專利名稱：抑制癌細胞中多重耐藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療癌癥的藥劑和方法。更具體地，本發(fā)明涉及在癌細胞中用L-亞硝基羥基丙氨酸治療癌癥細胞以便抑制在這類細胞中腺苷5’三磷酸(ATP)的從頭合成。特別地，本發(fā)明排除了已發(fā)育需要維持多重耐藥的能量的P-糖蛋白-介導(dǎo)的該耐藥的癌細胞。
本發(fā)明的歷史對癌癥化療效果的一個最大限制是癌細胞發(fā)生對許多抗癌和細胞毒性藥物的廣譜抗性的趨勢。據(jù)相信該多重耐藥(MDR)在大多數(shù)癌癥中發(fā)生到不同程度，從癌癥的初起時或化療后復(fù)發(fā)時。
據(jù)信MDR由細胞表面磷-糖蛋白，P-糖蛋白來介導(dǎo)的。在許多惡性細胞中發(fā)現(xiàn)了編碼P-糖蛋白的基因(mdr)的增加的表達，并且其可被惡性腫瘤的發(fā)作和/或與化療劑的細胞接觸而上調(diào)。一旦活化，據(jù)信P-糖蛋白起“疏水真空清潔劑”的作用，從靶細胞中排除疏水藥物。該藥物包括許多抗癌藥和細胞毒劑，如長春花屬生物堿(如長春堿)，蒽環(huán)類抗生素(如阿霉素)，表鬼臼毒素(如依托泊)，紫杉烷(taxanes)(如紫杉醇)，抗生素(如放線菌素D)，抗微管藥(如秋水仙素)，蛋白合成抑制劑(如嘌呤霉素)，毒性肽(如真菌霉素)，拓撲異構(gòu)酶抑制劑(如托泊替堪)，DNA嵌入劑(如溴化乙錠)，和抗有絲分裂劑。
MDR是多年集中研究的課題?？朔﨧DR的努力主要包括利用P-糖蛋白結(jié)合的疏水競爭劑，如鈣通道阻斷劑，頭孢菌素，類甾醇，免疫抑制劑，抗高血壓劑，抗心率失常劑，親脂性陽離子，洗滌劑和抗憂郁劑。最終，大多數(shù)這些藥物在不同程度上沒能足夠地克服MDR，原因包括其干擾化療藥的攝入和不期望的毒性。
P-糖蛋白的MDR作用的精確機理還不清楚。但是，知道P-糖蛋白需要大大增加的ATP儲備(相對于正常細胞)以起作用。因此，如同在生長的和/或轉(zhuǎn)移的癌細胞中增加mdr表達和P-糖蛋白活性一樣，這些細胞的ATP合成和代謝也增加了。
為了使細胞生產(chǎn)ATP，它們必須維持作為ATP合成的代謝底物的腺嘌呤的來源。若腺嘌呤的天然來源不足，細胞可求助于另一可替換的途徑，其中腺嘌呤從甲基硫代腺苷(MTA)的代謝中補救。因此，在活化的P-糖蛋白的細胞中顯著增加了從頭的和補救的腺嘌呤代謝。
本發(fā)明概述已發(fā)現(xiàn)在某些癌細胞中可通過應(yīng)用從頭腺嘌呤合成的抑制劑到該細胞而防止或克服MDR。對本發(fā)明的治療敏感的癌細胞是那些不能通過MTA代謝補救腺嘌呤的。尤其是，缺失了編碼MTA酶蛋白的基因的細胞不能代謝MTA到腺嘌呤(MTA酶缺乏細胞)。在治療有效量的從頭AMP合成的抑制劑的存在下，這種細胞變得缺乏腺嘌呤并且不能產(chǎn)生足量的維持P-糖蛋白活性的ATP。
本發(fā)明提供了治療和預(yù)防MTA酶缺乏的癌中MDR的方法，其通過將MTA酶缺乏細胞和治療有效量的抑制腺嘌呤從頭合成的從頭嘌呤合成的抑制劑接觸。在本發(fā)明的方法的一個方面，嘌呤合成的抑制劑是L-亞硝基羥基丙氨酸。
也提供了治療和限制MTA酶充足癌細胞中MDR的方法。按照本發(fā)明的這一個方面，用化療劑和嘌呤合成的抑制劑的組合治療MTA酶充足癌細胞，從而在該細胞中限制MDR的獲得和維持。
在一個方面，本發(fā)明提供了測定特定的癌細胞是否是MTA酶缺乏(并從而敏感于防止MDR的治療)的方法，其通過提供測定細胞是否缺乏MTA酶的測試而進行。用于這方面的優(yōu)選的測試是檢測細胞中編碼MTA酶蛋白的基因的純合缺失測試。
還提供了用于本發(fā)明方法中的試劑盒，包括用于進行本發(fā)明的MTA酶缺乏測試的試劑和嘌呤合成的抑制劑的藥用組合物。在一個方面，提供的抑制劑是L-亞硝基羥基丙氨酸和/或其活性代謝物，L-亞硝基羥基丙氨酰AICOR。
附圖簡介

圖1A是描述L-亞硝基羥基丙氨酸和不同的化療劑(長春堿和紫杉醇)對MDR癌細胞系(MV522Q6)的影響的圖。圖1B是描述相同的藥物獲得耐受前對該細胞系(MV522)的影響的圖。比較兩者，耐受細胞系對用長春堿和紫杉醇化療的敏感性是大大降低的。然而，腺嘌呤合成的抑制劑L-亞硝基羥基丙氨酸在耐受細胞系中的效力較之于在非耐受細胞中的效力，如果不是更高，則是相同的。
圖2和3(A-B)是表示在用L-亞硝基羥基丙氨酸治療后，對MTA酶充足或MTA酶缺乏細胞系給藥各種外源MTA酶底物的效果圖。
圖4是基因組MTA酶(序列1)的核甘酸序列，其中劃出了外顯子。
圖5是圖示在每天注射L-亞硝基羥基丙氨酸后，在小鼠中的MTA酶缺乏腫瘤細胞中獲得的腫瘤生長的減少。
圖6是表示哺乳動物中腺嘌呤代謝的表。
發(fā)明詳述嘌呤合成的抑制對MDR的作用基于早期的體外研究，細菌抗生素亞硝基羥基丙氨酸的L異構(gòu)體(獲自Streptomyces alanosinicus；下文稱為“L-亞硝基羥基丙氨酸”)似乎有希望用作抗病毒和抗腫瘤劑。尤其地，據(jù)信L-亞硝基羥基丙氨酸抑制次黃苷5’-一磷酸(IMP)的腺苷酸琥珀酸合成酶(ASS)轉(zhuǎn)化為AMP，從而耗竭了AMP和ATP的靶細胞(無腺嘌呤時)。然而，L-亞硝基羥基丙氨酸在人類癌癥病人中療效的臨床研究是令人失望的(參見，例如收集于以下的資料Tyagi和Cooney，A dv.Pharmacol.Chemotherapy，2069-120，1984[迄今的結(jié)果對L-亞硝基羥基丙氨酸治療人類癌癥的功效幾乎沒提供任何幫助]；Creagan等，Cancer，52615-618，1993[Ⅱ階段的研究的總反應(yīng)率僅為4％]；Creagan等，Am.J.Clin.Oncol.，7543-544，1984[在黑素瘤病人中進行Ⅱ階段的研究；幾乎沒觀察到任何治療反應(yīng)]；VonHoff等，Invest.New Drugs，987-88，1991[在乳腺癌病人中幾乎沒觀察到任何目標(biāo)反應(yīng)])。最終，放棄了所有的L-亞硝基羥基丙氨酸用于治療癌癥的臨床試驗。
如同時待審的普通擁有的美國專利申請系列號08/612542(其全部公開內(nèi)容以參考文獻形式并入本發(fā)明，恰如其全文公開于此一樣)所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)盡管L-亞硝基羥基丙氨酸并非對所有的癌細胞都有療效，但其對MTA酶缺乏細胞有療效。雖然不限制于有關(guān)作用機制的任何具體的理論，相信L-亞硝基羥基丙氨酸治療MTA酶缺乏癌細胞的效果是由于其消除了腺嘌呤的從頭合成。由于MTA酶缺乏細胞不能通過補救途徑補救腺嘌呤，該治療的細胞變得缺乏腺嘌呤(以及隨之的ATP)并死亡。
更具體地，從頭嘌呤合成的抑制劑(L-亞硝基羥基丙氨酸，氨甲喋呤，6-巰基嘌呤，6-硫代鳥嘌呤和二去氮雜四氫葉酸)的活性在體內(nèi)通過在血漿中充足的用作AMP和ATP產(chǎn)生的底物的次黃嘌呤的補救而被繞過了。因此，迄今為止的阻斷胞內(nèi)AMP和ATP產(chǎn)生的腺嘌呤代謝途徑的藥劑的體內(nèi)效果是極差的。
然而，隨著足夠靈敏的鑒定某些人類癌細胞中編碼MTA酶的基因的純合缺失的測試的開發(fā)(參見普通轉(zhuǎn)讓的美國專利申請系列號08/827342，1997年3月26日提交，其公開內(nèi)容并入本發(fā)明)，似乎在L-亞硝基羥基丙氨酸的臨床試驗中治療的腫瘤產(chǎn)生MTA酶并因此能產(chǎn)生足量的腺嘌呤以維持AMP庫，盡管抑制了從IMP的AMP的產(chǎn)生。
盡管本發(fā)明類似地不限制于有關(guān)作用機制的任何具體的理論，相信腺苷酸缺乏也剝奪了敏感細胞的維持MDR所需的P-糖蛋白活性的充分的ATP。
為便于理解本發(fā)明，圖6提供了表示產(chǎn)生ATP的胞內(nèi)代謝途徑的表?？傊?，有三個主要的用于胞內(nèi)ATP產(chǎn)生的底物的來源。首先是通過MTA酶的甲硫腺苷到腺嘌呤的代謝。此途徑在MTA酶缺乏細胞中被阻斷。
其次是通過ASS或腺苷酸琥珀酸裂解酶(ASL)的活性轉(zhuǎn)化IMP到作為ATP產(chǎn)生的中間體的AMP。目前還沒有已知的ASL活性的抑制劑。然而，隨著ASS活性的丟失(被L-亞硝基羥基丙氨酸抑制)，IMP→AMP的轉(zhuǎn)變也基本上被消除了。
第三是次黃嘌呤對AMP的補救。然而，由于IMP→AMP的轉(zhuǎn)變發(fā)生在次黃嘌呤補救的遠端，所以IMP→AMP的ASS分解代謝的抑制阻斷了次黃嘌呤補救途徑。
在MTA酶缺乏和MTA酶充足癌細胞中治療和預(yù)防MDR的方法A．L-亞硝基羥基丙氨酸的藥理和毒理參數(shù)用治療有效劑量的嘌呤(如腺嘌呤)合成的抑制劑如L-亞硝基羥基丙氨酸，L-亞硝基羥基丙氨酰-AICOR或殺腺癌菌素，優(yōu)選是前者，治療(a)患有根據(jù)本發(fā)明的MTA酶缺乏測試(描述于普通擁有的美國專利申請系列號5571510和同時待審的普通擁有的美國專利申請系列號08/827342并概述如下)測定為MTA酶缺乏的癌；和(b)是，或?qū)⑹?，進行用已知其療效在MDR細胞中下降的藥物治療癌癥的哺乳動物宿主。
在這些病人中，嘌呤合成的抑制劑起雙重作用；即其抑制MDR并通過腺嘌呤的缺乏治療細胞起抗癌劑的作用。用其他抗癌療法的進一步的治療是可接受的，但不是必須的。然而，亞硝基羥基丙氨酸激酶抑制劑，如下述的那些，可望加強L-亞硝基羥基丙氨酸的活性，從而其與L-亞硝基羥基丙氨酸的聯(lián)用可能是臨床需要的。
用治療有效劑量的嘌呤合成的抑制劑和治療藥物治療(a)患有MTA酶充足的癌；和(b)是，或?qū)⑹?，進行用已知其療效在MDR細胞中下降的藥物治療癌癥的哺乳動物宿主。該治療藥物可包括，但不限于，長春花屬生物堿(如長春堿)，蒽環(huán)類抗生素(如阿霉素)，表鬼臼毒素(如依托泊)，紫杉烷(taxanes)(如紫杉醇)，抗生素(如放線菌素D)，抗微管藥(如秋水仙素)，蛋白合成抑制劑(如嘌呤霉素)，毒性肽(如真菌霉素)，拓撲異構(gòu)酶抑制劑(如托泊替堪)，DNA嵌入劑(如溴化乙錠)，和抗有絲分裂劑。
在這些病人中，嘌呤合成的抑制劑的主要作用是作為MDR抑制劑?；卩堰屎铣傻囊种苿┰贛TA酶充足細胞中作為抗癌劑的臨床試驗和用途的較差的結(jié)果，該抑制劑不可能對該細胞發(fā)揮顯著的抗癌作用。相反地，在本發(fā)明的此實施方案中，由其他治療劑提供抗癌治療。
盡管一般來說，嘌呤合成的抑制劑作為化療劑的臨床試驗和用途是不成功的，但其對本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供了有關(guān)這類抑制劑的劑量和毒性的參數(shù)。在靈長類動物中，在24小時內(nèi)約有75％的L-亞硝基羥基丙氨酸主要以L-亞硝基羥基丙氨酰-IMP和L-亞硝基羥基丙氨酰-AICOR的形式從尿中排出。靜脈給藥后，人的血漿清除是雙相的，t1/2α=14分鐘而t1/2β=99分鐘(其中“t1/2”是半衰期而時間(t)是大約的)。
在現(xiàn)有的臨床試驗中，毒性是劑量限制性的，包括腎毒性，口炎，食管炎，以及較少見的骨髓抑制，頭痛，惡心和低或高血壓。在高于4g/m2體重的單團給藥時發(fā)生腎毒性。并且，有兩例以分離劑量接受約350mg/m2體重/天的較高劑量的兒科病人患有肝衰竭。多重團給藥后發(fā)生口炎和食管炎。其他所觀察的反應(yīng)是患者特異性的。
一個Ⅱ期試驗對患有急性非-成淋巴細胞白血病的成人使用約125mg/m2體重的劑量連續(xù)輸注5天。該劑量限制性的毒性是粘膜炎。
然而，可預(yù)測遠低于毒性水平的劑量可用于本發(fā)明的方法。在MTA酶缺乏的癌細胞中，在有從頭嘌呤合成的抑制劑存在時的MDR的缺乏和細胞對腺嘌呤缺乏的易感性提供了敏感于用該抑制劑進行治療的細胞。因此，在以前的臨床試驗中克服MTA酶充足的和耐藥細胞所需的高劑量在本發(fā)明的方法中是不需要的，本發(fā)明的方法特異性地靶向(a)MTA酶缺乏細胞(其獨特地敏感于嘌呤合成抑制劑的治療)，或(b)同時用不是嘌呤合成抑制劑的藥物進行化療的MTA酶充足癌細胞。
假定本發(fā)明的方法的特異性，用嘌呤合成抑制劑如L-亞硝基羥基丙氨酸治療哺乳動物的合適的劑量范圍是約50mg/m2到4g/m2，最通常是約90mg/m2到125mg/m2或在給藥的24小時內(nèi)足以使血藥濃度達到1000-2000nM的劑量。為治療MTA酶缺乏細胞，在該劑量范圍的下端值的劑量在大多數(shù)情況下是足夠的，而對于MTA酶充足細胞的劑量可以提高，在后一情況下要考慮通過其他化療劑的同時給藥而置于宿主的總藥物負荷。應(yīng)用于MTA酶缺乏癌癥的治療中的化療劑以醫(yī)用劑量提供，而其又是腫瘤學(xué)領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員周知的。
優(yōu)選地，通過給藥MTA和用于腺嘌呤合成的合適的底物類似物保護非惡性的、MTA酶充足細胞免于任何暴露于嘌呤合成的抑制劑的影響。用于此方面的合適的化合物包括MTA，2’-5’二脫氧腺苷，5’-脫氧腺苷，2’-脫氧-5’-脫氧-5’甲基硫代腺苷(見于，如實施例Ⅲ)。然而，應(yīng)理解MTA酶充足細胞能自甲基硫代腺苷的代謝產(chǎn)生腺嘌呤以補充該AMP細胞庫并從而不能期望耗盡AMP/ATP到MTA酶缺乏細胞的程度。
通常，以低于已知的產(chǎn)生毒性的劑量每天給藥或連續(xù)輸注嘌呤合成的抑制劑是優(yōu)選的治療方案以增強該藥物的抗代謝物活性?？墒褂萌魏吾t(yī)用的給藥方法和給藥途徑，包括靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻腔內(nèi)和直接導(dǎo)入腫瘤細胞中。
用于本發(fā)明的藥物組合物可包括，或在治療期給藥的腺苷激酶抑制劑。合適的抑制劑包括下式的那些 其中Y是CH或N；R1是H或具有1-18個碳原子的烷基；R2是具有1-24個碳原子的O-芳?；?，N3，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或鹵素；R3是具有1-18個碳原子的O-烷基或具有6-24個碳原子的O-芳基；R4是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R6同于R3，COR3，具有2-24個碳原子的酰氧甲基或CONH2；R7是OH，具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的O-芳基；R8是OH，具有6-24個碳原子的O-芳酰基或具有6-24個碳原子的O-芳基；R9是Cl，Br，I或具有1-18個碳原子的烷基，或其鹵化的衍生物或鹽?；蛘?，可替換地，具有下式的腺苷激酶抑制劑 其中R2是H，OH，具有1-24個碳原子的O-芳酰基，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或鹵素，其中進一步地，R3是具有1-18個碳原子的O-烷基或具有6-24個碳原子的O-芳基；R4是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18個碳原子的烷基或CN；和，R6同于R3，COR3，具有2-24個碳原子的酰氧甲基或CONH2；R7是具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的O-芳基，羥基或SO3；R8是具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的O-芳基，羥基或SO3；條件是當(dāng)R7是SO3時，R8也是SO3；和，R10是具有1-18個碳原子的O-烷基，具有1-18個碳原子的O-酰基，鹵素，鄰-甲苯磺酰基或OSO2R11，其中進一步地，R11是具有1-18個碳原子的烷基或具有6-24個碳原子的芳基，或其鹵化的衍生物或鹽。
上述腺苷激酶抑制劑的效價的范圍是羥基＞氨基≥脫氧＞氟＞氯＞疊氮基。例如，上述化合物的5’-羥基和5’-氨基變體的Ki值分別為80nM和150nM。這些化合物的毒性比已知的腺苷激酶抑制劑5’-iodotubercin分別低15和75倍。在小鼠中，口服30mg/kg劑量的5’-羥基變體可有效地抑制胸膜炎模型的炎癥(Cottam等，J.Med.Chem.，363424-2430，1993；引入本文作為參考)；本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地計算出在其它哺乳動物物種中產(chǎn)生相當(dāng)?shù)目寡谆钚缘膭┝繚舛龋鶕?jù)患者的目前狀況，所給藥的化合物的效價和所使用的給藥的方法的需要而增加劑量。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道，或者能容易地確定用于本發(fā)明中的其他腺苷激酶抑制劑，如5-iodotubercin，5’-N-乙基甲酰氨腺苷，2-甲基腺苷，N-6-環(huán)己基腺苷，N-6-L-苯基異丙基腺苷，2-氯腺苷和6-甲基巰嘌呤核苷，P1，P4-(二-腺苷5’)-四磷酸和其他通過磷酰橋連接到磷?；荏w上的5’-羥基腺苷類似物(Cottam等，見上文；Lin等，Mol.Pharmacol.，34501-505(1998)Bone等，J.Biol.Chem.，2616410-16413(1986))。
可用于與本發(fā)明的藥物一起給藥的藥用載體包括無菌水或非水溶液，懸浮液和乳狀液。非水溶劑的例子是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，以及可注射的有機酯如油酸乙酯。水性載體包括水，醇/水溶液，乳狀液和懸浮液，包括鹽水和緩沖的介質(zhì)。胃腸外載體包括氯化鈉溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸化林格氏或固定油。靜脈內(nèi)賦形劑包括流體和營養(yǎng)增強劑，電解質(zhì)增強劑(如基于林格氏葡萄糖的那些)，以及類似物。藥物也可以靶向給藥系統(tǒng)形式提供，如脂質(zhì)體。也可存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑，抗氧劑，螯合劑和惰性氣體等。也可用本領(lǐng)域周知的手段凍干藥物組合物，用于隨后的重建和本發(fā)明的用途。
測定腫瘤細胞是MTA酶缺乏的或MTA酶充足的方法A．用于鑒定MTA酶缺乏細胞的多核苷酸試劑確定具體的細胞種群是否是MTA酶缺乏的優(yōu)選方法是通過雜交實驗檢測編碼MTA酶的基因自該細胞的純合缺失。依賴于核酸雜交的篩選步驟使得可能在任何生物體中檢測任何多核苷酸序列(以及，推知，任何該多核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì))，只要可得合適的探針。
適用于本發(fā)明的雜交技術(shù)的完整描述以及編碼MTA酶的基因的描述公開于同時待審的普通轉(zhuǎn)讓的美國專利申請系列號08/827，342中，其公開內(nèi)容以及任何修改以參考文獻的形式并入本發(fā)明。為便于參照，編碼MTA酶的基因的多核苷酸序列在本文中描述于所附的序列表中的序列1(SEQ.ID.No.1)和圖4中，其中基因的編碼區(qū)域以下劃線標(biāo)出。
基因組MTA酶多核苷酸位于染色體9的p21區(qū)域。有趣的是，很高百分數(shù)的具有編碼腫瘤抑制因子p16的基因的純合缺失的細胞也具有編碼MTA酶的基因的純合缺失。因此，檢測后者基因(MTA酶的)的純合缺失的一個可替換的方法是通過檢測前者基因(p16的)的純合缺失。在這方面的進一步的參考資料參見普通轉(zhuǎn)讓的同時待審的美國專利申請系列號08/227，800，其公開內(nèi)容以參考文獻的形式并入本發(fā)明。
含有大鼠的全長的基因組DNA的大腸桿菌菌株在1993年12月29日前通過郵寄保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD并且保藏號為55536，55537，55538，55539和55540。并不認為此保藏是實施本發(fā)明所必須的。然而，該保藏物會在任何時期內(nèi)保持存活或可能被適用于本公開的專利法所要求。
為了測定MTA酶基因是否已從目的細胞中純合缺失，從該宿主中得到可檢測的細胞樣品。例如，該樣品可包括例如來自宿主組織或腫瘤的體液或細胞。這種樣品可用臨床領(lǐng)域公知的方法獲得，如腫瘤細胞可通過活檢或外科切除獲得。優(yōu)選地，該細胞基本上無“污染物”；即可歪曲實驗結(jié)果的細胞，蛋白和類似的成分。例如，若實體瘤是可檢測的細胞樣品的來源，則在獲得生物樣品所進行的步驟中釋放自正常細胞的正常非惡性細胞和MTA酶被認為是污染物。這種污染物可通過常規(guī)的純化技術(shù)除去；例如用抗-MTA酶抗體的親和層析。
由于本發(fā)明的目的是檢測懷疑是MTA酶陰性的細胞的樣品中此基因的存在與否，優(yōu)選地擴增該樣品中的核酸以增強檢測方法的敏感性。優(yōu)選地通過使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)完成此擴增，盡管在聚合步驟中使用鏈式反應(yīng)并非絕對需要。
在樣品中待擴增的核酸由基因組或野生型DNA組成，該DNA若存在于樣品中通?？赏幋aMTA酶(參見序列1)。據(jù)信編碼MTA酶的DNA(以下稱為“靶DNA”)存在于包括人類細胞的所有的正常的哺乳動物細胞中。
對于用作對照或寡核苷酸探針和引物的源泉，編碼MTA酶的基因組DNA可按本領(lǐng)域周知的方法分離，如在Maniatis等，在分子克隆實驗室手冊(冷泉港實驗室，1982)所說。本文提供了證明人類MTA酶基因的基因組克隆的分離的工作實施例，其中用MTA酶cDNA寡核苷酸探針篩選粘?；蛭膸?參見實施例Ⅲ)。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到可使用得到編碼MTA酶的DNA的其他合適方法。
例如，可通過將各種衍生于cDNA的mRNA注射入卵母細胞，給予足夠的時間用于發(fā)生cDNA基因產(chǎn)物的表達，并檢測所需的cDNA表達產(chǎn)物的存在，例如，通過使用目的多核苷酸編碼的肽的特異性抗體或通過使用重復(fù)基序和目的多核苷酸編碼的肽的特征性組織表達模式的探針?；蛘撸墒褂迷撾牡奶禺愋钥贵w間接篩選cDNA文庫的具有至少一個表位的目的肽(如MTA酶蛋白)的表達。該抗體可為多克隆或單克隆衍生的并用于檢測指示目的cDNA的存在的表達產(chǎn)物(見于，為進一步參照，Maniatis等，分子克隆實驗室手冊(冷泉港實驗室，紐約，1982))。
用作本發(fā)明的對照、探針或引物的多核苷酸也可使用本領(lǐng)域周知的技術(shù)和核酸合成設(shè)備合成。在這方面的參照，見于Ausubel等，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，第2和4章(Wiley Interscience，1989)。
B．?dāng)U增編碼MTA酶的基因組DNA和為此的雜交檢測為了增強本發(fā)明的雜交檢測的敏感性，待測的細胞樣品優(yōu)選地需經(jīng)受有益于靶核苷酸的選擇性擴增的條件。優(yōu)選地，靶核苷酸會是編碼MTA酶的基因的核苷酸部分(即“靶核苷酸”)。擴增該靶核苷酸的優(yōu)選的方法是通過PCR。
PCR是使用雜交到特異的核酸序列并位于靶核酸內(nèi)的目的區(qū)域的側(cè)翼的寡核苷酸引物來酶促合成特異的DNA或RNA序列的體外方法。一系列重復(fù)的模板變性，引物退火和該退火的引物的酶促延伸的循環(huán)導(dǎo)致了在其末端以引物的5’端定義的特異性核酸片段的指數(shù)累積。在一個循環(huán)中合成的所得的產(chǎn)物(PCR產(chǎn)物)作為下一個循環(huán)的模板；結(jié)果，靶核酸拷貝的數(shù)量在每一循環(huán)中約加倍。
基本的PCR技術(shù)描述于授予Mullis等的美國專利4，683，195和4，683，202中，其公開內(nèi)容以PCR性能的常規(guī)技術(shù)的例子并入本發(fā)明。然而，本發(fā)明并不想被限制到授予Mullis等的’202專利教導(dǎo)的PCR技術(shù)的使用。自從Mullis等的技術(shù)的開發(fā)，已開發(fā)了許多利用該技術(shù)的改進的基于PCR的檢測。這些改進是本領(lǐng)域周知的并因此沒在本文中詳述。然而，為了說明本領(lǐng)域中該技術(shù)的范圍的目的，下文描述了幾個這樣的改進。
美國國家科學(xué)院院刊，美國(1990)872725-2729(Gilliland等，作者)中描述了使用序列和大小不同于靶核酸的競爭模板提供內(nèi)擴增標(biāo)準的PCR技術(shù)。普通擁有的美國專利5，747，251中描述了利用序列不同但大小相同的模板的進行“競爭性PCR”的另一技術(shù)。由于其使用了酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)分析擴增的核酸，此技術(shù)是尤其優(yōu)選的技術(shù)。美國國家科學(xué)院院刊，美國(1989)866230-6234(Saiki等，作者)中描述了使用也可應(yīng)用于本發(fā)明的方法使用位點特異性寡核苷酸檢測基因中突變或多態(tài)性的非競爭性PCR技術(shù)。這些技術(shù)都具有使用雜交探針的好處，該探針有助于消除可能發(fā)生于PCR過程中的衍生于任何非特異性擴增的假陽性結(jié)果。這些參考文獻都并入本發(fā)明。
對于進一步的背景知識，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可參閱Innis等，“PCR的最優(yōu)化”，PCR方案方法和應(yīng)用指南(學(xué)術(shù)出版社，1990)。此出版物總結(jié)了影響所需的PCR產(chǎn)物的特異性，保真性和收率的技術(shù)。
選擇寡核苷酸引物(至少一個引物對)使其會特異性雜交到MTA酶靶多核苷酸的任一側(cè)(即5’和3’)的一小段堿基對上(即“側(cè)翼區(qū)”)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本文所附的序列表中的序列1和圖4的多核苷酸序列信息無須過多的實驗即可方便地選擇合適的引物。
對于引物設(shè)計，重要的是該引物不含有可導(dǎo)致其自身雜交的互補的堿基。為了消除任何可能存在于該樣品中的污染物的擴增，優(yōu)選地設(shè)計引物以跨過外顯子(圖4中劃出了MTA酶基因的外顯子)。
如上所說，可能在該聚合步驟中不需要使用鏈式反應(yīng)以充分地擴增樣品中的核酸。例如，利用美國專利5，747，251(出處同上)所說的技術(shù)，在固相支持物上進行該聚合步驟，隨后與靶多核苷酸特異性探針雜交，該測試的靈敏度應(yīng)是可只需靶多核苷酸的單一聚合。
一旦完成了擴增步驟，檢測該PCR產(chǎn)物以確定該樣品中是否存在編碼MTA酶的基因。優(yōu)選地，雙鏈PCR產(chǎn)物會結(jié)合到固相上，這樣可通過變性分離其鏈，從而，讓序列特異性探針雜交到PCR產(chǎn)物的結(jié)合的反義鏈上以便可基本上如Kohsaka等(出處同上)所說檢測該基因?；蛘?，在加入雜交到雙鏈PCR產(chǎn)物的探針之前，從反應(yīng)環(huán)境中移出該PCR產(chǎn)物并從擴增混合物中分離。在該后者的方法中，根據(jù)本領(lǐng)域中有關(guān)選擇具體的檢測方法的周知的方法從該擴增混合物中分離PCR產(chǎn)物，如通過凝膠排阻，電泳或親和層析。
可通過使用穩(wěn)定結(jié)合到可檢測的標(biāo)記上的雜交探針實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的檢測。標(biāo)記是可導(dǎo)致檢測探針的能力的與核酸探針共價或穩(wěn)定結(jié)合的物質(zhì)。例如，標(biāo)記可為放射性同位素，酶底物或抑制劑，酶，不透射線物質(zhì)(包括膠態(tài)金屬)，熒光劑，化學(xué)發(fā)光分子，含上述任何標(biāo)記的脂質(zhì)體，或特異性結(jié)合對成員。一個合適的標(biāo)記不會在擴增過程中丟失決定著檢測性的性質(zhì)。
在診斷領(lǐng)域的技術(shù)人員會熟悉用于體外檢測實驗的合適的可檢測標(biāo)記。例如，適于體外使用的放射性同位素包括3H，125I，131I，32p，14C，35S。通過放射性同位素標(biāo)記的擴增的片段可直接通過γ計數(shù)器或放射自顯影圖的光密度法，結(jié)合光密度法的擴增的片段的Southern印跡檢測。合適的化學(xué)發(fā)光分子的例子是吖啶類或魯米諾。與用吖啶酯衍生的探針雜交的靶序列可通過嵌入而被保護免于水解。合適熒光劑的實例是熒光素，藻膽蛋白，稀土螯合物，丹?；蛄_丹明。
合適的酶底物或抑制劑的實例是會特異性結(jié)合到辣根過氧化物酶，葡糖氧化酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶，β-半乳糖苷酶，丙酮酸激酶或堿性磷酸酶乙酰膽堿酯酶。合適的不透射線物質(zhì)的實例是膠態(tài)金或磁性顆粒。
特異性結(jié)合對包括兩個不同的分子，其中一個分子在其表面或在空腔中有一種特異性結(jié)合到另一分子特定空間和極性組織上的區(qū)域。特異性結(jié)合對的成員通常是指配體和受體或配體和抗配體。例如，如果受體是抗體，則配體是相應(yīng)的抗原。其他特異性結(jié)合對包括激素-受體對，酶底物對，生物素-親和素對和糖蛋白-受體對。包括保留結(jié)合特異性的特異性結(jié)合對的片段和部分，免疫球蛋白的此類片段，包括Fab片段及其類似物?？贵w可為單克隆或多克隆的。如果一個特異性結(jié)合對成員用作標(biāo)記，則優(yōu)選的分離方法會包括親和層析。
如果在上述檢測中沒有檢測到擴增產(chǎn)物，則表明該樣品中的細胞是MTA酶缺乏的。由于正常(即非惡性的)細胞總會有可檢測量的編碼MTA酶的基因(即使丟失了等位基因)，發(fā)現(xiàn)細胞缺乏編碼MTA酶的基因(即具有該基因的純合缺失)意味著該檢測的細胞缺乏催化活性和催化失活的MTA酶。
然而，如需要，可用Seidenfeld等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，951861-1866(1980)；也參見下文的實施例1)所述的方法預(yù)篩選該樣品的MTA酶的催化活性。然后，本發(fā)明的檢測用于確定在該樣品中是否存在編碼MTA酶的基因。為了篩選出待檢測的樣品中細胞污染物的目的，即非惡性細胞，也測試該樣品中催化活性或催化失活的蛋白的存在?？稍谶@方面替換使用的合適的免疫檢測(即代替雜交檢測)描述于Nobori等，Cancer Res.531098-1101(1991)和同時待審的普通轉(zhuǎn)讓的美國專利申請系列號08/827，342中，其公開內(nèi)容并入本發(fā)明。
C．MTA酶缺乏細胞使用上述的檢測技術(shù)，已確定以下人類原發(fā)腫瘤是MTA酶缺乏的。應(yīng)理解此列表是癌癥類型的代表性的列表，但不是窮盡的，可用所述的檢測方法確定該癌癥類型為MTA酶缺乏的。
●急性成淋巴細胞白血病(約80％的發(fā)生率)●神經(jīng)膠質(zhì)瘤(約67％的發(fā)生率)●非小細胞性肺癌(約18％的發(fā)生率)●Urothelial tumors(如膀胱癌；發(fā)病率隨腫瘤類型而變化)基于這些數(shù)據(jù)，應(yīng)強烈懷疑MTA酶缺乏患者患有這些疾病。因此，應(yīng)常規(guī)地檢測來自這些患者的細胞樣品的MTA酶缺乏以確定該患者是否有可能受益于本發(fā)明的治療方法。
應(yīng)檢測其他癌患者的細胞樣品的MTA酶缺乏作為臨床指標(biāo)。為參照，沒有發(fā)現(xiàn)患有以下疾病的病人的原發(fā)腫瘤樣品是MTA酶缺乏的(即該癌癥是“MTA酶充足的”)●乳腺癌●結(jié)腸癌●頭頸部癌●黑素瘤●腎癌●成人非成淋巴細胞白血病●某些急性白血病(成人和青少年)已進行的用L-亞硝基羥基丙氨酸治療上述MTA酶充足癌的臨床試驗沒有顯著成功。
已充分描述了本發(fā)明，通過下述實施例例舉其實施。然而，應(yīng)理解這些實施例不限制由所附權(quán)利要求書定義的本發(fā)明的范圍。在全部實施例中使用標(biāo)準的縮寫，如“ml”表示毫升，“h”表示小時而“mg”表示毫克。
實施例Ⅰ在耐受細胞中抑制MDRMV522是人類癌細胞系；MV522Q6是有MDR的該細胞系的變種。每一細胞系與10uM的化療劑和/或L-亞硝基羥基丙氨酸接觸并生長成單層(如圖1A和1B所示)。培養(yǎng)三天后，通過減少四唑染料測定每一細胞種群中的生長與否。
圖1A示出L-亞硝基羥基丙氨酸和不同的化療劑(長春堿和紫杉醇)對MDR癌細胞系的影響(MV522Q6)。圖1B示出同樣藥物對獲得耐受前的該細胞系(MV522)的影響。比較二者，耐受細胞系對用長春堿和紫杉醇的化療的敏感性大大降低了。然而，在耐受細胞系中，腺嘌呤合成抑制劑L-亞硝基羥基丙氨酸的效能至少比所測試的其他藥劑強將近10倍。
為進一步證實這些結(jié)果，測試了得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland，USA的另外兩個細胞系A(chǔ)TCC CRL-1976；MES-SA和ATCC CRL-1977；MES-SA/Dx5。后者是前者細胞系的耐藥克隆。每一細胞系對常規(guī)化療劑(如長春堿和紫杉醇)所表現(xiàn)的耐受水平描述于Chen等，J.Biol.Chem.，2725974-5982(1997)；通常，MES-SA/Dx5是對這些藥劑高度耐受的，而MES-SA不是。
與MVS22Q6/MV522細胞系中所得的數(shù)據(jù)相同，較之于所測試的其他藥劑，L-亞硝基羥基丙氨酸更顯著地影響MES-SA/Dx5耐藥細胞系。
實施例Ⅱ用MTA酶底物保護MTA酶充足的健康細胞盡管加入MTA酶底物甲基硫代腺苷(MTA)，MTA酶缺乏的NSCLC細胞在L-亞硝基羥基丙氨酸(40uM)存在下增殖的選擇性無能在兩個細胞系，MTA酶充足的Calu-6和MTA酶缺乏的H292的比較中得以證實(圖2)。盡管有L-亞硝基羥基丙氨酸，含腺嘌呤的對照培養(yǎng)物(tAde)增殖，證實選擇性毒性是由于MTA酶缺乏細胞不能代謝MTA成腺嘌呤。
為進一步比較，加入MTA或MTA底物類似物5’-脫氧腺苷僅導(dǎo)致了MTA酶充足的A427細胞和MOLT-4細胞的生長恢復(fù)，而MTA酶缺乏的A549和CEM細胞保持生長抑制(圖3A和B)。由于MTA是精胺合成酶的反饋抑制劑，一些細胞系如MOLT-4受高濃度的抑制。這導(dǎo)致隨著增加的MTA濃度的雙相生長恢復(fù)曲線(圖3A)。
實施例ⅢMTA酶基因組克隆的克隆和部分表征如下分離人類MTA酶基因組克隆。用MTA酶cDNA基因探針，源于亞克隆MTAP-7的NotI/EcoRi片段，篩選構(gòu)建于人類胎盤DNA(Clontech)的粘?；蛭膸?。將來自該文庫的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞鋪于含氨芐青霉素(50毫克/升)的LB平板上，菌落密度為1-2×104/135×15mm平板。
進行以下步驟。從五十萬個菌落中分離出一個命名為MTAP-10的陽性菌落并通過PCR分析和直接測序進行部分表征。合成兩個引物，位于終止密碼子的上游120bp的有義寡核苷酸和位于終止密碼子的下游20bp的反義寡核苷酸，并用于PCR分析。PCR進行25個循環(huán)，每一循環(huán)由變性(92℃，1分鐘)，退火(55℃，2分鐘)和延伸(72℃，5分鐘)組成。在0．8％瓊脂糖凝膠上分離該PCR產(chǎn)物。
迄今，用上述技術(shù)鑒定的MTA酶基因中的外顯子位置以下劃線示于圖4中。
實施例Ⅳ應(yīng)用MTA酶序列特異性寡核苷酸到惡性細胞系中以檢測其中的MTA酶的存在與否為了檢測衍生于MTA酶基因組克隆(序列1)的寡核苷酸探針的用途，將其應(yīng)用于幾個已知含有MTA酶充足(Calu-6；ATCC命名號HTB-56)和缺乏細胞(A549；ATCC命名號CCL-185)的人類肺癌細胞系。如實施例Ⅲ所述分離基因組DNA并將其1微克用于PCR。
如上所述，擴增進行40個循環(huán)，每一循環(huán)由變性(92℃，1分鐘)，退火(55℃，1分鐘)和延伸(72℃，1/2分鐘)組成。在1.5％瓊脂糖凝膠上分析該PCR產(chǎn)物。在已知為MTA酶缺乏的細胞系中沒有檢測出MTA酶，而在MTA酶充足細胞系中檢測到了MTA酶。
實施例Ⅴ在每天用即定的腫瘤異種移植體注射到裸鼠后的MTAP缺乏腫瘤的L-亞硝基羥基丙氨酸抑制將107A549或A427NSCLC細胞皮下注射入6周齡Balb/c無胸腺的裸小鼠。當(dāng)腫瘤達到約0.4厘米的直徑時，開始通過每12小時腹膜下注射用L-亞硝基羥基丙氨酸或鹽水治療。
小鼠接受每次注射15毫克/公斤，7天，然后接受每次注射22.5毫克/公斤，5天。測定腫瘤大小為垂直直徑的乘積。圖5示出治療的小鼠的結(jié)果(每個細胞類型n=6[樣品大小])和對照的小鼠的結(jié)果(每個細胞類型n=4[樣品大小])。
在測試的任一計量水平?jīng)]有明顯的毒性(小鼠在測試的過程中有穩(wěn)定的重量)。通過每天兩次團劑注射給藥L-亞硝基羥基丙氨酸引起充分確定的MTAP缺乏腫瘤的大小的降低，但對MTAP-陽性細胞的生長沒有影響。
序列綜述序列1是甲基硫代腺苷磷酸化酶(MTA酶)的基因組克隆序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人The Regents of the Unlverslty of California(ⅱ)發(fā)明名稱抑制癌細胞中多重耐藥的方法(ⅲ)序列數(shù)1(ⅳ)聯(lián)系地址(A)地址Fulbright＆Jaworski L.L.P.
(B)街道865 S.Figueroa Street，29 Floor(C)城市Los Angeles(D)州CA(E)國家U.S.A.
(F)郵區(qū)碼90017-2576(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Verslon#1.30(ⅵ)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日(C)分類
(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/612，542(B)申請日1996年3月8日(ⅶ)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/176，855(B)申請日1993年12月29日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Berliner，Robert(B)注冊號20，121(C)參考/存檔號5555-502(ⅸ)電信信息(A)電話213-892-9200(B)傳真213-680-4518(2)SEQ ID No.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度3083堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述序列1CCTGGTCTCG CACTGCTCAC TCCCGCGCAG TGAGGTTGGC ACAGCCACCG CTCTGTGGCT 60CGCTTGGTTC CCTTAGTCCC GAGCGCTCGC CCACTGCAGA TTCCTTTCCC GTGCAGACAT 120GGCCTCTGGC ACCACCACTA CCGCCGTGAA GGTGAGATGA GCCCTCCCAG CCGCAGCGGT 180TCGCCTGCCG GATGCCTTCN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 240NNNNNNNNNN CCTTCAAATG TTTGTTGATT TTTATGGAAG GCTTTGAAAT ATTTGTTGAT 300TGATGTTCAG TAATTTTCAG ATTTCAAAAA AATAACTAGG GCTTGGCAGG AATGGAGAAG 360AGCATATGAA TAAATGAATT TGCTTAGAAT CTTATTTCTA ATAAAAATTA CCAAATACAA 420TAATCTTATA TGTCTTTTTC TGCTCTTAGA TTGGAATAAT TGGTGFAACA GGCCTGGATG 480ATCCAGAAAT TTTAGAAGGA AGAACTGAAA AATATGTGGA TACTCCATTT GGCAAGGTTA 540ATATCCAACT TGTGGAGACA TGTTTTNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 600TTCTCTAAGT TGTATCCTCA GACTCTTCAG ATTCCATGAG TCCTGTTGTG GTTGAACAAT 660TATAATTTAC ATACCTGTTT TTTAAATCAC TGAGTTAAAT GTCATTTTTT TCATTGCATG 720CAGCCATCTG ATGCCTTAAT TTTGGGGAAG ATAAAAAATG TTGATTGCGT CCTCCTTGCA 780AGGTATGGTA NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 840NNNNNNNNNN AAGCTTGATA CTCATCACGG GTTAACAATT TCTTCTCTCC TTCCATAGGC 900ATGGAAGGCA GCACACCATC ATGCCTTCAA AGGTCAACTA CCAGGCGAAC ATCTGGGCTT 960TGAAGGAAGA GGGCTGTACA CATGTCATAG TGACCACAGC TTGTGGCTCC TTGAGGGAGG 1020AGATTCAGCC CGGCGATATT GTCATTATTG ATCAGTTCAT TGACAGGTAA GCAGTCATAC 1080AAAATGCTTT AGGCTATTGT AGCTGGTCAT TTTCAGCTCA AATGGACGAC NNNNNNNNNN 1140NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1200GAGGTCGACG GTATCGATAA GCTTTGTAAA CAATTGTCTT TAGCTTATCC AGAGGAATTG 1260AGTCTGGAGT AAAGACCCAA ATATTGACCT AGATAAAGTT GACTCACCAG CCCTCGGAGG 1320ATGGAAAGAT GGCCTTAAAA TAAAACAAAC AAAAACCTTT TTTGCTTTAT TTTGTAGGAC 1380CACTATGAGA CCTCAGTCCT TCTATGATGG AAGTCATTCT TGTGCCAGAG GAGTGTGCCA 1440TATTCCAATG GCTGAGCCGT TTTGCCCCAA AACAAGAGAG GTGTGTAGTC TTTCTGGAAG 1500GTGTACCAGA ATAAATCATG TGGGCTTGGG GTGGCATCTG GCATTTGGTT AATTGGCAGA 1560CGGAGTGGCC CCATACCCTC ACTCAAGTTT GCTTTGTATT ATGCAAGTTT ATGGAGAGTT 1620ATTTCCTGTT GCTAATAATT TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 1680NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN AAGTGCAGCC TTAAGTTGTG CATGTGCTAG TATGTTTTGA 1740AGTTTCTGGT TTTTCTTTTC TAGGTTCTTA TAGAGACTGC TAAGAAGCTA GGACTCCGGT 1800GCCACTCAAA GGGGACAATG GTCACAATCG AGGGACCTCG TTTTAGCTCC CGGGCAGAAA 1860GCTTCATGTT CCGCACCTGG GGGGCGGATG TTATCAACAT GACCACAGTT CCAGAGGTGG 1920TTCTTGCTAA GGAGGCTGGA ATTTGTTACG CAAGTATCGC CATGGGCACA GATTATGACT 1980GCTGGAAGGA GCACGAGGAA GCAGTAGGTG GAATTCTTTT CTAAGCACAT ATAGCATGGG 2040TTTCTGGGTG CCAATAGGGT GTCTTAACTG TTTGTTTCTA TTACGTTAGT TTCAGAAAGT 2100GCCTTTCTAC AAGGTTTTGA AGTTGTTAAT ATTTTCTGTA GTTCCATTGG AAGGTAAGAA 2160CAAAGATCAA AAGAAAGAAA GAGACACTTT TACCCAAGGA TCAGTAGTGA AAATAGTACA 2220TTGTAGGCAT GTAGATGTGT TGAGAATCAT ACTAAGACTT GGGCCTTNNN NNNNNNNNNN 2280NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2340NNNNNNNNNN GAGCTCCGAA AAATGTTTTA TGACTAGCAG TGGAATTTTA AGTTCTAGTA 2400ACCTCCAGTG CTATTGTTTC TCTAGGTTTC GGTGGACCGG GTCTTAAAGA CCCTGAAAGA 2460AAACGCTAAT AAAGCCAAAA GCTTACTGCT CACTACCATA CCTCAGATAG GGTCCACAGA 2520ATGGTCAGAA ACCCTCCATA ACCTGAAGGT ASGTGTCAGC CATGGACAAC CAGGCATGTC 2580TGGAGACTCT CTATTGTCTT CTCCTCTCAC TAGCATCSCA CCCGGGGGTC CTCATGTATT 2640TTATGCCAGC CTANNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2700CTGTAGAATT TATTTAAAGT GTATGTTTCC TGCGTCCTCA CTTTGATCTA GAAAATCAAA 2760ATCTGGTTTT TTTTTTAACA AACATCTCAG TAATTACGCC AACATGTGAA TATCACTGCC 2820TCCTTTCTTC CTTTCAGAAT ATGGCCCAGT TTTCTGTTTT ATTACCAAGA CATTAAAGTA 2880GCATGGCTGC CCAGGAGAAA AGAAGACATT CTAATTCCAG TCATTTGGGA ATTCCTGCTT 2940AACTTGAAAA AAATATGGGA AAGACATGCA GCTTTCATGC CCTTGCCTAT CAAAGAGTAT 3000GTTGTAAGAA AGACAAGACA TTTGTGTGTA TTAGAGACTC CTGAATGATT TAGACAACTT 3060CAAAATACAG AAGAAAAGCA AAA 308權(quán)利要求
1．一種抑制脊椎動物宿主的靶細胞中的多重耐藥的方法，包括用治療有效量的腺嘌呤合成的抑制劑治療靶細胞，其中該治療具有耗盡靶細胞的腺苷5’-三磷酸的作用。
2．權(quán)利要求1的方法，其中的腺嘌呤合成的抑制劑是L-亞硝基羥基丙氨酸。
3．權(quán)利要求1的方法，進一步包括用化療劑或抗癌劑治療宿主。
4．權(quán)利要求1的方法，其中的靶細胞是甲基硫代腺苷磷酸酶(MTA酶)缺乏的。
5．權(quán)利要求4的方法，其中的靶細胞中的MTA酶缺乏通過如下步驟進行測定(a)采集懷疑是MTA酶缺乏的靶細胞的可測樣品；(b)加入會特異性雜交到存在于樣品中的任何編碼MTA酶的核酸的寡核苷酸探針到樣品中，其中該加入在允許該探針可檢測地雜交到存在于樣品中的任何這種核酸的條件下進行；和(c)檢測該樣品中是否存在編碼MTA酶的核酸，其中所說的核酸的存在表示該靶細胞的樣品中存在MTA酶蛋白。
6．權(quán)利要求4的方法，其中的MTA酶缺乏的宿主細胞是原發(fā)的腫瘤細胞，選自非小細胞性肺癌細胞，急性成淋巴細胞白血病細胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和Urothelial腫瘤細胞。
7．權(quán)利要求1的方法，其中的宿主是人。
8．權(quán)利要求1的方法，其中在用腺嘌呤合成的抑制劑治療該靶細胞后，將用于AMP的胞內(nèi)產(chǎn)生的底物給藥于宿主。
9．權(quán)利要求1的方法，進一步包括用腺苷激酶抑制劑治療宿主。
10．權(quán)利要求9的方法，其中的腺苷激酶抑制劑是下式的化合物 R1是H或具有1-18個碳原子的烷基；R2是具有1-24個碳原子的O-芳?；?，N3，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或鹵素；R3是具有1-18個碳原子的O-烷基或具有6-24個碳原子的O-芳基；R4是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R6同于R3，COR3，具有2-24個碳原子的酰氧甲基或CONH2；R7是OH，具有6-24個碳原子的O-芳酰基或具有6-24個碳原子的O-芳基；R8是OH，具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的O-芳基；R9是Cl，Br，I或具有1-18個碳原子的烷基，或其鹵化的衍生物或鹽。
11．權(quán)利要求10的方法，其中的腺苷激酶抑制劑是5’-羥基形式的式(1)化合物。
12．權(quán)利要求9的方法，其中的腺苷激酶抑制劑是下式的化合物 其中R2是H，OH，具有1-24個碳原子的O-芳?；琋H2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或鹵素，其中進一步地，R3是具有1-18個碳原子的O-烷基或具有6-24個碳原子的O-芳基；R4是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18個碳原子的烷基或CN；和，R6同于R3，COR3，具有2-24個碳原子的酰氧甲基或CONH2；R7是具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的芳?；鵒-芳基，羥基或SO3；R8是具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的O-芳基，羥基或SO3；條件是當(dāng)R7是SO3時，R8也是SO3；和，R10是具有1-18個碳原子的O-烷基，具有1-18個碳原子的O-?；u素，鄰-甲苯磺?；騉SO2R11，其中進一步地，R11是具有1-18個碳原子的烷基或具有6-24個碳原子的芳基，或其鹵化的衍生物或鹽。
13．權(quán)利要求12的方法，其中的腺苷激酶抑制劑是5’-羥基形式的式(2)化合物。
14．一種抑制脊椎動物宿主的靶細胞中的多重耐藥的方法，已知該靶細胞是甲基硫代腺苷磷酸酶(MTA酶)缺失的，包括用治療有效量的腺嘌呤合成的抑制劑治療靶細胞，其中該治療具有耗盡MTA酶缺失的靶細胞的腺苷5’-單磷酸的作用。
15．權(quán)利要求14的方法，其中的腺嘌呤合成的抑制劑是L-亞硝基羥基丙氨酸。
16．權(quán)利要求14的方法，進一步包括用化療劑或抗癌劑治療宿主。
17．權(quán)利要求14的方法，其中的靶細胞中的MTA酶缺乏通過如下步驟進行測定(a)采集懷疑是MTA酶缺乏的靶細胞的可測樣品；(b)加入會特異性雜交到存在于樣品中的任何編碼MTA酶的核酸的寡核苷酸探針到樣品中，其中該加入在允許該探針可檢測地雜交到存在于樣品中的任何這種核酸的條件下進行；和(c)檢測該樣品中是否存在編碼MTA酶的核酸，其中所說的核酸的存在表示該靶細胞的樣品中存在MTA酶蛋白。
18．權(quán)利要求14的方法，其中的MTA酶缺乏的宿主細胞是原發(fā)的腫瘤細胞，選自非小細胞性肺癌細胞，急性成淋巴細胞白血病細胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和Urothelial腫瘤細胞。
19．權(quán)利要求14的方法，其中的宿主是人。
20．權(quán)利要求14的方法，其中在用腺嘌呤合成的抑制劑治療該靶細胞后，將用于AMP的胞內(nèi)產(chǎn)生的底物給藥于宿主。
21．權(quán)利要求14的方法，進一步包括用腺苷激酶抑制劑治療宿主。
22．權(quán)利要求21的方法，其中的腺苷激酶抑制劑是下式的化合物 其中Y是CH或N；R1是H或具有1-18個碳原子的烷基；R2是具有1-24個碳原子的O-芳?；?，N3，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或鹵素；R3是具有1-18個碳原子的O-烷基或具有6-24個碳原子的O-芳基；R4是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R6同于R3，COR3，具有2-24個碳原子的酰氧甲基或CONH2；R7是OH，具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的O-芳基；R8是OH，具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的O-芳基；R9是Cl，Br，I或具有1-18個碳原子的烷基，或其鹵化的衍生物或鹽。
23．權(quán)利要求22的方法，其中的腺苷激酶抑制劑是5’-羥基形式的式(1)化合物。
24．權(quán)利要求21的方法，其中的腺苷激酶抑制劑是下式的化合物 其中R2是H，OH，具有1-24個碳原子的O-芳?；?，NH2，NHNH2，NHOH，OSO2NH2，NHOR3，SH，SR5，OR4，NHR6或鹵素，其中進一步地，R3是具有1-18個碳原子的O-烷基或具有6-24個碳原子的O-芳基；R4是具有1-18個碳原子的烷基或CN；R5是具有1-18個碳原子的烷基或CN；和，R6同于R3，COR3，具有2-24個碳原子的酰氧甲基或CONH2；R7是具有6-24個碳原子的O-芳酰基或具有6-24個碳原子的O-芳基，羥基或SO3；R8是具有6-24個碳原子的O-芳?；蚓哂?-24個碳原子的O-芳基，羥基或SO3；條件是當(dāng)R7是SO3時，R8也是SO3；和，R10是具有1-18個碳原子的O-烷基，具有1-18個碳原子的O-?；?，鹵素，鄰-甲苯磺酰基或OSO2R11，其中進一步地，R11是具有1-18個碳原子的烷基或具有6-24個碳原子的芳基，或其鹵化的衍生物或鹽。
25．權(quán)利要求24的方法，其中的腺苷激酶抑制劑是5’-羥基形式的式(2)化合物。
全文摘要
提供了治療和預(yù)防進行癌癥的化療的動物中多重耐藥(MDR)的發(fā)作和維持的方法,其中靶細胞耗盡了腺苷5’－單磷酸(AMP)和腺苷5’－三磷酸(ATP),使得該細胞不能支持P－糖蛋白活性。一種從宿主獲得靶細胞的種群并檢測甲基硫代腺苷磷酸酶(MTA酶)活性的缺失的方法。MTA酶降解代謝甲基硫代腺苷到腺嘌呤用于內(nèi)源拯救并入細胞內(nèi)AMP庫。用嘌呤合成的抑制劑如L－亞硝基羥基丙氨酸治療MTA酶缺乏的細胞,其使細胞缺乏腺嘌呤并抑制P－糖蛋白活性。也用嘌呤合成的抑制劑治療MTA酶充足細胞的MDR。也用其他抗癌藥治療MTA酶充足和缺乏細胞的惡性腫瘤。附圖描述了化療藥對該細胞系的作用。
文檔編號C12Q1/02GK1283234SQ98812541
公開日2001年2月7日 申請日期1998年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月23日
發(fā)明者丹尼斯·A·卡森, 霍華德·B·科塔姆, 登勉, 卡洛斯·J·卡雷拉 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會