮培養(yǎng)基加至細(xì)胞中，然后在37℃，將細(xì)胞保溫所標(biāo)明的時間。陰性對照是在與Tat相同的緩沖液中的羅丹明化BSA。將細(xì)胞用冰冷丙酮-甲醇(11)固定，然后用熒光顯微鏡肉眼觀察Tat的攝入和定位。通過將樣品的熒光與陰性對照進行比較來評估結(jié)果，將結(jié)果根據(jù)攝入量記錄為0至++++，不預(yù)先告知樣品標(biāo)號。為了研究活化內(nèi)皮細(xì)胞攝入Tat的途徑，使用濃度大不相同的外源Tat，例如前述用于誘導(dǎo)HUVE或KS細(xì)胞生長(10-50ng/ml)或者通過將蛋白質(zhì)加至攜帶HIV-1啟動子或原病毒的細(xì)胞中引發(fā)HIV-1反式激活(0.5-1ug/ml)所需的濃度，利用活化HUVE細(xì)胞完成試驗。在這些試驗中，為了與攝入抑制試驗相一致(見下文)，在4℃將細(xì)胞與不含胎牛血清的培養(yǎng)基預(yù)保溫2小時。所述預(yù)保溫不會影響隨后羅丹明化Tat的攝入。用羅丹明化Tat，蛋白質(zhì)向活化HUVE細(xì)胞核或核仁的攝入和易位是從與低至10ng/ml的羅丹明化Tat一起保溫15分鐘內(nèi)開始的。細(xì)胞內(nèi)Tat的攝入密度是劑量依賴性和時間依賴性的。羅丹明化BSA或緩沖液沒有信號，因此，將其常規(guī)用作陰性對照。為了確定活化HUVE細(xì)胞的Tat攝入是否由發(fā)現(xiàn)在KS細(xì)胞上表達的相同整聯(lián)蛋白介導(dǎo)，通過將IC激活的內(nèi)皮細(xì)胞與冷Tat(競爭者)，這些受體的生理學(xué)配體例如纖連蛋白(FN)或玻連蛋白(VN)預(yù)保溫，或者將細(xì)胞與抗α5β1和αvβ3受體RGD結(jié)合區(qū)的單克隆抗體預(yù)保溫來完成抑制試驗。簡要說明試驗過程。鋪在8孔玻片上后，將HUVE細(xì)胞與含15％FBS的培養(yǎng)基保溫18小時，然后與含未標(biāo)記的Tat(冷競爭者)(表1A)、FN、VN(表1B)或者抗FN或VN受體(分別為α5β1和αvβ3)RGD結(jié)合序列的單克隆抗體或者抗人Ⅷ因子的單克隆抗體(對照抗體)(圖1A)的SF培養(yǎng)基在4℃保溫2小時。然后將細(xì)胞與羅丹明化Tat保溫標(biāo)明的時間。對照由用SF培養(yǎng)基在4℃單獨處理2小時的細(xì)胞組成，然后與羅丹明化BSA一起保溫。將細(xì)胞固定、肉眼觀察、照相，然后按上述說明記錄分?jǐn)?shù)。表1A通過將細(xì)胞與1μg/ml未標(biāo)記的Tat預(yù)保溫，細(xì)胞因子激活的HUVE攝入100ng/ml和1μg/ml羅丹明化Tat的抑制作用a<tablesid="table1"num="001"><table>預(yù)保溫羅丹明化TatTat的攝入無血清培養(yǎng)基100ng/ml+++lμg/ml未標(biāo)記的Tat100ng/ml+/-無血清培養(yǎng)基1μg/ml++++lμg/ml未標(biāo)記的Tat1μg/ml+/-</table></tables>a按前述培養(yǎng)HUVE細(xì)胞(參考文獻40)。按前述(參考文獻9、46)從人T-嗜淋巴細(xì)胞病毒Ⅱ型(HTLV-Ⅱ)轉(zhuǎn)化的CD4+T細(xì)胞或植物凝集素-刺激的T細(xì)胞得到IC，然后用上清液(1∶8)激活HUVE細(xì)胞5天(傳代8-14天)。該上清液含有白介素-1α(IL-1α)和-β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和-β(TNF-β)和干擾素-γ(IFN-γ)(參考文獻9)?；旧习此?參考文獻98)在賴氨酸殘基處將Tat蛋白質(zhì)羅丹明化。簡而言之，通過加入2.5μl1MNa2CO3，將50μg重組Tat(2mg/ml)調(diào)至pH9.0。加入2.5μl在二甲亞砜(DMSO)中的1mg/mlTRITC，使反應(yīng)在4℃進行8小時。通過加入2.5μl0.5MNH4Cl將未反應(yīng)的TRITC猝滅，用1MHCl使pH降至7.0，將羅丹明化Tat對50mMTris-HCl，pH7.0，1mM二硫蘇糖醇(DTT)透析兩次以除去猝滅的TRITC。用以相同方式羅丹明化的BSA或PBS用作陰性對照。按所述檢測羅丹明化Tat的AIDS-KS細(xì)胞生長活性以確保保持生物活性(參考文獻40)。將HUVE細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基或者無血清培養(yǎng)基中的1μg/ml未標(biāo)記Tat預(yù)保溫2小時，與100ng/ml或1μg/ml羅丹明化Tat保溫60分鐘，然后通過熒光顯微鏡肉眼觀察Tat攝入。將陰性對照(+/-攝入)與無血清培養(yǎng)基預(yù)保溫，然后與羅丹明化BSA保溫。表1B通過將細(xì)胞與過量FN或VN預(yù)保溫對細(xì)胞因子激活的HUVE攝入10ng/ml羅丹明化Tat的抑制作用a<tablesid="table2"num="002"><table>預(yù)保溫羅丹明化Tat的攝入無血清培養(yǎng)基++++100ng/mlFN+/-100ng/mlVN+/-</table></tables>a將HUVE細(xì)胞與無血清培養(yǎng)基或在無血清培養(yǎng)基中的FN或VN預(yù)保溫2小時，然后與10ng/ml羅丹明化Tat保溫60分鐘，然后通過熒光顯微鏡肉眼觀察Tat攝入。將陰性對照(+/-攝入)與無血清培養(yǎng)基預(yù)保溫，然后與羅丹明化BSA保溫。通過冷Tat(表1A)、FN或VN(表1B)或者用抗FN受體α5β1和VN受體αvβ3(圖1A)的RGD結(jié)合區(qū)的單克隆抗體預(yù)處理細(xì)胞來抑制Tat的攝入。將細(xì)胞中的熒光強度降低至用陰性對照可見的水平，將細(xì)胞與抗人Ⅷ因子的單克隆抗體(作為陰性對照)預(yù)保溫未觀察到抑制作用，這表明抑制作用是特異性的(圖1A)。通過將細(xì)胞與抗α5β1受體和αvβ3受體RGD結(jié)合區(qū)的單克隆抗體預(yù)保溫來抑制100ng/mlTat的攝入和核定位。但是，在這兩種情況下，抑制作用均是不完全的。這些結(jié)果表明皮摩爾濃度Tat的攝入是由與細(xì)胞粘附Tat中有關(guān)的相同的整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的(參考文獻10)。但是，在較高濃度的細(xì)胞外Tat(例如≥100ng/ml)下，非整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的途徑引起一些蛋白質(zhì)的攝入。與這些結(jié)果相反，淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞對碘化Tat的攝入是線性的，并且是培養(yǎng)基中Tat濃度的函數(shù)，而且不受或很少受過量冷Tat的競爭，這說明沒有受體介入(參考文獻98)。但是，在該研究中，培養(yǎng)基中Tat的濃度范圍為約1-100μg/ml(參考文獻98)，遠(yuǎn)高于觀察對其生物活性敏感的細(xì)胞(例如活化的初級內(nèi)皮細(xì)胞)攝入Tat所需的濃度。另外，Tat的碘化影響其結(jié)構(gòu)和細(xì)胞對其的攝入，但是那些作者沒有列出碘化Tat的生物活性結(jié)果。這些未公開的結(jié)果表明Tat的攝入至少是通過兩個依賴于該蛋白質(zhì)濃度的途徑。在低(10-100ng/ml)Tat濃度，Tat的攝入是由α5β3受體和αvβ3受體通過與該蛋白質(zhì)的RGD序列相互作用而介導(dǎo)的，而在較高的細(xì)胞外Tat濃度，不依賴整聯(lián)蛋白的途徑更重要。整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的IC激活內(nèi)皮細(xì)胞對皮摩爾濃度Tat的攝入表明具有完全活性的蛋白質(zhì)能夠進入抗原呈遞細(xì)胞，例如活化的內(nèi)皮細(xì)胞和樹突細(xì)胞，引發(fā)免疫反應(yīng)。實施例2．構(gòu)建并表征突變的tat基因我們利用位點特異性誘變或通過缺失在不同的Tat區(qū)產(chǎn)生了19個突變體。通過測序控制每個突變DNA的序列。將tat突變基因的cDNAs克隆在在實施例3中描述的pCVO載體的PstI位點。按Ensoli等(參考文獻41)所述，用HIV-1LTR-CAT質(zhì)粒將每個突變體共轉(zhuǎn)染在COS-1細(xì)胞或JurkatT細(xì)胞系中，在所述質(zhì)粒中，CAT報導(dǎo)基因受HIV-1LTR的驅(qū)動。這些未公開的試驗結(jié)果列在表2中。表2Tat突變體對HIV-1LTR-CAT反式激活作用的影響和對Tat野生型活性的阻斷作用(負(fù)反式顯性)突變體反式激活活性a反式顯性活性b(％抑制)平均值(倍)(最小-最大值)平均值CYS220.09(0.021-0.22)21THR230.36(0.16-1)THR23A0.30(0.16-0.78)ASN240.34(0.34-0.82)ASN24A0.42(0.45-0.95)TYR260.14(0.08-0.19)LYS28/290.52(0.19-1.04)CYS300.30(0.045-0.65)CYS310.60(0.27-1.09)PHE320.31(0.077-0.097)LYS330.04(0.0027-0.068)46GLU350.31(0.19-0.43)PHE380.05(0.043-.057)98LYS410.04(0.025-0.061)97TYR470.58(0.31-0.8)57A0.35(0.26-0.44)TAT-RGD0.94(0.73-1.15)TAT-KGE1.11(0.67-1.49)TAT野生型11a所述結(jié)果是以野生型Tat誘導(dǎo)的CAT活性值(倍=1)的激活增加給出的。b將結(jié)果表示為野生型Tat活性的抑制百分比(％)。從表2所列的結(jié)果可以看出，對于大部分突變體來說，HIV-1LTR的反式激活作用降低或消失，例外是RGD突變體，該突變體的活性與野生型Tat的相似。我們選擇了4個具有最低(幾乎為零)反式激活活性的突變體(eys22，lys33，phe38，lys41)，然后確定對野生型Tat的反式激活作用的負(fù)反式顯性作用。至此，在存在HIV-1LTR-CAT載體的條件下，用含Tat突變體和pCV-Tat載體(10∶1)的各載體共轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。如表2所示，lys41和tyr47突變體幾乎完全抑制了Tat活性，而lys33和cys22突變體部分抑制Tat活性。但是，cys22重組蛋白質(zhì)(下列實施例3中所述的)在反式激活HIV-1LTR-CAT中，與野生型Tat蛋白質(zhì)競爭(圖1B)。選擇半胱氨酸區(qū)的突變體(cys22)、核心區(qū)的突變體(lys41)、缺失RGD序列的突變體(RGDΔ)和含lys41突變并缺失RGD序列的雙突變體(lys41-RGDΔ)。下文給出用于接種的tat插入片段和突變體的序列。描述通過1)取代一個堿基以得到氨基酸取代和2)缺失一個堿基以達到缺失相應(yīng)氨基酸而得到一系列tat突變體。通過定點誘變得到取代和缺失。將下文給出的野生型tat基因和tat基因突變體的序列插入在上述pCVO質(zhì)粒載體中。Seq.1是HIV-1tat基因序列，來自BH-10克隆和其衍生的蛋白質(zhì)。Seq.2是cys22突變體序列(和其衍生的蛋白質(zhì))，在從5’末端開始的第66位上，用鳥嘌呤(G)核苷酸取代Timine(T)核苷酸。在衍生的氨基酸序列中，該取代引起在氨基末端第22位上用甘氨酸(用單字母密碼G表示)取代半胱氨酸(用單字母密碼C表示)。Seq.3是lys41突變體序列(和其衍生的蛋白質(zhì))，在從5’末端開始的第123位上用胞嘧啶(C)核苷酸取代Timine(T)核苷酸。該取代在衍生的氨基酸序列中引起用蘇氨酸(單字母密碼T)取代距氨基末端第41位上的賴氨酸(單字母密碼K)。Seq.4是RGD突變體(和其衍生的蛋白質(zhì))的序列，從野生型tat基因的5’末端開始，缺失核苷酸序列CGAGGGGAC，從核苷酸232至核苷酸240。這樣缺失了從氨基末端78-80位的氨基酸精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(單字母密碼RGD)。Seq.5是雙突變體lys41-RGDΔ(和其衍生的蛋白質(zhì))的序列，來源于上述突變體的組合。野生型tat核苷酸序列(Seq.1)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOHCys22突變體的核苷酸序列(Seq.2)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCGGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTAGTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOHLys41核苷酸序列(Seq.3)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOHRGDΔ突變體的核苷酸序列(Seq.4)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOHLys41-RGDΔ突變體的核苷酸序列(Seq.5)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH實施例3．構(gòu)建并表征DNA免疫原將用于接種動物的DNA分子插入6.4kbpCVO質(zhì)粒載體(參考文獻5)。該質(zhì)粒含有兩個SV40復(fù)制起點，腺病毒的主要晚期啟動子(AdMLP)和腺病毒和小鼠免疫球蛋白基因的剪接序列，小鼠二氫葉酸-還原酶(dhfr)和SV40聚腺苷酸化信號的cDNA。PstI限制酶位點位于AdMLP的3’，并代表所需的外源基因被克隆的位點。HIV-1的tat基因cDNA(261個堿基對)(seq·1，實施例2)衍生于HIV-1BH10克隆(參考文獻126)并編碼86個氨基酸長的蛋白質(zhì)。通過將tatcDNA克隆到pCVOPstI位點，得到pCV-Tat載體(參考文獻5)，由AdMLP驅(qū)動。選擇該載體是基于相對于其他真核啟動子例如Ensoli等(參考文獻41)說明的巨細(xì)胞病毒(CMV)的立即早期區(qū)域啟動子而言，AdMLP可誘導(dǎo)較高水平的Tat表達和釋放，結(jié)果列于表3。表3．Tat在用pCV-Tat和CMV-Tat轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞中的表達、亞細(xì)胞定位、釋放和活性a<tablesid="table3"num="003"><table>載體Tat表達Tatb含量Tat活性陽性細(xì)胞核c胞質(zhì)(％)總量胞內(nèi)胞外(％)(％)胞內(nèi)d胞外e(倍)(cpm)pCV-TatCMV-Tat對照5-10++++3-5+++0--2563，536，514，692，27，8000502.478722.25411.400</table></tables>a通過用30μgpCV-Tat，CMV-Tat或?qū)φ誅NA電穿孔轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞(5×106)。轉(zhuǎn)染后48小時，通過用抗Tat單克隆抗體(給出的值是陽性細(xì)胞的百分比平均值)的免疫組織化學(xué)和通過核和胞質(zhì)Tat定位來評估Tat的表達。通過對細(xì)胞提取物(500μl)上和培養(yǎng)基(4毫升)中的放射性免疫沉淀，以及隨后的沉淀Tat帶的光密度讀數(shù)(GelscanXL；Pharmacia)來分析細(xì)胞內(nèi)-和細(xì)胞外Tat的存在。對用Tat表達載體或?qū)φ蛰d體和LTR-CATHIV-1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞提取物測量細(xì)胞內(nèi)Tat活性；在用表達Tat的質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基(1∶2和1∶4稀釋的)中測量細(xì)胞外Tat對AIDS-KS細(xì)胞增殖(用3H-胸苷摻入試驗確定的)的活性。所述結(jié)果是5個獨立試驗的平均值。b免疫沉淀Tat蛋白質(zhì)帶的光密度分析。將數(shù)值用任意標(biāo)度表示，總的檢測的最小值(細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外Tat)是10。c-負(fù)；+，Tat陽性細(xì)胞的50％；++，Tat陽性細(xì)胞的50-100％。d與對照載體保溫20分鐘后的CAT活性，其活性值為1。e用3[H]-胸苷摻入試驗測量AIDS-KS細(xì)胞生長(標(biāo)準(zhǔn)偏差，SD12％)。用對照DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液3[H]-胸苷摻入值為1，400cpm(SD11.5％)。得自活化T淋巴細(xì)胞(陽性對照)的培養(yǎng)基的3[H]-胸苷摻入值為2，400cpm(SD10％)。表3表示在pCV-Tat轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，與CMV-Tat轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，Tat陽性細(xì)胞的百分比和總Tat含量更高，釋放的Tat量更高，而且與總的和胞質(zhì)的Tat含量有關(guān)，因此，細(xì)胞外Tat對AIDS-KS細(xì)胞生長的生物活性更高。所述結(jié)果表明，pCV-Tat載體編碼生物活性蛋白，誘導(dǎo)高水平的tat基因表達并且從細(xì)胞中釋放的Tat量高于CMV-Tat載體。還可用pCVO載體表達HIV-1nef，rev和gag基因以及編碼IL-12和IL-15細(xì)胞因子的基因。利用與所述基因5’區(qū)前15個核苷酸(正向引物)(Seq.P1、P3、P5、P7、P9)或與3’區(qū)后15個核苷酸(反向引物)(Seq.P2、P4、P6、P8、P10)互補的特異性引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)擴增nef(618個堿基對，NL43株)(參考文獻112)，rev(348個堿基對，NL43株)(參考文獻95)和gag基因(1500個堿基對，NL43株)(參考文獻95)的cDNAs或者IL-12(參考文獻165)或者IL-15基因(參考文獻56)的cDNAs。此外，每個引物，不論正向反向均含有PstI限制酶的序列以便可以將擴增的產(chǎn)物克隆到pCVO載體中。克隆后，通過DNA測序控制插入基因的序列。還可將pCVO載體用于共表達Tat與HIV-1的其他病毒基因(rev、nef或gag)或者IL-12或IL-15細(xì)胞因子編碼基因。至此，用正向引物(包括PstI限制酶的序列(Seq.P11))和與tat基因的后15個核苷酸互補的反向引物(Seq.P12)通過PCR擴增261個堿基對的HIV-1tat基因的cDNA(Seq.1，實施例2)。用正向引物和反向引物擴增病毒基因(nef、rev或gag)或編碼IL-12或IL-15細(xì)胞因子的基因，可以讓所述基因在tat基因框架內(nèi)，所述正向引物也包括與tat3’區(qū)互補的15個堿基的序列(Seq．P13、P14、P15、P16、P17)，反向引物包括PstI限制酶序列(Seq．P2、P4、P6、P8、P10)。此后，完成第三個PCR反應(yīng)，其中用tat基因和所需基因的擴增產(chǎn)物為DNA模板。正向引物為用于擴增tat的引物(Seq.P11)，反向引物為用于擴增所需基因的引物(Seq.P2、P4、P6、P8、P10)。將擴增的tat/所需基因用瓊脂糖凝膠純化，用PstI消化并克隆在pCVO中。克隆后，通過DNA測序控制插入基因的序列，而用上述轉(zhuǎn)染方法確定蛋白質(zhì)的表達(參考文獻41)。上述引物的序列如下Seq.P1.正向引物Rev5’ATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P2.反向引物Rev5’CTATTCTTTAGTTCC3’Seq.P3.正向引物Nef5’ATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P4.反向引物Nef5’TCAGCAGTCCTTGTA3’Seq.P5.正向引物Gag5’ATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P6.反向引物Gag5’TTATTGTGACGAGGG3’Seq.P7.正向引物IL-125’ATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P8.反向引物IL-125’TTAGGAAGCATTCAG3’Seq.P9.正向引物IL-155’ATGAGAATTTCGAAA3’Seq.P10.反向引物IL-155’TCAAGAAGTGTTGAT3’Seq.P11.正向引物Tat5’ATGGAGCCAGTAGAT3’Seq.P12.反向引物Tat5’CTATTCCTTCGGGCC3’Seq.P13.正向引物Tat/Rev5’GGCCCGAAGGAAATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P14.正向引物Tat/Nef5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P15.正向引物Tat/Gag5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P16.正向引物Tat/IL-125’GGCCCGAAGGAAATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P17.正向引物Tat/IL-155’GGCCCGAAGGAAATGAGAATTTCGAAA3’實施例4．用抗Tat蛋白質(zhì)疫苗接種健康Macacafascicularis評估安全性、耐受性、抗病毒攻擊的特異性免疫反應(yīng)和保護效力用cynomolgus猴(Macacafascicularis)的試驗?zāi)Ｐ驮u估重組Tat蛋白質(zhì)疫苗抗病毒攻擊的耐受性、安全性以及引發(fā)特異性免疫反應(yīng)(體液和細(xì)胞的)的能力和保護作用，所述重組Tat蛋白是用所述方法生產(chǎn)的并通過肝素親和柱純化的。為了誘導(dǎo)廣泛的免疫反應(yīng)，我們使用了已在大量模型中檢測過的磷酸鋁(Alum)，而且只有它允許用于人。在顆粒佐劑中，我們使用RIBI(屬于乳化劑類型或者由單磷?；愔珹、二霉菌酸海藻糖(dimycolictrehasole)和卡介苗細(xì)菌壁的骨架組成)(參考文獻7、109)。在第一個預(yù)試驗中，我們評估耐受性、安全性和引發(fā)特異性免疫反應(yīng)(體液和細(xì)胞的)的能力。因此，按下列方案接種3只猴子用重懸在250μl自體血清和250μlRIBI中的重組Tat蛋白(100μg)接種猴子1(M1)，通過皮下途徑在一個位點接種；用重懸在250μl自體血清和250μlRIBI中的重組Tat蛋白(10μg)接種猴子2(M2)，通過皮下途徑在一個位點接種；猴子3(M3)是不接種的對照猴子。在第一次接種前42和35天，從所有猴子身上取10毫升血以便確定基礎(chǔ)參數(shù)。將血清和血漿樣品在-20℃或-80℃冷凍，以后用于重懸蛋白質(zhì)接種物。在0時和2、5、10、15、22、27、32和37周后給猴子1和2接種。對猴子M1在37周時中斷接種，對猴子M2在41周時中斷接種。將動物殺死以研究在數(shù)種器官和組織(脾和淋巴結(jié))中的免疫參數(shù)，例如評估是否存在對Tat的增殖反應(yīng)以及抗Tat的CAF和CTL活性。CAF活性是CD8+淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗病毒活性，既不是MHC限制的，也不是細(xì)胞溶解的。在接種免疫原的同樣天數(shù)，從每只動物身上取10毫升血以進行實驗室檢測(化學(xué)物理分析、電解質(zhì)、白細(xì)胞、血小板計數(shù)和血紅蛋白定量分析)，評估免疫學(xué)參數(shù)，例如是否存在特異性免疫球蛋白(IgM，IgG，IgA)，Th1型(IL-2，IFNγ)和Th2型細(xì)胞因子(IL-4，IL-10)的水平，趨化因子(RANTES，MIP-1α和MIP-1β)的生產(chǎn)，淋巴細(xì)胞表型(CD4、CD8、CD3、CD14、CD20、CD25、CD56、HLA-DR、CD45RA)，對Tat的增殖反應(yīng)，是否存在細(xì)胞毒活性(CTL)，是否存在抗病毒活性(CAF)以及是否存在由PBMC和自體血清介導(dǎo)的總抗病毒活性(TAA)。此外，為了評估體內(nèi)是否存在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，對所有接種的和對照猴子進行對Tat的皮膚試驗。試驗結(jié)果如下?；瘜W(xué)-物理、血液和行為參數(shù)沒有改變。在接種的和對照猴子中，在接種位點未檢測到炎癥和新血管形成的跡象。這些結(jié)果表明動物能夠很好地耐受Tat蛋白質(zhì)，而且在施用的劑量并以所用的接種途徑?jīng)]有毒性。在猴子M1和M2中，在第一次接種后5周，檢測到Tat特異性的IgG型抗體。在37周，在這兩只猴子中，以最大1∶6400稀釋的血漿中均可檢測到抗TatIgG，在41周，在最大1∶12800稀釋的血漿中，在M2中也可檢測到抗TatIgG。結(jié)果列于圖2和3中。在對照猴子M3中，檢測到滴度很低的抗Tat抗體，可能是由于重復(fù)接種少量Tat而引發(fā)的，給該猴子注射少量Tat是為了對照皮膚檢測反應(yīng)的特異性。在猴子M1和M2中，抗Tat抗體主要是抗Tat的氨基末端區(qū)(氨基酸1-20)，滴度為1∶3200(圖4)。在用10μgTat接種的猴子M2中，還檢測到了抗Tat的36-50氨基酸和46-60氨基酸的抗體，滴度分別為1∶50和1∶100(圖4)。通過以前所述的體外檢測方法確定猴子血清中和Tat的能力，所述體外檢測方法(參考文獻41)測量加入外源Tat蛋白后，在HLM-1細(xì)胞中，HIV-1復(fù)制獲救的抑制作用。這些檢測表明在首次接種后27周，來自猴子M1和M2的血漿阻斷由外源Tat誘導(dǎo)的病毒復(fù)制，正如通過定量分析培養(yǎng)上清液中p24抗原所確定的。相反，來自相同猴子的預(yù)免疫血漿不能阻斷Tat活性(表4)。表4猴子血漿對細(xì)胞外Tat誘導(dǎo)的病毒復(fù)制獲救的中和活性a<tablesid="table4"num="004"><table>樣品抑制作用(％)Tat(30ng/ml)+預(yù)免疫M10Tat(30ng/ml)+預(yù)免疫M20Tat(39ng/ml)+免疫M179.12Tat(30ng/ml)+免疫M2100</table></tables>a確定HLM-1細(xì)胞(HeLa-CD4+細(xì)胞，含整合拷貝的tat基因缺陷的HIV-1原病毒)中的血漿中和活性。將HLM-1細(xì)胞以6×105細(xì)胞/孔接種在24孔平板中，然后在37℃保溫16小時。用含0．1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS將細(xì)胞洗滌兩次，然后存在重組Tat蛋白和等體積血漿[在0時取的(預(yù)免疫血漿)或在27周取的(免疫血漿)]的情況下，用新鮮培養(yǎng)基(0.3ml)培養(yǎng)48小時。陰性對照細(xì)胞是僅用不含Tat集池的預(yù)免疫血漿、用集池的免疫血漿或者用含0.1％(BSA)的PBS(PBS+0.1％BSA)處理的細(xì)胞。在所有對照樣品中，對病毒復(fù)制的獲救沒有影響。對每種血漿一式兩份進行檢測。用市售p24抗原捕獲ELISA試劑盒(NEN-Dupont)，通過定量分析P24Gag抗原來檢測是否存在由細(xì)胞釋放的病毒。將結(jié)果表示為與預(yù)免疫血漿(0％抑制作用)相比，免疫血漿的病毒獲救的抑制百分比[在兩個孔中測量每種血漿的p24(pg/ml)平均值]。用重懸在250μl自體血清和250μlRIBI中的重組Tat蛋白(分別為100μg和10μg)接種猴子M1和M2，并通過皮下途徑在一個位點注射。結(jié)果表明在用重組Tat蛋白接種的猴子中，在22周存在對Tat的增殖反應(yīng)(表5)，在每次用10μg重組Tat蛋白加強的猴子M2中，更高。表5對Tat的增殖反應(yīng)aa將通過Ficoll密度梯度分離的PBMCs以2×105細(xì)胞/孔的濃度，一式三份鋪在平底96孔平板上，在用10％胎牛血清(FCS)補充的RPMI-1640中培養(yǎng)，然后用給猴子接種的Tat(1或5μg/ml)、PHA(4μg/ml)或破傷風(fēng)類毒素(TT)進行刺激。在RPMI，10％FCS培養(yǎng)基中培養(yǎng)未刺激的對照。在第5天，按前述(參考文獻39、22)，通過3[H]-胸苷摻入測量細(xì)胞增殖的增加。將結(jié)果表示為刺激指數(shù)并按下列方法計算檢測樣品的平均值(cpm)/對照平均值(cpm)。數(shù)值大于2.5認(rèn)為是陽性。皮下用重懸在250μl自體血清和250μlRIBI中的100μg或10μg重組Tat免疫接種猴子M1和M2。M3代表對比猴。如表6所示，在用重組Tat免疫的猴子M1和M2中未檢測到細(xì)胞毒性活性。表6分析對Tat的細(xì)胞毒性活性(CTL)aa將通過Ficoll密度離心分離的PBMCs以1×107細(xì)胞/ml的濃度重懸在用10％熱失活FCS補充的RPMI1640中，接種在24孔平板(500μl/孔)上，存在lμgTat的條件下，在37℃培養(yǎng)12小時。1天后，將不與Tat培養(yǎng)的細(xì)胞以1500rpm離心，然后重懸在50微升用10％FCS補充的RPMI1640中，在37℃與1微克Tat培養(yǎng)3小時，洗滌，重懸在500微升新鮮培養(yǎng)基中，然后加至含前述刺激的PBMCs的孔中。第2天，將細(xì)胞用1毫升含IL-2(2IU/ml)的培養(yǎng)基稀釋，然后培養(yǎng)14天。用接種前從各猴子分離的自體B淋巴細(xì)胞作為靶細(xì)胞(BLCL)。為了達到該目的，將在第35天通過Ficoll密度離心分離的PBMCs以3×105細(xì)胞/孔的濃度接種在96孔平板中，然后在存在50％從以前所述的生產(chǎn)狒狒屬病毒(Papiovirus)的細(xì)胞系(參考文獻28)收集的培養(yǎng)基的條件下，培養(yǎng)2或3周。將對各動物獲得的10個B細(xì)胞系擴增并冷凍。為了檢測毒性，使用以時間分辨熒光為基礎(chǔ)的Delfia細(xì)胞毒性試驗(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)(參考文獻12、13、14)。為了達到該目的，將BLCL以1×106細(xì)胞/200微升用10％FCS補充的、含4微克Tat的RPMI1640的濃度在37℃培養(yǎng)12小時。作為對照，將另一份自體BLCL與不含Tat的相同培養(yǎng)基一起保溫。按制造商的說明，將BLCL洗滌并重懸在1毫升用10％FCS補充的、含5微升熒光增強配體的RPMI1640中，然后在37℃保溫15分鐘。洗滌5次后，將BLCL以5×104細(xì)胞/ml的濃度重懸，然后迅速離心以收集上清液用于測量背景水平。將PBMCs(效應(yīng)物)以2.5×104細(xì)胞/100微升的濃度一式兩份接種在含IL-2的培養(yǎng)基中，然后在96孔平板中迅速稀釋。將5×103個靶細(xì)胞/100微升(與或不與Tat培養(yǎng))加至各孔中。靶效應(yīng)物的比例為1∶50、1∶25、1∶12.5、1∶6.25、1∶3.125。在37℃，將PBMCs和靶細(xì)胞(Tat-脈沖的或未脈沖的)與下列物質(zhì)保溫2小時ⅰ)20微升5％Triton以測量最大釋放，ⅱ)100微升生長培養(yǎng)基以檢測自發(fā)釋放，ⅲ)200微升靶細(xì)胞上清液以檢測背景水平。在保溫期結(jié)束時，將平板離心，將20微升各上清液轉(zhuǎn)移到新平板中，然后在存在200微升試劑盒中所含的Europium溶液的條件下保溫。保溫20分鐘后，用時間分辨熒光讀數(shù)器(Victor,Wallac,Turku,Finland)測量熒光。按下列公式測量特異性CTL活性％特異性釋放=[(樣品檢測平均值-背景)-(自發(fā)釋放-背景)]/[(最大釋放-背景)-(自發(fā)釋放-背景)]×100。對于大部分檢測的效應(yīng)物靶比例，當(dāng)Tat特異性釋放大于4％時，認(rèn)為檢測是陽性。4％是在以前對照試驗基礎(chǔ)上建立的任意值。ND，未確定。用重懸在250微升自體血清和250微升RIBI中的10微克重組Tat皮下免疫接種猴子M2。M3代表對照猴子。ND未做。*殺死M2后，從外周淋巴結(jié)分離PBMCs。此外，在22、27和37周的結(jié)果表明，存在CD8+T淋巴細(xì)胞(CAF)介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性，該活性是按猴子CD8+T淋巴細(xì)胞上清液抑制嵌合病毒SHIV89.6P在CEMx174細(xì)胞中急性感染或者控制在OM-10-1細(xì)胞中HIV-1慢性感染重激活作用的能力測量的(表7)。與對照動物相比，通常在接種猴子中可觀察到CAF活性。表7分析是否存在CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性(CAF)a<tablesid="table6"num="007"><table>猴子ID初次接種后的周數(shù)％病毒復(fù)制抑制作用急性感染慢性感染M12289.5ND276261.737NDNDM22244ND275427374853M32224ND273722377523</table></tables>a用Ficoll密度梯度從用100μg(M1)和10μg(M2)重組Tat蛋白質(zhì)接種的猴子和未接種但用Tat重復(fù)皮膚試驗的對照猴子(M3)中分離PBMC。按照制造商的說明，用抗CD8磁珠(Dynabeads，Dynal，Norway)從PBMC中分離CD8+T淋巴細(xì)胞富集的培養(yǎng)物。用抗特異性細(xì)胞標(biāo)記(CD3、CD4、CD8)的系列抗體，通過FACS分析控制培養(yǎng)物的純度。以5×105個細(xì)胞/500微升/孔，將CD8+富集的培養(yǎng)物接種(一式兩份)在48孔平板中，預(yù)先用抗CD3單克隆抗體(2．5μg/ml，BioSourceInternational，Camarillo，CA)在4℃包被12小時，然后在含10％胎牛血清和IL-2(20U/ml)的RPMI1640中生長。每3天收集250微升培養(yǎng)基，收集2周，并用等量新鮮培養(yǎng)基代替。將細(xì)胞上清液離心，過量(0．45μm)，然后于-80℃儲存。除第一點外，將得自所由時間點的細(xì)胞上清液集池，按照其在兩個系統(tǒng)中(分別為急性和慢性感染)抑制病毒復(fù)制的能力檢測抗病毒活性是否存在。對于急性感染系統(tǒng)，使用CEM×174細(xì)胞系，該細(xì)胞系衍生于與人T細(xì)胞系CEM融合的人B細(xì)胞系721.174(參考文獻143)。在含有或不含按上述制備的200微升CD8+上清液的聚丙烯試管中將細(xì)胞(2×105)在37℃培養(yǎng)2小時。將細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌3次，以2×104個細(xì)胞/孔接種在96孔平板上，然后以200微升與(處理的細(xì)胞)或者不與(未處理的細(xì)胞)不同體積(50微升、5微升和0.5微升)的培養(yǎng)上清液保溫，所述上清液得自用疫苗注射的猴子或?qū)φ蘸镒拥腃D8+T淋巴細(xì)胞。感染后，每3天收集培養(yǎng)上清液等分樣，然后用預(yù)先加入接種和對照猴子的CD8+培養(yǎng)上清液的等體積完全培養(yǎng)基代替。表中所列的結(jié)果對應(yīng)于在感染后7天，并表示為與未處理細(xì)胞相比，用接種猴子的CD8+培養(yǎng)上清液處理的細(xì)胞病毒復(fù)制抑制作用百分比(％)。按所述(參考文獻54)測量在各時間點收集的細(xì)胞上清液的RT值或者通過ELISA的p27Gag值來確定病毒復(fù)制。對于慢性感染系統(tǒng)，使用OM-10-1細(xì)胞系(參考文獻20、21)，該細(xì)胞系為用HIV-1慢性感染的人T淋巴細(xì)胞系。在存在抗TNFβ抗體(40μg/ml)條件下，將細(xì)胞以5×104細(xì)胞/200微升/孔的濃度接種(一式兩份)在96孔平板中，有或沒有不同體積(50微升、5微升和0．5微升)的接種或?qū)φ蘸镒拥腃D8+T淋巴細(xì)胞上清液。用PMA(10-7M)激活細(xì)胞進行增殖。24小時后，收集培養(yǎng)基以便通過測量RT或者用ELISA測量p24Gag水平來確定病毒復(fù)制。將結(jié)果表示為與未處理細(xì)胞相比，在處理細(xì)胞中重激活感染的抑制％。在表中列出的急性和慢性感染的結(jié)果指用來自CD8+細(xì)胞培養(yǎng)物的5微升上清液處理的細(xì)胞。ND未作。用皮膚試驗分析延遲的超敏(DTH)表明接種的(M1和M2)和對照(M3)猴子都是陰性(表8)。表8對Tat的皮膚試驗aa將在150μlPBS-0．1％BSA或僅緩沖液中的Tat(1和5微克)在第一次接種后10、15、22、27、32和37周，通過皮內(nèi)途徑接種在預(yù)先刮過的接種和對照(反應(yīng)特異性的對照)猴子的背部。用在250微升自體血清和250微升RIBI中的重組Tat蛋白(分別為100微克和10微克)接種猴子M1和M2，通過皮下注射在一個位點。猴子M3是未接種的對照猴子。在48-72小時后出現(xiàn)的結(jié)紅斑表明有延遲的超敏反應(yīng)(DTH)++，Φ≥5mm；+，Φ≥1-4mm，+／-紅斑，未變硬；-，Φ＜1mm。該預(yù)試驗的結(jié)果表明按我們所述的方法生產(chǎn)和純化的Tat重組蛋白質(zhì)在皮下給藥的100和10微克劑量下沒有毒性。另外，Tat蛋白質(zhì)引發(fā)具有抗病毒活性的特異性和廣泛的免疫反應(yīng)，包括體液和細(xì)胞介導(dǎo)的。在用10微克重組蛋白接種的猴子M2中觀察到更強的特異性的抗Tat免疫反應(yīng)。此外，在接種的猴子中，RIBI佐劑沒有任何明顯的毒性跡象?；谶@些結(jié)果，設(shè)計第二個預(yù)試驗以確定用10微克Tat與RIBI或Alum佐劑組合的免疫效果。按下列方案在皮下一個位點給猴子注射。猴子M1-3在250微升自體血清和250微升RIBI中的10微克重組Tat蛋白。猴子4-6在250微升自體血清和250微升Alum中的10微克重組Tat蛋白。猴子M7250微升RIBI和250微升自體血清(對照猴子)。猴子M8250微升Alum和250微升自體血清(對照猴子)。在第一次免疫接種前9天，從每個猴子取10毫升血以便完成前述預(yù)試驗中的檢測并確定每個動物的基礎(chǔ)參數(shù)。在0時和2、6、11、15、21、28和32周后，給猴子接種。在36周，用200微升ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)和300微升PBS中的重組Tat蛋白(16微克)給猴子M1-6最后加強接種。ISCOM是由quilA皂角苷、膽固醇和磷脂組成的佐劑，它可以提高體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(參考文獻109、90)。在相同的時間點，僅給猴子M7和M8注射佐劑。在每次接種時和40、44和50周時，從動物中取10毫升血以分析前述預(yù)試驗中的臨床和免疫學(xué)參數(shù)。此外，收集尿樣和陰道棉拭以分析是否存在Tat特異性分泌的IgA。為了評估Tat免疫對感染的保護作用，用含HIV-1tat基因的嵌合“猿/人免疫缺陷型病毒”(SHIV)，株89.6P攻擊接種和對照猴子，所述株在Macacafascicularis中生長并滴定(參考文獻128、129、69)。攻擊后，監(jiān)測(第一個月每兩周，接下來的3個月每四周，然后每8周監(jiān)測6-12個月)動物的病毒學(xué)參數(shù)，例如血漿p27抗原血癥和血漿和細(xì)胞的病毒負(fù)載。為了確定已發(fā)生感染，還通過用于檢測抗HIV-2抗體的市售試劑盒檢測抗SIV抗體，該試劑盆也識別抗SIV抗體(ElaviaAc-Ab-AkⅡ試劑盒，DiagnosticPasteur,Paris,France)。現(xiàn)在，第二個預(yù)試驗的結(jié)果如下?；瘜W(xué)-物理、血液學(xué)和行為學(xué)參數(shù)沒有變化。在接種位點，猴子沒有任何炎癥或新血管形成跡象。觀察到特異性抗體反應(yīng)(IgM,IgG)。在15周，抗Tat抗體(IgG)滴度達到很高的水平，為1∶6400-1∶25600(圖5-7)。所述抗體主要與Tat的氨基末端區(qū)(氨基酸1-20)反應(yīng)，在22周，滴度為1∶1600-1∶3200(圖8)。此外，還檢測到抗Tat的氨基酸46-60的抗體，滴度為1∶100-1∶200(圖8)。按前面第一個預(yù)試驗中所述，通過檢測與系列量外源Tat保溫的HLM-1細(xì)胞中的病毒獲救的抑制作用來檢測猴子血漿中和Tat活性的能力。這些試驗的結(jié)果表明在15周，來自猴子M1-6的免疫血漿(1∶2稀釋的)阻斷30ng/ml外源Tat誘導(dǎo)的病毒復(fù)制，正如通過測量釋放到培養(yǎng)基中的p24抗原所確定的。相反，猴子M1-6的預(yù)免疫血漿或來自對照猴子(M7，M8)的血漿不能阻斷Tat活性(表9)。此外，在21周取出的猴子M1-6的免疫血漿(1∶2稀釋)阻斷60ng/ml、120ng/ml、240ng/ml和500ng/ml外源Tat誘導(dǎo)的病毒復(fù)制。具體地講，這些血漿將很高劑量細(xì)胞外Tat(240ng/ml和500ng/ml)誘導(dǎo)的病毒復(fù)制降低了10倍(表9)。表9免疫血漿對細(xì)胞外Tat誘導(dǎo)的病毒復(fù)制獲救的中和活性aa按表4注，在HLM-1細(xì)胞中確定抗Tat血漿中和Tat活性的能力。將重組Tat蛋白(30ng/ml、60ng/ml、120ng/ml、240ng/ml和500ng/ml)單獨或與等體積猴預(yù)免疫血漿一起或在15周或21周加入(免疫血漿)。用在250微升自體血清和250微升RIBI中的10微克Tat接種猴子M1-3；用在250微升自體血清和250微升Alum中的10微克Tat接種猴子M4-6；給兩個對照猴子注射RIBI(250微升和250微升自體血清)(M7)或Alum(250微升和250微升自體血清)(M8)。按表4注表示結(jié)果。在用嵌合病毒SHIV89.6P感染的CEM×174細(xì)胞中檢測猴子血漿中和急性感染過程中細(xì)胞釋放的細(xì)胞外Tat活性的能力。在感染后第7天，在50％用SHIV感染的且與預(yù)免疫猴子M1-6血漿一起培養(yǎng)的對照細(xì)胞中觀察到病毒復(fù)制。相反，在存在44周從猴子M1-6取的免疫血漿的條件下生長的感染細(xì)胞中沒有檢測到病毒復(fù)制(表10)。表10免疫血漿對病毒感染傳播的中和活性a<tablesid="table7"num="011"><table>樣品p27(pg／ml)SHIV+預(yù)免疫M1NegSHIV+預(yù)免疫M2NegSHIV+預(yù)免疫M31.080SHIV+預(yù)免疫M40.602SHIV+預(yù)免疫M51.169SHIV+預(yù)免疫M6NegSHIV+免疫M1NegSHIV+免疫M2NegSHIV+免疫M3NegSHIV+免疫M4NegSHIV+免疫M5NegSHIV+免疫M6Neg</table></tables>a在37℃，用在含10％FCS的RPMI1640中的嵌合SHIV89.6P病毒(5×10-5TCID50/細(xì)胞)，將96孔平板中的CEM×174細(xì)胞(3×104細(xì)胞/150微升)感染2小時。將細(xì)胞用RPMI1640洗滌兩次，然后重懸在150微升完全培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中含有5％猴子預(yù)免疫血漿或者用重組Tat(10微克)和RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接種的動物的免疫血漿(44周)。將動物血漿在56℃預(yù)加熱30分鐘，然后用ELISA分析以控制抗Tat抗體滴度。將每種血清一式兩份進行檢測。在感染后第3、5和7天，收集120微升培養(yǎng)基，然后用含5％來自猴子M1-6的預(yù)免疫或免疫血漿的等體積新鮮培養(yǎng)基代替。通過用ELISA(CoulterInternational,Miami.FL)檢測培養(yǎng)基中的病毒Gagp27來確定血漿中和在急性感染過程中釋放的細(xì)胞外Tat并控制感染的體外傳播的能力。表示為p27值的結(jié)果(pg/ml)相當(dāng)于在感染后7天，每種血清兩個孔的平均值。此外，從11周開始觀察到對Tat的增殖反應(yīng)(表11)。表11對Tat的增殖反應(yīng)aa按表5注釋分離外周血淋巴細(xì)胞，用PHA(4微克/ml)、破傷風(fēng)類毒素(TT)(10微克/ml)和Tat(5微克/ml)激活并檢測。用在250微升自體血清和250微升RIBI中的10微克重組Tat蛋白接種猴子M1-3；用在250微升自體血清和250微升Alum中的10微克重組Tat接種猴子M4-6；給兩個對照猴子接種RIBI(250微升和250微升自體血清)(M7)或Alum(250微升和250微升自體血清)(M8)。ND，未做。在用Tat蛋白質(zhì)和RIBI接種的猴子(M1)中以及用Tat蛋白與Alum接種的猴子(M4和M5)中檢測到強細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)(CTL)，而在用Tat和Alum免疫的猴子(M6)中觀察到弱CTL反應(yīng)(圖9和表12)。表12CTL反應(yīng)分析aa按表6所述完成檢測。用在250微升自體血清和250微升RIBI中的10微克重組Tat接種猴子M1-3；用在250微升自體血清和250微升Alum中的10微克重組Tat接種猴子M4-6；給兩個對照猴子接種RIBI(250微升和250微升自體血清)(M7)和Alum(250微升和250微升自體血清)(M8)。ND，未做。在44周，確定存在著總抗病毒活性(TAA)。將TAA測量為用重組Tat蛋白接種的猴子的PBMC(存在自體血清的條件下培養(yǎng)的)抗SHIV89.6P感染的能力(表13)。表13分析總抗病毒活性(TAA)的存在a<tablesid="table8"num="014"><table>猴子ID感染后天數(shù)717最小感染劑量(TCID50/細(xì)胞)最小感染劑量(TCID50/細(xì)胞)M110-210-2M210-410-4M310-310-3M410-210-2M510-210-2M610-310-3M710-310-3M810-410-3</table></tables>a在44周，從用重組Tat蛋白(10微克)與RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接種的猴子中以及從用RIBI(M7)或Alum(M8)接種的對照猴子中收集PBMC。用Ficoll梯度純化并以5×105/200微升/孔一式三份接種在48孔平板中的PBMC生長在含10％FCS和5％在56℃預(yù)先加熱30分鐘的自體血漿的RPMI1640中，存在抗CD3單克隆抗體(5ng/ml)和IL-2(2U/ml)的條件下，在37℃生長48-72小時。在37℃，將細(xì)胞用系列稀釋的嵌合病毒SHIV89．6P(10-2、10-3、10-4、10-5TCID50/細(xì)胞)感染2小時，用PBS-A洗滌3次，然后以5×105細(xì)胞/ml/孔重懸在50％條件培養(yǎng)基和50％新鮮培養(yǎng)基中。在感染后第3、7、10、14和17天，按份收集培養(yǎng)基，然后用等體積新鮮培養(yǎng)基代替。用p27GagELISA(CoulterInternational,Miami,FL)確定細(xì)胞上清液中的病毒復(fù)制。將結(jié)果表示為在感染后第7和17天，能夠感染猴子淋巴細(xì)胞的SHIV(TCID50/細(xì)胞)最小感染劑量。結(jié)果表明存在由CD8+T淋巴細(xì)胞(CAF)介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性(表14)。與對照動物相比，在接種的猴子中觀察到CAF活性的總增加。表14分析由CD8+T淋巴細(xì)胞(CAF)介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性的存在aa分析是否存在由來自用重組Tat蛋白(10微克)與RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接種的猴子和來自用RIBI(M7)或Alum(M8)接種的對照猴子的CD8+T淋巴細(xì)胞(CAF)介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性。對用SHIV89．6P感染的CEM×174細(xì)胞檢測急性感染。按表7所述完成檢測，結(jié)果為感染后7天的結(jié)果。用U1細(xì)胞系(參考文獻47)檢測慢性感染系統(tǒng)上存在的CAF，U1細(xì)胞系是用HIV-1慢性感染的幼單核細(xì)胞人細(xì)胞系。將以1×104細(xì)胞/200微升/孔接種在96孔平板中的U1細(xì)胞與PMA(10-8M)一起保溫以誘導(dǎo)HIV-1感染的再激活，加入或不加入不同體積(50微升、5微升、0．5微升)來自接種和對照猴子的CD8+T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。PMA處理后3天，用RT檢測或p24GagELISA確定培養(yǎng)基中HIV-1的存在。將結(jié)果表示為與未處理細(xì)胞相比，在用CD8+T細(xì)胞上清液處理的細(xì)胞中HIV-1復(fù)制的抑制％。急性和慢性感染的抑制結(jié)果指用5微升CD8+上清液處理的細(xì)胞。還要確定在用Tat和RIBI(M1-3)或Tat與Alum(M4-6)接種的猴子和對照猴子M7和M8的PBMC中，細(xì)胞因子(γIFN、IL-4、TNFα)與RANTES趨化因子的生產(chǎn)(表15)。表15細(xì)胞因子和趨化因子生產(chǎn)的分析a分析來自用10微克Tat與RIBI(M1-3)或者Alum(M4-6)接種的猴子PBMC中，培養(yǎng)48和96小時(48/96)后，細(xì)胞因子和趨化因子的生產(chǎn)。將對照猴子(M7和M8)分別用RIBI或Alum佐劑接種。將在44周取出并用Ficoll梯度純化的PBMC以1×106細(xì)胞/ml/孔接種在24孔平板中，然后在含10％FCS的RPMI1640中生長。將PBMC不刺激(對照)以評估細(xì)胞因子和趨化因子的自發(fā)釋放，或者用PHA(2微克/ml)、破傷風(fēng)類毒素(TT,5微克/ml)或者Tat(1或5微克/ml)刺激。刺激后48和96小時收集培養(yǎng)上清液等份以便確定細(xì)胞因子和趨化因子的存在，用市售BioSourceInternational(Camarillo,CA,USA)ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子生產(chǎn)，用R&amp;DSystems(Abdigdon,Oxon,UK)試劑盒評估RANTES生產(chǎn)。將結(jié)果分別按培養(yǎng)48和96小時pg/ml表示(48/96)。截斷值(pg/ml)為γIFN,31.2；IL-4,3.12；TNFα,15.6；RANTES,6.25。(-)，所述數(shù)值低于相應(yīng)的截斷值。Nd未做。此外，在15周，用重組蛋白接種的5只猴子(M2-6)對Tat的皮膚檢測有陽性反應(yīng)，有強延遲超敏反應(yīng)(表16和圖19)。在猴子4和5中，皮膚檢測反應(yīng)甚至比以后周中的都強(表16)。表16對Tat的皮膚檢測aa將在150微升PBS-0.1％BSA中的Tat(1和5微克)或者僅緩沖液通過皮內(nèi)途徑接種于接種猴子背部刮過的區(qū)域。在第一次免疫接種后第11、15、21、28、32、36和44周，不給對照動物接種(ND，未做)。用在250微升自體血清和250微升RIBI中的10微克重組Tat蛋白接種猴子M1-3；用在250微升自體血清和250微升Alum中的10微克重組Tat蛋白接種猴子M4-6；給兩個對照猴子接種RIBI(250微升和250微升自體血清)(M7)或Alum(250微升和250微升自體血清)(MB)。在48-72小時后紅斑結(jié)的存在表明有延遲的超敏反應(yīng)(DTH)++，Φ≥5mm；+，Φ≥1-4mm；+/+，紅斑不變硬；-，Φ＜1mm。攻擊后結(jié)果表明4/6(67％)的接種猴子可以抵御10MID50SHIV89.6P的感染，正如通過病毒檢測結(jié)果所表明的(表17)。具體地講，在猴子M1、M2、M4和M6的血漿中未檢測到p27Gag抗原，在來自這些猴子的淋巴細(xì)胞中通過PCR未發(fā)現(xiàn)原病毒DNA，胞病毒血癥是陰性。通過檢測細(xì)胞中的原病毒DNA和陽性胞病毒血癥，血漿中存在p27Gag抗原表明，猴子M3和M5受到感染(表17)。以相同的病毒學(xué)檢測為基礎(chǔ)，兩個對照(M7和M8)的結(jié)果是都受到感染。為了進一步控制用于攻擊的病毒劑量的感染性，將另一只首次用于試驗的猴子(M13)加到對照動物中并用2.85MID50SHIV89.6P(相應(yīng)于比方法中用于攻擊動物的劑量低3.5倍的病毒劑量)感染。以所有病毒學(xué)檢測為基礎(chǔ)，猴子M13的結(jié)果是受到感染。為了證明動物與病毒接觸，按照本實施例已描述過的方法分析抗SIV抗原的抗體的存在，該抗原由嵌合SHIV89.6P病毒編碼(Gag,Pol,RT,Nef)。病毒學(xué)參數(shù)是陰性的猴子(M1、M2、M4和M6)中，抗SIV抗體的存在證明這些動物與病毒接觸并說明在這些猴子中已發(fā)生SHIV的頓挫型感染。按照下列方法，將低抗SIV抗體滴度的猴子用于體外特異性抗病毒IgG(IVAP)生產(chǎn)(參考文獻177、178)的研究。將PBMC(2×106/孔)接種在24孔平板中，然后用PWM(2μg/ml，Sigma,St.Louis,USA)刺激。7天后，收集保溫(37℃，存在5％CO2和95％溫度)培養(yǎng)上清液以通過用于檢測HIV-1和HIV-2抗體的ELISA市售試劑盒(Abbott，HIV-1/HIV-2EIAThirdGenerationPlus)檢測抗HIV抗體生產(chǎn)。對于抗HIVEnv抗體的生產(chǎn)，所有被攻擊猴子的結(jié)果均是陽性，因為HIV-1Env存在于SHIV89.6P。表17病毒學(xué)參數(shù)的分析分析攻擊用10微克重組Tat蛋白與RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接種的猴子后的病毒學(xué)參數(shù)。對照猴子(M7和M8)分別用RIBI或Alum接種。猴子M13是用2.85MID50SHIV89.6P感染的首次用于試驗的猴子。a用p27GagELISA(Innogenetics，Belgium)評估血漿抗原血癥并將其表示為p27值(pg/ml)。對Neg,其值低于相應(yīng)的截斷值(18pg/ml)。b用QIAamp血液試劑盒(AngiogenGmbhandQiagenInc.,Hilden,Germany)通過全血純化DNA。按以前所述(參考文獻141)，通過PCR擴增β珠蛋白基因來控制DNA的質(zhì)量。通過半定量PCR擴增SIVgag分析原病毒DNA的存在。按所述(參考文獻153)所述，用引物SG1096Ngag(相當(dāng)于SIVmac251基因組上的核苷酸1096-11195’TTAGGCTACGACCCGGCGGAAAGA3’)和SG1592CgagD(在SIVmac251基因組上的核苷酸1569-1592作圖5’ATAGGGGGTGCAGCCTTCTGACAG3’)對1微克細(xì)胞DNA進行PCR，擴增SHIVgag基因的496個堿基對片段。為了定量分析原病毒DNA的拷貝數(shù)，用質(zhì)粒pCMRII-Δgag(含SlVmac251gag基因中100個堿基對的缺失)為模板DNA和上述擴增396個堿基對DNA片段的引物制備每個試驗中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用電泳分析PCR產(chǎn)物，然后用光密度分析(UltrascanLXEnhancerLaser，LKB，Bormma，Sweden)定量分析。通過線性回歸分析(Statgraphics,Manugistics,Inc.Cambridge,MA)確定OD值與Δgag質(zhì)粒分子數(shù)量之間的關(guān)系。OD值在高達1000個分子時仍呈線性(相關(guān)系數(shù)=0.954±0.026)。將每個樣品的OD值插到標(biāo)準(zhǔn)曲線中確定SHIV原病毒DNA拷貝數(shù)/微克細(xì)胞DNA。檢測的靈敏度是1拷貝原病毒/μgDNA。c用共培養(yǎng)試驗確定胞病毒血癥。為了達到該目的，將1×104CEM×174細(xì)胞在存在系列稀釋(共12個稀釋度，1×106-3.9×103細(xì)胞/孔)的研究中的CD-8耗盡PBMC的條件下，培養(yǎng)在96孔平板中。在感染后第3、7和10天，取出150微升以用ELISA(Innogenetics,Belgium)檢測p27Gag的存在并用等體積新鮮培養(yǎng)基代替。用Reed和Muench公式分析結(jié)果以確定每1百萬總細(xì)胞生產(chǎn)性感染PBMC的數(shù)量。d用ElaviaAc-Ab-AkⅡ試劑盒(DiagnosticPasteur,Paris,France)，按照制造商的說明，一式兩份檢測系列稀釋的動物血漿中抗SHIV抗體的存在。列出血漿值高于截斷值的最高稀釋度。e完成病毒分離，對于猴子M13沒有胞病毒血癥。為了達到該目的，將用Ficoll純化的不同劑量SHIV89.6P感染的猴子的PBMC(3×106)與CEM×174細(xì)胞(1×106)在1毫升含10％FCS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時后，以1×106/ml稀釋細(xì)胞，然后將細(xì)胞培養(yǎng)3天。然后收集2毫升培養(yǎng)基，并以3×105/ml將細(xì)胞再接種在7毫升培養(yǎng)基中。棄去過量的細(xì)胞。將該過程每周重復(fù)2次，重復(fù)4周。用p27GagELISA(Innogenetics,Belgium)然后用RT檢測確定病毒的存在。當(dāng)3個連續(xù)樣品中兩個檢測(p27和RT)均為陽性時，認(rèn)為病毒分離是陽性(+)。相反，認(rèn)為病毒分離是陰性(-)。f對猴子M13進行定性DNA-PCR。如表18中所示，病毒學(xué)數(shù)據(jù)與CD4淋巴細(xì)胞的絕對數(shù)量重疊，在感染的猴子(M3、M5、M7、M8)中CD4淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著降低，而病毒陰性動物(M1、M2、M4、M6)中則高且穩(wěn)定。表18CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的FACS分析aaFACS分析用10微克重組Tat蛋白與RIBI(M1-3)或Alum(M4-6)接種的猴子的CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞。對照猴子(M7和M8)分別僅用RIBI或Alum佐劑接種。猴子M13是用2.85MID50SHIV89.6P感染的首次用于試驗的動物。用熒光激活的細(xì)胞分類術(shù)(FACS)按所述(參考文獻137)，利用標(biāo)記的單克隆抗體(抗CD4-FITC,BioSource；抗CD8-PerCp,Becton-Dickinson)完成分析。ND，未做。攻擊前的結(jié)果表明Tat作為免疫原，以及RIBI和Alum作為佐劑(或者在最后一次加強免疫中用作佐劑的ISCOM)可以被動物很好地耐受，而且是無毒的，這證明了在第一個預(yù)試驗中用Tat免疫得到的安全性和耐受性結(jié)果。此外，這些數(shù)據(jù)證明了第一個預(yù)試驗的觀察結(jié)果，支持重組Tat蛋白引發(fā)體外和體內(nèi)具有抗病毒作用的Tat特異性的強體液和細(xì)胞反應(yīng)的其它證據(jù)。攻擊后結(jié)果(4/6保護的猴子)證實了體外結(jié)果的預(yù)期并表明抗Tat疫苗誘導(dǎo)抗感染的保護作用并因此可以抵御疾病。對兩只接種的和感染的猴子的觀察將證明接種對疾病進展的影響。實施例5．在Macacafascicularis中接種抗TatDNA疫苗分析安全性、耐受性、特異性免疫反應(yīng)和抗病毒攻擊的保護效力建議直接接種含tat基因的cDNA的質(zhì)粒pCV-Tat的DNA，用質(zhì)粒pCVO作為對照DNA。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(參考文獻110)和“EuropeanAgencyfortheevaluationofmedicalproducts；HumanMedicineEvaluationUnit”(TechnicalReportSeriesNo.17January1997)確立的方法在大腸桿菌(DH5菌株)中擴增將施用給動物的質(zhì)粒DNAs，將所述DNA用兩次CsCl梯度純化并對100體積PBS透析48-72小時。然后通過限制酶消化檢查DNA。通過利用磷酸鈣技術(shù)(參考文獻110)，將5-10微克DNA轉(zhuǎn)染到H3T1細(xì)胞(1×106)中以及48小時后，通過CAT活性分析(參考文獻55)來檢查質(zhì)粒DNA的功能，所述H3T1細(xì)胞含有整合拷貝的報道質(zhì)粒HIV-1LTR-CAT。用cynomolgus猴子(Macacafascicularis)評估用pCV-Tat質(zhì)粒DNA免疫接種后，耐受性、安全性、引發(fā)特異性免疫反應(yīng)(體液和細(xì)胞的)的能力和抗病毒攻擊保護作用的效力。在第一個預(yù)試驗中，按照下列方案免疫接種3只猴子在靠近腋淋巴結(jié)的背部2個位點，用200微克在300μlPBS中的pCV-Tat皮內(nèi)接種猴子M1(150μl/位點)；在背部的2個位點，用500微克在500μlPBS中的pCV-Tat肌肉內(nèi)接種猴子M2(250μl/位點)。在肌肉內(nèi)接種前第1或5天，將含0．5％布比卡因和0．1％對羥基苯甲酸甲酯的250μl生理溶液注射在預(yù)先標(biāo)記的2個位點，在所述位點已接種過質(zhì)粒DNA。這樣做是為了提高DNA在肌肉中的攝入和表達(參考文獻37、45)。猴子M3不接種并將其用作對照動物。但是，從10周開始，用6微克(5+1微克)Tat皮內(nèi)接種該猴子作為皮膚試驗的對照。在第一次接種前42和35天，從所有猴子身上各取10毫升血以分析基礎(chǔ)參數(shù)。在0時和5、10、15、22、27、32和37周后，給猴子接種。最后，在第42周，用在200微升ISCOM和300微升PBS中的重組Tat蛋白(16微克)給動物進行最后一次加強接種。按實施例4所述，每天觀察動物的臨床參數(shù)。此外，按實施例4所述，在接種的同一天取10毫升血。用10MID50SHIV89.6P攻擊猴子后，確定接種的保護作用，在65周靜脈內(nèi)途徑注射攻擊。按實施例4所述完成攻擊后觀察，并繼續(xù)觀察。該試驗的結(jié)果如下。在2只接種的猴子和對照猴子中，臨床、血液學(xué)和行為學(xué)參數(shù)沒有變化。在注射部位沒有發(fā)現(xiàn)炎癥跡象和新血管生成。這些結(jié)果表明pCV-TatDNA能夠被動物很好地耐受，而且在試驗所用的劑量和接種途徑下沒有毒性。用200微克DNA皮內(nèi)接種的猴子M1自32周產(chǎn)生Tat特異性IgG抗體(圖11)?？贵w滴度(從32周至58周)為1∶100至1∶800(圖12)。在37周，表位圖譜分析(按圖4注釋完成的)表明這些抗體抗Tat的特異性區(qū)域，所述區(qū)域為氨基酸1-20、氨基酸46-60和氨基酸65-80，滴度分別為1∶200，1∶100和1∶50(數(shù)據(jù)未給出)。在500微克DNA經(jīng)肌肉內(nèi)接種的猴子M2中，在整個研究期間，幾乎檢測不到抗Tat抗體(1∶50滴度，未列出)。所述結(jié)果示于圖11中。按實施例4所述，在與外源Tat蛋白保溫的HLM1細(xì)胞中，通過檢測病毒復(fù)制獲救的抑制作用來檢測用200微克DNA經(jīng)皮內(nèi)途徑接種的猴子M1的血漿中和Tat活性的能力。該檢測表明在37周得到的以1∶2稀釋的猴子M1血漿可以降低30ng/ml外源Tat誘導(dǎo)的病毒復(fù)制。相反，在0時得到的同一猴子的血漿(預(yù)免疫)不能阻斷細(xì)胞外Tat(表19)。表19血漿對細(xì)胞外Tat誘導(dǎo)的病毒感染獲救的中和活性a樣品抑制作用Tat+M1預(yù)免疫0Tat+M1免疫51a在與0時(預(yù)免疫)或37周(免疫)從猴子M1得到的等體積血漿預(yù)保溫的HLM1細(xì)胞中，通過加入30ng/ml重組Tat蛋白，確定抗Tat抗體中和Tat活性的能力，所述猴子M1用200微克pCV-Tat質(zhì)粒DNA經(jīng)皮內(nèi)途徑接種。按表4所述完成檢測并表示結(jié)果。表20中的結(jié)果表明在經(jīng)皮內(nèi)用200微克DNA免疫接種的猴子M1中，在42周存在對Tat的增殖反應(yīng)，而在猴子M2中，未檢測到這種細(xì)胞反應(yīng)。表20對Tat的增殖反應(yīng)aa分離PBMC，用PHA(4μg/ml)、破傷風(fēng)類毒素(TT)和Tat(1或5μg/ml)刺激，然后按表5所述檢測。將猴子用200微克pCV-Tat(M1)經(jīng)皮內(nèi)途徑或者用500微克pCV-Tat(M2)經(jīng)肌肉內(nèi)途徑接種。不給猴子M3接種，但自10周開始，用6微克(5+1微克)Tat皮內(nèi)接種作為皮膚試驗的對照。ND未做。在42和48周，在猴子M1中檢測抗Tat細(xì)胞毒性活性(CTL)，在48周，檢測猴子M2中的抗Tat細(xì)胞毒性活性。此外，在48周，對自10周用6微克Tat接種作為皮膚試驗對照的猴子M3中觀察陽性CTL反應(yīng)(表21)。表21Tat特異性細(xì)胞毒性活性(CTL)的分析aa按表6所述完成檢測。用200微克(M1)pCV-Tat經(jīng)皮內(nèi)或用500微克(M2)pCV-Tat經(jīng)肌肉內(nèi)接種猴子。不給猴子(M3)接種，但自10周開始，用6微克(5+1微克)Tat皮內(nèi)接種作為皮膚試驗的對照。ND未做。列于表22中的結(jié)果表明在52周，在用200和500微克DNA接種的兩只猴子中均存在總抗病毒活性(TAA)。表22總抗病毒活性(TAA)的分析aa按表13所述完成檢測。用200微克(M1)pCV-Tat經(jīng)皮內(nèi)或用500微克pCV-Tat經(jīng)肌肉內(nèi)接種猴子。不給猴子(M3)接種，但自10周開始，用6微克(5+1微克)Tat皮內(nèi)接種作為皮膚試驗的對照。從首次免疫接種后第52周收集PBMc，用SHIV89．6P(10-2、10-4、10-6、10-8TCID50/細(xì)胞)感染PBMc。將結(jié)果表示為仍能感染細(xì)胞的最小SHIV(TCID50/細(xì)胞)感染劑量。表23中所列的結(jié)果表明在22和27周，在兩只接種的猴子中均存在由CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性(CAF)。該活性在對照猴子中較低。表23分析CD8+細(xì)胞介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性(CAF)aa分析衍生于用200微克(M1)和500微克(M2)pCV-Tat接種的猴子和猴子M3的CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性抗病毒活性(CAF)是否存在。按表7所述，在用SHIV89.6P感染的CEM×174細(xì)胞中和用HIV-1慢性感染的OM-10-1細(xì)胞中對急性和慢性感染進行抗病毒活性檢測。將結(jié)果表示為與未處理的細(xì)胞相比，用CD8+T淋巴細(xì)胞上清液處理的細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制作用百分比(％)。在表中所列的急性和慢性感染的結(jié)果是用5微升CD8+培養(yǎng)上清液處理的樣品的。ND，未做。表24中所列的結(jié)果表明用200微克DNA經(jīng)皮內(nèi)途徑接種的猴子M1在22周對Tat的皮膚試驗為陽性。表24對Tat的皮膚試驗aa從首次免疫接種后第10、15、22、27、32、37、42、48、52和58周，將在150微升PBS-0.1％BSA中的Tat(1和5微克)或僅緩沖液(對照)經(jīng)皮內(nèi)接種在接種動物和對照猴子(有關(guān)反應(yīng)特異性的對照)的預(yù)先thrichotomized的上背部區(qū)域。用200微克質(zhì)粒pCV-Tat的DNA經(jīng)皮內(nèi)接種猴子M1，而用500微克同樣質(zhì)粒經(jīng)肌肉內(nèi)接種猴子M2。不給猴子M3(對照)接種，但自10周開始，用6微克(5+1微克)Tat皮內(nèi)接種作為皮膚試驗的對照。48至72小時后，出現(xiàn)紅斑結(jié)，表明存在延遲類型的超敏反應(yīng)(DTH)++，Φ≥5mm；+，Φ≥1-4mm，±紅斑，未變硬；-，Φ＜1mm。這些結(jié)果表明質(zhì)粒pCVTat(pCVTat-DNA)在給定的劑量經(jīng)皮內(nèi)和肌肉內(nèi)均能被很好地耐受并是安全的。此外，這些結(jié)果表明用pCVTat-DNA免疫接種可誘導(dǎo)具有抗病毒作用的體液(盡管低于用重組Tat蛋白誘導(dǎo)的)和細(xì)胞抗Tat免疫反應(yīng)。有關(guān)攻擊后(在首次免疫接種后第65周完成的)的保護性效力、病毒學(xué)參數(shù)，包括抗原血癥和胞病毒血癥的測量以及PBMCs中原病毒DNA(DNA-PCR)拷貝數(shù)的確定表明用Tat-DNA經(jīng)肌肉內(nèi)免疫的猴子M2在用10MID50SHIV-89.6P攻擊后受到保護，而用較小劑量Tat-DNA(200微克)皮內(nèi)免疫接種的獼猴M1受到感染，這表明就用DNA免疫接種而言，肌肉內(nèi)途徑比皮內(nèi)接種更有效。對照猴子M3也對感染產(chǎn)生抗性。但是，如前所述，與其它試驗方法中的對照不同，該猴子接受了有關(guān)Tat的重復(fù)皮膚試驗以對照試驗的特異性(表24)，而抗Tat抗體，盡管滴度較低(1∶100)，但自免疫開始后32周仍可檢測到(數(shù)據(jù)未給出)。此外，在該猴子中，對Tat的增殖反應(yīng)是對抗原的一種弱而散發(fā)的反應(yīng)性(表20)。最后，猴子M3存在特異性抗TatCTLs(表21)。盡管是初步的，但這些數(shù)據(jù)表明皮內(nèi)重復(fù)注射6微克Tat就使動物免疫并產(chǎn)生免受攻擊的保護作用。因此，認(rèn)為猴子M3是用Tat蛋白皮內(nèi)接種的并照此研究。表25病毒學(xué)參數(shù)的分析猴子M1已用200微克pCVTat皮內(nèi)免疫接種，猴子M2已用500微克pCVTat肌肉內(nèi)免疫接種。獼猴M3用6微克Tat蛋白皮內(nèi)重復(fù)注射數(shù)次以便對照皮膚試驗的特異性。因此，從攻擊后開始，認(rèn)為猴子M3是接種的猴子。按表17注釋評估病毒學(xué)參數(shù)。用FACS評估CD4和CD8淋巴細(xì)胞的百分比和絕對數(shù)量證實了病毒學(xué)數(shù)據(jù)，在感染的猴子中，在第一次感染后分析(30天)時CD4淋巴細(xì)胞顯著減少(約4倍)，而且此后(60天)也是如此(表26)。表26CD4和CD8亞組的FACS分析按表18注的說明完成分析。猴子M1已用200微克pCVTat質(zhì)粒DNA皮內(nèi)接種，猴子M2用500微克pCVTat-DNA肌肉內(nèi)接種。獼猴M3用6微克Tat蛋白皮內(nèi)接種。以這些結(jié)果為基礎(chǔ)設(shè)計第二個試驗，其中在3只猴子(M9-M11)中評估用pCVTat-DNA免疫的效果，與接受pCVO-DNA的對照猴子(M12)進行比較。在背部的2個位點肌肉內(nèi)給所有猴子接種共1mgpCVTat(M9-M11)或pCVO(M12)。在接種前1或5天，將250微升含0．5％布比卡因和0．1％對羥基苯甲酸甲酯的鹽水溶液接種到兩個標(biāo)記位點，所述位點已連續(xù)注射過質(zhì)粒。在0時和第6、11、15、21、28和32周接種獼猴。在36周，用重懸在200微升ISCOM和300微升PBS中的重組Tat蛋白(16微克)進行最后的加強接種。按實施例4所述，每天對照動物的臨床參數(shù)。此外，按實施例4所述，在初次免疫接種前9天和每個免疫接種時，取10毫升血。為了評估接種的保護作用，從免疫開始第50周靜脈內(nèi)注射10MID50SHIV-89.6P攻擊猴子。按實施例4所述進行攻擊后觀察并完成觀察。該試驗的結(jié)果如下。在接種的和對照猴子中，就行為、臨床參數(shù)和血液化學(xué)而言，沒有改變。在注射位點未檢測到炎癥或血管新形成的跡象。這些結(jié)果證實肌肉內(nèi)注射1mg質(zhì)粒pCVTatDNA能夠被很好地耐受且無毒。自15周檢測到抗TatIgG(圖13)，滴度為1∶50至1∶100(數(shù)據(jù)未列出)。此外，在一只猴子(M11)中，早在2周就檢測到對Tat的增殖反應(yīng)(表27)。表27對Tat的增殖反應(yīng)a<tablesid="table13"num="028"><table>猴子刺激首次接種后的周數(shù)26111521283236404450M9PHATat8.92.90.49.21.70.517.10.90.658.211.5181.81.647.10.70.943.41.113.10.80.772.611.164.67772.71.9M10PHATat8.52.41180.30.319.80.80.7NDNDND10.11.11.12.20.60.514.71115.20.90.94.40.60.78.46.44.2NDNDNDM11Tat25.74.25.143.31.90.81.31.612.10.90.727.81.11.13.43.61.121.31.21.214.10.80.715.90.30.725.81.8NDNDNDM12PHATat28.73.23.230.91.61.4410.90.850.75.21.330.81.617.61.61.6431.3122.61.10.834.61119.90.71.655.13.11.3</table></tables>a按表5所述分離PBMC，用PHA(4μg/ml)或破傷風(fēng)類毒素(TT，10μg/ml)或Tat(1和5μg/ml)刺激，然后檢測。用1mgpCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，對照)肌肉內(nèi)給猴子注射。ND，未確定的。在免疫后32周檢測抗TatCTLs(表28)表28抗Tat細(xì)胞毒性活性(CTLs)的分析aa按表6所述完成檢測。用1mgpCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，對照)肌肉內(nèi)給猴子注射。通過以前所述的檢測總抗病毒活性(TAA)存在的檢測方法，在44周，從猴子M11得到的PBMCs對系列稀釋的嵌合SHIV-89.6P病毒的體外感染產(chǎn)生抗性。事實上，將TAA評估為來自用pCVTat-DNA接種的猴子的、在存在自體血清條件下生長的PBMCs抵御系列病毒稀釋物感染的能力(表29)。表29總抗病毒活性(TAA)的分析a按表13所述完成檢測。用1mgpCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，對照)肌肉內(nèi)給獼猴注射。從第一次免疫第44周，取PBMCs，然后體外用10-2、10-3、10-4、10-5TCID50SHIV-89.6P感染。將結(jié)果表示為仍能感染細(xì)胞的SHIV(TCID50/細(xì)胞)最小感染劑量。*在檢測所用的最高SHIV濃度(10-2TCID50/細(xì)胞)沒有培養(yǎng)物受到感染。**在感染后17天，培養(yǎng)物變成陰性。表30中所列的結(jié)果表明在接種的猴子和用空載體(pCVO)注射的對照猴子(M12)中，存在由CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性(CAF)。表30分析由CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性(CAF)aa分析由CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的可溶性抗病毒活性(CAF)的存在。從用1mgpCVTat接種的3只猴子(M9-M11)和用1mgpCVO接種的對照猴子(M12)得到PBMs。按表14所述，在用SHIV-89.6P感染的CEM×174細(xì)胞中完成急性感染試驗。按表14所述，在用HIV-1慢性感染的U1細(xì)胞中完成慢性感染試驗。將結(jié)果表示為存在或不存在(對照)5微升CD8+T細(xì)胞上清液條件下培養(yǎng)的細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制作用百分比(％)。在44周，用來自接種和對照猴子的PBMCs評估細(xì)胞因子(γIFN,IL-4,TNFα)和趨化因子RANTES的生產(chǎn)(表31)。表31分析細(xì)胞因子和RANTES的生產(chǎn)aa按表15所述完成檢測。用1mgpCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，對照)給猴子進行肌肉內(nèi)注射。在第一次免疫后第44周，取PBMCs。將結(jié)果表示為分別在48和96小時(48/96)檢測的細(xì)胞因子和RANTES(pg/ml)。(-)，數(shù)值低于截斷值。截斷值(pg/ml)是γIFN31.2；IL-43.12；TNF-α15.6；RANTES62.5。ND未做。結(jié)果表明在11周，在一只猴子(M9)中存在對Tat皮膚試驗的弱反應(yīng)性(表32)。表32對Tat的皮膚試驗aa從首次免疫接種后第11、15、21、28、32、36和44周，將在150微升PBS-A，0.1％BSA中的Tat(1和5微克)或僅緩沖液(對照)經(jīng)皮內(nèi)接種在接種動物(但對照猴子除外)預(yù)先thrichotomized的上背部區(qū)域。用1mgpCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，對照)肌肉內(nèi)給獼猴注射。48至72小時后，出現(xiàn)紅斑結(jié)，表明存在延遲類型的超敏性(DTH)++，Φ≥5mm；+，Φ1-4mm，±紅斑，未變硬；-，Φ＜1mm。攻擊后的結(jié)果表明所有接種動物均受到保護，免于10MID50SHIV-89.6P的感染，正如均為陰性的病毒學(xué)試驗(血漿抗原血癥、原病毒DNA拷貝數(shù)的確定、胞病毒血癥)所表明的(表33)。此外，在猴子M11中存在著SIV抗體表明與病毒接觸或頓挫型感染。相反，在剩余的猴子中未檢測到，因此我們決定完成體外抗體生產(chǎn)檢測(IVAP)以及對SIV抗原的淋巴增殖反應(yīng)。這些試驗正在進行，而且初步的數(shù)據(jù)表明在所有DNA接種的猴子中存在抗HIVEnv抗體。用較高劑量的病毒接種獼猴，既然甚至對照動物M12也對感染產(chǎn)生抗性。該猴子已用空載體pCVO接種。文獻上的最新數(shù)據(jù)已表明由特定DNA序列(在細(xì)菌中比在真核細(xì)胞中更常見，而且，與LPS和甘露糖類似)所起的佐劑作用，代表了有關(guān)天然免疫的強刺激(參考文獻179)。因此，可以想象，在猴子M12中觀察到的保護作用可能是由于這些細(xì)菌序列的非特異性抗病毒免疫的誘導(dǎo)作用，例如IFNα，IFNβ，IL-12和IL-18的生產(chǎn)，已知發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)劑和抗病毒功能。通過在該獼猴中在沒有抗Tat特異性體液和細(xì)胞免疫的條件下存在TAA(表29)和CAF(表30)抗病毒活性，有力地說明了這一點。事實上，這些檢測還測量了非抗原特異性抗病毒活性。首次用于試驗的猴子M13，用比獼猴M12低3．5倍的病毒劑量接種，產(chǎn)生感染。這些結(jié)果證實接種猴子M12的10MID50攻擊劑量是感染性的(表33)。以該結(jié)果為基礎(chǔ)，本發(fā)明人計劃使用pCVO載體或其部分作為佐劑。表33病毒學(xué)參數(shù)的分析a，b，c，d按表17所述完成檢測。用1mgpCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，對照)肌肉內(nèi)給獼猴注射。猴子M13是首次用于試驗的動物，用2.85MID50SHIV89.6P感染。e完成代替胞病毒血癥的病毒分離并且結(jié)果為陽性。fDNAPCR是非定量性的，結(jié)果為陽性。CD4和CD8亞組的FACS分析(表34)證實了病毒學(xué)數(shù)據(jù)。事實上，僅首次用于試驗的猴子M13在攻擊后15天和60天觀察到CD4淋巴細(xì)胞百分比和絕對數(shù)量的顯著降低，正如通過血漿抗原血癥、原病毒DNA和病毒分離陽性所表明的，產(chǎn)生感染(表33)。表34CD4和CD8淋巴細(xì)胞的FACS分析a按表18所述完成檢測。用1mgpCVTat(M9-M11)或pCVO(M12，對照)肌肉內(nèi)給獼猴注射。猴子M13是首次用于試驗的動物，用2.85MID50SHIV89.6P感染。這些結(jié)果表明用pCVTat質(zhì)粒免疫接種能夠被很好地耐受而且無毒，并證實了在第一個預(yù)研究中獲得的DNA接種的安全性和耐受性。另外，這些數(shù)據(jù)提供了證據(jù)，表明pCVTat-DNA質(zhì)粒誘導(dǎo)具有抗病毒作用的特異性體液(盡管比Tat蛋白誘導(dǎo)的弱)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，部分原因可能是由于在pCVO載體中存在的特定DNA序列可能起佐劑的作用。評估免疫方法，所述方法包括將編碼其它HIV-1的DNA與在實施例3中描述的細(xì)胞因子基因組合。在這些試驗中，將使用含HIV的tat，rev和nef基因的SHIV(參考文獻146、85、142、65、94、129)。利用可提高免疫效力的其它送遞系統(tǒng)，例如脂質(zhì)體、納米顆粒、紅細(xì)胞、基因槍送遞給動物接種pCVO和pCVTat質(zhì)粒，或者利用在預(yù)言實施例9和10中所述的皰疹載體送遞TatDNA。實施例6．治療疫苗以Tat-蛋白質(zhì)和TatDNA為基礎(chǔ)，設(shè)計接種方法以評估在已感染個體中抗Tat疫苗的安全性和毒性。對用減少劑量的SHIV89.6P感染的猴子和有免疫缺陷性疾病(AIDS)的猴子完成試驗。用于感染的病毒儲備液得自14天前感染的cynomolgus猴子的脾和淋巴結(jié)。將用機械分離純化的淋巴細(xì)胞分成兩份(各1，5×106細(xì)胞/ml)。用免疫磁珠(Dynal,Norway)耗盡一份的CD8+T細(xì)胞。將兩份培養(yǎng)物用PHA(1μg/ml)刺激3天，然后在存在50U/mlIL-2的條件下，以1×106細(xì)胞/ml濃度接種。通過在3天后收集的培養(yǎng)基中反轉(zhuǎn)錄酶(RT)的存在來檢測病毒復(fù)制。檢測前，將上清液澄清，然后以100，000rpm在+4℃超離心11分鐘(BeckmanTL-100超離心機)，溶解顆粒。將30微升懸浮液加到反應(yīng)混合物(TRISHCl1M,pH8；MgCl2,0.5M；KCl,1M；PolyAlmg/ml；oligo-dT12-18100μg/ml；DTT0.02M；1.23[H]-甲基胸苷三磷酸1mCi/ml)中，然后在37℃保溫60分鐘。通過加入500微升焦磷酸鈉0．1MpH5和600微升三氯乙酸(TCA)20％來停止反應(yīng)，然后將樣品滴到0．45μm濾紙(Millipore)上，接著在加入5ml閃爍混合物(FilterCount,Packard)后用β計數(shù)器讀數(shù)。將含20，000cpm的培養(yǎng)基離心并用10％人血清AB補充。將病毒通過在30，000rpm(4℃，90分鐘)超離心濃縮，重懸在含10％人血清(AB類)的RPMI1640中，然后以小份儲存在液氮中。在人細(xì)胞系CEM×174和C8166(3×103TCID50/細(xì)胞)上體外滴定病毒儲備液，在cynomolgus猴子上體內(nèi)滴定病毒儲備液(3．17×105.69MID50/ml)。在按上述制備的靜脈內(nèi)感染SHIV89．6P的7只猴子身上完成第一個預(yù)試驗。按下列方法，每只猴子接受用2％人血清(AB,Rh-)補充的鹽水水緩沖液稀釋的1毫升SHIV。一只猴子(IM1)用1∶500病毒稀釋物接種；兩只猴子(IM2，IM3)接受1∶5，000稀釋物；兩只猴子(IM4，IM5)用1∶50，000接種；猴子IM6接受1∶500，000稀釋物；最后一只猴子(IM7)接種1∶5，000，000稀釋物。在用SHIV感染前7天從每只猴子身上取血以確定基礎(chǔ)參數(shù)。將血清和血漿樣品在-20℃或-80℃冷凍，然后用于重懸蛋白質(zhì)接種物。在0時，用SHIV89.6P給所有猴子接種。給猴子每天做檢查。此外，在0天以及2和4周后，從猴子身上取血，然后用10毫升血進行血-化學(xué)確定(化學(xué)臨床分析、電解質(zhì)、白細(xì)胞和血小板計數(shù)、血紅蛋白)和病毒學(xué)和免疫學(xué)分析(即血漿p27Ag確定以及血漿和細(xì)胞中的病毒負(fù)載)。在感染后4周，感染6只猴子(IM1-6)。接受最低病毒稀釋物(1∶5，000，000)的猴子IM7是SHIV陰性(表35)。表35在用系列病毒稀釋物感染的猴子中，檢測SHIV89.6P的存在按表17注所述完成a病毒分離和b血漿p27Ag(pg/ml)。按文中所述用病毒儲備液的系列稀釋物靜脈內(nèi)接種猴子。在感染后第7周，按照下列方法給表現(xiàn)出嚴(yán)重免疫缺陷性癥狀的所有動物接種Tat蛋白質(zhì)和質(zhì)粒pCVTat的DNA。猴子IM1、IM3、IM5和IM6接受Tat蛋白質(zhì)(20微克)，將Tat蛋白質(zhì)溶解在250微升用0.1％BSA和20％自體血漿補充的PBS-A中，然后加到250μlAlum佐劑中。將蛋白質(zhì)接種物皮下接種在猴子上背部的一個位點，將重浮在1mlPBS-A中的質(zhì)粒pCVTat(1mg)肌肉內(nèi)注射在背部的不同位點。用250微升Alum和250微升PBS-A，0.1％BSA20％自體血漿給猴子IM2和IM4(對照)皮下注射在上背部的一個位點，用重懸在1mlPBS-A中的pCV-0(1mg)肌肉內(nèi)注射在與前一個位點不同的上背部位點。不給未感染的猴子IM7接種。接種日程安排為在相當(dāng)于SHIV感染后7周的0時和1、4、5、10、11、13、14、17、18周進行接種。為了評估所述接種對疾病進展的影響，每天檢查每只獼猴是否存在疾病或有疾病的跡象，在0時和3、8、12、16和21周后，取10毫升血以進行實驗室檢測(化學(xué)-臨床分析、電解質(zhì)、白細(xì)胞和血小板計數(shù)、血紅蛋白)、評估免疫學(xué)狀態(tài)(是否存在特異性免疫球蛋白、測量Th1和Th2細(xì)胞因子、趨化因子產(chǎn)生)、通過FACS分析表征淋巴細(xì)胞(CD4、CD8、CD28、CD40、CD86、CD20、CD2、CD26和CD20)，而且最后評估病毒學(xué)參數(shù)(如前所述，通過半定量PCR檢測原病毒DNA，通過競爭性RT-PCR的血漿病毒負(fù)載，通過ELISA檢測血漿p27Gag抗原以及抗SHIVAb的存在)。在免疫學(xué)、病毒學(xué)和臨床結(jié)果的基礎(chǔ)上進行其它加強接種。在最后一次接種后，每月監(jiān)測并在出現(xiàn)臨床變化時監(jiān)測。每次將PBMC、血清、血漿和尿樣冷凍以便將來進行前述的監(jiān)測。描述了已可以從該試驗中獲得的在免疫后8周得到的結(jié)果。在兩個接種的無癥狀和對照猴子中，在接種位點沒有炎癥和新血管形成的跡象或者一般的疾病癥狀。在已有癥狀的猴子中，沒有臨床狀態(tài)變化的證據(jù)。此外，未檢測到病毒復(fù)制的激活作用。綜合考慮這些結(jié)果表明在用生物活性Tat蛋白質(zhì)或DNA接種的猴子中，沒有毒性或增加的病毒復(fù)制(表36)。表36病毒學(xué)參數(shù)的分析按表17所述完成檢測。給猴子IM1、IM3、IM5和IM6皮下注射Tat蛋白質(zhì)(20微克)和Alum佐劑以及肌肉內(nèi)注射pCVTat(1mg)。給猴子IM2和IM4(感染對照)皮下注射Alum佐劑以及肌肉內(nèi)注射pCVO(1mg)。IM7是未感染的首次用于試驗的猴子。FACS分析表明在接種后，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞沒有變化(表37)。表37CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞的FACS分析按表18注釋完成FACS分析。給猴子IM1、IM3、IM5和IM6皮下注射Tat蛋白質(zhì)(20微克)和Alum佐劑以及肌肉內(nèi)注射pCVTat(1mg)。給猴子IM2和IM4(感染對照)皮下注射Alum佐劑以及肌肉內(nèi)注射pCVO(1mg)。IM7是未感染的首次用于試驗的猴子。這些數(shù)據(jù)證實在所用的劑量和接種途徑，Tat蛋白質(zhì)和pCVTat質(zhì)粒在接種的猴子中均能很好地被耐受且沒有任何毒性作用，此外，它們既沒有增加感染動物中的病毒復(fù)制，也沒有使CD4T細(xì)胞減少。實施例7．用抗CD3/28包被的珠共刺激來自SIV感染猴子的純化CD4+淋巴細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量對數(shù)級增加，而沒有顯著的病毒復(fù)制和傳播用抗CD8免疫磁珠(Dynal，Oslo；DynabeadsM-450CD8)耗盡外周血單核細(xì)胞中的CD8+細(xì)胞種群。通過FACS分析評估純化程度，如果純度高于95％，就認(rèn)為是可接受的。在存在PHA(2μg/ml)和IL-2(40U/ml)或預(yù)先用抗CD3(克隆FN18，BioSource)和CD28(克隆9.3)抗原的兩種單克隆抗體包被的免疫磁珠(抗CD3/28珠)的條件下，使CD8耗盡的細(xì)胞(命名為CD8-PBMC)生長。為了提高抗CD3/28珠與靶細(xì)胞的結(jié)合，在一旋轉(zhuǎn)輪處理儀(rotatingwheeldisposal)上進行保溫。然后，用磁鐵選擇結(jié)合的細(xì)胞(命名為CD8-CD3+D28+)并接種在培養(yǎng)基中。一周三次，將細(xì)胞濃度調(diào)整到開始的水平，在標(biāo)明的地方加入IL-2；此外，就用抗CD3/28珠刺激的細(xì)胞而言，初步的結(jié)果表明連續(xù)的刺激方案與在每個時間點調(diào)整的恒定控制的珠細(xì)胞比在誘導(dǎo)增殖反應(yīng)中是非常有效的。我們以前的研究已表明不存在外源IL-2時，CD8-CD3+CD28+細(xì)胞種群比用抗CD3/28珠刺激的CD8-PBMC增殖的更好。此外，加入外源IL-2(40U/ml，每周3次)可以顯著提高就細(xì)胞數(shù)量和作用過程而言的增殖動力學(xué)(圖14)。為了評估這種刺激作用的抗病毒活性，在0天，用0.1M.O.I.SIV感染來自4只未感染猴子的CD8-CD3+CD28+純化的細(xì)胞，然后在連續(xù)刺激的條件下培養(yǎng)。用PHA和IL-2刺激的CD8-PBMC是對照試驗。用市售ELISA(Coulter,Hialeah,FL)檢測培養(yǎng)上清液中的p27Gag抗原來跟蹤病毒感染。在感染后第6和12天測量p27Gag抗原水平(ng/ml)。如圖15所示，在兩個刺激方案中，感染存在顯著的差異。事實上，在感染后第6天，在CD3／28珠刺激的培養(yǎng)物中的p27抗原比用PHA加IL-2刺激的培養(yǎng)物中的p27抗原少40％至87％，在第12天，在4只猴子中的2只，這種差異增大。這表明，病毒感染的敏感性降低。在兩種刺激方案中，僅在一種情況(MK9401)下觀察到病毒繁殖。本文所描述的結(jié)果表明Macacafascicularis是一個很好的通過抗CD3/28珠共刺激來自體內(nèi)擴增淋巴細(xì)胞亞種群的模型，沒有病毒復(fù)制。這代表了我們建議的治療疫苗的基本原理，該基本原理是以感染HIV的個體中，自體抗病毒特異性淋巴細(xì)胞的增加和再輸注為基礎(chǔ)。實施例8．將樹突細(xì)胞用于免疫接種樹突細(xì)胞(DC)和巨噬細(xì)胞在較低的程度上能夠有效地將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞，然后在該細(xì)胞亞組中誘導(dǎo)增殖或特異性細(xì)胞毒性活性的獲得。這些細(xì)胞被命名為“抗原呈遞細(xì)胞”(APCs)并可引發(fā)免疫反應(yīng)。因此，DC可用于來自體內(nèi)免疫接種方法。出于該原因，通過在GM-CSF和IL-2刺激7天后，體外培養(yǎng)粘附的細(xì)胞，從Macacafascicularis的外周血中分離DC前體?；蛘撸瑢D34+細(xì)胞用免疫磁珠純化，然后在體外與GM-CSF和TNF-α一起培養(yǎng)14天。為了證明分離了DC，完成形態(tài)學(xué)分析和表型表征(FACS分析和免疫組織化學(xué))。功能分析是以DC誘導(dǎo)同種異體淋巴細(xì)胞增殖的特有能力為基礎(chǔ)。所得的結(jié)果完全證實了DC純化和功能表征的效力。詳細(xì)地講，為了分離DC前體，將通過Ficoll密度梯度離心得到的PBMCs再在Percoll不連續(xù)梯度(50％和42．5％)上成層。以500g離心30分鐘后，在兩個梯度間的細(xì)胞級分主要由單核細(xì)胞組成(正如用FACS分析所證實的，數(shù)據(jù)未列出)。將這些細(xì)胞保持在4℃以避免細(xì)胞與塑料管粘附，然后將細(xì)胞收集、洗滌、計數(shù)并在37℃接種在培養(yǎng)基中。此后，通過4次溫和的洗滌洗掉未粘附的細(xì)胞。為了誘導(dǎo)分化成DC，將用GM-CSF(200ng/ml,Leucomax,Sandoz,Milan,Italy)和IL-4(200U/ml,PeproTech,London,England)補充的完全培養(yǎng)基加至粘附細(xì)胞中。作為對照，加入不含細(xì)胞因子的完全培養(yǎng)基以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞譜系中單核細(xì)胞的正常分化。一周兩次，一半的上清液用與0天所用相同的新鮮培養(yǎng)基代替。通過典型的形態(tài)學(xué)改變，如成簇、失去粘附和細(xì)胞分株的發(fā)育來檢測用細(xì)胞因子處理的孔中DC的成熟。通過EDTA處理(PBS-A中0.5mM)來脫附在沒有細(xì)胞因子條件下生長的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞粘附細(xì)胞，洗滌兩次、計數(shù)并根據(jù)所完成的試驗，以不同濃度重懸在新鮮培養(yǎng)基中。對于同種異體混合的白細(xì)胞反應(yīng)(AMLR)，用固定量的同種異體T淋巴細(xì)胞檢測得到的APCs(DC或巨噬細(xì)胞)，APC通過Ficoll和Percoll梯度和粘附來純化，然后冷凍。在48孔平板中，用0.5×106T淋巴細(xì)胞和APCs的系列稀釋物完成AMLR。培養(yǎng)4天時，將固定量的細(xì)胞懸浮液一式三份接種在96孔平板中。將1μCi3H-胸苷加到各孔中，然后將平板在37℃保溫16小時。在保溫結(jié)束時，用β計數(shù)器測量通過細(xì)胞摻入的3H-胸苷的量，并以每分鐘計數(shù)(cpm)表示。結(jié)果表明所得的DC是有效的APC，正如與巨噬細(xì)胞刺激相比，在同種異體人淋巴細(xì)胞中有較高的增殖誘導(dǎo)作用，以及在所用的所有濃度，在猴子中誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖的能力所表明的(圖16B)。為了用于接種，將DC以1×105細(xì)胞/100μl濃度重懸于用5％自體血清、10mMHepes緩沖液、100U/ml青霉素-鏈霉素、0.5mg/ml兩性霉素B和0.03％谷氨酰胺補充的RPMI1640中，然后在37℃，存在Tat蛋白質(zhì)或Tat肽或Tat、Rev、Nef、Gag和/或細(xì)胞因子的組合的條件下保溫2小時。然后，將所述處理的DC從第一次注射開始2-4周內(nèi)靜脈內(nèi)接種2次或更多次?；蛘?，將DC用含tat基因的載體單獨或者與上述其它載體一起轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后靜脈內(nèi)注射。預(yù)言實施例9將把所述的免疫原用于誘導(dǎo)和/或加強粘膜水平的特異性免疫反應(yīng)。一種方法是基于利用“工程”細(xì)菌(格氏鏈球菌和乳桿菌屬)表達上述病毒抗原。這些細(xì)菌在小鼠的口腔和陰道粘膜移生并誘導(dǎo)局部和全身的抗體反應(yīng)，所述抗體反應(yīng)是針對在重組細(xì)菌表面上表達的異源抗原(參考文獻116、104、106、121、117、139、105、107)。這些細(xì)菌可作為疫苗的活載體并有助于延長免疫系統(tǒng)的刺激作用。此外，我們將評估在細(xì)菌表面共表達病毒抗原和與免疫反應(yīng)有關(guān)的分子，例如大腸桿菌溫度敏感型毒素的B亞單位或細(xì)胞因子的可能性。將按照以前的描述(參考文獻116)完成格氏鏈球菌重組菌株的制備。簡而言之，(ⅰ)重組DNA分子的染色體整合；(ⅱ)與強染色體啟動子的轉(zhuǎn)錄融合；(ⅲ)與編碼M6蛋白質(zhì)(一種鏈球菌表面蛋白)的基因的轉(zhuǎn)錄融合。將用格氏鏈球菌的重組菌株在猴子的陰道粘膜形成菌落。已經(jīng)表明在一次接種后，表達HIV-1gp120的V3區(qū)和HPV-16的E7蛋白的格氏鏈球菌的重組菌株在小鼠陰道粘膜形成永久菌落，誘導(dǎo)局部和全身的抗原特異性抗體反應(yīng)。全身反應(yīng)普遍由IgG2a抗體組成，表明產(chǎn)生Th1型反應(yīng)(參考文獻105，106)。我們將選擇人陰道的乳桿菌屬菌株，它們能夠在猴子的陰道粘膜形成菌落。因此，將使用一個成熟的遺傳系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在乳桿菌屬表面上表達異源抗原(Rush,1997)。這種方法是基于(ⅰ)將遺傳融合物(emm6/異源基因)克隆到攜帶接合轉(zhuǎn)座子Tn916同源物的插入載體中；(ⅱ)將所述載體轉(zhuǎn)化到作為中間宿主的細(xì)菌菌株(枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis))中；(ⅲ)重組轉(zhuǎn)座子從枯草芽孢桿菌接合移動至乳桿菌屬中。將用乳桿菌屬的重組菌株在猴子的陰道粘膜形成菌落。用特殊的吸附濾紙(參考文獻38、105、106)獲得陰道樣品。通過將陰道樣品鋪在選擇性平板上來評估菌落化，并通過對陰道swap進行免疫熒光分析來監(jiān)測HIV抗原的體內(nèi)表達(參考文獻105)。利用已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的方法(參考文獻38)，將陰道swaps用于(ⅰ)在陰道接種的情況下進行Papanicolau試驗；(ⅱ)在細(xì)胞中是否存在疫苗抗原；(ⅲ)通過細(xì)胞熒光測定分析對細(xì)胞的表型進行表征(CD1、CD2、CD4、CD5、CD8、CD11c、CD14、CD20、CD28、CD40、CD25、HLA-DR)；(ⅳ)評估細(xì)胞因子生產(chǎn)(IL-2、IFNγ、TNFα、IL-4、IL-10、IL-15、半定量RT-PCR)，用ELisa監(jiān)測確定在粘液中是否存在細(xì)胞因子和β趨化因子；(ⅴ)用ELisa確定粘液中的總的和特異性免疫球蛋白(IgA和IgG)的劑量[DiFabioetal.,Vaccine151(1997)]。最后一次接種免疫原一個月后，將猴子通過靜脈內(nèi)或者粘膜途徑用SHIV89.6P感染。按實施例4所述完成對猴子的跟蹤觀察。取血樣以完成常規(guī)的實驗室檢測，按實施例4所述評估免疫學(xué)參數(shù)，包括體液的和細(xì)胞的。本發(fā)明人相信可利用該方法經(jīng)陰道途徑成功地誘導(dǎo)猴子的特異性免疫?；蛘?，按上述通過施用蛋白免疫原，在存在佐劑例如大腸桿菌的熱敏感性毒素和霍亂毒素的條件下直接通過粘膜途徑或者利用其它細(xì)菌和非細(xì)菌送遞系統(tǒng)例如細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑和脂質(zhì)體或者通過能夠誘導(dǎo)最有效及保護性免疫反應(yīng)的其它途徑的接種(參考文獻83、81、62)誘導(dǎo)粘膜免疫。此外，本發(fā)明人相信，表達上述病毒蛋白的重組皰疹載體是誘導(dǎo)有效粘膜免疫反應(yīng)的優(yōu)秀系統(tǒng)。將利用來自單純性皰疹病毒1型(HSV-1)的重組病毒載體表達病毒蛋白用于誘導(dǎo)全身(通過皮膚免疫，皮內(nèi))和粘膜(通過口腔、陰道或鼻途徑)反應(yīng)。將利用非致病性、非復(fù)制性皰疹載體(參考文獻99)，這是由于它們包含大外源序列而不會干擾感染效力的能力(參考文獻52、64)。因此，將構(gòu)建能夠含一個以上HIV基因(輔助、調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)基因)的載體?？赏ㄟ^口腔、陰道或鼻疫苗以誘導(dǎo)粘膜免疫?？蓪捳钶d體用于這些接種方法，因為HSV-1可通過粘膜途徑直接施用(參考文獻176、75)。利用有利于外源序列插入到病毒基因組中的兩步法構(gòu)建重組病毒。第一步需要利用標(biāo)準(zhǔn)同源重組方法，插入含克隆在Pacl限制位點的報道基因(β-半乳糖苷酶，LacZ)的表達盒，所述報道基因不存在于HSV-1基因組中，將該基因插入在想要的HSV-1靶序列側(cè)以中斷HSV-1基因。用“x-gal染色用藍(lán)色表型通過噬菌斑的形成篩選重組病毒。用Pacl消化病毒DNA釋放標(biāo)記基因并產(chǎn)生兩個大病毒DNA片段，不能生產(chǎn)感染性病毒顆粒。第二步是共轉(zhuǎn)染消化的病毒DNA和用以產(chǎn)生缺失的相同的質(zhì)粒，其中用想要的基因代替報道基因。在“x-gal染色”后，通過篩選白色表型的噬菌斑來鑒定重組病毒。這種重組將消除Pacl位點，可以利用該方法在HSV-1基因組的不同座位插入許多基因(參考文獻74)。通過雜交含單個基因的不同載體，我們可以產(chǎn)生所有的不同的遺傳組合。通過用不同的標(biāo)記、表型篩選和在感受態(tài)細(xì)胞上選擇性生長可以分離含所有想要基因的載體。通過改變DNA轉(zhuǎn)染和病毒重組可產(chǎn)生全部組合。構(gòu)建表達單基因tat、rev、nef或gag的載體用作基礎(chǔ)載體，這是在基因4-/22-/27-/41含突變的載體，與其它HSV-1非復(fù)制型載體相比，因毒性更低并能更強地表達外源基因而更好。使用組成型啟動子，例如來自HCMV(人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子)或ICPOlep(感染細(xì)胞蛋白立即早期啟動子)和莫洛尼鼠類白血病病毒LTR的啟動子以誘導(dǎo)上述基因的表達。將構(gòu)建表達不同組合的HIV蛋白的非復(fù)制型HSV-1載體。通過遺傳雜交在前點所述含單基因的載體可產(chǎn)生含多種不同基因的那些病毒。產(chǎn)生雙、三和四載體。將載體經(jīng)皮內(nèi)或通過粘膜(口腔、陰道或鼻)途徑給猴子接種，要特別注意后一種施用方式(參考文獻176、101、102)。接種方案是在不同的時間點多次接種，這必須根據(jù)免疫原或免疫原的組合來確定。在免疫接種過程中，監(jiān)測動物，按實施例4所述評估血液化學(xué)和免疫學(xué)參數(shù)。用已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的方法，獲得陰道樣品，按本實施例前述研究所述樣品。預(yù)言實施例10送遞系統(tǒng)將用新的送遞系統(tǒng)例如紅細(xì)胞或納米顆粒接種Tat(蛋白質(zhì)和/或DNA)或其組合(按上述)。利用紅細(xì)胞的送遞系統(tǒng)是基于送遞接合在自體紅細(xì)胞上的抗原的可能性。事實上，在其存活期間(在人體中存活約120)結(jié)束時，通過巨噬細(xì)胞從循環(huán)中除去紅細(xì)胞，已知紅細(xì)胞有專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞的功能。可將該特性用于疫苗方案。因此，用特定的技術(shù)(參考文獻95、96)將抗原與紅細(xì)胞結(jié)合，使其保留抗原的免疫原性(參考文獻29、30)。通過這種方法，在不明顯改變其特性和生命期的條件下，可將紅細(xì)胞生物素化(參考文獻95)。由巨噬細(xì)胞對老紅細(xì)胞進行的吞噬作用將引發(fā)免疫反應(yīng)。攜帶抗原的紅細(xì)胞的抗體調(diào)理作用將有助于從循環(huán)中除去抗原。這種方法的主要優(yōu)點是1)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)僅需少量抗原，2)由于在外周中持續(xù)存在由紅細(xì)胞攜帶的抗原，因此，可以長時間持續(xù)免疫，3)由該系統(tǒng)本身提供的佐劑功能。事實上，在動物研究中已經(jīng)表明，施用結(jié)合在自體紅細(xì)胞膜上的抗原可誘導(dǎo)與施用弗氏佐劑和相同抗原所得免疫反應(yīng)(參考文獻29)類似或更高的免疫反應(yīng)。這些特性對于開發(fā)抗HIV疫苗非常有用，尤其是當(dāng)需要提高抗原的免疫原性和抗原的利用度而且當(dāng)需要少量免疫時。另外，當(dāng)接種方法中不包括佐劑時，可使用這種方法。事實上，用小鼠模型已經(jīng)表明通過自體紅細(xì)胞施用的抗原誘導(dǎo)與施用弗氏佐劑和相同抗原所得免疫反應(yīng)相比類似或更高的免疫反應(yīng)，而弗氏佐劑是已知的市售的最有效的佐劑(參考文獻29)，盡管由于嚴(yán)重的副作用而不允許用于人的研究。因此，將用非人靈長類分析單獨攜或與前述其它免疫原組合攜帶Tat蛋白質(zhì)的紅細(xì)胞的佐劑作用。將這些數(shù)據(jù)與存在Alum、RIBI或ISCOM時施用Tat蛋白質(zhì)得到的數(shù)據(jù)進行比較。納米顆粒的利用代表了另一種送遞方案。功能性納米顆粒代表了一種用于運輸和釋放蛋白質(zhì)和DNA的重要系統(tǒng)(參考文獻27、172)。納米球是由不同化學(xué)成分組成的膠體聚合顆粒，直徑在10-1000nm的大范圍內(nèi)。它可將不同類型的物質(zhì)吸附在納米球表面或內(nèi)部(寡核苷酸、藥物、蛋白質(zhì)、肽、DNA)，然后帶到胞質(zhì)或細(xì)胞核中，在那里將攜帶的物質(zhì)緩慢釋放出來。另外，由于納米球的特征，只需送遞少量的免疫原。納米顆粒是一種很好的送遞系統(tǒng)，特別是對于在細(xì)胞外環(huán)境中不太穩(wěn)定的分析或者當(dāng)送遞針對具體的靶細(xì)胞時。本發(fā)明人相信，可用納米球送遞上述病毒抗原?？梢灾苽浜捅碚?種用于送遞和控釋DNA(納米球1和2型)和蛋白質(zhì)(納米球3型)的納米球。為了送遞DNA，可以用兩種納米球(納米球1和2型)。第一種納米球(納米球1型)有三層結(jié)構(gòu)，外層是聚氧乙二醇(poly-oxy-ethylen-glicole)(PEG)。以秘密系統(tǒng)研究為基礎(chǔ)的最新報道(參考文獻180、78)表明PEG可使納米球不被肝巨噬細(xì)胞(Kupfercell)發(fā)現(xiàn)。相反，更內(nèi)層是由具有表面活性特征的含季銨基團的單體和由甲基-甲基丙烯酸酯(methyl-metacrylate)為單體制成的內(nèi)核制成，所述含季銨基團的單體通過離子交換機制可逆地吸附DNA。在存在表面活性試劑混合物的條件下，通過在有關(guān)聚合vinlic或vinilidenic單體的微乳液中聚合得到這些納米球。因此這些試劑能夠聚合單體。其中，一種含有與寡核苷酸相互作用的季銨基團，另一種含有長鏈PEG。第二種DNA送遞系統(tǒng)是由具有水凝膠特征的功能納和微球(納米球2型)制成。應(yīng)在存在DNA的條件下制備這些納米球以便將DNA捕獲在該送遞系統(tǒng)內(nèi)。需要納米球核-殼以送遞蛋白質(zhì)(納米球3型)。這種納米球是由聚甲基甲基丙烯酸酯的內(nèi)核和丙烯酸與甲基-甲基丙烯酸酯水溶性統(tǒng)計共聚物的外殼組成，已知所述共聚物與蛋白質(zhì)有高度的親和性(參考文獻79、80)。這種共聚物是市售的(EUDRAGIT)并可以以兩種共聚用單體的不同百分比得到。制備這種第二類型納米球的制備方法包括在分散液中聚合。合成方法包括在存在具有空間穩(wěn)定功能的EUDRAGIT的條件下，游離基聚合vinilic或vinilidenic單體。納米球成核后，EUDRAGIT排列在所述顆粒的外部。因此，改變游離基引發(fā)劑的濃度、單體與EUDRAGIT之間的比例以及反應(yīng)時間，就可以得到具有不同形態(tài)和化學(xué)特征的各種納米球樣品。因此，可以評估用納米顆粒僅送遞Tat蛋白或TatDNA或者送遞Tat蛋白或DNA與上述免疫原(蛋白質(zhì)或者DNA)的組合是否可誘導(dǎo)抗HIV的免疫反應(yīng)。具體地講，對體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)進行評估并與在猴子模型中用非送遞免疫原得到的數(shù)據(jù)進行比較。本發(fā)明人相信，從這些研究中得到的資料可用于開發(fā)抗HIV疫苗。另外，可將從本試驗方法得到的資料用于其它疫苗研究，特別是有關(guān)低免疫原性重組蛋白質(zhì)或肽的疫苗研究。開發(fā)僅一次施用的疫苗的可能性對于疫苗的效力和降低疫苗開發(fā)成本是非常有利的。參考文獻1．Agostini等，血液(Blood)901115(1997)2．Albini等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)924838(1995)3．Allan等，科學(xué)(Science)230813(1985)4．抗體-實驗室手冊(Antibodies-Alaboratorymanual),HarlowE.,LaneD.編，冷泉港實驗室(1988)5．Arya等，科學(xué)(Science)22969(1985)6．Aryoshi等，AIDS9555(1995)7．Audibert等，當(dāng)代免疫學(xué)(Immunol.Today)14281(193)8．Badolato等，血液(Blood)902804(1997)9．Barillari等，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1493727(1992)10．Barillari等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)907941(1993)11．Barillari等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1493727(1993)12．Blomberg等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)16027-34(1993)13．Blomberg等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol．Methods)168267-273(1994)14．Blomberg等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)193199-206(1996)15．Bohan等，基因?qū)嶒?GeneExpr.)2391(1992)16．Bourgault等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)6675(1992)17．Boyer等，天然藥物(NatureMed.)3526(1997)18．Bruisten等，傳染病雜志(J.Infect.Dis.)166620(1992)19．Buseyne等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)67694(1993)20．Butera等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)654645(1991)21．Butera等，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)682726(1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p;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#6226atgagattcgaaa15&amp;#60210&amp;#6227&amp;#60211&amp;#6215&amp;#60212&amp;#62DNA&amp;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#6227tcaagaagtgttgat15&amp;#60210&amp;#6228&amp;#60211&amp;#6215&amp;#60212&amp;#62DNA&amp;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#6228atggagccagtagat15&amp;#60210&amp;#6229&amp;#60211&amp;#6215&amp;#60212&amp;#62DNA&amp;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#6229ctattccttcgggcc15&amp;#60210&amp;#6230&amp;#60211&amp;#6227&amp;#60212&amp;#62DNA&amp;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#60&amp;#6230ggcccgaaggaaatggcaggaagaagc27&amp;#60210&amp;#6231&amp;#60211&amp;#6227&amp;#60212&amp;#62DN&amp;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#6231ggcccgaaggaaatgggtggcaagtgg27&amp;#60210&amp;#6232&amp;#60211&amp;#6227&amp;#60212&amp;#62DNA&amp;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#6232ggcccgaaggaaatgggtgcgagagcg27&amp;#60210&amp;#6233&amp;#60211&amp;#6227&amp;#60212&amp;#62DNA&amp;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#6233ggcccgaaggaaatgtggccccctggg27&amp;#60210&amp;#6234&amp;#60211&amp;#6227&amp;#60212&amp;#62DNA&amp;#60213&amp;#62Aids-相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒&amp;#60400&amp;#6234ggcccgaaggaaatgagaatttcgaaa2權(quán)利要求1．用作疫苗的具有生物活性的分離的Tat蛋白質(zhì)，其片段和/或突變體和/或TatDNA，所述Tat以皮摩爾至納摩爾濃度能夠(ⅰ)進入并定位在活化的內(nèi)皮細(xì)胞或樹突細(xì)胞的核中；和/或(ⅱ)激活卡波濟肉瘤(KS)細(xì)胞的增殖、遷移和侵入和細(xì)胞因子激活的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白。2．根據(jù)權(quán)利要求1的具有生物活性的分離的Tat蛋白質(zhì)，其片段和/或突變體和/或DNATat，還能夠(ⅲ)當(dāng)加入到感染細(xì)胞中時激活病毒復(fù)制，這是a)通過加入外源蛋白質(zhì)后，HLM-1細(xì)胞中Tat-缺陷型原病毒的獲救；和/或b)通過反式激活HIV-1啟動子-報道基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的HIV-1基因表達而度量的。3．根據(jù)權(quán)利要求2的具有生物活性的分離的Tat蛋白質(zhì)，其片段和/或突變體和/或TatDNA，還能夠(ⅳ)在存在血管生成因子或炎癥細(xì)胞因子的條件下，在小鼠中誘導(dǎo)KS樣損傷的發(fā)展。4．根據(jù)權(quán)利要求1-3的具有生物活性的分離的Tat蛋白質(zhì)，其片段和/或突變體和/或TatDNA，其量在10ng/ml或更少至1μg/ml的范圍內(nèi)。5．用于預(yù)防和/或治療AIDS、腫瘤、與HIV感染有關(guān)的綜合征和癥狀的根據(jù)權(quán)利要求1-4的具有生物活性的分離的Tat蛋白質(zhì)，其片段和/或突變體和/或TatDNA。6．預(yù)防和/或治療AIDS、腫瘤、與HIV感染有關(guān)的綜合征和癥狀的蛋白質(zhì)或肽或DNA疫苗，它含有權(quán)利要求1-4中定義的有生物活性的Tak和/或其突變體和/或蛋白質(zhì)或肽部分或者DNA。7．根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗，其中Tat具有下列核苷酸序列(Seq.1)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’以及任何HIV型和亞型的任何其他Tat變體。8．根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗，其中Tat具有下列氨基酸序列NH2-EPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKAISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH以及任何HIV型和亞型的任何其他Tat變體。9．根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗，其中突變體在具有下列核苷酸序列或其部分的突變體中進行選擇cys22突變體的核苷酸序列(Seq.2)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCGGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’lys41的核苷酸序列(Seq.3)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’RGDΔ突變體的核苷酸序列(Seq.4)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’lys41-RGDΔ突變體的核苷酸序列(Seq.5)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’10．根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗，其中突變體在具有下列氨基酸序列或其部分的突變體中進行選擇cys22突變體的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTAGTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOHlys41的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOHRGDΔ突變體的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOHlys41-RGDΔ突變體的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH11．根據(jù)權(quán)利要求6的疫苗，其中Tat部分在下列肽序列中進行選擇Pep.1.MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTPep.2.ACTNCYCKKCCFHCQVCFITPep.3.QVCFITKALGISYGRKPep.4.SYGRKKRRQRRRPPQPep.5.RPPQGSQTHQVSLSKQPep.6.HQVSLSKQPTSQSRGDPep.7.PTSQSRGDPTGPKE12．權(quán)利要求6-11的疫苗，它含有與破傷風(fēng)類毒素的T輔助通用表位或任何T輔助肽結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽。13．權(quán)利要求6-12的疫苗，它與HIVNef,Rev或Gag或其部分的重組蛋白質(zhì)或肽組合。14．權(quán)利要求6的疫苗，它含有融合蛋白Tat(野生型或其突變體)/Nef,Tat(野生型或其突變體)/Rev,Tat(野生型或其突變體)/Gag或其部分。15．權(quán)利要求6-14的疫苗，它與重組免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子或其他分子或其部分組合，提高抗病毒免疫反應(yīng)。16．權(quán)利要求15的疫苗，其中細(xì)胞因子是IL-12和/或IL-15或IFNα或IFNβ。17．權(quán)利要求6的疫苗，它含有融合蛋白Tat(野生型或其突變體)/免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子，Tat(野生型或其突變體)/IL-12，Tat(野生型或其突變體)/IL-15，Tat(野生型或其突變體)/其他分子，或其部分，提高抗病毒免疫反應(yīng)。18．權(quán)利要求6、7、9的DNA疫苗，它含有編碼Tat野生型或其突變體或其部分的DNA，所述DNA插入在表達載體中。19．權(quán)利要求6、7、9的DNA疫苗，它與包括HIVrev，nef和gag基因或其部分的表達載體組合。20．權(quán)利要求18或19的DNA疫苗，其中所述載體是共表達tat(野生型或其突變體)/rev，tat(野生型或其突變體)/nef，tat(野生型或其突變體)/gag或其部分的質(zhì)粒。21．權(quán)利要求6、7、9的DNA疫苗，它與插入在表達載體中的DNA分子組合，所述DNA分子編碼免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子或其他免疫調(diào)節(jié)劑分子或其部分，提高抗病毒免疫反應(yīng)。22．權(quán)利要求21的DNA疫苗，其中細(xì)胞因子是IL-12和/或IL-15。23．權(quán)利要求21或22的DNA疫苗，其中所述載體是共表達tat(野生型或其突變體)/IL-12，tat(野生型或其突變體)/IL-15，tat(野生型或其突變體)/其他分子或其部分的質(zhì)粒，能夠提高抗病毒免疫反應(yīng)。24．權(quán)利要求18-23的疫苗，其中所述載體是pCVO。25．前述權(quán)利要求中的疫苗，它包括按照前述權(quán)利要求處理的和/或未處理的自體樹突細(xì)胞。26．前述權(quán)利要求的疫苗，它包括能夠提高抗病毒免疫反應(yīng)的佐劑。27．權(quán)利要求26的疫苗，其中所述佐劑選自Alum,ISCOM,RIBI和相關(guān)混合物。28．前述權(quán)利要求的疫苗，它含有送遞系統(tǒng)。29．權(quán)利要求28的疫苗，其中送遞系統(tǒng)選自納米顆粒、皰疹載體、紅細(xì)胞、細(xì)菌和其組合。30．權(quán)利要求29的疫苗，其中所述細(xì)菌選自格氏鏈球菌和乳桿菌屬。31．權(quán)利要求29和30的疫苗，其中細(xì)菌被修飾過以表達病毒抗原。32．前述權(quán)利要求的疫苗，用于免疫來自感染個體的外周血細(xì)胞，通過用包被有抗-CD3和抗-CD28抗體的磁珠共刺激來擴展。33．前述權(quán)利要求的治療疫苗，它與病毒復(fù)制抑制劑組合。34．權(quán)利要求6-33的疫苗，其中將活性物質(zhì)送遞到粘膜。35．權(quán)利要求34的疫苗，其中經(jīng)鼻、口、陰道和/或直腸施用所述活性物質(zhì)。36．權(quán)利要求6-33的疫苗，其中經(jīng)全身或局部途徑施用所述活性物質(zhì)。37．權(quán)利要求36的疫苗，其中通過肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)途徑施用所述活性物質(zhì)。38．權(quán)利要求37的疫苗，其中以1-6μg的量皮內(nèi)施用所述活性物質(zhì)，不加佐劑。39．權(quán)利要求34-38的疫苗，其中用生物學(xué)可接受的流體攜帶所述活性物質(zhì)。40．權(quán)利要求34-39的疫苗，它還含有可藥用載體和賦形劑以使該物質(zhì)的活性達到最大。41．權(quán)利要求34-40的疫苗，它含有預(yù)防和/或治療量的權(quán)利要求1的Tat作為活性物質(zhì)。42．生物活性Tat核苷酸序列(Seq.1)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’43．生物活性Tat氨基酸序列NH2-EPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKAISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH44．具有選自下列的核苷酸序列的生物活性Tat突變體蛋白質(zhì)cys22突變體的核苷酸序列(Seq.2)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCGGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’lys41突變體的核苷酸序列(Seq.3)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’RGDΔ突變體的核苷酸序列(Seq.4)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’lys41-RGDΔ突變體的核苷酸序列(Seq.5)5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCCGACAGGCCCGAAGGAATAG3’45．生物活性Tat突變體氨基酸序列，它選自cys22突變體的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTAGTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOHlys41突變體的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOHRGDΔ突變體的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOHlys41-RGDΔ突變體的氨基酸序列NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSPTGPKE-COOH46．具有選自下列的肽序列的生物活性Tat突變體Pep.1.MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTPep.2.ACTNCYCKKCCFHCQVCFITPep.3.QVCFITKALGISYGRKPep.4.SYGRKKRRQRRRPPQPep.5.RPPQGSQTHQVSLSKQPep.6.HQVSLSKQPTSQSRGDPep.7.PTSQSRGDPTGPKE47．表達載體，它含有選自權(quán)利要求42和44中所列序列或其部分的DNA序列。48．表達載體pCVO，它包括選自權(quán)利要求42-44中所列序列或其部分的DNA序列。49．權(quán)利要求48的表達載體pCVO，它含有編碼選自tat,rev,nef,gag,IL-12，IL-15和其組合的基因的DNA序列。50．包括權(quán)利要求47-49的載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。51．用權(quán)利要求42-46的Tat蛋白質(zhì)或其肽或突變體或者與Rev，Nef和Gag蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞因子的組合處理的樹突細(xì)胞。52．用含有tat基因的表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的權(quán)利要求51的樹突細(xì)胞。53．生成生物活性Tat蛋白質(zhì)或其突變體或其重組形式或其部分的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求50的細(xì)胞，并且分離并純化由此得到的蛋白質(zhì)或其部分。54．制備權(quán)利要求49的pCVO載體的方法，其中用選自下列的引物通過PCR技術(shù)擴增相應(yīng)的cDNASeq.P1.正向引物Rev5’ATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P2.反向引物Rev5’CTATTCTTTAGTTCC3’Seq.P3.正向引物Nef5’ATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P4.反向引物Nef5’TCAGCAGTCCTTGTA3’Seq.P5.正向引物Gag5’ATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P6.反向引物Gag5’TTATTGTGACGAGGG3’Seq.P7.正向引物IL-125’ATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P8.反向引物IL-125’TTAGGAAGCATTCAG3’Seq.P9.正向引物IL-155’ATGAGAATTTCGAAA3’Seq.P10.反向引物IL-155’TCAAGAAGTGTTGAT3’Seq.P11.正向引物Tat5’ATGGAGCCAGTAGAT3’Seq.P12.反向引物Tat5’CTATTCCTTCGGGCC3’Seq.P13.正向引物Tat/Rev5’GGCCCGAAGGAAATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P14.正向引物Tat/Nef5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P15.正向引物Tat/Gag5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P16.正向引物Tat/IL-125’GGCCCGAAGGAAATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P17.正向引物Tat/IL-155’GGCCCGAAGGAAATGAGAATTTCGAAA3’55．選自下列的引物Seq.P1.正向引物Rev5’ATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P2.反向引物Rev5’CTATTCTTTAGTTCC3’Seq.P3.正向引物Nef5’ATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P4.反向引物Nef5’TCAGCAGTCCTTGTA3’Seq.P5.正向引物Gag5’ATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P6.反向引物Gag5’TTATTGTGACGAGGG3’Seq.P7.正向引物IL-125’ATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P8.反向引物IL-125’TTAGGAAGCATTCAG3’Seq.P9.正向引物IL-155’ATGAGAATTTCGAAA3’Seq.P10反向引物IL-155’TCAAGAAGTGTTGAT3’Seq.P11正向引物Tat5’ATGGAGCCAGTAGAT3’Seq.P12反向引物Tat5’CTATTCCTTCGGGCC3’Seq.P13.正向引物Tat/Rev5’GGCCCGAAGGAAATGGCAGGAAGAAGC3’Seq.P14.正向引物Tat/Nef5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGGCAAGTGG3’Seq.P15.正向引物Tat/Gag5’GGCCCGAAGGAAATGGGTGCGAGAGCG3’Seq.P16.正向引物Tat/IL-125’GGCCCGAAGGAAATGTGGCCCCCTGGG3’Seq.P17.正向引物Tat/IL-155’GGCCCGAAGGAAATGAGAATTTCGAAA3’.56．制備權(quán)利要求6-41的疫苗的方法，其中Tat呈其非氧化形式。57．制備權(quán)利要求6-41的疫苗的方法，其中將凍干形式的Tat重懸在用于施用的生物學(xué)可接受的流體中。58．活性形式的Tat蛋白質(zhì)野生型和/或其突變體和/或蛋白質(zhì)或肽相關(guān)部分或編碼這些蛋白質(zhì)或其部分或肽的DNA在制備預(yù)防和/或治療AIDS、腫瘤和HIV感染相關(guān)綜合征和癥狀的蛋白質(zhì)或肽或DNA疫苗中的用途。59．Alum,ISCOM、RIBI和其他佐劑單獨或組合用于制備權(quán)利要求6的疫苗的用途。60．用單克隆抗體抗-CD3和抗-CD28包被的順磁珠用于制備權(quán)利要求6的疫苗的用途。61．用于治療AIDS、腫瘤、與HIV感染有關(guān)的綜合征和癥狀的治療方法，其特征在于施用預(yù)防或治療量的權(quán)利要求1-5的生物活性Tat。全文摘要本發(fā)明涉及作為活性物質(zhì)的Tat,用于抗HIV感染、感染HIV個體的AIDS發(fā)展和腫瘤及其他綜合征和癥狀的發(fā)展的預(yù)防和/或治療疫苗。Tat可以是重組蛋白或肽或者DNA的生物活性形式。更具體地講,本發(fā)明涉及以HIV－1Tat為免疫原的疫苗,作為DNA和/或重組蛋白或肽接種,單獨或者與其他基因或病毒基因產(chǎn)物(Nef,Rev,Gag)或其部分組合,或者與各種免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子(IL－12、IL－15)或者與編碼免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子或其部分的基因組合。將Tat、Nef、Rev、Gag和免疫調(diào)節(jié)劑細(xì)胞因子作為重組蛋白、肽或融合蛋白的混合物(Tat/Nef、Tat/Rev、Tat/Gag、Tat/IL－12、Tat/IL－15)或者作為質(zhì)粒DNA施用。文檔編號C12P21/02GK1283121SQ98812496公開日2001年2月7日申請日期1998年11月30日優(yōu)先權(quán)日1997年12月1日發(fā)明者B·恩索利申請人:高等健康研究院