專利名稱：去飽和酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼△5-脂肪酸去飽和酶的DNA序列，編碼的△5-脂肪酸去飽和酶，以及△5-脂肪酸去飽和酶的應(yīng)用。
多不飽和脂肪酸在神經(jīng)藥物學(xué)(neutraceutically)上很重要，因?yàn)樗鼈兙哂歇?dú)特的促進(jìn)健康的活性；它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)上也很重要，因?yàn)樗鼈冊(cè)谥委熖囟膊顩r方面有潛在的藥物用途。
多不飽和脂肪酸是兩類主要代謝物-前列腺素類(包括前列腺素和血栓素)和白三烯一的前體?！?-脂肪酸去飽和酶通過(guò)在各底物△5碳上引入雙鍵來(lái)催化二高(dihomo)γ亞麻酸(DHL)轉(zhuǎn)變成花生四烯酸(AA)以及催化二十碳四烯酸(ETA)轉(zhuǎn)變成二十碳五烯酸(EPA)，它在天然狀態(tài)中以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白存在。
花生四烯酸是具有4個(gè)雙鍵的20碳鏈，它在人體代謝中非常重要，因?yàn)樗呛幸粋€(gè)5元碳環(huán)的前列腺素-20-碳鏈脂肪酸合成的前體。前列腺素是激素作用的調(diào)節(jié)劑，它的潛在效應(yīng)包括刺激發(fā)炎、調(diào)節(jié)流入特定器官的血流、控制離子運(yùn)輸通過(guò)某些膜、以及調(diào)節(jié)突觸傳遞。前列腺素還可能用作避孕藥，因?yàn)樗鼈兡芤种圃型姆置?。因此，通過(guò)控制多不飽和脂肪酸前體合成的表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)前列腺素合成的能力在醫(yī)學(xué)上和商業(yè)上均是非常重要的。
多不飽和脂肪酸在食品和藥物工業(yè)中重要性的增加導(dǎo)致了其需求的增加超過(guò)了目前的生產(chǎn)水平，因此需要有高品質(zhì)、低成本多不飽和脂肪酸的補(bǔ)充來(lái)源。
目前多不飽和脂肪酸的商業(yè)來(lái)源包括經(jīng)過(guò)挑選的種子植物、海洋魚(yú)類和經(jīng)過(guò)挑選的哺乳動(dòng)物，從這些來(lái)源提取多不飽和脂肪酸的傳統(tǒng)加工技術(shù)包括溶劑萃取、凝析、形成尿素加成物以及蒸餾。然而，目前的來(lái)源具有以下缺點(diǎn)生產(chǎn)水平和質(zhì)量隨季節(jié)及氣候變化，缺少可利用的植物和魚(yú)來(lái)源，以及精制低等級(jí)油的成本高。高成本加上不充足的生產(chǎn)水平阻礙了多不飽和脂肪酸在商業(yè)上的利用價(jià)值的發(fā)展。
人們作了許多努力來(lái)開(kāi)發(fā)多不飽和脂肪酸的其它來(lái)源，現(xiàn)已對(duì)其生物合成的組成基因和編碼蛋白進(jìn)行了研究。例如，將多不飽和脂肪酸的生物合成基因工程改造到油料種子中具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如可用來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)大量γ亞麻酸酯(GLA)、二高-γ-亞麻酸酯(DHGLA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。其實(shí)用性已經(jīng)通過(guò)琉璃苣△6去飽和酶基因在煙草中表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生GLA和十八碳四烯酸(184，Soyanova等人，(1997)，PNAS 94，9411-9414)進(jìn)行了描述。隨之得到更多的多不飽和脂肪酸合成的生物合成基因，這開(kāi)辟了在油料種子中至少生產(chǎn)GLA、AA、EPA和DHA的可能性，并能控制裝配的脂質(zhì)類型。從這些作物可以獲得的益處包括大規(guī)模持續(xù)提供廉價(jià)的所需多不飽和脂肪酸，定制多不飽和脂肪酸的特性以滿足特殊的營(yíng)養(yǎng)需求，并且在精細(xì)化學(xué)工業(yè)中生產(chǎn)出具有預(yù)定水平和不飽和位置的不同尋常的脂肪酸。
生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的另一種方法是利用低等生物的生物合成能力，這些低等生物例如是藻類、細(xì)菌、真菌(包括藻菌)，它們能合成所有的多不飽和脂肪酸，并能以工業(yè)規(guī)模生長(zhǎng)。對(duì)這些生物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，將有可能開(kāi)發(fā)出過(guò)度生產(chǎn)型菌株，并能通過(guò)基因工程改造途徑來(lái)操縱多不飽和脂肪酸的分布類型。
現(xiàn)已克隆出真菌的△5和△6脂肪酸去飽和酶，它們的序列公開(kāi)在WO98/46763、WO98/46764和WO98/46764中。
多不飽和脂肪酸的代謝是人體代謝中最為重要的。這些酸通過(guò)二十烷類對(duì)適當(dāng)維持體內(nèi)平衡起重要作用，并與嚴(yán)重的生理性和病理生理性綜合征有關(guān)。
本發(fā)明者已經(jīng)令人驚奇地從土壤滋生絲狀真菌中分離并鑒定了接合菌類高山被孢霉(Mortierella alpina)編碼功能性△5-脂肪酸去飽和酶的DNA序列。
另外，本發(fā)明者還令人驚奇地分離并鑒定了線蟲(chóng)Caenorhabditis elegans中編碼功能△5-脂肪酸去飽和酶的DNA序列。認(rèn)為編碼功能性△5-脂肪酸去飽和酶的該DNA序列與人△5-脂肪酸去飽和酶的關(guān)系，可能比迄今分離得到的任何△5-脂肪酸去飽和酶基因序列都近。
除了本發(fā)明DNA序列所編碼的多肽具有潛在的人用優(yōu)點(diǎn)外，本發(fā)明的DNA序列也許能夠克隆等價(jià)人基因，從而使得人DNA序列的過(guò)度生產(chǎn)變得容易，并使其能在生物醫(yī)學(xué)上用于治療某些人類疾病。
植物和真菌去飽和酶主要是整合的膜多肽，這使得它們很難用常規(guī)方法來(lái)純化并鑒定。因此，為更好地研究脂質(zhì)代謝，采用了包括突變體和轉(zhuǎn)基因植物的分子技術(shù)。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供一種分離的動(dòng)物△5-脂肪酸去飽和酶及其功能性部分。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供一種分離的C.elegans△5-脂肪酸去飽和酶。
本發(fā)明第三方面提供了編碼本發(fā)明第一或第二方面的DNA序列，它包括SEQ.2所示序列的至少一部分，和與該序列或該序列一部分等效的序列，它們依靠遺傳密碼簡(jiǎn)并性編碼功能性△5-脂肪酸去飽和酶。較佳的，該DNA序列從Caenorhabditselegans DNA序列衍生獲得。
較佳的，由克隆基因編碼的△5-脂肪酸去飽和酶的編碼基因長(zhǎng)1341bp。其蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為447個(gè)氨基酸，估計(jì)的分子量為57kDa。
或者，該DNA序列編碼功能性△5-脂肪酸去飽和酶，并包含SEQ.1所示序列的至少一部分，和與該序列或該序列一部分等效的序列，它們依靠遺傳密碼簡(jiǎn)并性編碼功能性△5-脂肪酸去飽和酶。較佳的，該DNA序列從高山被孢霉DNA序列衍生獲得。
較佳的，由克隆基因編碼的△5-脂肪酸去飽和酶的編碼基因長(zhǎng)1338bp。其蛋白質(zhì)長(zhǎng)446個(gè)氨基酸，估計(jì)的分子量為57kDa。
較佳的，根據(jù)本發(fā)明第三方面所述的DNA序列在哺乳動(dòng)物中具有功能。
較佳的，該DNA序列在哺乳動(dòng)物中表達(dá)。
較佳的，該DNA序列在人體內(nèi)表達(dá)。
較佳的，該DNA序列是通過(guò)修飾編碼△5-脂肪酸去飽和酶的功能性天然基因而獲得的。
較佳的，該修飾包括用化學(xué)、物理或生物方法進(jìn)行修飾而不除去其編碼的酶的催化活性。
較佳的，該修飾提高了其編碼的酶的催化活性。
較佳的，生物學(xué)修飾包括重組DNA方法和強(qiáng)制進(jìn)化技術(shù)。
較佳的，強(qiáng)制進(jìn)化技術(shù)是DNA改組。
本發(fā)明第四個(gè)方面提供由本發(fā)明第三方面的DNA序列編碼的多肽。
較佳的，該多肽的至少一部分具有SEQ.3所示序列或該序列或其部分的功能性等效序列?；蛘撸摱嚯牡闹辽僖徊糠志哂蠸EQ.4所示序列或該序列或其部分的功能性等效序列。
較佳的，該多肽催化二高γ亞麻酸轉(zhuǎn)變成花生四烯酸。
較佳的，該多肽經(jīng)過(guò)修飾而沒(méi)有失去編碼多肽的催化活性。
較佳的，該多肽經(jīng)過(guò)如此方式的修飾，以致能在底物的分子結(jié)構(gòu)中某特定位置處引入特定水平的底物飽和度。
本發(fā)明第五個(gè)方面提供含有本發(fā)明第三方面的DNA序列之任何一部分DNA序列的載體。
本發(fā)明第六個(gè)方面提供一種生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，該方法包括使底物與本發(fā)明第一或第二方面的△5-脂肪酸去飽和酶或本發(fā)明第四方面的多肽接觸。
本發(fā)明的第七個(gè)方面提供一種將二高γ亞麻酸轉(zhuǎn)變成花生四烯酸的方法，其中該轉(zhuǎn)變反應(yīng)由本發(fā)明第一或第二方面的△5-脂肪酸去飽和酶或是本發(fā)明第四方面的多肽來(lái)催化。
本發(fā)明第八個(gè)方面提供一種生物，該生物經(jīng)基因工程改造可高水平地產(chǎn)生本發(fā)明第四方面的多肽。
本發(fā)明第九個(gè)方面提供一種生物，該生物經(jīng)基因工程改造可高水平地產(chǎn)生一種由本發(fā)明的第一或第二方面的△5-脂肪酸去飽和酶、或本發(fā)明第四方面的多肽的催化的反應(yīng)產(chǎn)物。
較佳的，該生物經(jīng)過(guò)工程改造可用以實(shí)施本發(fā)明第六方面或第七方面的方法。
較佳的，該生物是微生物。
較佳的，該微生物選自藻類、細(xì)菌和真菌。
較佳的，該真菌包括藻菌?；蛘撸撐⑸锸墙湍?。
另外，該生物是植物。較佳的，該植物選自油料種子植物。
較佳的，該油料種子植物選自油菜、向日葵、谷物(包括玉米)、煙草、莢果(包括花生和大豆)、紅花、油棕、椰子和其它棕櫚、棉花、芝麻、芥菜、亞麻籽、蓖麻、琉璃苣和月見(jiàn)草。
本發(fā)明第十方面提供從本發(fā)明第九方面的生物衍生獲得的種子或其它可繁殖的物質(zhì)。
較佳的，該生物是哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明第十一個(gè)方面提供一種分離的多酶途徑，其中該途徑包括本發(fā)明第一或第二方面的△5-脂肪酸去飽和酶。
本發(fā)明第十二個(gè)方面提供一種通過(guò)底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的化合物，其中所述轉(zhuǎn)化由本發(fā)明第一或第二方面的△5-脂肪酸去飽和酶催化。
本發(fā)明第十三個(gè)方面提供一種中間化合物，該化合物由本發(fā)明第一或第二方面的△5-脂肪酸去飽和酶催化的反應(yīng)產(chǎn)生。
本發(fā)明第十四個(gè)方面提供一種食物或飲食添加物，它含有用本發(fā)明第六方面的方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸。
本發(fā)明的第十五個(gè)方面提供一種藥物制劑，該制劑含有用本發(fā)明第六方面的方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸。
本發(fā)明的第十六個(gè)方面提供由生物合成途徑合成的前列腺素，該生物合成途徑包括本發(fā)明第一或第二方面的△5-脂肪酸去飽和酶的催化活動(dòng)。
本發(fā)明的第十七個(gè)方面提供一種調(diào)節(jié)前列腺素合成的方法，該方法是控制本發(fā)明第三方面的DNA序列的表達(dá)水平。
本發(fā)明的第十八個(gè)方面提供一種探針，該探針包含本發(fā)明第三方面的全部或部分DNA序列或等效的RNA序列。
本發(fā)明的第十九個(gè)方面提供一種探針，該探針包含本發(fā)明第四方面的△5-脂肪酸去飽和酶多肽的全部或一部分。
本發(fā)明的第二十個(gè)方面提供一種用本發(fā)明第十九個(gè)方面的探針來(lái)分離△5-脂肪酸去飽和酶的方法。
本發(fā)明的基因可以轉(zhuǎn)化到人細(xì)胞內(nèi)并在以合適的水平用于體內(nèi)基因治療，以提供恒定量的酶將患者體內(nèi)的脂肪酸轉(zhuǎn)變成多不飽和脂肪酸。在例如高膽固醇患者或患有其它醫(yī)學(xué)病狀而給予多不飽和脂肪酸可能有防病有利效果的患者中，這可能是一種有效的預(yù)防性治療手段。
另外，本發(fā)明DAN序列的全部或部分，或本發(fā)明多肽序列的全部或部分可作為搜索探針用于研究或診斷目的。
現(xiàn)在將通過(guò)實(shí)施例并參看附1至4以及SEQ.1至SEQ.4來(lái)描述本發(fā)明，其中SEQ.1是編碼高山被孢霉△5-脂肪酸去飽和酶的cDNA序列；SEQ.2是編碼C.elegans △5-脂肪酸去飽和酶的cDNA序列；SEQ.3是SEQ.1的基因序列翻譯獲得的肽序列；SEQ.4是SEQ.2的基因序列翻譯獲得的肽序列；

圖1是該基因編碼的高山被孢霉△5-脂肪酸去飽和酶與各種△6去飽和酶和△12去飽和酶的序列對(duì)比；圖2是該基因編碼的△5-脂肪酸去飽和酶與C.elegans △6去飽和酶和真菌高山被孢霉的△5去飽和酶的序列對(duì)比；圖3是轉(zhuǎn)化了高山被孢霉△5-脂肪酸去飽和酶基因的經(jīng)誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化體以及未經(jīng)誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化體的脂肪酸甲酯的氣相色譜軌跡線；圖4是轉(zhuǎn)化了C.elegans△5-脂肪酸去飽和酶基因的經(jīng)誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化體以及未經(jīng)誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化體的脂肪酸甲酯的氣相色譜軌跡線。
高山被孢霉的△5-脂肪酸去飽和酶基因的克隆和測(cè)序本發(fā)明的DNA序列編碼△5-脂肪酸去飽和酶，用PCR技術(shù)結(jié)合cDNA文庫(kù)模板以及特別設(shè)計(jì)的引物克隆了該序列。通過(guò)在酵母中表達(dá)相應(yīng)的cDNA來(lái)確認(rèn)該DNA序列的功能(即將二高γ亞麻酸(DHL)轉(zhuǎn)變成花生四烯酸(AA)以及將二十碳四烯酸(ETA)轉(zhuǎn)變成二十碳五烯酸(EPA))。
用高山被孢霉的cDNA作模板，根據(jù)已由Shanklin鑒定的植物△12和△15去飽和酶第一和第三組氨酸堿基(Shanklin，J.Whittle，EJ & Fox，BG.Biochemistry.33，12787-12794(1994))，特別設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并的寡核苷酸引物(DP)(如下所示)，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆了高山被孢霉的△5-脂肪酸去飽和酶。
簡(jiǎn)并的寡核苷酸引物(DP)5′-GCGAATTA(A/T)TIGGICA(T/C)GA(T/C)TG(T/C)GICA-3′5′-GCGAATTC ATIT(G/T)IGG(A/G)AAIA(G/A)(A/G)TG(A/G)TG-3′其中I代表肌苷，EcoRI位點(diǎn)用下劃線表示。
完全用常規(guī)方法在熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序是94℃ 2分鐘，然后94℃ 45秒-55℃ 1分鐘-72℃ 1分鐘循環(huán)32輪，然后再于72℃延伸10分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
從高山被孢霉cDNA模板擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物范圍包括660bp的產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行凝膠純化，克隆到pGEM-T(PromegaRTM)中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)宿主DH5α中。
根據(jù)660bp的產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)引物，用克隆的660bp片段作為模板，根據(jù)660bp產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)序列特異性引物(P)進(jìn)行片段PCR擴(kuò)增。
△B正向引物5′-GATGCGTCTCACTTTTCA-3′△B反向引物5′GTGGTGCGCACAGCCTGGTAGTT-3′凝膠純化該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，并用作探針來(lái)篩選高山被孢霉cDNA文庫(kù)。片段探針與3.5×105個(gè)噬菌體克隆中的25個(gè)雜交，一個(gè)克隆經(jīng)限制性分析顯示具有1.5kb的預(yù)計(jì)大小。選出該克隆(命名為L(zhǎng)11)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。
對(duì)L11進(jìn)行序列分析，結(jié)果揭示有一個(gè)長(zhǎng)度為1.338kb的開(kāi)放讀框，它編碼446個(gè)氨基酸的多肽。當(dāng)用GCG 8程序(Devereux J.等人，Nucleic Acids.Res..12，387-395(1984))在蛋白質(zhì)和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析時(shí)，L11顯示出與集胞藻屬PCC6803的△6去飽和酶基因的相同性很低，只有20％(圖1)。
在圖1中，進(jìn)行序列對(duì)比的序列具有下列保藏號(hào)S54259△12螺旋藻屬 保藏號(hào)X86736S54809△6螺旋藻屬 保藏號(hào)X87094S68358推定的鞘脂去飽和酶保藏號(hào)X87143S35157△6集胞藻屬 保藏號(hào)L11421PBOR6 △6琉璃苣 保藏號(hào)U79010FU2 △5去飽和酶 保藏號(hào)AF054824
另外，盡管翻譯的序列中存在去飽和酶的所有三個(gè)組氨酸盒特征，但是位于該序列1159bp位的第3個(gè)組氨酸盒含有變異的QXXHH。該翻譯序列的N端還含有細(xì)胞色素b5-樣血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括EHPGG基序，而該特征在以前只在其它真菌去飽和酶的C端觀察到。
基因組DNA的Southern印跡根據(jù)L11的組氨酸盒1與盒3之間的L11序列設(shè)計(jì)出序列特異性引物(P)，用于PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增L11序列的660bp區(qū)域。凝膠純化660bp的PCR產(chǎn)物，用該660bp的片段作為探針，對(duì)限制性的高山被孢霉和卷枝毛霉基因組DNA進(jìn)行Southern印跡。結(jié)果表明，編碼本發(fā)明的△5-脂肪酸去飽和酶的基因單拷貝存在于高山被孢霉中，并且看來(lái)不存在于卷枝毛霉中。另外，在卷枝毛霉中也沒(méi)有可檢測(cè)的△5-脂肪酸去飽和酶活性。
編碼△5-脂肪酸去飽和酶的克隆的高山被孢霉基因的表達(dá)為了確認(rèn)L11序列編碼了△5-脂肪酸去飽和酶，將cDNA亞克隆到InvitrogenTM提供的酵母表達(dá)載體pYES2中，使其在GAL4聚合酶啟動(dòng)子的控制下，產(chǎn)生質(zhì)粒pYES2/L11。用PromegaTM偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄-翻譯pYES2/L11，檢查L(zhǎng)11的表達(dá)。產(chǎn)生35S甲硫氨酸標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行SDS PAGE，并通過(guò)放射自顯影膠片曝光來(lái)顯示。該產(chǎn)物的估計(jì)分子量為55-60kD，而沒(méi)有插入物的對(duì)照質(zhì)粒pYES2不能產(chǎn)生任何有標(biāo)記的翻譯產(chǎn)物。
將構(gòu)建物pYES2/L11轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，在尿嘧啶缺失的YCA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。憑借pYES2/L11攜帶的URA3可選擇標(biāo)記的存在選出轉(zhuǎn)化體，加入半乳糖至最終濃度為1％mM，誘導(dǎo)L11表達(dá)。使培養(yǎng)物在0.5mM二高γ亞麻酸酯、洗滌劑(1％tergitolNP-40)和2％棉子糖存在下生長(zhǎng)過(guò)夜。在0、4和16小時(shí)收獲等份。通過(guò)甲酯的GC來(lái)分析酵母的總脂肪酸。用甲醇配的1M HCl于80℃對(duì)誘導(dǎo)的樣品和未誘導(dǎo)的對(duì)照樣品的脂質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)甲基化1小時(shí)。以己烷萃取脂肪酸甲酯(FAMES)。用裝有25M×0.32mm RSL-500bp結(jié)合的毛細(xì)管柱和火焰電離檢測(cè)器的Hewlett Packard 58804系列氣相色譜對(duì)FAME進(jìn)行GC分析。
當(dāng)對(duì)攜帶質(zhì)粒pYes2/L11并在半乳糖和二高γ亞麻酸存在下生長(zhǎng)的酵母中分離出的總脂肪酸甲酯進(jìn)行GC分析時(shí)，觀察到還有一個(gè)額外的峰(見(jiàn)圖3)。該額外峰具有與花生四烯酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)相同的滯留時(shí)間，這表明轉(zhuǎn)基因酵母能使二高γ亞麻酸的△5位脫氫。而在對(duì)照樣品(用pYes2轉(zhuǎn)化)中沒(méi)有觀察到有這樣的峰(圖3)。用GCMS(Kratos MS80RFA，在70eV的電離電壓下操作，掃描范圍為500-40道爾頓)確認(rèn)該額外峰的身份，結(jié)果明確鑒定出該化合物是花生四烯酸。
這證明高山被孢霉的DNA序列所編碼的功能性多肽在半乳糖和二高γ亞麻酸酯存在下參與了花生四烯酸的合成。
C.elegans △5-脂肪酸去飽和酶基因的克隆和測(cè)序本發(fā)明者先已鑒定出與以前鑒定的微粒體去飽和酶不同的來(lái)自植物和動(dòng)物種類的真菌△5和△6-脂肪酸去飽和酶。不同之處在于存在一個(gè)與電子供體蛋白細(xì)胞色素b5同源的N-端延伸序列。
在對(duì)真菌(高山被孢霉)△5-脂肪酸去飽和酶和C.elegans △6-脂肪酸去飽和酶(在粘粒WO8D2中(保藏號(hào)Z70271))進(jìn)行特性分析時(shí)，本發(fā)明者在也含有C.elegans DNA的粘粒T13F2.1(保藏號(hào)Z81122)上鑒定出一個(gè)有關(guān)序列可能編碼脂肪酸去飽和酶。
該序列的分析(用Genefinder程序(Wilson，R.等人，(1994)Nature，368.32-38))揭示粘粒WO8D2和T13F2含有重疊的區(qū)域。另外，發(fā)現(xiàn)粘粒T13F2含有一個(gè)開(kāi)放讀框(ORF)(命名為T13F2.1)，它含有N端細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域(通過(guò)His-Pro-Gly-Gly診斷性基序而確定)以及所有微粒體去飽和酶的三個(gè)“組氨酸盒”特征。另外，該推定的去飽和酶含有變異的第三個(gè)組氨酸盒，在His-X-X-His-His基序中第一個(gè)組氨酸發(fā)生H→Q的置換。這種谷氨酸置換存在于植物和動(dòng)物△6-脂肪酸去飽和酶中以及高山被孢霉的真菌△5-脂肪酸去飽和酶中。
通過(guò)粘粒T13F2和WO8D2之間的重疊可以確定推定的去飽和酶ORF，T13F2.1與△6-脂肪酸去飽和酶的鄰近程度，結(jié)果揭示這兩個(gè)序列在染色體V中串聯(lián)排列，從T13F2.1的預(yù)計(jì)終止密碼子到△6-脂肪酸去飽和酶的起始甲硫氨酸三聯(lián)體相隔990個(gè)堿基。
由于序列分析預(yù)示T13F2.1 ORF中分散有多個(gè)內(nèi)含子，因此基因組DNA的異源功能性表達(dá)是不可行的。因此，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于T13F2.1 ORF 5′端大的預(yù)計(jì)外顯子的部分cDNA克隆，PCR采用下列引物CEFOR和CEREVCEFOR5′-ATGGTA TTACGA GAGCA AGA-3′CEREV5′-TCTGGG ATCTCT GGTT CTTG-3′在94℃最初變性2分鐘后，如下進(jìn)行32輪循環(huán)的擴(kuò)增94℃ 45秒，55℃1分鐘，72℃ 1分鐘，最后再72℃延伸10分鐘。
擴(kuò)增得到具有正確預(yù)計(jì)大小的DNA片段(如1％瓊脂糖凝膠上所示)，切下凝膠條帶，純化DNA，直接連接到pGEM-T(Promega)中，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。用Qiagen QIAprep微量制備試劑盒純化質(zhì)粒DNA進(jìn)行測(cè)序，用ABI-377 DNA測(cè)序儀對(duì)插入物的核苷酸序列進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)序。
為了分離對(duì)應(yīng)于ORF T13F2.1的完整的編碼區(qū)域，用該分離的233bp PCR-擴(kuò)增的片段來(lái)篩選由Prof Yuji Kohara-Mishima(日本)在λZapⅡ中構(gòu)建的混合階段C.eleganscDNA文庫(kù)。用克隆的PCR產(chǎn)物作為探針，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等人(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)進(jìn)行篩選。用Ready to Go DNA-標(biāo)記反應(yīng)混合物(Pharmacia)，用α[32P]dCTP標(biāo)記DNA片段。在篩選與233bp片段雜交的1.4×105pfu中，5個(gè)噬斑給出陽(yáng)性信號(hào)，將它們從瓊脂板上切下，稀釋在SM緩沖液中。用CEFOR和CEREV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得噬菌體懸浮液是否存在T13F2.1。用PCR分離的233bp片段在65℃下對(duì)一個(gè)克隆(命名為L(zhǎng)4)進(jìn)行額外2輪接種和雜交篩選予以純化。通過(guò)切割從λ克隆L4中釋放出質(zhì)粒L4，用Perkin Elmer AB1-377 DNA測(cè)序儀對(duì)插入的cDNA在兩條鏈上進(jìn)行測(cè)序。
所得DNA序列顯示在SEQ.2中，預(yù)計(jì)的氨基酸序列顯示在SEQ.4中。
酵母中L4的功能性分析用PCR擴(kuò)增L4的完整的編碼區(qū)(編碼447個(gè)氨基酸)，PCR擴(kuò)增采用如下所示的引物YCEDFor和TCEDRev，這些引物還引入了側(cè)接的HindIII和BamHI位點(diǎn)YCEDFor5′-GCGAAGCTT AAAATGG TATTACG AGAGCAA GAGC-3′(與起始甲硫氨酸的退火用粗體表示，HindIII限制性位點(diǎn)用下劃線表示)YCEDRev5′-GCGGGAT CCAAT CTAGGC AATCTT TTTAG TCAA-3′(與終止密碼子互補(bǔ)序列的退火用粗體表示，BamHI限制性位點(diǎn)用下劃線表示)利用HindIII和BamHI位點(diǎn)(酶由Boehringer Mannheim提供)，將含有L4完整編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到酵母表達(dá)載體pYES2(Invitrogen)中GAL1啟動(dòng)子的下游。將所得構(gòu)建物(命名為pYES2/L4)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過(guò)利用TNT系統(tǒng)(Promega)的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯在體外確認(rèn)質(zhì)粒pYES2/L4中PCR產(chǎn)生的插入物的保真度。用35S甲硫氨酸標(biāo)記所得翻譯產(chǎn)物，用SDS-PAGE分離并通過(guò)放射自顯影顯示。
從pYES2/L4獲得的翻譯產(chǎn)物的分子量約為57000，而沒(méi)有插入物的對(duì)照載體pYES2不產(chǎn)生翻譯產(chǎn)物。
為了對(duì)L4編碼區(qū)進(jìn)行功能性分析，用乙酸鋰方法(Elble R.(1992)Bio Techniques13 18-20)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到釀酒酵母DBY746中。在含有棉子糖作為碳源、并添加入亞油酸(18∶2△9.12)或二-高-γ-亞麻酸(C20∶3△8，13，14)的培養(yǎng)基中在1％tergitol表面活性劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜(如Napier等人(1998)Bioehem.J.330 611-614中所述)。釀酒酵母中不存在這些脂肪酸，但這些脂肪酸分別是△6或△5去飽和酶的特異性底物。加入半乳糖至1％，誘導(dǎo)L4編碼區(qū)從載體的GAL1啟動(dòng)子開(kāi)始表達(dá)。使培養(yǎng)物繼續(xù)生長(zhǎng)16小時(shí)，然后取出等份對(duì)脂肪酸進(jìn)行GC分析。用甲酯氣相色譜(GC)分析從酵母培養(yǎng)物中提取出的總脂肪酸。用甲醇配的1M HCl使脂質(zhì)于80℃轉(zhuǎn)甲基化1小時(shí)，然后以己烷萃取脂肪酸甲酯(FAME)。用裝有25M×0.32mm RSL-500bp結(jié)合的毛細(xì)管柱和火焰電離檢測(cè)器的Hewlett Packard 58804系列氣相色譜儀對(duì)FAME進(jìn)行GC分析。通過(guò)與FAME標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)的滯留時(shí)間進(jìn)行比較，鑒定了脂肪酸。從峰面積來(lái)估計(jì)脂肪酸的相對(duì)百分?jǐn)?shù)。用GC-MS(用Kratos MS80RFA，在70eV的電離電壓下操作，掃描范圍為500-40道爾頓)鑒定出花生四烯酸。圖4顯示轉(zhuǎn)化酵母菌株的脂肪酸甲酯的GC分析結(jié)果。與空載體對(duì)照相比，在二-高-γ-亞麻酸存在下從誘導(dǎo)生長(zhǎng)的pYES2/L4所獲得的軌跡中明顯有一個(gè)額外的峰。該峰也不存在于二-高-γ-亞麻酸上生長(zhǎng)的未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中，重要的是還應(yīng)注意，在亞油酸存在下生長(zhǎng)的pYES2/L4沒(méi)有產(chǎn)生任何新的峰，這表明該種脂肪酸不是C.elegans cDNA編碼的酶的底物。該額外峰的滯留時(shí)間與可靠的甲基-花生四烯酸標(biāo)準(zhǔn)品相同。用GCMS(氣相色譜質(zhì)譜法)對(duì)二-高-γ-亞麻酸產(chǎn)生的脂肪酸作進(jìn)一步特性分析，鑒定為花生四烯酸。因此，結(jié)果表明質(zhì)粒pYES2/L4轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞獲得了功能性△5-去飽和酶活性，現(xiàn)在已能從底物二-高-γ-亞麻酸合成花生四烯酸。該轉(zhuǎn)化酵母中的△5-去飽和酶看來(lái)是一種有效的催化劑。
這證明了C.elegans的DNA序列編碼了一種功能性多肽，該多肽能在半乳糖和二-高-γ-亞麻酸存在下參與合成花生四烯酸。
SEQ.4編碼C．elegans△5脂肪酸去飽和酶的基因的預(yù)計(jì)的氨基酸序列
權(quán)利要求
1．一種分離的動(dòng)物△5-脂肪酸去飽和酶及其功能性部分。
2．分離的C.elegans△5-脂肪酸去飽和酶。
3．一種編碼權(quán)利要求1或2所述的△5-脂肪酸去飽和酶的DNA序列。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA序列，它包含SEQ.2所示序列的至少一部分，和與該序列或該序列之部分等效的序列，它們依靠遺傳密碼簡(jiǎn)并性編碼功能性△5-脂肪酸去飽和酶。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA序列，該序列從Caenorhabditis elegans DNA序列衍生獲得。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA序列，該DNA序列編碼一種功能性△5-脂肪酸去飽和酶，并包含SEQ.1所示序列的至少一部分，和與該序列或序列一部分等效的序列，它們依靠遺傳密碼簡(jiǎn)并性編碼功能性△5-脂肪酸去飽和酶。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA序列，該DNA序列從高山被孢霉DNA序列衍生獲得。
8．根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項(xiàng)所述的DNA序列，其中該DNA序列在哺乳動(dòng)物中具有功能。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA序列，其中該DNA序列在哺乳動(dòng)物中表達(dá)。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的DNA序列，其中該DNA序列在人體內(nèi)表達(dá)。
11．一種通過(guò)修飾編碼權(quán)利要求1或2所述的△5-脂肪酸去飽和酶的功能性天然基因而獲得的DNA序列。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的DNA序列，其中修飾作用包括用化學(xué)、物理或生物學(xué)方法進(jìn)行修飾而不失去其編碼的酶的催化活性。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA序列，其中該修飾作用提高了其編碼的酶的催化活性。
14．根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的DNA序列，其中生物學(xué)修飾包括重組DNA方法和強(qiáng)制進(jìn)化技術(shù)。
15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的DNA序列，其中強(qiáng)制進(jìn)化技術(shù)是DNA改組。
16．一種由權(quán)利要求3至15中任一項(xiàng)所述的DNA序列編碼的多肽。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽，其中該多肽的至少一部分具有SEQ.3所示的序列或該序列或其部分的功能性等效序列。
18．根據(jù)權(quán)利要求16所述的多肽，其中該多肽的至少一部分具有SEQ.4所示的序列或該序列或其部分的功能性等效序列。
19．根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所述的多肽，其中該多肽催化二高γ亞麻酸轉(zhuǎn)變成花生四烯酸。
20．根據(jù)權(quán)利要求16至19中任一項(xiàng)所述的多肽，其中該多肽經(jīng)過(guò)修飾而沒(méi)有失去編碼多肽的催化活性。
21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的多肽，其中該多肽經(jīng)如此方式修飾，以便在底物的分子結(jié)構(gòu)中特定位置處引入特定水平的底物飽和度。
22．一個(gè)載體，它含有權(quán)利要求3至15中任一項(xiàng)所述的DNA序列或該DNA序列的任何部分。
23．一種生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，該方法包括使合適的底物與權(quán)利要求1或2所述的△5-脂肪酸去飽和酶或權(quán)利要求16至21所述的多肽接觸。
24．一種將二高γ亞麻酸轉(zhuǎn)變成花生四烯酸的方法，其中所述轉(zhuǎn)變反應(yīng)由權(quán)利要求1或2的△5-脂肪酸去飽和酶或權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的多肽或修飾的多肽來(lái)催化。
25．一種生物，該生物經(jīng)基因工程改造可高水平地產(chǎn)生權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的多肽。
26．一種生物，該生物經(jīng)基因工程改造可高水平地產(chǎn)生由權(quán)利要求1或2所述的△5-脂肪酸去飽和酶或權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的多肽催化的反應(yīng)產(chǎn)物。
27．一種生物，該生物經(jīng)過(guò)基因工程改造可實(shí)施權(quán)利要求23或24所述的方法。
28．根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的生物，其中該生物是微生物。
29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的生物，其中該微生物選自藻類、細(xì)菌和真菌。
30．根據(jù)權(quán)利要求29所述的生物，其中真菌包括藻菌。
31．根據(jù)權(quán)利要求28所述的生物，其中所述微生物是酵母。
32．根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)所述的生物，其中該生物是植物。
33．根據(jù)權(quán)利要求32所述的生物，其中該植物選自油料種子植物和煙草。
34．根據(jù)權(quán)利要求33所述的生物，其中所述油料種子植物選自油菜、向日葵、包括玉米在內(nèi)的谷物、煙草、包括花生和大豆在內(nèi)的莢果、紅花、油棕、椰子和其它棕櫚、棉花、芝麻、芥菜、亞麻籽、蓖麻、琉璃苣和月見(jiàn)草。
35．一種從權(quán)利要求33或34所述的生物衍生獲得的種子或其它可繁殖的物質(zhì)。
36．根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)所述的生物，其中該生物是哺乳動(dòng)物。
37．一種分離的多酶途徑，其中該途徑包括權(quán)利要求1或2所述的△5去飽和酶或權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的多肽。
38．一種通過(guò)底物轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的化合物，其中所述轉(zhuǎn)變反應(yīng)由權(quán)利要求1或2所述的△5去飽和酶或權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的多肽來(lái)催化。
39．一種中間化合物，該化合物由權(quán)利要求1或2所述的△5去飽和酶或權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的多肽催化的反應(yīng)所產(chǎn)生。
40．一種食物或飲食添加物，它含有用權(quán)利要求23或24所述的方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸。
41．一種藥物制劑，它含有用權(quán)利要求23或24所述的方法產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸。
42．由生物合成途徑合成的前列腺素，該生物合成途徑包括權(quán)利要求1或2所述的△5去飽和酶或權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的多肽的催化活動(dòng)。
43．一種調(diào)節(jié)前列腺素合成的方法，該方法是控制權(quán)利要求3至15中任一項(xiàng)所述的DNA序列的表達(dá)水平。
44．一種探針，該探針包含權(quán)利要求3至15中任一項(xiàng)所述的DNA序列全部或部分，或等效的RNA序列。
45．一種診斷或研究用探針，該探針包含權(quán)利要求1或2所述的△5去飽和酶或權(quán)利要求16至21中任一項(xiàng)所述的多肽的全部或一部分。
46．一種用權(quán)利要求44或45所述的探針?lè)蛛x△5去飽和酶的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼△5－脂肪酸去飽和酶的cDNA序列,該序列包含SEQ.1和SEQ.2所示的序列。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1283230SQ9881250
公開(kāi)日2001年2月7日 申請(qǐng)日期1998年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月23日
發(fā)明者J·A·內(nèi)皮爾, L·邁克爾森, K·斯托巴特 申請(qǐng)人:布利斯脫大學(xué)