專利名稱：信號(hào)序列捕獲方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)和分離編碼具有分泌能力的肽的DNA的方法。
背景技術(shù)：
至今，已將編碼激素或生長(zhǎng)因子的基因分離并用于生產(chǎn)許多商業(yè)上作為藥的重組蛋白。它們中大多數(shù)為分泌蛋白。因此，在開(kāi)發(fā)新藥中分離編碼新型分泌蛋白的基因是一極其重要的步驟。因此，已開(kāi)發(fā)出分離編碼分泌蛋白的基因的方法。例如，Honjo等人開(kāi)發(fā)了一種方法(未經(jīng)實(shí)質(zhì)審查公開(kāi)的日本專利申請(qǐng)JP-平6-315380)，該方法利用分泌蛋白具有允許胞內(nèi)表達(dá)蛋白轉(zhuǎn)位到細(xì)胞表面的信號(hào)序列的特征。在該方法中，人體IL-2受體，一種分泌蛋白的α鏈的信號(hào)序列用相應(yīng)于來(lái)自靶細(xì)胞或組織的mRNA的5′-末端序列的短cDNA片段替換以構(gòu)建文庫(kù)，然后將它導(dǎo)入細(xì)胞中。在克隆中，IL-2受體在帶有信號(hào)序列的克隆的細(xì)胞表面上表達(dá)，但是不含信號(hào)序列的那些克隆卻不能。因此，該信號(hào)序列的存在可以通過(guò)抗-IL-2受體抗體檢測(cè)。
Genetics Institute，Inc.，(Cambridge，MA)開(kāi)發(fā)了一種利用酵母代謝酶的更復(fù)雜的系統(tǒng)(US5536637)。轉(zhuǎn)化酶，一種酵母代謝酶，是一種在培養(yǎng)基中將蔗糖裂解成葡萄糖和果糖以傳遞能量的分泌酶。不分泌該酶的突變型菌株在沒(méi)有葡萄糖但含蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。在利用該現(xiàn)象的方法中，將轉(zhuǎn)化酶基因與cDNA連接以構(gòu)建文庫(kù)，然后將其導(dǎo)入缺乏轉(zhuǎn)化酶基因的突變型酵母菌株中。將含該信號(hào)肽的克隆通過(guò)選擇能在僅含蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的克隆進(jìn)行分離。
然而，Honjo等人的方法的缺陷在于，由于使用抗體，因此在選擇陽(yáng)性克隆中需要繁復(fù)的步驟。而且，檢測(cè)靈敏度非常低。Genetics Institute，Inc.的方法的問(wèn)題還在于，不能將酵母中分泌效率差的克隆分離出來(lái)。此外，由于當(dāng)報(bào)道基因與大的蛋白融合時(shí)抗原性或酶活性可能喪失，因此這些方法僅能檢測(cè)短DNA。而且，這些方法不能檢測(cè)N-末端在細(xì)胞內(nèi)而C-末端在細(xì)胞外的Ⅱ型膜蛋白。
本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容本發(fā)明提供了一種檢查所試驗(yàn)的cDNA是否編碼具有分泌能力的肽的方法。本發(fā)明還提供了一種分離編碼具有分泌活性的肽的cDNA的方法，它能夠使用編碼長(zhǎng)肽編碼區(qū)的cDNA。
如細(xì)胞因子受體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞表面，在結(jié)合其配體時(shí)，其二聚化并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。已知蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞表面的能力(分泌能力)依賴于信號(hào)序列的存在。本發(fā)明人認(rèn)為，通過(guò)從蛋白質(zhì)中去掉信號(hào)序列(或具有附加的胞外區(qū))并用含所需肽的融合蛋白替換它，在細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白，并檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，可以檢測(cè)所需肽是否具有分泌活性。如果肽具有分泌能力，融合蛋白則轉(zhuǎn)位到細(xì)胞表面、二聚化、并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。與此相反，如果肽不含分泌活性，融合蛋白則不能轉(zhuǎn)位到細(xì)胞表面和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。因此，可以通過(guò)僅檢測(cè)細(xì)胞增殖作為指標(biāo)來(lái)檢測(cè)所融合的肽的分泌能力。而且，本發(fā)明人認(rèn)為，可以通過(guò)選擇增殖的細(xì)胞對(duì)具有分泌能力的肽進(jìn)行陽(yáng)性篩選。因此，本發(fā)明人使用mpl(血小板生成素受體)作為通過(guò)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞表面并二聚化以觸發(fā)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)，并開(kāi)發(fā)出一種檢測(cè)和分離具有分泌能力的肽的方法。
特別地，我們通過(guò)從mpl的組成活性形式去掉分泌信號(hào)和大部分胞外域制備了編碼人體mpl但沒(méi)有分泌能力的DNA，這是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的(在沒(méi)有配體的情況下通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)來(lái)改變mpl以給IL-3依賴型細(xì)胞系提供自主增殖能力；Blood 881399-1406(1996))。然后將該DNA與待檢測(cè)的cDNA、編碼已知分泌蛋白的DNA、或編碼分泌信號(hào)區(qū)被除去的分泌肽的DNA連接。所得嵌合基因在細(xì)胞中被表達(dá)，并檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，編碼用作測(cè)試cDNA的已知分泌蛋白的DNA誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，然而對(duì)編碼分泌信號(hào)區(qū)被移去的分泌蛋白的DNA來(lái)說(shuō)沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞增殖。以這種方式，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以使用如此開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)使用細(xì)胞增殖作為指標(biāo)容易地檢測(cè)并分離編碼具有分泌活性并含長(zhǎng)肽編碼區(qū)的肽的DNA。事實(shí)上，他們進(jìn)行了篩選并成功地檢測(cè)和分離了編碼包括Ⅰ型膜蛋白和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白的DNA。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種肽，其能夠在細(xì)胞表面通過(guò)二聚化誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并且缺乏分泌能力；(2)(1)中所述的肽，其中該肽得自細(xì)胞因子受體；
(3)(1)中所述的肽，其中該肽得自mpl；(4)(2)或(3)中所述的肽，其中該肽為配體非依賴型；(5)(1)中所述的肽，其中該肽包括SEQ ID NO4的氨基酸序列；(6)編碼(1)-(5)中任意一項(xiàng)所述肽的DNA；(7)含(6)中所述DNA和cDNA在該DNA的5′-上游區(qū)的克隆位點(diǎn)的載體；(8)(7)中所述的載體，其中該載體得自逆轉(zhuǎn)錄病毒；(9)(7)或(8)中所述的載體，其中將cDNA插入(6)的DNA的5′-上游；(10)攜帶(9)中所述載體的細(xì)胞；(11)(10)中所述的細(xì)胞，其中細(xì)胞為哺乳動(dòng)物的細(xì)胞；(12)一種檢測(cè)被待測(cè)試的cDNA編碼的肽是否含有分泌能力的方法，該方法包括(a)將測(cè)試cDNA與(7)的載體連接，(b)將(a)中制得的載體導(dǎo)入細(xì)胞中，和(c)培養(yǎng)(b)中制得的轉(zhuǎn)化體，并檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；(13)一種分離編碼具有分泌能力的肽的cDNA的方法，該方法包括(a)將cDNA文庫(kù)與(7)的載體連接，(b)將(a)中制得的載體導(dǎo)入細(xì)胞中，(c)培養(yǎng)(b)中制得的轉(zhuǎn)化體，并檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，和(d)選擇(c)中經(jīng)鑒定具有細(xì)胞增殖能力的陽(yáng)性細(xì)胞，并從所述細(xì)胞中分離該cDNA；(14)一種(12)或(13)中所述的方法，其中所述載體來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒，并且待導(dǎo)入載體的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞；(15)用(13)的方法分離編碼具有分泌能力的肽的cDNA；和(16)由(15)中所述的cDNA編碼的肽。
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)編碼具有分泌能力的肽的DNA的方法。該檢測(cè)方法的特征是使用一種編碼能夠在細(xì)胞表面通過(guò)二聚化誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并缺乏分泌能力的肽的DNA，來(lái)檢測(cè)具有分泌能力的肽。這里，“能夠在細(xì)胞表面通過(guò)二聚化誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的肽”包括mpl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644(1992))，GM-CSF的α鏈或β鏈(Blood 832802(1994))，紅細(xì)胞生成素受體(Nature 348647(1990))，c-kit受體(Blood 85790(1995))和neu(Nature 339230(1989))，但不限于此。在本發(fā)明的方法中，構(gòu)建一cDNA以編碼上面去除了分泌能力的肽。通常通過(guò)刪除含信號(hào)序列的區(qū)域除去分泌能力。例如，人體mpl的信號(hào)序列是相應(yīng)于蛋白質(zhì)氨基酸序列中1-25位置的區(qū)域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644(1992))，人體GM-CSF的β鏈的信號(hào)序列是相應(yīng)于1-48位置的區(qū)域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879655-9659(1990))。優(yōu)選地，也將胞外域從肽中刪除。
經(jīng)構(gòu)建的cDNA編碼的肽優(yōu)選為配體非依賴型(如果肽為配體依賴型，它可能喪失配體結(jié)合能力并在創(chuàng)建融合蛋白之后失活)。例如，創(chuàng)建配體非依賴型肽的方法應(yīng)在肽中引入突變。在mpl的情況下，將Ser 498取代為Asn可以去除對(duì)配體和血小板生成素的依賴性(Blood 881399-1406(1996))。本發(fā)明方法中所用的mpl優(yōu)選包括SEQ ID NO4中所述的氨基酸序列。
將如上所述制備的DNA插入適宜的表達(dá)載體中。對(duì)該表達(dá)載體沒(méi)有限制，優(yōu)選是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，能通過(guò)病毒感染高效地將其引入各種細(xì)胞中，并在細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)插入載體中的DNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的例子包括加工為用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建體的載體，如pBabeX(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，929146-9150(1995))或pMX(Exp.Hematol.24324-329(1996))。同樣，可以使用例如腺病毒、EB病毒和乳頭瘤病毒的病毒載體，或例如pEF-BOS(Nucleic Acid Res.18(17))和pcD SRα296(Mol.Cell.Biol.Jan.466-472(1988))的質(zhì)粒載體。該表達(dá)載體應(yīng)在上面DNA插入體的5′-上游具有待測(cè)試其分泌能力的cDNA的克隆位點(diǎn)以表達(dá)融合蛋白。創(chuàng)建cDNA克隆位點(diǎn)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
接下來(lái)，將所制備的載體與待測(cè)試的cDNA連接。將該測(cè)試的cDNA連接到“編碼能夠在細(xì)胞表面通過(guò)二聚化誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的肽的DNA”的5′-上游中，將其插入載體中。該測(cè)試cDNA可以是任意編碼具有待試驗(yàn)分泌能力的肽的cDNA。該測(cè)試cDNA可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法與載體連接。例如，使用T4 DNA連接酶經(jīng)過(guò)銜接子或連接子的連接方法(Maniatis T.，MolecularCloning)。
然后將所制備的載體引入細(xì)胞中。對(duì)引入載體中的細(xì)胞沒(méi)有限制，包括細(xì)胞因子依賴型增殖細(xì)胞如Ba/F3、OTT-1、FDCP-1和TF-1細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)方法可以將載體引入細(xì)胞中，這些標(biāo)準(zhǔn)方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法和電穿孔法。在逆轉(zhuǎn)錄病毒感染-介導(dǎo)的引入法中，將載體引入包裝細(xì)胞并整合成病毒顆粒?？梢允褂美缌姿徕}法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的標(biāo)準(zhǔn)方法引入載體。例如，可以使用如BOSC23、Bing(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908392-8396(1993))、NX-E和NX-A細(xì)胞(Nolan G.P.Immunity 8461-471(1998))作為包裝細(xì)胞。
接下來(lái)，將這樣制得的轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)并檢查其增殖能力。當(dāng)由插入載體中的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)被表達(dá)成具有配體非依賴型活性細(xì)胞因子受體的融合蛋白時(shí)，在缺乏細(xì)胞所依賴的細(xì)胞因子(配體)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體。如果檢測(cè)到顯著細(xì)胞增殖，那么判斷該測(cè)試cDNA為編碼含有分泌能力的肽的“陽(yáng)性克隆”?；蛘?，如果沒(méi)有檢測(cè)到顯著細(xì)胞增殖，判斷該cDNA為編碼缺乏分泌能力的肽的“陰性克隆”。當(dāng)由插入的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)被表達(dá)為具有配體依賴型細(xì)胞因子受體的融合蛋白時(shí)，在存在配體的情況下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體。如果必要的話，在與沒(méi)有配體情況下的陰性對(duì)照比較之后，如果檢測(cè)到顯著的細(xì)胞增殖，則判斷該測(cè)試cDNA為“陽(yáng)性克隆”。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)載體所插入的細(xì)胞類型以及待表達(dá)的融合蛋白的性質(zhì)適當(dāng)選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的其它條件。
本發(fā)明還涉及一種分離編碼含有分泌能力的肽的cDNA的方法。在該方法中，將cDNA文庫(kù)連接到載體中，而不是上面用于檢測(cè)編碼含分泌能力的肽的cDNA的測(cè)試cDNA。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，將使用隨機(jī)引物制備的cDNA與BstXI銜接子連接并插在兩個(gè)BstXI位點(diǎn)之間；一個(gè)是載體的，另一個(gè)插在活性mpl的胞外切割位點(diǎn)中。cDNA文庫(kù)的來(lái)源不被限制在任意具體的一個(gè)上，但可以是能從其中分離出含分泌能力的所需肽的細(xì)胞或組織。可以使用許多標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。在本方法中，判斷能夠增殖的細(xì)胞選自引入cDNA文庫(kù)的細(xì)胞。在所選細(xì)胞中含有的cDNA被假定為編碼具有分泌能力的肽。例如，通過(guò)提取基因組DNA或RNA、通過(guò)PCR使用被設(shè)計(jì)成包含克隆位點(diǎn)的引物將感興趣的cDNA擴(kuò)增(在為RNA的情況下，使用逆轉(zhuǎn)錄酶將其轉(zhuǎn)變成DNA之后進(jìn)行)、以及回收該產(chǎn)物可以從其增殖已被檢測(cè)的細(xì)胞中分離出cDNA。
所回收的cDNA是否為全長(zhǎng)還是片段，或者它是否為編碼新型分泌肽的cDNA，可以將該cDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的那些蛋白質(zhì)進(jìn)行比較來(lái)進(jìn)行分析。如果該cDNA不是全長(zhǎng)，常常篩選二級(jí)cDNA文庫(kù)以分離全長(zhǎng)cDNA?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法構(gòu)建該二級(jí)cDNA文庫(kù)，例如文獻(xiàn)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition.Sambrook J.等人，(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)中所述的那些。
可以利用通過(guò)本發(fā)明的方法分離的編碼具有分泌能力的肽的cDNA生產(chǎn)用于醫(yī)藥或相關(guān)疾病的基因治療中的重組蛋白。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法生產(chǎn)來(lái)自該分離cDNA的重組蛋白。例如，將該cDNA插入到適宜載體中，這些載體例如有pED(Kaufman等人，Nucleic Acids Res.194484-4490(1991))、pEF-BOS(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.185322(1990))、pXM、pJ13和pJL4(Gough等人，EMBO J.4645-653(1985))，將該載體引入宿主細(xì)胞，培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體以使其表達(dá)重組蛋白，并純化該重組蛋白。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示了用于檢測(cè)分泌能力的肽和通過(guò)表達(dá)該肽檢測(cè)BAF/03細(xì)胞的細(xì)胞因子非依賴型增殖能力的結(jié)果。
下面參照實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但并不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限制其中。
實(shí)施例1.載體構(gòu)建在小鼠骨髓增殖白血病病毒中，將env連接到包括由從跨膜結(jié)構(gòu)域到N-末端的56個(gè)氨基酸組成的胞外域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)域的小鼠mpl上。進(jìn)行PCR以獲得編碼人體mpl的相應(yīng)區(qū)域的cDNA，該區(qū)域從Leu(449)到終止密碼子(636)，緊靠在該Leu(499)前面是NotI位點(diǎn)(單個(gè)核苷酸插入)以及緊靠在終止密碼子之后是SalI位點(diǎn)，以便為如下所示的GM-CSF cDNA框架中。將該″pBabeX MPLM″(Blood 881399-1406.(1996))，活性人體mplcDNA在其中克隆，用作模板。所用引物列于表1中。
表1Not v-mpl (SEQ ID NO1)(TGCGGCCGCCCTGGAGCTGCGCCCGCGATCCTGCTACCGTTTA)NotI mpl序列MPL Sal(SEQ ID NO2)(GTATGTCGACTCAAGGCTGCTGCCAATAG)SalI使用GeneAmpPCR系統(tǒng)(Perkin Elmer)在含10μg/ml模板DNA、1μM各種引物、50U/ml KOD DNA聚合酶(TOYOBO)、1mM MgCl2、0.2mMdNTPs、120mM Tris-HCl(pH8)、10mM KCl、6mM(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100和10μg/ml BSA的反應(yīng)混合物中在以下條件下進(jìn)行PCR在98℃下變性60秒，接著在98℃下15秒、60℃下10秒和74℃下30秒循環(huán)25次。在瓊脂糖膠上電泳分析該P(yáng)CR產(chǎn)物，切除含0.6kb感興趣的片段凝膠片提取DNA。然后在該DNA的5′-末端用T4多核苷酸激酶(TOYOBO)使其磷酸化，并使用T4 DNA連接酶(TOYOBO)將其與用SmaI(TaKaRaShuzo)和細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP；TaKaRa Shuzo)預(yù)處理過(guò)的pBluescript SK(-)載體(Stratagene)連接。用ABI PRISM 310遺傳分析儀(Perkin Elmer)證實(shí)插在所得質(zhì)粒中的活性mpl cDNA的核苷酸序列。該質(zhì)粒用NotI(TaKaRa Shuzo)和SalI(TaKaRa Shuzo)消化并在瓊脂糖凝膠上電泳分離，分離出一條0.6kb片段。使用T4 DNA連接酶將該片段與pMX(Proc.Natl.Acad.Sci.USA929146-9150.(1995))連接以獲得pMX v-mplM，其中pMX也用NotI和SalI消化，用BAP處理，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化過(guò)。該質(zhì)粒pMX v-mplM含編碼缺乏分泌能力的活性mpl的cDNA。該cDNA插入體的核苷酸序列和由該cDNA編碼的肽的氨基酸序列分別顯示在SEQ ID NO3和NO4中。
接下來(lái)，為了獲得其中終止密碼子用NotI位點(diǎn)替換的人體GM-CSFcDNA，使用含人體GM-CSF cDNA的pcDSRα298 hGM-CSF(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824360-4394(1985))作為模板進(jìn)行PCR。所用引物示于表2中。
表2EcoGMss(SEQ ID NO5)(CGAATTCAAAGTTCTCTGGAGGATG)EcoRIEcoGM(SEQ ID NO6)(CGAATTCGCCGCCACCATGGCACCCGCCCGCTCGCCC)EcoRIGM Not(SEQ ID NO7)(AGCGGCCGCCTCCTGGACTGGCTCCCA)NotI將EcoGM設(shè)計(jì)成具有翻譯起始密碼子ATG代替Ser(17)，而且與在EcoGMss和EcoGM中一樣，EcoRI位點(diǎn)和Kozak共有序列(J.Cell Biol.10829.(1989))緊靠在ATG密碼子前面。將EcoGMss和GM Not的引物對(duì)用于PCR以擴(kuò)增含信號(hào)序列的GM-CSF，將EcoGM和GM Not用于擴(kuò)增缺乏信號(hào)序列的GM-CSF。除了使用55℃作為退火溫度外，如上所述進(jìn)行PCR，將該產(chǎn)物克隆成pBluescript SK(-)。使用ABI PRISM 310遺傳分析儀(Perkin Elmer)證實(shí)DNA插入體的核苷酸序列。然后用EcoRI(TaKaRa)和NotI消化該質(zhì)粒并將其插入如上所述的pMX v-mplM的EcoRI-NotI位點(diǎn)，獲得″pMX GM(+)v-mplM″和″pMX GM(-)v-mplM″。該″pMX GM(+)v-mplM″和″pMX GM(-)v-mplM″分別在從Leu(449)開(kāi)始的活性mpl的C-末端部分和有信號(hào)序列或沒(méi)有信號(hào)序列的整個(gè)GM-CSF之間編碼融合蛋白。其cDNA插入體的核苷酸序列示作SEQ ID NO8和NO10，由該cDNAs編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列示作SEQ ID NO9和NO11。
實(shí)施例2.病毒感染使用LipofectAMINE(Life Technologies)將上面各種質(zhì)粒引入包裝細(xì)胞系BOSC23(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908392-8396.(1993))。將BOSC23細(xì)胞涂布在含10％胎牛血清(FCS；JRH Biosciences)的Dulbecco′s改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；Nissui Pharmaceutical)的6-cm培養(yǎng)皿(CORNING)中。培養(yǎng)6小時(shí)之后，用減少了血清的OPTI-MEM I培養(yǎng)基(Life Technologies)洗滌細(xì)胞。分別地，將稀釋在200μl OPTI-MEM I中的LipofectAMINE(18μl)與3μg稀釋在200μl OPTI-MEM I中的每種質(zhì)粒樣品混合。使所得混合物在室溫下靜置15分鐘，與1.6ml OPTI-MEM I混合，然后添加到細(xì)胞中。5小時(shí)之后，將含20％FCS的2ml DMEM添加到細(xì)胞中，將細(xì)胞再培養(yǎng)19小時(shí)。然后用含10％FCS的3ml DMEM替換培養(yǎng)基，24小時(shí)后回收培養(yǎng)基上清液。將小鼠白細(xì)胞介素-3(IL-3)和10μg/ml polybrene(1，5-二甲基-1，5二氮十一亞甲基聚甲溴化物，Sigma)加入含重組病毒的培養(yǎng)基上清液中，并且Ba/F3細(xì)胞也懸浮在其中以感染。感染24小時(shí)之后，在含10％FCS但沒(méi)有小鼠IL-3的RPMI1640(Nissui Pharmaceutical)中將該細(xì)胞洗滌兩次，在相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
在含信號(hào)序列的整個(gè)GM-CSF和活性mpl(得自pMX GM(+)v-mplM)之間含有融合蛋白的細(xì)胞以及那些含具有分泌能力的活性mpl的細(xì)胞在沒(méi)有IL-3的情況下生長(zhǎng)。相反地，在沒(méi)有信號(hào)序列的GM-CSF和活性mpl(pMXGM(-)v-mplM)之間含有融合蛋白的細(xì)胞以及其中沒(méi)有引入融合蛋白表達(dá)載體的對(duì)照Ba/F3細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)(圖1)。
實(shí)施例3.篩選合成以下的寡核苷酸(表3)，使用T4多核苷酸激酶使其5′-末端磷酸化?；旌显摴押塑账岵⒃?5℃下變性，然后通過(guò)漸漸將其冷卻到40℃退火以制備DNA序列盒。
表35′-GGCCCCAGCACAGTGGC-3′(SEQ ID NO12)5′-GGTCGTGTCACCGCCGG-3′(SEQ ID NO13)
用NotI(TaKaRa)消化并用BAP處理的pMX GM(-)v-mplM與該序列盒混合并使用T4 DNA連接酶連接。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)所得質(zhì)粒中該序列盒的方向?yàn)榘碆stXI和NotI(pMX GM(-)v-mplM2)的次序。使用TRIZOL試劑(GIBCO BRL)由大鼠成神經(jīng)細(xì)胞系MNS70制備總RNA并通過(guò)寡脫氧胸苷酸柱(Pharmacia)以制備polyA(+)RNA。用SuperScript選擇系統(tǒng)(GIBCO BRL)中所含的隨機(jī)六聚體合成雙鏈cDNA。該cDNA為平端，與BstXI銜接子(Invitrogen)相連，使用SizeSep 400旋轉(zhuǎn)柱(Pharmacia)分級(jí)分離。然后混合該cDNA并使用T4 DNA連接酶將其與用BstXI(TaKaRa)消化并用BAP處理過(guò)的pMX GM(-)v-mplM2連接。使用基因脈沖發(fā)生器(BioRad)通過(guò)電穿孔將DNA引入DH10B大腸桿菌(GIBCO BRL)中以構(gòu)建cDNA文庫(kù)。
從含cDNA文庫(kù)的重組大腸桿菌中提取質(zhì)粒并使用JETstar柱(GENOMED)純化。使用如上所述的LipofectAMINE將文庫(kù)質(zhì)粒引入BOSC23包裝細(xì)胞中。將小鼠IL-3(10 ng / ml)和10μg/ml polybrene(1，5-二甲基-1，5二氮十一亞甲基聚甲溴化物，Sigma)加入含重組病毒的培養(yǎng)物上清液中，并且將Ba/F3細(xì)胞懸浮在其中以進(jìn)行感染。感染24小時(shí)之后，用磷酸鹽緩沖液將該細(xì)胞洗滌兩次，再在含10％FCS的RPMI1640中培養(yǎng)。由在沒(méi)有IL-3情況下生長(zhǎng)的克隆制備基因組DNA，使用設(shè)計(jì)為包含cDNA插入位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR以回收該cDNA片段。
表45′-GGGGGTGGACCATCCTCTA-3′(SEQ ID NO14)5′-CGCGCAGCTGTAAACGGTAG-3′(SEQ ID NO15)使用GeneAmpPCR系統(tǒng)2400在50μl含500ng基因組DNA、500pM各種引物、2.5U TaKaRa LA Taq(TaKaRa)、2.5mM MgCl2、0.3mM dNTPs和所附緩沖液的反應(yīng)混合物中在以下條件下進(jìn)行PCR在98℃下變性60秒，接著在98℃下20秒和68℃下120秒循環(huán)30次。在瓊脂糖凝膠上電泳分離該P(yáng)CR產(chǎn)物，切下含擴(kuò)增片段的凝膠片，并純化DNA。確定從所得190個(gè)克隆中純化的DNA片段的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)150個(gè)克隆是編碼已知分泌蛋白或膜蛋白的cDNA，或其部分。發(fā)現(xiàn)其它40個(gè)克隆編碼未知分泌蛋白。將如此獲得的已知分泌蛋白的一部分示于表5中，其中“長(zhǎng)度”是指以氨基酸殘基數(shù)計(jì)所得cDNA片段ORF的長(zhǎng)度。編碼已知分泌蛋白的克隆的平均長(zhǎng)度為273個(gè)氨基酸殘基?！暗卿浱?hào)”是指在GenBank蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)。應(yīng)注明的是，本方法的背景值，如檢測(cè)編碼除分泌蛋白外的蛋白質(zhì)的cDNA或以反方向插入的cDNA為1％或更少。長(zhǎng)度登錄號(hào)名稱221 1805299 淀粉樣前體288 416630淀粉樣蛋白1350 468563淀粉樣前體樣蛋白2561 112929淀粉樣A4蛋白同源物前體161 2494287 O-乙酰GD3神經(jīng)節(jié)苷脂合酶176 2507439 多配體蛋白聚糖3(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白)218 118115Cyr61蛋白(生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白)382 3219172 膠原蛋白α1(Ⅴ)286 461671Ⅰ型膠原蛋白α1159 1082724 前列環(huán)素刺激因子259 1777354 SHPS-1.BIT254 205167120kDa唾液酸糖蛋白(肝溶酶體膜蛋白)482 1708023 K-磷脂酰肌醇蛋白聚糖224 1139548 與抽搐有關(guān)的基因產(chǎn)物6Ⅱ型前體105 135818G-蛋白偶合凝血酶受體482 129731蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶322 1172451 基底膜蛋白聚糖(基底膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)165 1709256 神經(jīng)蛋白聚糖(蛋白聚糖核心蛋白前體)264 2367641 神經(jīng)纖維網(wǎng)-2(semaphorin Ⅲ受體)211 126638賴氨酰氧化酶308 2627143 神經(jīng)鈣粘著蛋白459 3123675 Notch140 1718156 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子534 627989內(nèi)皮縮血管肽轉(zhuǎn)化酶89 114393輸送鈉/鉀的腺苷三磷酸酶β-1鏈工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種檢測(cè)和分離編碼分泌肽的cDNA的方法，該方法使用了一種能夠在細(xì)胞表面通過(guò)其二聚化引發(fā)細(xì)胞增殖但缺乏分泌能力的肽。由于該方法利用細(xì)胞增殖作為檢測(cè)指標(biāo)，因此它特別容易且靈敏。而且，與能夠檢測(cè)短DNA片段的傳統(tǒng)方法相比，該方法能夠檢測(cè)和分離含較長(zhǎng)肽編碼區(qū)的cDNA，因此它從一級(jí)分離克隆中提供了更多的信息。此外，該方法能夠檢測(cè)和分離包括Ⅰ型和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白。
序列表&#60110&#62中外制藥株式會(huì)社北村俊雄&#60120&#62信號(hào)序列捕獲方法&#60130&#62C1-902PCT&#60150&#62JP 1997-324912&#60151&#621997-11-26&#60160&#6215&#60210&#621&#60211&#6243&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#621tgcggccgcc ctggagctgc gcccgcgatc ctgctaccgt tta 43&#60210&#622&#60211&#6229&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#622gtatgtcgac tcaaggctgc tgccaatag 29&#60210&#623&#60211&#62579&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工改造的人體mpl序列&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(1)..(573)&#60400&#62 3gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct cgc tac cgt tta cag ctg 48Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu1 5 10 15cgc gcc agg ctc aac ggc ccc acc tac caa ggt ccc tgg agc tcg tgg 96Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp20 25 30tcg gac cca act agg gtg gag acc gcc acc gag acc gcc tgg atc tcc 144Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser35 40 45ttg gtg acc gct ctg cat cta gtg ctg ggc ctc aac gcc gtc ctg ggc 192Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly50 55 60ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca cac tac agg aga ctg agg 240Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg65 70 75 80cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gac ctg cac cgg gtc cta ggc cag 288His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln85 90 95tac ctt agg gac act gca gcc ctg agc ccg ccc aag gcc aca gtc tca 336Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser100 105 110gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc ctt gaa atc ctc ccc aag 384Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys115 120 125tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt tcc tcc cag gcc cag atg 432Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ala Gln Met130 135 140gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg ggg acc atg ccc ctg tct 480Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser145 150 155 160gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc tgc tgt acc acc cac att 528Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile165 170 175gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat tgg cag cag cct 570Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro180 185 190tgagtcgac 579&#60210&#624&#60211&#62190&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工改造的人體mpl序列&#60400&#624Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu1 5 10 15Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp20 25 30Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser35 4O 45Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly Leu Asn Ala Val Leu Gly50 55 60Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg65 70 75 80His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln85 90 95Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser100 105 110Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys115 120 125Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ala Gln Met130 135 140Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser145 150 155 160Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile165 170 175Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro180 185 190&#60210&#62 5&#60211&#6225&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#625cgaattcaaa gttctctgga ggatg 25&#60210&#626&#60211&#6237&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#626cgaattcgcc gccaccatgg cacccgcccg ctcgccc 37&#60210&#627&#60211&#6227&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#627agcggccgcc tcctggactg gctccca 27&#60210&#628&#60211&#621032&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的人體GM-CSF-人體mpl融合基因序列&#60220&#62&#60221&#62信號(hào)肽&#60222&#62(22)..(72)&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(22)..(1026)&#60400&#628gaattcaaag ttctctggag g atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc 51Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly15 10act gtg gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc 99Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser15 20 25acg cag ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc 147Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu30 35 40ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa 195Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu45 50 55gtc atc tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc 243Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr60 65 70cgc ctg gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc 291Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu75 80 85 90aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct 339Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro95 100 105cca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt 387Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser110 115 120ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc 435Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys125 130 135tgg gag cca gtc cag gag gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct 483Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser140 145 150cgc tac cgt tta cag ctg cgc gcc agg ctc aac ggc ccc acc tac caa 531Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln155 160 165 170ggt ccc tgg agc tcg tgg tcg gac cca act agg gtg gag acc gcc acc 579Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr175 180 185gag acc gcc tgg atc tcc ttg gtg acc gct ctg cat cta gtg ctg ggc 627Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly190 195 200ctc aac gcc gtc ctg ggc ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca 675Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala205 210 215cac tac agg aga ctg agg cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gac ctg 723His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu220 225 230cac cgg gtc cta ggc cag tac ctt agg gac act gca gcc ctg agc ccg 771His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro235 240 245 250ccc aag gcc aca gtc tca gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc 819Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu255 260 265ctt gaa atc ctc ccc aag tcc tca gag agg act cot ttg ccc ctg tgt 867Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys270 275 280tcc tcc cag gcc cag atg gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg 915Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu285 290 295ggg acc atg ccc ctg tct gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc 963Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser300 305 31Otgc tgt acc acc cac att gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat 1011Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr315 320 325 330tgg cag cag cct tgagtcgac 1032Trp Gln Gln Pro&#60210&#629&#60211&#62334&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的人體GM-CSF-人體mpl融合蛋白序列&#60400&#629Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly
1 5 10Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser15 20 25Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu30 35 40Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu45 50 55Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr60 65 70Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu75 80 85 90Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro95 100 105Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser110 115 120Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys125 130 135Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser140 145 150Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln155 160 165 170Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr175 180 185Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly190 195 200Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala205 210 215His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu220 225 230His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro235 240 245 250Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu255 260 265Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys270 275 280Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu285 290 295Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser300 305 310Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr315 320 325 330Trp Gln Gln Pro&#60210&#6210&#6021l&#621032&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的人體GM-CSF-人體mpl融合基因序列&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(16)..(972)&#60400&#6210gaattcaaag ttctctggag g atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc 51Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly15 10act gtg gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc 99Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser15 20 25acg cag ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc 147Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu30 35 40ctg aac ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa 195Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu45 50 55gtc atc tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc 243Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr6O 65 70cgc ctg gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc 291Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu75 80 85 90aag ggc ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct 339Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro95 100 105cca acc ccg gaa act tcc tgt gca acc cag att atc acc ttt gaa agt 387Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser110 115 120ttc aaa gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc 435Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys125 130 135tgg gag cca gtc cag gag gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct 483Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala 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Glu Val Glu Pro Ser Leu255 260 265ctt gaa atc ctc ccc aag tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt 867Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys270 275 280tcc tcc cag gcc cag atg gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg 915Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu285 290 295ggg acc atg ccc ctg tct gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc 963Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser300 305 310tgc tgt acc acc cac att gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat 1011Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr315 320 325 330tgg cag cag cct tgagtcgac 1032Trp Gln Gln Pro&#60210&#6211&#6021l&#62334&#60212&#62PRT&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的人體GM-CSF-人體mpl融合蛋白序列&#60400&#6211Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly1 5 10Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser15 20 25Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu30 35 40Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu45 50 55Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr60 65 70Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu75 80 85 90Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro95 100 105Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser110 115 120Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys125 130 135Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser140 145 150Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln155 160 165 170Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr175 180 185Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly190 195 200Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala205 210 215His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu220 225 230His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro235 240 245 250Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu255 260 265Leu 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權(quán)利要求
1．一種肽，它能夠在細(xì)胞表面通過(guò)二聚化誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并且該肽缺乏分泌能力。
2．權(quán)利要求1的肽，其中該肽得自細(xì)胞因子受體。
3．權(quán)利要求1的肽，其中該肽得自mpl。
4．權(quán)利要求2或3的肽，其中該肽為配體非依賴型。
5．權(quán)利要求1的肽，其中該肽包括SEQ ID NO4的氨基酸序列。
6．編碼權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的肽的DNA。
7．一種載體，其含有權(quán)利要求6的DNA和cDNA在該DNA的5′-上游區(qū)的克隆位點(diǎn)。
8．權(quán)利要求7的載體，其中該載體得自逆轉(zhuǎn)錄病毒。
9．權(quán)利要求7或8的載體，其中將cDNA插入權(quán)利要求6的DNA的5′-上游。
10．一種細(xì)胞，其攜帶權(quán)利要求9中所述載體。
11．權(quán)利要求10的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。
12．一種檢測(cè)被待測(cè)試的cDNA編碼的肽是否含有分泌能力的方法，該方法包括(a)將測(cè)試cDNA與權(quán)利要求7的載體連接，(b)將(a)中制得的載體導(dǎo)入細(xì)胞中，和(c)培養(yǎng)(b)中制得的轉(zhuǎn)化體，并檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。
13．一種分離編碼具有分泌能力的肽的cDNA的方法，該方法包括(a)將cDNA文庫(kù)與權(quán)利要求7的載體連接，(b)將(a)中制得的載體導(dǎo)入細(xì)胞中，(c)培養(yǎng)(b)中制得的轉(zhuǎn)化體，并檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，和(d)選擇(c)中經(jīng)鑒定具有細(xì)胞增殖能力的陽(yáng)性細(xì)胞，并從所述細(xì)胞中分離該cDNA。
14．權(quán)利要求12或13的方法，其中載體得自逆轉(zhuǎn)錄病毒，并且將被導(dǎo)入載體的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。
15．一種編碼具有分泌能力的肽的cDNA，其是用權(quán)利要求13的方法分離的。
16．一種肽，其是由權(quán)利要求15的cDNA編碼的。
全文摘要
一種編碼缺乏分泌能力的人體mp1的DNA,它是通過(guò)去除穩(wěn)態(tài)活性mp1的分泌信號(hào)和其胞外域主要部分制得的。該DNA與測(cè)試cDNA、編碼已知分泌蛋白的cDNA和另一編碼除去了分泌信號(hào)區(qū)域的相同蛋白的cDNA連接,所得每一種嵌合基因在細(xì)胞中表達(dá)以檢查細(xì)胞增殖能力。在含作為測(cè)試cDNA的編碼已知分泌蛋白的cDNA的細(xì)胞中檢測(cè)到細(xì)胞增殖,然而對(duì)除去了分泌信號(hào)區(qū)域的編碼相同蛋白的cDNA沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)胞增殖。因此,通過(guò)構(gòu)建cDNA文庫(kù)并通過(guò)上面的方法篩選它,可以檢測(cè)和分離編碼包括Ⅰ型膜蛋白和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白的cDNAs。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1285847SQ98812969
公開(kāi)日2001年2月28日 申請(qǐng)日期1998年11月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月26日
發(fā)明者北村俊雄, 小嶋哲郎 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社, 北村俊雄