專利名稱：：用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞的制備方法。對(duì)于生產(chǎn)基于，例如細(xì)胞系的生物制品，利用放大程序在生物反應(yīng)器中制備大量細(xì)胞將是必要的。美國(guó)專利5，017，490公開了這樣一種放大程序，其特別具有降低轉(zhuǎn)移污染風(fēng)險(xiǎn)的優(yōu)點(diǎn)。然而，該方法不適用于依賴于貼壁的細(xì)胞(因此，不適合只有固定到基質(zhì)上才生長(zhǎng)的細(xì)胞)或者包埋入基質(zhì)的細(xì)胞(例如，在多孔載體中)。美國(guó)專利4，644，912公開了一種用于生產(chǎn)生物制品(即，病毒)的依賴于貼壁的細(xì)胞的制備方法，該方法從細(xì)胞工作種子開始，然后在1升、5升、25升、150升連續(xù)增加體積的生物反應(yīng)器中進(jìn)行傳代，最后在1000升生物反應(yīng)器中或大量的150升的生物反應(yīng)器中。在所有這些傳代步驟之間，均用蛋白酶稀釋液使細(xì)胞從其載體上釋放下來(lái)。在最后一代時(shí)，進(jìn)行病毒接種。假設(shè)平均細(xì)胞周期時(shí)間約20-24小時(shí)，傳代間隔可能約3-5天。因此，為了使細(xì)胞從MWCS(生產(chǎn)商的工作細(xì)胞儲(chǔ)備庫(kù))擴(kuò)增到足夠大量的培養(yǎng)物，根據(jù)終生物反應(yīng)器的體積，總放大程序可能需要幾周。上述制備細(xì)胞的方法中，各種終生產(chǎn)批量必須從MWCS開始制備。對(duì)于巨大量生物制品的生產(chǎn)，需要利用幾個(gè)平行的培養(yǎng)線直到最大容器體積。因此這種制備程序非常耗時(shí)，并為了制備細(xì)胞和制備生物制品需要相當(dāng)大數(shù)目的生物反應(yīng)器進(jìn)行操作。本發(fā)明的目的在于，在制備用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞的過(guò)程中提供快得多的生產(chǎn)率。因此，本發(fā)明涉及制備用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞的方法，該方法為培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到所需的預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞容量，其后是重復(fù)的不連續(xù)過(guò)程a)部分預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞用于制備至少一個(gè)生產(chǎn)批量，和b)其余部分預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞用作種子，以制備至少一個(gè)后續(xù)預(yù)生產(chǎn)批量。更具體的是，本發(fā)明涉及制備用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞的方法，該方法為培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到所需的預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞容量，其后是重復(fù)的不連續(xù)過(guò)程a)轉(zhuǎn)移部分預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞，用于制備至少一個(gè)生產(chǎn)批量，和b)轉(zhuǎn)移其余部分預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞，用作種子制備至少一個(gè)后續(xù)預(yù)生產(chǎn)批量。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，從工作種子原種通過(guò)至少一步傳代，制備第一預(yù)生產(chǎn)批量。在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施方案中，制備的細(xì)胞是依賴于貼壁的。在后一種情況下，通常需要使細(xì)胞在基質(zhì)上生長(zhǎng)。在每次重復(fù)過(guò)程中，當(dāng)部分批量用于生產(chǎn)一個(gè)新批量時(shí)，另加入一定量的基質(zhì)是可取的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每次加入基質(zhì)之前，首先使至少部分細(xì)胞從其原始基質(zhì)上釋放下來(lái)。本發(fā)明使用的表示方法“生產(chǎn)批量”指用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明使用的表示方法“預(yù)生產(chǎn)批量”指用在本發(fā)明方法中制備至少一個(gè)生產(chǎn)批量(如前面的定義)和一個(gè)后續(xù)預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明使用的表示方法“生物制品”指可以從細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的任何物質(zhì)和有機(jī)體?！吧镏破贰钡膶?shí)例是病毒和蛋白質(zhì)，例如酶。本發(fā)明使用的表示方法“工作種子原種”指儲(chǔ)藏用作種子的指定祖先的一定量某種類型的細(xì)胞，所有同樣類型細(xì)胞的培養(yǎng)物來(lái)源于該種子。本發(fā)明使用的表示方法“依賴于貼壁細(xì)胞”指其合適的生長(zhǎng)和/或增殖需要附著于本發(fā)明定義的基質(zhì)的細(xì)胞。本發(fā)明使用的表示方法“基質(zhì)”指用于吸附細(xì)胞的任何顆粒物質(zhì)。本發(fā)明使用的表示方法“傳代步驟”指在細(xì)胞增殖和生產(chǎn)過(guò)程中的連續(xù)活動(dòng)，包括至少將適當(dāng)量細(xì)胞和適當(dāng)量培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)容器中，容器在適合細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的條件下保溫足以使細(xì)胞有效生長(zhǎng)和增殖的一段時(shí)間。傳代步驟經(jīng)過(guò)足以使細(xì)胞有效生長(zhǎng)和增殖的一段時(shí)間后，任選可以包括將細(xì)胞從培養(yǎng)基和/或從基質(zhì)中分離。本發(fā)明的方法與本領(lǐng)域已知的在連續(xù)過(guò)程而不是本發(fā)明的不連續(xù)過(guò)程中生產(chǎn)細(xì)胞的方法本質(zhì)不同，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。按照專利公開文本EP0417531和WO89/08701，連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用于生產(chǎn)病毒。首先，細(xì)胞在第一生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)，達(dá)到一定細(xì)胞密度后，將細(xì)胞連續(xù)地從所述第一生物反應(yīng)器加入第二生物反應(yīng)器。在該第二生物反應(yīng)器中，使病毒在細(xì)胞中生長(zhǎng)，隨后將這些病毒連續(xù)地從該第二生物反應(yīng)器中撤出。按照本發(fā)明，基本工作方法是使用母生物反應(yīng)器，用來(lái)自其中的細(xì)胞裝填生產(chǎn)生物反應(yīng)器。如果細(xì)胞是依賴于貼壁的，在各傳代步驟之后，優(yōu)選需要使細(xì)胞從其基質(zhì)上解吸附。已經(jīng)研制了大生物反應(yīng)器的胰蛋白酶消化程序用于該目的。生產(chǎn)細(xì)胞被限制在所謂ECB(擴(kuò)大細(xì)胞庫(kù))的特定和特征化傳代數(shù)目范圍內(nèi)。因?yàn)閺腤CS到生產(chǎn)細(xì)胞的放大途徑可以被大大縮短，所以所述方法允許高生產(chǎn)率生產(chǎn)；且因?yàn)椴辉傩枰叫猩a(chǎn)線，所以僅需要少得多的生物反應(yīng)器。本發(fā)明的各種實(shí)施方案如圖1所示。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞從一安瓿MWCS經(jīng)一或多步傳代擴(kuò)增到第一預(yù)生產(chǎn)批量水平。該預(yù)生產(chǎn)批量應(yīng)用的生物反應(yīng)器的大小可以從幾升工作體積到幾百升不等。接著，部分例如10-20％由此擴(kuò)增的細(xì)胞(例如，傳代X)用于重新加入生物反應(yīng)器，生產(chǎn)下一個(gè)預(yù)生產(chǎn)批量(傳代數(shù)X+1)，而將大部分的細(xì)胞(傳代X或X+1)轉(zhuǎn)移到更大尺寸的生物反應(yīng)器中，以便直接開始生產(chǎn)或者首先使其繁殖，然后開始生產(chǎn)。典型的連續(xù)生產(chǎn)線中，收獲時(shí)衍生于MWCS的細(xì)胞加倍數(shù)在一定范圍內(nèi)是預(yù)先已知的。在生產(chǎn)系統(tǒng)開始時(shí)設(shè)定最大允許代數(shù)。在本發(fā)明的方法中，最大細(xì)胞代數(shù)可以通過(guò)ECB限定。因此，生產(chǎn)代數(shù)(生產(chǎn)生物制品之前使用的細(xì)胞代數(shù))在通過(guò)ECB限定的范圍內(nèi)是無(wú)關(guān)緊要的。因此，考慮到調(diào)控限制，應(yīng)當(dāng)遵循該最大代數(shù)。結(jié)果是生產(chǎn)生物制品的特定批量是一個(gè)直接放大途徑的終產(chǎn)品。為了證明處于生產(chǎn)中ECB階段的細(xì)胞的特征(specification)是否類似于MCB(主細(xì)胞庫(kù))，需要為該目的就生長(zhǎng)特征、不同階段的偶然性、外源和內(nèi)源物質(zhì)的自由度、核學(xué)同工酶分析等進(jìn)行具體驗(yàn)證。一旦充分鑒定了該ECB特征，可以用處于MCB和ECB之間任何代數(shù)的細(xì)胞生產(chǎn)產(chǎn)品，因?yàn)榭梢约俣?xì)胞特征之間沒(méi)有改變。因此，結(jié)果是對(duì)MWCS的測(cè)試可以限于無(wú)菌性測(cè)試。這是本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)點(diǎn)。設(shè)定最大代數(shù)后，可以使用兩者之間任何階段的細(xì)胞。基于此，為了進(jìn)一步最小化細(xì)胞從MWCS擴(kuò)增到生產(chǎn)生物反應(yīng)器所需要的時(shí)間，使細(xì)胞大規(guī)模啟動(dòng)是有利的。這可以通過(guò)例如下列方式之一實(shí)現(xiàn)●可以在環(huán)境溫度(17-32℃)下使細(xì)胞在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)停于一定的代數(shù)，然后通過(guò)升高溫度和改變培養(yǎng)基使細(xì)胞復(fù)原到對(duì)數(shù)擴(kuò)增生長(zhǎng)階段，或者●可以大批冷凍細(xì)胞(溫度＜-80℃)，然后解凍，之后將它們轉(zhuǎn)移到預(yù)定體積的生物反應(yīng)器中，由此顯著減少必須的放大途徑。按照本發(fā)明的方法可以對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物實(shí)施，尤其是對(duì)依賴于貼壁細(xì)胞實(shí)施。合適的細(xì)胞類型為，例如，倉(cāng)鼠細(xì)胞(CHO、BHK-1)、猴細(xì)胞(Vero)、牛細(xì)胞(MDBK)、犬細(xì)胞(MDCK)，人細(xì)胞(CaCo、A431)或者雞細(xì)胞(CEF)。按照本發(fā)明的生物反應(yīng)器可以使用多單元的例如攪拌發(fā)酵罐、固定床發(fā)酵罐、流化床發(fā)酵罐、氣升式發(fā)酵罐、或中空纖維反應(yīng)器的單一單元。上次細(xì)胞可以，并且如果某些細(xì)胞被固定到懸浮液中的固體支持物(例如微載體、或大載體)上，甚至應(yīng)該在例如固定床、流化床或懸浮液、或者類似中空纖維中培養(yǎng)。還可以將細(xì)胞包埋入載體(例如，多孔載體)。在本發(fā)明的方法實(shí)施過(guò)程中，尤其是利用固體支持物時(shí)，細(xì)胞將從其固體支持物上釋放下來(lái)。這可以通過(guò)用于使細(xì)胞從固體支持物物上解吸附的任何方法實(shí)現(xiàn)。該后一步有益地可以應(yīng)用蛋白酶溶液進(jìn)行。任選地，該酶釋放步驟之前可以進(jìn)行一步或多步預(yù)處理步驟，例如用PBS和/或EDTA處理，以便增強(qiáng)蛋白酶解效率，和/或降低所需的蛋白酶的量。在胰蛋白酶-EDTA溶液中(LifeTechnologies，Paisly，Scotland)通過(guò)胰蛋白酶消化作用使細(xì)胞從載體上解吸附下來(lái)。載體沉淀后，將80％的解吸附細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其它3個(gè)類似大小的生物反應(yīng)器中。后者這些“生產(chǎn)”生物反應(yīng)器均含有預(yù)先加入的載體(細(xì)胞基質(zhì))。使細(xì)胞重新布居(repopulate)到載體，然后在這些生產(chǎn)生物反應(yīng)器中進(jìn)行生產(chǎn)。將“母生物反應(yīng)器”中的其它細(xì)胞重新布居到剩余的Cytodex-3載體上，并培養(yǎng)到所需細(xì)胞密度。接著通過(guò)胰蛋白酶消化作用使母發(fā)酵罐中附著于微載體的其余細(xì)胞解吸附，隨后加入新載體，并使細(xì)胞重新布居到基質(zhì)上。在起始培養(yǎng)中，將冷凍的大批細(xì)胞(總共14.4×108個(gè)細(xì)胞)接種到含每升5gCytodex和EpiSerf培養(yǎng)基的3升母發(fā)酵罐中，然后于37℃培養(yǎng)。在第1天通過(guò)更換培養(yǎng)基除去殘留的防凍劑。在第2天進(jìn)行胰蛋白酶消化，50％的細(xì)胞接受大批冷凍，其余的細(xì)胞接種到后續(xù)發(fā)酵罐的微載體上。從表1可以推斷，在第2天到第3天，細(xì)胞的確以正常速率連續(xù)生長(zhǎng)。在第4天，母發(fā)酵罐中的內(nèi)容物用胰蛋白酶消化吸附，然后再配料到其它兩個(gè)鄰接母發(fā)酵罐的發(fā)酵罐中的新微載體上(10g/1)。到第5天，出菌率(platingefficiency)約為85％。表1<tablesid="table1"num="001"><table>天3升母發(fā)酵罐3升發(fā)酵罐3升發(fā)酵罐細(xì)胞×100.000/ml細(xì)胞×100.000/ml細(xì)胞×100.000/ml0NOD16.6214315.543055.51010出菌率85％85％85％</table></tables>實(shí)施例5從小規(guī)模母發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移到大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵罐利用5gCytodex/升的微載體密度，在65升和550升發(fā)酵罐(工作容積分別為50升和250)中，將細(xì)胞放大到大規(guī)模。如表2所示，總細(xì)胞中的90％從800.000個(gè)細(xì)胞/ml的50升發(fā)酵罐培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到大規(guī)模發(fā)酵罐(69％證明具有生存力)。在50升母發(fā)酵罐中發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果，約69％的再增殖細(xì)胞證明具有生存力。過(guò)程如下第0天，使載體在50升細(xì)胞培養(yǎng)物中靜置，除去上清液(培養(yǎng)基)后，替換為PBS。將發(fā)酵罐中的內(nèi)容物攪拌5-15分鐘。載體沉降后，除去上清液。如果需要可以重復(fù)該步驟。接著用PBS/EDTA重復(fù)該步驟(0.4gEDTA/升PBS)。再次攪拌該培養(yǎng)物5-15分鐘，使載體沉降，除去上清液，重復(fù)PBS/EDTA步驟，直到細(xì)胞變圓，易于被胰蛋白酶解吸附。然后將胰蛋白酶(0.025％終濃度)加入PBS/EDTA，保溫5-15分鐘。接著轉(zhuǎn)移(如實(shí)施例9)含上清液的細(xì)胞(此時(shí)的“裸”載體沉降后)或者轉(zhuǎn)移細(xì)胞加載體的混合物(總混合物的80％)。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到550升發(fā)酵罐，重新用培養(yǎng)基灌注50l發(fā)酵罐后，使其余的細(xì)胞(因此，10％的存活細(xì)胞)再次布居于仍然留在發(fā)酵罐中的載體。約70％的細(xì)胞證明具有生存力。表2<tablesid="table2"num="002"><table>天50升培養(yǎng)物250升培養(yǎng)物細(xì)胞×100.000/ml細(xì)胞×100.000/ml08(400×108個(gè)總細(xì)胞)1.1(275×108個(gè)存活細(xì)胞)10.822.933.448.9518.0</table></tables>實(shí)施例6類似于實(shí)施例5，但是將80％的結(jié)合載體的細(xì)胞的培養(yǎng)物從母生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)生物反應(yīng)器。添加病毒后，開始生產(chǎn)。當(dāng)物理上分離的生產(chǎn)生物反應(yīng)器正在生產(chǎn)時(shí)，使母發(fā)酵罐中剩余的20％細(xì)胞和載體胰蛋白酶消化，解吸附，向母生物反應(yīng)器中添加新基質(zhì)后，使細(xì)胞重新布居在母生物反應(yīng)器中。1天后，附著于載體的活細(xì)胞量為0.45×106個(gè)細(xì)胞/ml，從該密度后細(xì)胞開始生長(zhǎng)。當(dāng)密度達(dá)到2.8×106個(gè)細(xì)胞/ml時(shí)，通過(guò)胰蛋白酶消化使細(xì)胞從其載體上解吸附，其中80％轉(zhuǎn)移到50升工作體積的發(fā)酵罐(載體5g／l)中。從表3可以推斷出，在第1天，細(xì)胞大批冷凍后，活細(xì)胞量約為45％。相對(duì)于轉(zhuǎn)移細(xì)胞的總量，胰蛋白酶解吸附后，存活率為71．4％。表權(quán)利要求1．用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞的制備方法，通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到所需的預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞容量，其后是重復(fù)的不連續(xù)過(guò)程a)部分預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞用于制備至少一個(gè)生產(chǎn)批量，和b)其余部分的預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞用作種子，制備至少一個(gè)后續(xù)預(yù)生產(chǎn)批量。2．按照權(quán)利要求1的方法，其中重復(fù)的不連續(xù)過(guò)程為a)轉(zhuǎn)移部分預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞，用于制備至少一個(gè)生產(chǎn)批量，和b)轉(zhuǎn)移其余部分的預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞，用作種子制備至少一個(gè)后續(xù)預(yù)生產(chǎn)批量。3．按照權(quán)利要求1或2的方法，特征在于第一預(yù)生產(chǎn)批量從工作種子原種通過(guò)至少一個(gè)傳代步驟而制備。4．按照權(quán)利要求1-3之一的方法，特征在于細(xì)胞是依賴于貼壁的。5．按照權(quán)利要求2的方法，特征在于細(xì)胞是依賴于貼壁的，細(xì)胞生長(zhǎng)在基質(zhì)上，且在每次轉(zhuǎn)移步驟之前，細(xì)胞從其基質(zhì)上釋放。6．按照權(quán)利要求1-5之一的方法，特征在于目的生物制品是病毒。全文摘要本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞的制備方法,該方法為培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到所需的預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞容量,其后是一個(gè)重復(fù)的不連續(xù)過(guò)程:a)部分預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞用于制備至少一個(gè)生產(chǎn)批量,和b)其余部分預(yù)生產(chǎn)批量的細(xì)胞用作種于生產(chǎn)至少一個(gè)后續(xù)預(yù)生產(chǎn)批量。文檔編號(hào)C12N5/00GK1283223SQ98812635公開日2001年2月7日申請(qǐng)日期1998年12月17日優(yōu)先權(quán)日1997年12月24日發(fā)明者R·布蘭茲申請(qǐng)人:杜菲爾國(guó)際開發(fā)有限公司