專利名稱：人胰島素原的制備方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人胰島素原的制備方法，更具體地說，如下列化學(xué)式(Ⅰ)所代表的人胰島素原的制備方法 其中，R是可以被酶或化學(xué)降解的氨基酸殘基或肽，和倘若從A-1到A-21的區(qū)域是胰島素A鏈，從B-1到B-30的區(qū)域是胰島素B鏈，X是胰島素A鏈中A-1氨基和胰島素B鏈中B-30羧基之間的鍵，其可以通過酶法或化學(xué)法從A鏈或B鏈中分離。
在化學(xué)式(Ⅰ)中，存在由A鏈和B鏈中的6個(gè)半胱氨酸殘基形成的3個(gè)二硫鍵(A-6和A-11之間，A-7和B-7之間，以及A-20和B-19之間)。
現(xiàn)有技術(shù)描述一般，在通過包括將結(jié)構(gòu)基因插入大腸桿菌(E．coli)質(zhì)粒DNA步驟的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)成熟胰島素(“胰島素”)過程中，已經(jīng)制備了人胰島素前體(“胰島素原”)。
如

圖1所示，含胰島素原的融合蛋白質(zhì)在大腸桿菌中以內(nèi)含體的形式表達(dá)，細(xì)胞溶解后，通過離心獲得的內(nèi)含體用非離子型或離子型去污劑，或者用低濃度變性劑清洗。重復(fù)進(jìn)行該處理并進(jìn)行離心，以使所需蛋白質(zhì)的純度增加(參見Mukhopadhyay，A．等，生物化學(xué)工程／生物技術(shù)進(jìn)展(Advances in Biochemical Engineering／Biotechnology)，56，61-108，1997)。為了減小分子間疏水作用力和不正確二硫鍵的形成，將清洗后的內(nèi)含體溶解于變性劑，例如含有還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或2-巰基乙醇)的脲或胍·鹽酸溶液中，或者溶解于NaOH中(參見Fischer等，生物技術(shù)和生物工程(Biotechnology & Bioengineering)41，3-13，1993)。將溶解的內(nèi)含體高速離心，用冷水稀釋上清液，以便提取作為沉淀的內(nèi)含體(參見EP 0 055 945 A2)。由此獲得的內(nèi)含體含有由胰島素原和異源蛋白質(zhì)(例如β-半乳糖苷酶，其通過支鏈連接到蛋氨酸殘基上)構(gòu)成的融合蛋白。用溴化氰(CNBr)處理融合蛋白質(zhì)，存在于胰島素原中的六個(gè)(6)-SH基取代為-SSO3-基，之后得到胰島素原S-磺酸鹽。該磺酸化步驟導(dǎo)致胰島素前體的穩(wěn)定性增加，以及后期重折疊反應(yīng)的效能增加(參見EP 0055945 A2)。利用例如2-巰基乙醇、DTT等還原劑，或氧化還原系統(tǒng)例如谷胱甘肽使胰島素原S-磺酸鹽重折疊，使其具有天然構(gòu)象(參見Fischer等，生物技術(shù)和生物工程41，3-13，1993)。通過用胰蛋白酶和羧肽酶B處理而去除連接A鏈和B鏈的X(或C鏈)，使上述得到的天然胰島素原轉(zhuǎn)化成有生物活性胰島素(參見Kemmler W．等，J．B．C．，246，6786-6790，1971)。最后，胰島素通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)等純化(參見Kroeff，E．P．，等，色譜雜志(J．Chromatogr．)，461，45-61，1989)，并通過Zn-結(jié)晶化技術(shù)進(jìn)行結(jié)晶(參見Mirsky，等，臨床研究雜志(J．Clinical Investigation)42，1869-1872，1963；Brader M．L．，TIBS，16，341-345，1991)。
然而，已證明制備胰島素原或胰島素的常規(guī)方法在以下幾個(gè)方面不令人滿意其需要復(fù)雜的溶解和磺化、純化、濃縮和脫鹽步驟；和其采用的是一種低效率的重折疊反應(yīng)，該反應(yīng)導(dǎo)致所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)量降低。因此，有足夠的原因需開發(fā)和研制一種以簡便有效同時(shí)保留其生物活性的方式制備胰島素原或胰島素的改進(jìn)方法。
發(fā)明概述本發(fā)明人努力解決以內(nèi)含體形式表達(dá)的人重組胰島素原的常規(guī)制備方法中的問題，并成功地建立了制備人胰島素原的方法，其中溶解和磺化、純化、濃縮和脫鹽步驟大大簡化，同時(shí)增加了重折疊反應(yīng)的效率。
因此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種具有良好重現(xiàn)性的制備人重組胰島素原的簡便方法。
附圖簡述本發(fā)明的上述和其它目的以及特征通過結(jié)合附圖給出的下文描述將變得更清楚，其中圖1是顯示由在重組大腸桿菌中表達(dá)的融合人胰島素前體制備人胰島素的常規(guī)方法的示意圖。
圖2是顯示按照本發(fā)明由在重組大腸桿菌中表達(dá)的融合人胰島素前體制備人胰島素的方法的示意圖。
圖3描述了在本發(fā)明的人胰島素原制備方法中應(yīng)用的重折疊系統(tǒng)。
發(fā)明詳述按照本發(fā)明的制備人胰島素原的方法，在將內(nèi)含體溶解到脲或胍鹽酸溶液的步驟中，用連四硫酸鈉(Na2S4O4)和亞硫酸鈉(Na2SO3)處理以內(nèi)含體形式表達(dá)的人胰島素前體，其導(dǎo)致胰島素前體中的半胱氨酸殘基中的-SH基取代為-SSO3-基，得到下列化學(xué)式(Ⅱ)所示的胰島素原S-磺酸鹽，通過使該胰島素原S-磺酸鹽在含水介質(zhì)中與2-巰基乙醇反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化成化學(xué)式(Ⅰ)所示的胰島素原。 其中，R和X與前面所述的相同。
下面結(jié)合圖2和圖3更詳細(xì)地描述本發(fā)明的人胰島素原的制備方法。在制備人胰島素原的過程中，所有步驟均優(yōu)選在約4℃的低溫下進(jìn)行，當(dāng)然為了操作者方面，也可以在室溫下進(jìn)行。步驟1內(nèi)含體的純化為了制備重組人胰島素，本發(fā)明人應(yīng)用在大腸桿菌中表達(dá)的一種由經(jīng)修蝕的β-半乳糖苷酶和胰島素原構(gòu)成的融合蛋白質(zhì)(參見韓國專利
發(fā)明者洪清一, 金正優(yōu), 李旺植, 金昌圭, 金容麟, 夫濟(jì)泥, 申政祐, 吳成珍 申請人:株式會社鐘根堂