專利名稱：突變的羥基苯丙酮酸雙氧化酶、基dna序列和含該基因且耐除草劑的植物的分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種編碼突變的羥基苯丙酮酸雙氧化酶(HPPD)的核酸序列，涉及一種含有該序列作為編碼序列的嵌合基因，以及涉及該序列在分離耐某些除草劑的植物中的應(yīng)用。
羥基苯丙酮酸雙氧化酶是催化對(duì)-羥基苯丙酮酸(HPP)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚝谒岱磻?yīng)的酶。該反應(yīng)在鐵(Fe2+)和氧存在下發(fā)生(Croach N.P.等，Tetrahedron53，20，6993-7010，1997)。據(jù)此推測(cè)，HPPD含有一個(gè)能催化此反應(yīng)的活性位點(diǎn)，其中鐵、底物和水分子連接在一起，但是這個(gè)活性位點(diǎn)迄今未被描述過。
也已知道某些分子能抑制此酶，與此酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合從而抑制HPP轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚝谒?。這類分子中的一些分子已被用作除草劑，因?yàn)橐种浦参镏械脑摲磻?yīng)將導(dǎo)致受處理植物的葉子變白和所述植物死亡(Pallett K.E.等，1997 Pestic.Sci.50 83-84)。這類以HPPD為目標(biāo)物且在現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)里揭示的除草劑是，具體說是異噁唑(歐洲專利EP 418175、EP 470856、EP 487352、EP 527036、EP 560482、EP 682659美國(guó)專利US 5424276)，特別是isoxaflutole(它是玉米的選擇性除草劑)、腈基二酮(EP 496630、EP 496631)特別是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1，3-二酮和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-2、3Cl2苯基)丙烷-1，3-二酮，三酮(EP 625505，EP 625508、US 5506195)特別是Sulcotrione，或還有吡唑啉酸鹽(pyrazolinates)。
為了使植物耐受除草劑可采用三種主要策略，即(1)用酶將除草劑或其活性代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成無毒降解產(chǎn)物，使除草劑去毒。如能耐受溴苯腈溴(bromoxynil)或草胺膦(basta)的酶(EP 242236、EP 337899)；(2)使除草劑作用的靶酶功能上發(fā)生突變，從而降低其對(duì)除草劑或除草劑活性代謝產(chǎn)物的敏感性，如耐受草甘膦(glyphosate)的酶類(EP 293356，Padgette S.R.等，J.Biol.chem.，266，33，1991)或(3)使敏感的酶過度表達(dá)，在植物中產(chǎn)生大量靶酶，即使存在其抑制物所產(chǎn)生的酶量足以對(duì)抗除草劑植物因具有足夠的有功能的酶仍可保持恒定的酶動(dòng)力學(xué)。
上述第三種策略已獲成功，獲得了耐受HPPD抑制劑的植物(WO 96/38567)?，F(xiàn)知道，這是該策略第一次將過度表達(dá)的(非突變的)敏感靶酶成功地在農(nóng)業(yè)水平上使種植物耐受除草劑。
盡管僅僅靠過度表達(dá)靶酶的策略獲得了成功，但耐受HPPD抑制劑的該系統(tǒng)仍需改進(jìn)，以便在種植耐受植物的條件下，或在農(nóng)場(chǎng)所使用的除草劑劑量下獲得這種耐受性。
本發(fā)明首先涉及到一種突變的HPPD，它是有功能的，也就是說它保留了催化HPP轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚝谒岬男阅堋⑼瑫r(shí)對(duì)HPPD抑制劑的敏感性低于未突變的天然的HPPD。
鑒于該抑制作用的競(jìng)爭(zhēng)性特點(diǎn)，可以假設(shè)，HPPD抑制劑結(jié)合于該酶的活性位點(diǎn)或活性位點(diǎn)鄰近部位，因而阻斷了HPP與該活性位點(diǎn)的結(jié)合，阻止了在鐵和氧存在下HPP的轉(zhuǎn)變。通過突變作用，限制其抑制劑與該酶活性位點(diǎn)的結(jié)合，同時(shí)保證HPP能與該活性位點(diǎn)結(jié)合，就可能獲得具有此酶功能但對(duì)HPPD抑制劑敏感性較低的突變酶。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過此酶C末端部分的突變，可能獲得具有HPPD功能但對(duì)HPPD抑制劑敏感性降低的突變酶，結(jié)果這些功能性HPPD在植物中表達(dá)，可改善種植物對(duì)HPPD抑制劑的耐受性。
因此本發(fā)明涉及一種新的有功能的突變性HPPD，它對(duì)抑制劑的敏感性降低，其C末端部分含有至少一處突變。
根據(jù)本發(fā)明，“突變”應(yīng)理解為一級(jí)序列中的一個(gè)氨基酸被另一個(gè)氨基酸所替代。下文將用“突變的氨基酸”表示該氨基酸被另一個(gè)氨基酸所替代，這是指在該蛋白質(zhì)一級(jí)序列中的突變位點(diǎn)上。
現(xiàn)有技術(shù)已揭示了幾種HPPD和它們的一級(jí)序列，具體講，有細(xì)菌如假單孢菌(Ruetschi等，Eur.J.Biochem.，205，459-466，1992，WO 96/38567)、植物如Arabidopsis(WO 96/38567、Genebank AF047834)或葫蘿卜(WO96/38567、Genebank 87257)或Coccicoides(Genebank COITRP)?；虿溉閯?dòng)物(如小鼠或豬)的HPPD。
采用本領(lǐng)域常規(guī)方法，例如Thompso，J.D.等人描述的方法(Clustal W通過序列稱重，位點(diǎn)特異性空隙罰分和加權(quán)矩陣選擇，改進(jìn)累加的多序列排列對(duì)比。Nucleic Acids Research 22；4673-4680，1994)，排列對(duì)比了這些已知的序列，并通過英特網(wǎng)訪問了用于序列對(duì)比的那些計(jì)算機(jī)程度，例如，技術(shù)人員可以根據(jù)參照序列確定這些序列的同源性，找出關(guān)鍵性氨基酸或確定共有區(qū)域，尤其是根據(jù)參照序列確定C末端和N末端區(qū)域。
就本發(fā)明而言，該參考序列是假單胞菌(Pseudomonas)序列，具體氨基酸位置都是依照假單胞菌HPPD的一級(jí)序列而確定。

圖1顯示了本技術(shù)領(lǐng)域揭示的幾種HPPD序列的排列；進(jìn)行對(duì)比的這些序列有作為參照序列的假單胞菌HPPD序列，并包括除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)(Genebank SAV11864)的HPPD序列，胡蘿卜(Daucus Carota)(Genebank DCU 87257)的HPPD序列，鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)(Genebank AF047834)的HPPD序列，玉蜀黍(Zea mais)的HPPD序列，大麥(Hordeum Vulgare)(Genebank HVAJ693)的HPPD序列，禾本科上的球腔菌屬(Mycosphaerella graminicola)(Genebank AF038152)的HPPD序列，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)(Genebank CIOTRP)的HPPD序列和小家鼠(Mus musculus)(Genebank MU54HD)的HPPD序列。此圖給出了假單胞菌序列的氨基酸編號(hào)，并用星號(hào)標(biāo)明這些序列共同的氨基酸。在這種排列對(duì)比的基礎(chǔ)上，從假單胞菌氨基酸的位置和性質(zhì)，很容易確定另一種HPPD序列中相應(yīng)氨基酸的位置(對(duì)植物、哺乳動(dòng)物和細(xì)菌不同來源的HPPD的序列對(duì)比，證明本技術(shù)領(lǐng)域人員公知的這一排列對(duì)比方法可以推廣到任何其它序列)。專利申請(qǐng)WO 97/49816中也描述了不同HPPD序列的排列比較。
HPPD的C末端部分為此酶活性位點(diǎn)所在處，與其N末端部分不同在于有一連接肽，此肽保證了此酶的穩(wěn)定性和寡聚體的形成(假單胞菌HPPD是四聚體，而植物HPPD為二聚體)。圖2顯示了假單胞菌HPPD單體三級(jí)結(jié)構(gòu)的模式圖。該結(jié)構(gòu)通過常規(guī)的蛋白晶體X射線衍射法獲得。此連接肽可以明確此酶C末端部分的N端，所述的連接肽位于假單胞菌HPPD的145-157位氨基酸之間。
因此C末端部分可界定為，一端是連接肽，另一端是此酶的C末端。HPPD的C末端部分中的突變就發(fā)生在界定的此區(qū)域內(nèi)。圖1中的序列對(duì)比顯示的所有序列中，注意到有兩個(gè)氨基酸位于假單胞菌的161和162位(D=天門冬氨酸161和H=組氨酸162)參照假單胞菌HPPD，可以確定代表HPPD C末端部分的N末端的此連接肽，位于天門冬氨酸161上游約5-15個(gè)氨基酸之間。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，用具有更大空間位阻的氨基酸，或電離的或可電離的氨基酸進(jìn)行替換來產(chǎn)生突變。較佳的，被突變的氨基酸具有弱空間位阻。根據(jù)本發(fā)明，弱空間位阻氨基酸宜理解為甘氨酸或諸如丙氨酸，胱氨酸，絲氨酸等弱空間位阻氨基酸。
具有比被替換氨基酸更大空間位阻的任何氨基酸，都可用于本發(fā)明的突變。優(yōu)選下列氨基酸亮氨酸、異亮氨酸或色氨酸，來替代突變位點(diǎn)的氨基酸。
根據(jù)本發(fā)明，電離的或可電離的氨基酸，是指具有(除進(jìn)入肽鍵的基因外)氨基，羧酸(COOH)或胺或-COO-基團(tuán)的氨基酸，具有該性質(zhì)的下述氨基酸是優(yōu)選的谷氨酰氨和谷氨酸或天冬酰氨或天門冬氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，在幾種HPPD序列的共同C末端部分中的一個(gè)氨基酸上進(jìn)行突變，可通過序列對(duì)比方法來鑒定這些序列。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案，該突變的HPPD在其C末端部分含有以下肽序列-甘-苯丙-Xaa-Yaa-Xab-天冬酰胺-苯丙-Yab-Yac亮-苯丙-其中Xaa和Xab，各自獨(dú)立地代表甘氨酸(Gly)或位阻比甘氨酸大的氨基酸，如果Xaa或Xab代表甘氨酸則另一個(gè)氨基酸不是甘氨酸，Yaa代表任一氨基酸，優(yōu)選的是丙氨酸，賴氨酸或谷氨酸，Yab代表任一氨基酸，優(yōu)選的是賴氨酸，絲氨酸，精氨酸或天冬酰胺*，Yac代表任一氨基酸，優(yōu)選的是丙氨酸，絲氨酸，谷氨酸或谷氨酰胺*。
有利的是，Xaa和Xab中至少一個(gè)是亮氨酸、谷氨酸、色氨酸或異亮氨酸。
參照假單胞菌HPPD序列，突變的氨基酸選自以下氨基酸脯215、甘298、甘332、苯丙333、甘334、甘336和天冬酰胺337，更佳的是脯215和甘336。
可以引用以下優(yōu)選的突變實(shí)例脯215亮。甘336谷、甘336色或甘336異亮。
上述突變可以配對(duì)組合，例如甘334和甘336氨基酸雙突變。
本發(fā)明還涉及編碼上述突變的HPPD的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明，“核酸序列”可以是DNA或RNA類型的核苷酸序列，優(yōu)選DNA類型尤其是雙鏈DNA，不論這是天然的還是人工合成來源的。具體的說，編碼本發(fā)明突變的HPPD的DNA序列已按照待表達(dá)它的宿主生物情況進(jìn)行過優(yōu)化，優(yōu)化的方法是本技術(shù)人員所熟知的。
編碼最初的未突變HPPD的核酸序列來源不限。具體說可以是細(xì)菌來源。優(yōu)選實(shí)例是假單胞菌屬細(xì)菌，例如，熒光假單胞菌或集胞藻藍(lán)藻菌。該核酸序列也可來源于植物。具體說，衍生自雙子葉植物，如煙草、擬南芥屬(Arabidopsis)、傘形科植物(如胡蘿卜)，或單子葉植物，如玉蜀黍或小麥，大麥。此編碼序列及其分離和克隆的方法在上述引用的參考文獻(xiàn)中有所描述，其內(nèi)容納入本文作參考。
在編碼最初未突變HPPD核酸序列中可用合適的方法進(jìn)行突變。在該所述序列中，用替代氨基酸的相應(yīng)密碼子，替代被突變氨基酸的密碼子。這些密碼子文獻(xiàn)已廣有描述并為技術(shù)人員所熟知。
幾種分子生物學(xué)方法可用于進(jìn)行這種突變。
第一種方法是在存在或缺乏誘變劑時(shí)，使培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)受HPPD抑制劑的長(zhǎng)期選擇壓力，在這種選擇壓力作用下，HPPD基因發(fā)生自發(fā)性突變。也可能在適當(dāng)誘變劑作用下，所述基因發(fā)生變化編碼出一個(gè)突變酶。在未修飾酶部分或完全受抑制的條件下，該突變酶能表達(dá)HPPD活性。培養(yǎng)細(xì)胞可以是植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。后者可表達(dá)細(xì)菌來源的天然HPPD或表達(dá)另一來源(細(xì)菌、真菌、藻類或植物)的HPPD。向某細(xì)菌導(dǎo)入另一來源的HPPD，以允許該HPPD表達(dá)的適當(dāng)形式，用于誘變?cè)摼烊籋PPD的編碼基因，該基因宜有缺失，或已被缺失。轉(zhuǎn)化細(xì)菌的方法是技術(shù)人員所熟知的，文獻(xiàn)中也廣有描述。突變方法也如此(具體見Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press.Cold Spring Harbor.New York)。
當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞是表達(dá)天然HPPD的植物細(xì)胞時(shí)，可用習(xí)慣的方法從細(xì)胞培養(yǎng)物里分離和克隆此突變HPPD，或再生出植株。所得植株能表達(dá)對(duì)HPPD抑制劑敏感性比天然HPPD低的有功能的突變HPPD。再生植株的方法文獻(xiàn)中(包括上文引用參考文獻(xiàn))廣有描述并為技術(shù)人員所熟知。
用適當(dāng)?shù)暮Y選方法選出具有對(duì)HPPD抑制劑敏感性低的突變HPPD的細(xì)胞。鑒于本發(fā)明目的，需解決的問題是要得到對(duì)抑制劑敏感性低的HPPD。采用的簡(jiǎn)單篩選方法是確定能完全抑制最初的未突變HPPD的，對(duì)表達(dá)該未突變HPPD細(xì)胞是致死性的抑制劑劑量。進(jìn)行突變后，使細(xì)胞經(jīng)受這預(yù)定的劑量，分離出能耐受此致死量的突變細(xì)胞，然后分離和克隆該突變HPPD的編碼基因。
已在許多表達(dá)自身天然HPPD的假單胞菌細(xì)胞上進(jìn)行過這種誘變培養(yǎng)細(xì)胞的方法(具體見下述實(shí)施例)。在所有例子中用上述選擇方法分離得到的突變株都是突變位于HPPD C末端部分的突變株。
制備本發(fā)明突變核酸序列和其相應(yīng)蛋白質(zhì)的另一方法是對(duì)預(yù)先選擇的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)誘變。例如，通過鑒定幾種HPPD序列C末端部分的共同氨基酸；或嘗試在一種來源的HPPD中再產(chǎn)生通過對(duì)另一來源HPPD隨機(jī)誘變(培養(yǎng)細(xì)胞)獲得的突變。獲得這些定點(diǎn)突變的方法是本技術(shù)領(lǐng)域人員熟知的，在文獻(xiàn)中(具體說定點(diǎn)誘變，實(shí)踐方法，1991，M.J.McPHERSON編著，IRL PRESS)廣有描述，或者可以采用這些方法的市售試劑盒(如Pharmacia的U.S.E誘變?cè)噭┖??？傊?，在定點(diǎn)誘變后，采用上述隨機(jī)誘變所用的同樣方法來選擇對(duì)抑制劑敏感性低于相應(yīng)未突變HPPD的突變HPPD。
因此本發(fā)明還涉及制備編碼本發(fā)明突變HPPD的核酸序列的方法。所述方法上面已提及。
本發(fā)明還涉及到用編碼本發(fā)明突變HPPD的核酸序列作為標(biāo)記基因，或作為編碼基因，在轉(zhuǎn)化植物方法中，賦于某種植物耐受除草劑(HPPD的抑制劑)。當(dāng)然，可以理解，此序列也可與其它標(biāo)記基因和/或編碼一種或多種農(nóng)作物性狀的序列聯(lián)合使用。
本發(fā)明還涉及一種嵌合基因(或表達(dá)盒)，它包含一個(gè)編碼序列以及5’和3’位置上的異源調(diào)控元件；能在宿主生物，特別是植物細(xì)胞或植物中發(fā)揮作用。該編碼序列含有至少一個(gè)編碼上述突變HPPD的核酸序列。
“宿主生物”指任何低等或高等，單細(xì)胞或多細(xì)胞生物，可向其引入本發(fā)明的嵌合基因，目的是產(chǎn)生突變的HPPD。這些生物具體有細(xì)菌如大腸桿菌、醇母菌，特別是酵母菌屬或克氏梭菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)；真菌特別是曲霉菌，桿狀病毒，或者宜為植物細(xì)胞和植物。
“植物細(xì)胞”，根據(jù)本發(fā)明，指衍生于植物的任何細(xì)胞，它能形成不分化的組織如胼胝體，和分化組織如胚芽，部分植株，植株或種子。
根據(jù)本發(fā)明“植物”指任何能進(jìn)行光合作用的分化的多細(xì)胞生物。具體說是單子葉或雙子葉生物，更具體指，向動(dòng)物或人類提供營(yíng)養(yǎng)的栽培作物、如玉米、小麥、油菜、大豆、稻、甘蔗、甜菜、煙草、棉花等。
表達(dá)編碼HPPD的核酸序列所需的調(diào)控元件是技術(shù)人員所熟知的，隨宿主生物而變。具體講，它們包括啟動(dòng)子序列，轉(zhuǎn)錄激活子，終止序列還包括起始和終止密碼子。鑒定和選擇調(diào)控元件的工具與方法是技術(shù)人員所熟知的。文獻(xiàn)中也廣有描述。
本發(fā)明特別涉及到植物的轉(zhuǎn)化。植物中天然表達(dá)一種基因的任何啟動(dòng)子序列，特別是植物葉子中表達(dá)基因所需啟動(dòng)子，如細(xì)菌、病毒或植物來源的所謂構(gòu)成型啟動(dòng)子，例如專利申請(qǐng)EP 0507698所述的組蛋白啟動(dòng)子；或水稻肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子；或植物病毒基因如花菜花葉病毒(CAMV 19S或35S)的啟動(dòng)子，或所謂光依賴性啟動(dòng)子如植物核酮糖雙羥化酶/加氧酶(RuBisCo)小亞基基因的啟動(dòng)子，以及任何合適的已知啟動(dòng)子，都可用作這些植物中的啟動(dòng)調(diào)節(jié)序列。
根據(jù)本發(fā)明，可與上述啟動(dòng)調(diào)節(jié)序列聯(lián)用的其它調(diào)控序列位于啟動(dòng)子和編碼序列之間，如轉(zhuǎn)錄激活子(增強(qiáng)子)，例如專利申請(qǐng)WO 87/07644中描述的煙草花葉病毒(TMV)翻譯活化子，或Carrington & Freed所述etch病毒(TEV)活化子。
如專利申請(qǐng)EP 0633317中所述，細(xì)菌來源的相應(yīng)序列，如根瘤土壤桿菌的nos終止子，或植物來源的如組蛋白終止子可用作終止調(diào)節(jié)序列，或用作聚腺苷酸化序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所用的編碼一種轉(zhuǎn)移肽的核酸序列位于編碼突變HPPD的核酸序列的5’端，此轉(zhuǎn)移肽序列處于啟動(dòng)子和編碼突變HPPD的序列之間，而允許轉(zhuǎn)移肽/突變HPPD融合蛋白的表達(dá)。該轉(zhuǎn)移肽可引導(dǎo)突變HPPD進(jìn)入質(zhì)體，具體說進(jìn)入葉綠體，在通過質(zhì)體膜時(shí)，該融合蛋白在轉(zhuǎn)移肽與突變HPPD之間斷裂。轉(zhuǎn)移肽也許是簡(jiǎn)單的，如EPSPS轉(zhuǎn)移肽(見美國(guó)專利5188642)或植物核酮糖雙羧化酶/加氧酶小亞基(RuBisCo ssu)的轉(zhuǎn)移肽，只包含成熟RuBisCO ssu(EP 18970)N末端部分的幾個(gè)氨基酸；或是復(fù)合轉(zhuǎn)移肽，它包含了融合于成熟蛋白(具有質(zhì)體)N端序列某部分的第一種植物轉(zhuǎn)移肽，和與該部分進(jìn)一步融合的第二種植物轉(zhuǎn)移肽(見專利EP 508909所述)。更具體說，優(yōu)化的轉(zhuǎn)移肽，包括與玉米R(shí)uCisCO ssu N端22個(gè)氨基酸融合的向日葵RuCisCO ssu的轉(zhuǎn)移肽，它進(jìn)而再與玉米R(shí)uCisCO ssu的轉(zhuǎn)移肽融合。編碼序列見專利EP 508909。
本發(fā)明還涉及到轉(zhuǎn)移肽/突變HPPD融合蛋白，該融合蛋白的兩種組成成分如上所述。
本發(fā)明還涉及用于轉(zhuǎn)化宿主生物的克隆和/或表達(dá)載體。該載體至少含有上述一種嵌合基因，除上述嵌合基因外，該載體至少含有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。此載體可以是質(zhì)粒、粘粒、嗜菌體或是因?qū)肓吮景l(fā)明嵌合基因而轉(zhuǎn)化的一種病毒。這種取決于待轉(zhuǎn)化宿主生物的轉(zhuǎn)化載體是本技術(shù)領(lǐng)域人員熟知的，文獻(xiàn)中廣有描述。具體說，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植株的轉(zhuǎn)化載體是病毒，可用它來轉(zhuǎn)化長(zhǎng)成的植株，它還含有自己的復(fù)制和表達(dá)元件。根據(jù)本發(fā)明，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植株的載體優(yōu)選是質(zhì)粒。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化宿主生物，特別是植物細(xì)胞的方法，該方法系將至少一種核酸序列或上述嵌合基因整合入宿主生物中?？捎萌魏我阎暮线m方法獲得這種轉(zhuǎn)化。這些方法在專業(yè)文獻(xiàn)中，特別是在本申請(qǐng)引用的參考文獻(xiàn)中有所描述。更具體地說可用本發(fā)明的載體來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
已有一系列的方法包括用吸附有DNA序列的顆粒轟擊細(xì)胞，原生質(zhì)體或組織。另一些方法包括，將嵌合基因插入到根瘤土壤桿菌Ti質(zhì)?；虬l(fā)根土壤桿菌Ri質(zhì)粒中，作為轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物的工具。也許可采用其它方法，如顯微注射，或電穿孔或用PEG直接沉淀。技術(shù)人員會(huì)根據(jù)宿主生物，特別是植物細(xì)胞或植株的性質(zhì)，選擇合適的方法。
本發(fā)明還涉及到被轉(zhuǎn)化的，含有上述突變HPPD編碼序列的嵌合基因的宿主生物，特別是植物細(xì)胞或植株。
本發(fā)明還涉及到含有被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的植物，特別是從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生的植株。通過合適的方法獲得這種再生，而方法取決于物種的性質(zhì)，上述參考文獻(xiàn)中有所描述。關(guān)于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和再生植株、具體引用了下述專利和專利申請(qǐng)US4，459，355，US4，536，475，US5，464，763，US5，177，010，US5，187，073，EP267，159，EP604，662，EP672，752，US4，945，050，US5，036，006，US5，100，792，US5，100，792，US5，371，014，US5，478，744，US5，179，022，US5，565，346，US5，484，956，US5，508，468，US5，538，877，US5，554，798，US5，489，520，US5，510，318，US5，204，253，US5，405，765，EP442，174，EP486，233，EP486，234，EP539，563，EP674，725，WO91/02071和WO95/06128。
本發(fā)明還涉及栽培和/或雜交上述再生植株而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物，并涉及這種轉(zhuǎn)化植物的種子。
按照本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)化植物可能是單子葉植物，如谷物、甘蔗、水稻和玉米，或雙子葉植物如煙草、大豆、油菜、棉花、甜菜、苜蓿等。
本發(fā)明還涉及對(duì)植物，特別農(nóng)作物選擇性除草的方法，借助于HPPD抑制劑，具體說是前述的除草劑進(jìn)行。該方法的特征在于在谷物播種前，長(zhǎng)出前或長(zhǎng)出后，將該除草劑施用于已按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物。
本發(fā)明還涉及控制田間雜草的方法，該田間區(qū)域內(nèi)種下了用本發(fā)明嵌合基因轉(zhuǎn)化的種子和作物。方法是向所述田間區(qū)域施用HPPD抑制性除草劑，施予量對(duì)雜草有毒而不顯著影響轉(zhuǎn)化了本發(fā)明嵌合基因的種子或作物。
本發(fā)明還涉及栽培用本發(fā)明嵌合基因轉(zhuǎn)化的作物的方法。此方法是在適合栽培所述作物的田間，種了所述轉(zhuǎn)化作物的種子，如果田間有野草，向所述田間區(qū)域施用對(duì)雜草有毒性劑量的除草劑(它的靶子是上述HPPD)，而不明顯影響所述轉(zhuǎn)化種子或作物的生長(zhǎng)。當(dāng)作物達(dá)到理想的成熟期，收獲栽培作物，適當(dāng)時(shí)候?qū)⑹斋@作物的種子分離出來。
在上述兩種方法中，以HPPD為靶子的除草劑，按照本發(fā)明于谷物播種前，長(zhǎng)出前或長(zhǎng)出后施用。
本發(fā)明“除草劑”的含義指本身有除草活性的物質(zhì)或與能改變其效果的添加劑合用的物質(zhì)。這種添加劑有增加其活性的制劑(協(xié)同劑)或限制其活性的制劑(安全劑)。HPPD抑制性除草劑前已有描述，當(dāng)然其施用時(shí)，是與農(nóng)業(yè)化學(xué)中習(xí)慣采用的輔佐劑一起聯(lián)合使用的。
當(dāng)按本發(fā)明的作物含有耐受另一除草劑的基它基因時(shí)(如，編碼突變的或非突變的EPSPS的基因，它賦予該作物對(duì)草甘膦(glyphosate)的耐受性)，或當(dāng)轉(zhuǎn)化作物天然對(duì)另一除草劑敏感時(shí)，本發(fā)明方法可包括同時(shí)、或錯(cuò)開時(shí)間與所述除草劑(如草甘膦)聯(lián)合施用HPPD抑制劑。
本發(fā)明還涉及在一種作物的”轉(zhuǎn)化/再生”周期中和上述除草劑選擇中，采用編碼突變HPPD的嵌合基因作為標(biāo)記基因。
借助于下述實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例將能更好地理解本發(fā)明的不同方面內(nèi)容。
在這些實(shí)施例中描述的所有方法或操作，以舉例方式給出，從達(dá)到同樣結(jié)果而采用的不同方法中作出選擇，這種選擇對(duì)結(jié)果沒有影響，因此技術(shù)人員可采用任何合適的方法來達(dá)到同樣的效果。操縱DNA片段的絕大多數(shù)方法參見“Current Protocols in Molecular Biology”第1、2卷Ausubel F.M.等編著。Greene Publishing Associates和Wiley Interscience出版(1989)，或“Molecular cloning”T.Maniatis，E.F.Fritsch.J.Sambrook 1982。
實(shí)施例1．篩選耐受2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1，3-二酮突變株的比色試驗(yàn)pRP C將含有一基因組DNA片段和熒光假單胞菌A32的HPPD基因的編碼區(qū)的載體pRPA(見專利申請(qǐng)WO96/38567)用NcoⅠ消化，并純化，然后連接到表達(dá)載體pKK233-2(Clontech)上，它本身已經(jīng)NcoⅠ消化，而在此載體上形成了一個(gè)唯一的克隆位點(diǎn)。證實(shí)在所產(chǎn)生的pRPC載體中，此基因的方向允許其在trc啟動(dòng)子控制下表達(dá)。
將含有1％瓊脂(Gibco BRL超純)、5mM L-酪氨酸(Sigma)和選擇上述pRPC載體的試劑的YT肉湯培養(yǎng)基加入96孔板，每孔100μl。每孔再加入10μl指數(shù)生長(zhǎng)期的含pRPC載體的大腸桿菌。37℃16小時(shí)后，只含培養(yǎng)基，或接種過含載體pKK233-2的大腸桿菌的孔是半透明的，而接種過含載體pRPC的大腸桿菌的孔呈棕色。
用鑒定培養(yǎng)基配制一系列樣品。此鑒定培養(yǎng)基含不同濃度的(0至14mM)溶于水、pH7.5的2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲苯基)丙烷-1，3-二酮(EP 0496631)。此分子是一種腈基二酮，知道它是HPPD活性的有效抑制劑(Pallett K.E.等，1997，Pestic.Sci.50，83-84)。當(dāng)這種化合物以7mM濃度存在時(shí)，含有載體pRPC的細(xì)菌培養(yǎng)物均無顏色。
通過使含7mM濃度的2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲苯基)丙烷-1，3-二酮的培養(yǎng)基變成棕色，而篩選出定向誘變和隨機(jī)誘變產(chǎn)生的HPPD突變株。
分別用3.5mM和7mM的2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-(甲硫基)苯基)丙烷-1，3-二酮和2-(2-氯-3-乙氧基-4-(乙基磺?；?苯甲?；?-5-甲基-1，3-環(huán)己二酮(WO93/03009)代替2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲基-4-三氟苯甲基)丙烷-1，3-二酮，獲得了相同結(jié)果。
這些結(jié)果證實(shí)，以HPPD活性為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)(不論此活性來源)可以鑒定能耐受異噁唑家族和三酮家族HPPD活性抑制劑的(突變的)HPPD活性。
實(shí)施例2.用羥胺隨機(jī)誘變A32熒光假單胞菌的HPPD基因用標(biāo)準(zhǔn)方法抽提含有上述pRPC載體的大腸桿菌的質(zhì)粒DNA。用標(biāo)準(zhǔn)方法將此DNA與羥胺一起80℃培育1小時(shí)。羥胺是一種化學(xué)誘變劑，能導(dǎo)致胞嘧啶被胸腺嘧啶替代。用所產(chǎn)生的可能突變的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12的DH10B菌株。采用實(shí)施例1中描述的比色篩選試驗(yàn)，從幾千個(gè)可能突變的克隆中鑒定出幾個(gè)能使培養(yǎng)基變?yōu)樽厣木洹Ｒ簿褪钦f甚至在7mM的2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟苯甲基)丙烷-1，3-二酮存在下。這些菌落也能將HPP轉(zhuǎn)化為尿黑酸。
測(cè)定這些不同突變株的序列后，證明采用這種誘變/篩選方法分離到4個(gè)不同的突變株，對(duì)應(yīng)于三個(gè)不同的突變位點(diǎn)。
位點(diǎn)1215位脯氨酸被亮氨酸替代，該突變株命名為PfL215。
位點(diǎn)2334位甘氨酸被絲氨酸替代，該突變株命名為PfS334。
334位甘氨酸被天門冬氨酸替代，該突變株命名為PfD334。
位點(diǎn)3336位甘氨酸被絲氨酸替代，該突變株命名為PfS336。
導(dǎo)致編碼蛋白的耐受性比未突變HPPD提高的這三個(gè)突變位點(diǎn)，位于該蛋白的C末端區(qū)域。從含有熒光假單胞菌A32的HPPD基因(它含有一個(gè)或多個(gè)突變)編碼區(qū)的pRPC克隆衍生得到的克隆，取名是在pRPC后加上該突變的名稱，如pRPC PfL215或pRPC PfS336(或另一種方法，簡(jiǎn)單地只按突變的氨基酸命名，如PfL215和PfS336，除非關(guān)于突變HPPD的來源另有指明。
可對(duì)具有HPPD活性的任何蛋白質(zhì)進(jìn)行隨機(jī)誘變來產(chǎn)生一個(gè)或幾個(gè)改變，也就是說這種改變能將4-羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)變成尿黑酸，其編碼區(qū)也可被克隆，本文所述的HPPD特別指熒光假單胞菌，鼠耳芥，胡蘿卜，玉米和集胞藻屬的HPPD。對(duì)技術(shù)人員來說顯然這些改變都可用于其它HPPD。
實(shí)施例3.通過序列類似性定點(diǎn)誘變熒光假單胞菌A32的HPPD基因通過熒光假單胞菌A32、鼠耳芥、小鼠、豬和Coccicoides的HPPD蛋白質(zhì)序列的排列對(duì)比，有可能找出不同序列中一定數(shù)目的保守性氨基酸，然后對(duì)它們誘變獲得耐受性HPPD。也可在圖1所示的排列對(duì)比中加入文獻(xiàn)報(bào)告的其它HPPD的序列。
這些不同序列的排列對(duì)比清楚的表明，一個(gè)最保守的區(qū)域位于332位甘氨酸和342位苯丙氨酸之間。高度保守的不只是這一區(qū)域還包括隨機(jī)誘變所鑒定的334和336位兩個(gè)甘氨酸(序列對(duì)比用粗體字加星號(hào)標(biāo)記)。采用Pharmacia的U.S.E誘變?cè)噭┖袑?duì)pRPC載體進(jìn)行了誘變。用M寡核苷酸誘變333苯丙氨酸、334甘氨酸、336甘氨酸和337天冬酰胺，也用于誘導(dǎo)334和336位兩性甘氨酸雙突變，如以下圖解所示(見序列鑒定SEQ ID N0.1～12)苯丙333的誘變，它被色氨酸替代寡核苷酸1GAAGTTGCCC TCGCCCCACC CATCGTCGCC CTT苯丙333的誘變，被亮和異亮氨酸替代寡核苷酸2GAAGTTGCCC TCGCCRAKCC CATCGTCGCC CTT甘334誘變，被色氨酸替代寡核苷酸3CTTGAAGTTG CCCTCCCAAA ACCCATCGTC GCC甘334誘變，被天門冬氨酸替代寡核苷酸4CTTGAAGTTG CCCTCGTCAA ACCCATCGTC GCC
甘334誘變，被絲氨酸替代寡核苷酸5CTTGAAGTTG CCCTCGCTAA ACCCATCGTC GCC甘334誘變，被亮和異亮氨酸替代寡核苷酸6CTTGAAGTTG CCCTCRAKAA ACCCATCGTC GCC甘336誘變，被天門冬氨酸替代寡核苷酸7CAGCGCCTTG AAGTTGTCCT CGCCAAACCC ATC甘336誘變，被谷氨酸替代寡核苷酸8CAGCGCCTTG AAGTTYTCCT CGCCAAACCC ATC甘336誘導(dǎo)，被色氨酸替代寡核苷酸9CAGCGCCTTG AAGTTCCACT CGCCAAACCC ATC甘336誘變，被亮氨酸替代寡核苷酸10CAGCGCCTTG AAGTTDACTC GCCAAACCCA甘334和甘336的TC誘變，它們被其它氨基酸替代，因此可能獲得雙突變株寡核苷酸11CGCTTGAAGT TNNNCTCNNN AAACCCATCG TC天冬酰胺337誘變，被亮或異亮氨酸替代寡核苷酸12GAACAGCGCC TTGAARAKGC CCTCGCCAAA CCC在對(duì)幾百個(gè)可能的突變體用2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮篩選后，經(jīng)比色測(cè)定，獲得了15個(gè)新的突變體，其中12個(gè)單突變體，3個(gè)雙變異體具有耐受2-氰基-3環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮抑制劑的功能。應(yīng)補(bǔ)充的是定點(diǎn)誘變過程中鑒定出的某些突變體肯定與實(shí)施例2中鑒定出的突變體相同(如PfS334和PfD334)。
進(jìn)行聯(lián)合突變也是可能的，不僅可發(fā)生在靠近的區(qū)域，如334和336位的雙突變體；還可發(fā)生在遠(yuǎn)隔區(qū)域，如215和336位的雙突變體。
pRPC PfL215δpRPC PfL215克隆的質(zhì)粒DNA用PstⅠ消化，純化并再連接。因?yàn)榈?個(gè)PstI位點(diǎn)位于28P亮氨酸，下一個(gè)PstⅠ位置位于pKK233.2多克隆位點(diǎn)，得到克隆pRPC PfL215δ含有包括脯215亮突變的PfL215 HPPD編碼序列，但不含該未端部分也沒有基因組部分。
pRPC PfL215 W336、pRPC PfL215 E336，pRPC PfL215 I336將pRPC PfW336，pRPC PfE336，pRPC PfI336克隆質(zhì)粒DNA用MluⅠ和HindⅢ消化。MluⅠ位于熒光假單胞菌HPPD編碼部分的254位天門冬氨酸處，HindⅢ位于PKK223.3多克隆位點(diǎn)處。將含有突變HPPD的C末端部分及基團(tuán)組部分的片段純化、再連接到經(jīng)MluⅠ和Hind Ⅲ消化的pRPC PfL215δ質(zhì)粒上，如此得到的3個(gè)克隆與pRPC PfL215克隆等同，但分別含有W336，E336和I336突變。
對(duì)得到的突變株鑒定如下單突變株苯丙氨基酸333被色氨酸替代稱為PfW333苯丙333被亮氨酸替代稱為PfL333甘334被色氨酸替代稱為PfW334甘334被脯氨酸替代稱為PfP334甘334被亮氨酸替代稱為PfL334甘334被異亮氨酸替代稱為PfI334甘336被天門冬氨酸替代稱為PfD336甘336被谷氨酸胺替代稱為PfQ336甘336被谷氨酸替代稱為PfE336甘336被色氨酸替代稱為PfW336甘336被異亮氨酸替代稱為PfI336天門冬酰胺337被亮氨酸替代稱為PfL337定點(diǎn)誘變所獲得的突變株甘334和甘336均被丙氨酸替代，稱為PfA334-A336甘334被丙氨酸替代和甘336被精氨酸替代稱為PfA334-R336甘334被絲氨酸替代和甘336被精氨酸替代稱為PfS334-R336克隆獲得的雙突變株脯215被亮氨酸替代和甘336被色氨酸替代稱為PfL215-W336脯215被亮氨酸替代和甘336被谷氨酸替代稱為PfL215-E336脯215被亮氨酸替代和甘336被異亮氨酸替代稱為PfL215-I336以上結(jié)果表明，通過誘交不同HPPD蛋白C末端部分序列之間的保守氨基酸，得到耐受HPPD活性的抑制劑的HPPD是可能的。同時(shí)不同的HPPD氨基酸序列間的保守區(qū)都是得到耐受性突變株的良好靶點(diǎn)。已經(jīng)證明任何突變右多個(gè)突變都有可能得到耐受性HPPD，即使本文沒有舉例說明的這種蛋白質(zhì)都是本發(fā)明的一部分。
以上結(jié)果也表明為獲得對(duì)不同抑制制具有良好耐受性的HPPD，C末端區(qū)域是誘變HPPD的首選靶點(diǎn)。就熒光假單胞菌A32而言，很難確定其N端第1個(gè)氨基酸至連結(jié)肽之間的保守區(qū)域。對(duì)其它種來源的HPPD的相當(dāng)區(qū)域亦是如此。
根據(jù)序列排列對(duì)比所推導(dǎo)出的信息，具有HPPD活性，即可轉(zhuǎn)變4-羥基苯丙酮酸為尿黑酸的蛋白都可能經(jīng)定點(diǎn)誘變進(jìn)行改變，其編碼區(qū)可克隆或已經(jīng)被克隆。本研究描述的HPPD雖然來自于熒光假單胞菌、鼠耳芥、胡蘿卜、玉蜀黍和集胞藻屬，然而很顯然，所有這些改變都可施加于其它種類的HPPD。
實(shí)施例4.熒光假單胞菌A32的HPPD基因的定點(diǎn)誘變。
實(shí)施例2中描述了隨機(jī)誘變得到的結(jié)果，以及HPPD不同序列排列對(duì)比后得到的結(jié)果，清楚地證明為得到耐受性，F(xiàn)333到F338(根據(jù)熒光假單胞菌HPPD編號(hào))是誘變應(yīng)特別注意的一個(gè)區(qū)域。
與此同時(shí)，通過分析熒光假單胞菌A32株酶的3級(jí)結(jié)構(gòu)，(如圖1)發(fā)現(xiàn)此單體蛋白的C末端部分含有該酶的催化位點(diǎn)。因此為了能改變此蛋白和抑制劑之間的作用，并得到耐受性更好的酶，此C末端區(qū)域的氨基酸是首選的誘變區(qū)域。
通過分析熒光假單胞菌HPPD蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，研究了點(diǎn)突變，它可以引起333經(jīng)苯丙氨酸到338位苯丙氨酸六肽的構(gòu)形改變，而不是直接突變?cè)撾??；鞠敕ㄊ请x活性位點(diǎn)相當(dāng)遠(yuǎn)又不保守的氨基酸的這種突變，可能影響到苯丙333到苯丙338肽的空間位置，并通過間接效應(yīng)誘導(dǎo)了對(duì)HPPD抑制劑的耐受性。
尋找在結(jié)構(gòu)上接近此六肽的氨基酸，僅少量氨基酸符合這標(biāo)準(zhǔn)[該六肽334位甘氨酸的α碳原子距催化位點(diǎn)中的鐵原子9.61_，298位甘氨酸的α碳原子距334甘氨酸α碳原子5.75 _]，如287位天門冬氨酸，298位甘氨酸。298位甘氨酸似乎是這兩個(gè)氨基酸中較好的候選者，因?yàn)檎T變將導(dǎo)致氨基酸帶有圈套側(cè)鏈。用谷氨酸(其側(cè)鏈帶負(fù)電)代替這個(gè)甘氨酸，獲得了效果看起來足夠滿意的變化。
此外，當(dāng)298位甘氨酸被谷氨酸替代后，谷氨酸非常大的側(cè)鏈對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)β片層的作用顯著。面保守基序LLQIF正位于此結(jié)構(gòu)中。這個(gè)基序中312苯丙氨酸也非常靠近鐵原子。
我們還測(cè)定了甘298變?yōu)楣?98的突變。
甘298變?yōu)楣?98的突變是用寡核苷酸序列No.13(SEQ.ID.NO.13)通過定點(diǎn)誘變pRPC載體而產(chǎn)生。
甘氨酸298由谷氨酸來替代寡核苷酸1 3GCCTTCCACGGAAGATTCGTCCAGCAGGATACC這個(gè)突變體稱PfE 298，能引起含7mM RPA202248的篩選培養(yǎng)基變成棕色。
這證實(shí)，對(duì)HPPD三級(jí)結(jié)構(gòu)的了解，有可能鑒定到一定數(shù)目的導(dǎo)致對(duì)HPPD抑制劑耐受的有效突變，而不論該HPPD來源于植物、細(xì)菌或其它生物。事實(shí)上，由于已經(jīng)知道了熒光假單胞菌HPPD的精確結(jié)構(gòu)，模擬已知蛋白質(zhì)序列的任何HPPD的結(jié)構(gòu)是可能的。特別令人感興趣的模擬是模擬C-末端區(qū)域，該區(qū)域是一級(jí)序列中最保守的，特別是此區(qū)域?qū)Ξa(chǎn)生對(duì)HPPD抑制劑的耐受而言，是最有希望的。
根據(jù)模式化的HPPD三級(jí)結(jié)構(gòu)推導(dǎo)的信息，即通過分析定點(diǎn)誘變而導(dǎo)致的變化，或?qū)Υ嬖诨虿淮嬖谠谝种苿┣闆r下獲得的該蛋白質(zhì)晶體的分析，確定的三維結(jié)構(gòu)，可能適用于所有具有HPPD活性(即可將4-羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)變的尿黑酸，其編碼區(qū)可被克隆)的蛋白。
本申請(qǐng)描述的HPPD，特別是熒光假單胞菌，鼠耳芥，胡蘿卜，玉蜀黍和集胞藻的HPPD，對(duì)技術(shù)人員都是顯而易懂的，所有這些變化均可施加于其它種類的HPPD。
實(shí)施例5.在煙草中表達(dá)熒光假單胞菌的HPPD突變體。
A嵌合基因的構(gòu)建pRP-VB3用HindⅢ和XbaⅠ酶切二元載體pBI121的DNA，用pfu多聚酶(stratagene)，以dNTP補(bǔ)平未端，純化此載體。實(shí)施例2 PCT 96/38567申請(qǐng)中描述了克隆pRP-S的DNA，它包含了序列“雙組蛋白啟動(dòng)子-TEV-OTP-HPPD基因-Nas終止子”用Hid Ⅲ和SacⅠ消化，用pfu多聚酶，以dNTP補(bǔ)平未端，純化該插入片斷，然后與前述純化的載體連接，用SalⅠ消化驗(yàn)證方向?？寺RP-VB3具有如下嵌合基因結(jié)構(gòu)PB/Nos啟動(dòng)子/NPTⅡ/Nos終止子/雙組蛋白啟動(dòng)子/tev/otp/HPPD/Nos終止子/LB
RB LB分別為鼠耳芥T-DNA的右邊和左邊邊界Nos啟動(dòng)子鼠耳芥胭脂堿(nopaline)合成酶的啟動(dòng)子NPTⅡ編碼Ⅱ型新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的序列(提供對(duì)卡那霉素的抗性)Nos終止子根癌土壤桿菌胭脂堿合成酶的終止子序列雙組蛋白啟動(dòng)子見EP 507 689中所述tevTEV增強(qiáng)子(Carrington & Freed)otp最適轉(zhuǎn)移肽(EP 508 909)pRP-VB3-b克隆pRP-VB3的DNA，用Bam HⅠ消化，純化，然后連接于載體pZERO-1(Invitrogen)，此載體不含限制性內(nèi)切酶Bst E 11和SalⅠ的位點(diǎn)。用BamHⅠ消化此載體再純化。將一部分OTP、HPPD基因、Nos終止子也以此法轉(zhuǎn)入到pZERO-1中。
pRP-VB3-c克隆pRPVB3-b的DNA用SalⅠ消化，純化，用BstEⅡ限制性位點(diǎn)替代SalⅠ限制性位點(diǎn)，5’TCGAGAGAGAGGTGACCGAGAGA 3’3’CTCTCTCCACTGGCTCTCTAGCT 5’pRP-VB3-d克隆pRP-VB3-c的DNA用BamHⅠ消化，純化插入片段，克隆到用BamHⅠ酶消化的載體PUC19中。將一部分OTP，HPPD基因及Nos終止子以同法轉(zhuǎn)入到PUCl9中。
pRP-VB3-e因PUC19載體無PmlⅠ和StuⅠ限制性位點(diǎn)，克隆pRP-VB3-d的DNA用PmlⅠ和StuⅠ消化、純化，然后自身連接這樣有可能去掉HPPD基因Not位點(diǎn)，縮短約500個(gè)堿基對(duì)的編碼HPPD部分，使隨后篩選帶有整合的突變HPPD的轉(zhuǎn)化菌落工作變得容易些。
pRP-VB3-fpRP-VB3-e用Not酶消化，用pfu多聚酶和dNTPs補(bǔ)平未端。純化后用BamHⅠ酶消化，純化，然而克隆進(jìn)到經(jīng)KpnⅠ消化的載體PUC19中，其未端用dNTP和pfu多聚酶補(bǔ)平。純化后用BamⅠ消化、再純化。
pRP-VB83-g克隆pRP-VB3的DNA用BstEⅡ消化，未端用pfu及dNTP補(bǔ)平。將純化載體自身連結(jié)從而有可能消除該載體唯一的BstEⅡ位點(diǎn)。
pRP-RD224克隆pRP-VB3-f的DNA用BamHⅠ和SacⅠ消化，純化，然后連接到經(jīng)BamHⅠ和SacⅠ消化并化過的載體pRP-VB3-g中。因此克隆pRD-RD224具有下列結(jié)構(gòu)RB/Nos活動(dòng)子/NPTⅡ/Nos終止子/雙組蛋白啟動(dòng)子/tev/otp/截短的HPPD/Nos終止子/LBpRP-RD224突變體帶有突變HPPD的載體DNA和含有未突變HPPD的載體PKK 233-2用KpnⅠ和BstEⅡ消化、純化，然后連接到經(jīng)KpnⅠ和BstEⅡ消化和純化的載體pRP-RD224中。根據(jù)KpnⅠ和BstEⅡ消化的插入物大小選出整合突變HPPD基因的轉(zhuǎn)化子。得到的克隆稱pRP-RD224，其后再加上HPPD中的突變類型。如以下克隆pRP-RD224pf(此酶未突變)；pRP-RD-224 pfD336(此酶336位為天門冬氨酶)；pRP-RD225 pfQ336(此酶336位為谷氨酰胺)；pRP-RD224PfL333(此酶333位為亮氨酸)，pRP RD224pfA334～A336(此酶334，336為丙氨酸，雙突變)。
B)“Petit havana”煙草的轉(zhuǎn)化將上述嵌合基因轉(zhuǎn)移到“Petit havana”煙草中，轉(zhuǎn)化和再生方法見歐洲專利申請(qǐng)EP No.05089091)轉(zhuǎn)化將此載體導(dǎo)入非腫瘤性和根癌土壤桿菌EHA101株中。
2)再生從葉外植體再生煙草“Petit havana”，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基，含蔗糖30g/L，350mg/L cefotaxime以及不同劑量的2-氰基-1-[4-(甲磺酰基)-2-三氟甲苯基]-3-(1-甲基環(huán)丙基)丙烷-1，3-二酮(EP 496630)，10ppm，20ppm，40ppm，此物是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲苯基)丙烷-1，3-二酮的同類物，或者直接用2或4或8ppm劑量的2-氨基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺酰基-4-三氟甲苯基)丙烷-1，3-二酮。從溫室作物中取出葉外植體以連續(xù)三階段葉園片技術(shù)轉(zhuǎn)化(Science 1985.227.1229-1231)一首先是在加有30g/L蔗糖，0.05mg/L萘基乙酸(ANA)和2mg/L芐基氨基嘌呤(BAP)以及不同劑量的除草劑，即2-氰基-1-[4-(甲磺?；?-2-三氟甲苯基]-3-(1-甲基環(huán)丙基)丙烷-1，3-二酮(EP 496630)或2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺酰基-4-三氟甲苯基)丙烷-1，3-二酮的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)抽芽15天。
-在這段階形成的的綠芽再培養(yǎng)在加有30g/l的蔗糖，不同劑量除草劑，但無激素的MS培養(yǎng)基上，讓其發(fā)育10天。
-取出已長(zhǎng)成的芽，種到含一半鹽、維生素、糖和不同劑量的isoxaflutole但不含激素的生根MS培養(yǎng)基上，15天后，將生根的芽種入田中。
C)體外芽胚對(duì)除草劑耐受性的測(cè)定使選擇性試劑與下表中指出的突變體反應(yīng)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，證明在采用無突變的HPPD的轉(zhuǎn)化/再生試驗(yàn)中除草劑最高的劑量不能得到芽/芽胚，相反，由于突變酶的耐受性提高，即使在高劑量的2-氰基-1-[4-(甲磺酰基)-2-三氟甲苯基]-3-(1-甲基環(huán)丙基)丙烷-1，3-二酮，或2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮作用下也得到了芽胚(見總結(jié)表)。用HPPD突變體在高濃度選擇性試劑下得到芽胚，而用野生型HPPD得不到是完全正常的。
在體外用1ppm，2ppm，4ppm和8ppm 2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基丙烷-1，3-二酮選擇過程中，有一定數(shù)量的突變體看來不易使轉(zhuǎn)化的煙草芽胚再生，且所用除草劑的劑量無關(guān)。但我們注意到，通過大量的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和/或確定好選擇劑的濃度，轉(zhuǎn)化子是可以得到的。
與其它突變體相反，得到綠色芽胚卻很容易，這完全正常。在本方法研究的突變體中產(chǎn)生最多芽胚的突變體是PfL215，pfD336和pfQ336突變體。
在用PfD336轉(zhuǎn)化中，1ppm下得到25％轉(zhuǎn)化，2ppm下得到25％轉(zhuǎn)化，4ppm下得到35％轉(zhuǎn)化，8ppm下得到15％轉(zhuǎn)化。
在用PfL215轉(zhuǎn)化中，1ppm下得到8％轉(zhuǎn)化，2ppm下得到60％轉(zhuǎn)化，4ppm下得到8％轉(zhuǎn)化，8ppm下得到24％轉(zhuǎn)化。
在用PfQ336轉(zhuǎn)化中，1ppm下得到35％轉(zhuǎn)化，2ppm下得到25％轉(zhuǎn)化，4ppm下得到40％轉(zhuǎn)化，8ppm下得到0％轉(zhuǎn)化。
在用未突變的HPPD轉(zhuǎn)化中，1ppm下得到15％轉(zhuǎn)化，2ppm下得到70％轉(zhuǎn)化，
4ppm下得到15％轉(zhuǎn)化，8ppm下得到0％轉(zhuǎn)化。
這些結(jié)果證實(shí)，從統(tǒng)計(jì)學(xué)看，突變HPPD比野生型HPPD更有效。用二個(gè)突變體PfD336和PfL215，在最高劑量的2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮得到轉(zhuǎn)化子是可能的，而用非突變HPPD是不可能的。
此外，用PfQ336突變體，在4ppm 2-氰基-3環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟苯甲基)丙烷-1，3-二酮可得的許多轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，40％為芽胚，而用野生型HPPD，在4ppm的這種除草劑下，只得到很低百分比的作物。
熒光假單胞菌HPPD突變體一覽表HPPD類型“篩選試驗(yàn)”中的活性所用選擇性 以某ppm劑量除草試劑的劑量 劑處理后獲得的綠芽百分率0mM 7mM野生型突變 10 0 4ppm下15％PfL215 10 7 8ppm下24％PfE298 83 沒有綠色小苗PfL333 54-PfW333 -- 沒有綠色小苗PfS334 77 沒有綠色小苗PfD334 11-PfW334 66-PfP334 55 沒有綠色小苗PfL334 54 沒有綠色小苗PfI334 54 沒有綠色小苗PfS336 -- -PfD336 21 8ppm下15％PfQ336 88 8ppm下40％PfE336 10 8 -PfW336 10 9 -PfI336 10 8 -
PfL337 88沒有綠色小苗PfA334-A33688 -PfA334-R33687沒有綠色小苗PfS334-H33655沒有綠色小苗*見實(shí)施例1所述的篩選試驗(yàn)‘-’未得到數(shù)據(jù)數(shù)字10表示在缺乏抑制劑時(shí)獲得的活性與用未突變HPPD獲得的水平同樣高，而數(shù)字0表示無活性，由于受到2-氰基-3-環(huán)丙基-1(2-甲磺?；?-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮的完全抑制，或由于導(dǎo)致此酶失活的突變；數(shù)字1至9表示中等活性，在實(shí)施例1的評(píng)價(jià)試驗(yàn)中數(shù)字大、活性高。
以上結(jié)果證實(shí)，向作物導(dǎo)入耐受HPPD抑制劑的突變HPPD，賦予了該作物對(duì)同一抑制劑的耐受性，該耐受性優(yōu)于用未突變HPPD所獲得的耐受性。
D)體內(nèi)受耐性所有作物生根后都進(jìn)入暖房培養(yǎng)直至結(jié)實(shí)。
將幾種子囊的種子混合后，播種在混合的堆肥和沙子中，每個(gè)播種盤約100粒種子。以Petit Havana野生基因型作為對(duì)照。以每公頃600g配制的isoxaflutole進(jìn)行處理。處理12天后對(duì)秧苗的外貌進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，最好的5份，最壞的1份，幾個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(每種HPPD評(píng)價(jià)10-20個(gè)轉(zhuǎn)化物)觀察評(píng)分的平均值，代表了野生型或突變型HPPD的早期耐受值。
對(duì)336位和215位上的幾種熒光假單胞菌HPPD突變體進(jìn)行了這種測(cè)定。
試驗(yàn) 1 2Pf未突變2.06 2.2Pfw 336 -2.8PfD 336 3.35 -PfQ 336 2.94 -PfL 215 3 -以上結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)化的作物中有本發(fā)明的突變的HPPD，該轉(zhuǎn)化作物對(duì)HPPD抑制性除草劑的耐受性優(yōu)于含相應(yīng)的天然HPPD的作物。
實(shí)施例6集胞藻HPPD基因的定點(diǎn)誘變根據(jù)對(duì)HPPD抑制物的耐受性，在熒光假單胞菌HPPD上選擇了一個(gè)有效突變位點(diǎn)，將其轉(zhuǎn)移到另一HPPD上。
這個(gè)轉(zhuǎn)換是從熒光假單胞菌HPPD或其它已知HPPD轉(zhuǎn)移到一個(gè)盡可能不同的HPPD上，為了這么做，我們采用了集胞藻HPPD編碼基因，由于對(duì)這個(gè)從未克隆的藍(lán)藻菌(cyanobacterium)基因組進(jìn)行了系統(tǒng)性測(cè)定而得知該HPPD基因。所以我們先分離了該基因，然后使其在大腸桿菌中表達(dá)。
1)此基因的分離采用標(biāo)準(zhǔn)方案，提取和純化藍(lán)藻菌集胞藻PCC 6803的基因組DNA。取200μg該基因組DNA進(jìn)PCR擴(kuò)增，緩沖液反應(yīng)體積為50μl，含牛多聚酶(Boehringer)1.25μ，200μM dNTP，引物用合成的寡核苷酸序列16和17(SEQIDNO16和17)，是從Genebank發(fā)表的Synecho-CystisHPPD序列推導(dǎo)出的。
Oligo 16 ATTATGGAAT TCGACTATCT TOligo 17 CAGTATTCAT AATGTTAATT ATG擴(kuò)增程序?yàn)?4℃5分鐘，50輪94℃1分鐘，49℃1分鐘，72℃1分鐘然后72℃5分鐘用PerKin-Elmer 9600裝置進(jìn)行。
2)此基因的克隆和表達(dá)PCR擴(kuò)增得到的片斷純化后，用EcoRⅠ消化，再純化，克隆到預(yù)先用EcoRⅠ和SmaⅠ酶解過的載體ptrc-99A(Phrmacia)中，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM105菌，測(cè)序證實(shí)該克隆片段與公開發(fā)表的集胞藻HPPD序列一致。
如此得到的集胞藻HPPD具有雙氧化酶活性，采用上述的比色試驗(yàn)，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)濃度為1mM，誘導(dǎo)此蛋白質(zhì)表達(dá)，可見到培養(yǎng)基變?yōu)樽厣?。在同樣條件下，但在含有7mM的2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮時(shí)培養(yǎng)基不變棕色，證明2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺酰基-4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮抑制了集胞藻HPPD的活性。
3)定點(diǎn)誘變通過集胞藻PCC 6803 HPPD和熒光假單胞菌A32 HPPD蛋白序列的排列對(duì)比，估測(cè)熒光假單胞菌HPPD 334和336位甘氨酸(實(shí)施例3的圖中以星號(hào)標(biāo)記，非常保守)，在集胞藻HPPD中為318和320位(圖3蛋白質(zhì)序列對(duì)比中用粗體表示)。
已獲得熒光假單胞菌334位的幾個(gè)突變體。采用寡核苷酸MUGLYA和MUGLYB替代集胞藻318位甘氨酸(對(duì)應(yīng)于熒光假單胞菌334位甘氨酸)或用天門冬酰胺式絲氨酸，或脯氨酸式丙氨酸(SEQ.ID.N018和19)進(jìn)行了兩次定點(diǎn)誘變實(shí)驗(yàn)。
GLY318可用絲氨酸或天門冬氨酸替代寡核苷酸18 CGGGCAAAAG GAGTTTARCCA AGGAAACTTT CAAGGLY318可用脯氨酸或丙氨酸替代寡核苷酸19 CGGGCAAAAG GATTTSCNCA AGGAAACTTT CAAG在這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，誘變后得到的克隆可使加有7mM 2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮的篩選培養(yǎng)基變?yōu)樽厣Ｃ看螌?shí)驗(yàn)測(cè)定一個(gè)突變株的序列。
Glycine 318用天冬酰胺替代，稱為SyN318，相似于PfD334(實(shí)施例3)Glycine 318由丙氨酸替代，稱為SyA318，相似于PfA334(實(shí)施例3)這些結(jié)果證實(shí)導(dǎo)致耐受的突變可轉(zhuǎn)移到另一生物種類的另一HPPD中。
這些結(jié)果也證實(shí)不管HPPD來源(細(xì)菌或其它生物)，改變其C末端部分的蛋白質(zhì)序列能導(dǎo)致對(duì)HPPD抑制劑的耐受性。
實(shí)施例7集胞藻突變體，突變HPPD的系列化研究在前述實(shí)施例中得到的突變體SyN318和SyA318與集胞藻未變異的HPPD作比較研究了針對(duì)HPPD抑制劑的生化特性Km和IC50。抑制劑為2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺酰基-4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮。分析按下列方案進(jìn)行a)活性測(cè)定HPPD活性用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定產(chǎn)物量來衡量，也就是說測(cè)定酶和底物HPP孵育后產(chǎn)生的尿黑酸。向色譜柱中注入12到48nmol的不同劑量的尿黑酸，確定尿黑酸滯留時(shí)間，峰面積與注入的產(chǎn)物量相關(guān)。
活性測(cè)定反應(yīng)最終容積為200μl，內(nèi)含12.6mM維生素C，178μM鐵(FeH8N2O8S2·6H2O)(預(yù)先用pH6 0.1M Tris-乙酸緩沖液配制)，50μg HPPD粗提物352μM HPP，pH7.5 0.1M Tris-乙酸緩沖液。第一步將酶溫育30℃1分鐘，隨后加入維生素C和鐵30℃5分鐘最后，加入底物HPP起動(dòng)反應(yīng)。繼續(xù)孵育30℃1分30秒，加入20％高氯酸70μl以終止反應(yīng)。20℃15300rpm離心5分鐘除去蛋白質(zhì)，收集上清液，將形成的尿黑酸75μl注入與HPLC系統(tǒng)連接的PicoTag C18柱分析其量。洗脫流速為1ml/分。常液洗脫過程如下1-0％緩沖液B(為100％緩沖液A水，3％(v/v)乙腈，0.1％(v/v)三氟乙酸6分鐘；2-100％緩沖液B(乙腈100％)，直至第11分鐘；3-0％緩沖液B直到第19分鐘，在柱子的出口，測(cè)尿黑酸的288nm吸光度。形成產(chǎn)物的量由層析圖中峰面積確定。
b)Km值的測(cè)定HPPD對(duì)HPP的Km值是通過測(cè)量在不同濃度HPP(5.5μM至1400μM)下反應(yīng)初速度來確定的。
c)IC50的測(cè)定IC50的測(cè)定是通過在下述條件下，測(cè)定反應(yīng)初速度得到的。即在有鐵，維生素C，1056μM濃度的底物和不同濃度抑制劑存在下，孵育酶30℃10分鐘后測(cè)定。使用的2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺酰基-4-三氟苯甲基)丙烷-1，3-二酮濃度在10-10到10-4M之間。
酶對(duì)其底物，即4-羥基苯丙酮酸的估計(jì)Km值和以比較活性估測(cè)的I50值見下表HPPD(未突變) SyN318SyA318Km 60μM 470μM320μMI5080μM 80μM 40μM以上結(jié)果證實(shí)，此蛋白質(zhì)C末端部分的突變，是通過降低酶對(duì)底物的親和力(Km)起作用的，但通過降低酶對(duì)抑制劑的親和力(I50)起的作用更強(qiáng)。事實(shí)上突變的HPPD I50與未突變HPPD的I50之比，對(duì)SyN318和SyA 318而言分別為1000和500，而突變HPPD的Km與未突變HPPD的Km之比，對(duì)SyN318、和SyA 318而言分別為8和5(這反映了對(duì)底物親和力喪失)。這是一個(gè)很好例子，即此兩個(gè)變異體對(duì)酶的底物親和力稍有下降，但對(duì)酶的抑制劑2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮的親和力顯著降低。
這些結(jié)果證實(shí)，實(shí)例例1所述的比色篩選試驗(yàn)可檢測(cè)對(duì)HPPD活性抑制劑有耐受性的HPPD突變體。它是一有效工具，可用于篩選和鑒定對(duì)HPPD抑制劑有耐受性的HPPD突變株。這種篩選方法快速而簡(jiǎn)單，這就是其為什么被使用的原因。當(dāng)然，也可用其它方法進(jìn)行類似的分析，如-一種測(cè)定活性和抑制作用的篩選方法是基于HPP的消失(放射試驗(yàn)分光光度試驗(yàn)等)，或基于氧耗量或基于尿黑酸的出現(xiàn)。
-體內(nèi)篩選方法，如在HPPD抑制劑物存在的情況下，以HPP作為碓一碳培養(yǎng)細(xì)胞可選擇出只耐受，HPPD的克隆。
-完全可以想象在作物中進(jìn)行體內(nèi)篩選，采用植物轉(zhuǎn)化載體，利用轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，再生系統(tǒng)，和用HPPD抑制劑的選擇系統(tǒng)。見實(shí)施例5和8所述。
實(shí)施例8在煙草中，評(píng)價(jià)突變和非突變的集胞藻HPPD，突變體為SyA 318，非突變體為SyA 318。
A)構(gòu)建嵌合基因用于構(gòu)建在煙草作物pBD6中可表達(dá)集胞藻(野生型式突變型)HPPD的質(zhì)粒載體稱為pRD224(見實(shí)施例5所述)。這個(gè)載體最初用于克隆所有的假單胞菌HPPD突變體，方法是在位點(diǎn)Kpml和BstEⅡ間直接替換截短的HPPD基團(tuán)。它也可用于克隆集胞藻HPPD基因以獲得轉(zhuǎn)基因植物。
B)克隆策略通過替換編碼截短的熒光假單胞菌HPPD的序列，將編碼集胞藻HPPD的序列克隆到載體pRD224中。但是它不能直接克隆到KpnⅠ和BstEⅡ位點(diǎn)之間，因?yàn)榧搴图賳伟鶫PPD基因的N端序列差別很大。然而，克隆在OTP BamHⅠ和BstⅡ位點(diǎn)之間是可能的，要如此做，必須在5’端，HPPD序列上游，重建BamHⅠ位點(diǎn)，其下游為OTP編碼部分。
用PCR方法擴(kuò)增載體pTRC99A中的集胞藻HPPD基因，引物為A和B、引物A可加到HPPD上游的BamHⅠ位，還可在該基因的起始點(diǎn)和BamHⅠ位點(diǎn)之間加入部分OTP序列。引物B可加到該基因下游的BstEⅡ位點(diǎn)上。引物A和B的序列SEQ ID N0 20和21如下所示引物A．5’NNNNNNNNNN GGATCCGGTG CATGGAATTC GACTATCTTC 3’引物B．5’NNNNNNNNNN GGTCACCAGT ATTCATAATG TTAATTATG 3’擴(kuò)增反應(yīng)在52℃雜交溫度下進(jìn)行。PCR產(chǎn)物隨后在瓊脂糖凝膠上分離，切取相當(dāng)于HPPD基因的DNA條帶并純化。
擴(kuò)增片段先在37℃用BamHⅠ消化一小時(shí)，隨后用BstE消化60℃1小時(shí)、然后再瓊脂糖凝上分離該插入片段，切取相當(dāng)于HPPD基因的DNA條帶，然后純化。
將這個(gè)片段隨后克隆入二元載體，(該載體預(yù)先經(jīng)BamHⅠ和BstEⅡ酶消化)并在瓊脂糖凝膠上分離出相當(dāng)于截短HPPD的片段。純化此載體，方法與HPPD基因純化相同。
二元載體和此插入片段于16℃用T4連接酶連接過夜。連接混合物用于轉(zhuǎn)化電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞DH10B。在含50μg/ml而卡那霉素LB培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。小量制備并用BamHⅠ和SacⅠ 37℃1小時(shí)消化該質(zhì)粒DNA后，在載體中瓊脂糖凝膠上檢查該二元載體中是否有在所需插入片段。重視載體用于轉(zhuǎn)化電感受態(tài)的根癌土壤桿菌EHA105細(xì)胞，在含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。重視載體為TDNA攜帶者，含有抗卡那霉抗性素基，并且含有在雙組蛋白啟動(dòng)子和Nos終止子控制下的編碼OTP-集胞藻HPPD單元的序列。
C)煙草變異體pBD6的轉(zhuǎn)化/再生轉(zhuǎn)化過程如實(shí)施例5所述，只是篩選先用200mg/毫升的卡那霉素。
另一方面，經(jīng)卡那霉素篩選得到的幼芽被一個(gè)個(gè)地切下移栽到無激素的培養(yǎng)基上，以促進(jìn)生根。培養(yǎng)基含2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮以篩選耐受該除草劑的轉(zhuǎn)基因芽胚。培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，它含有350mg/l的cefotaxine，1％蔗糖(P/V)和0或8ppm 2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟苯甲基)丙烷-1，3-二酮。在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中過量產(chǎn)生的HPPD可使耐受2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮的綠色芽胚發(fā)青，而來自于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，對(duì)除草劑敏感的芽胚則完全呈白色。
兩周以后，根已足夠生長(zhǎng)，可以將芽胚移種于土壤在溫室培育。
D)結(jié)果每次構(gòu)建，平均60葉盤，約40個(gè)芽生出。在有2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲苯基)丙烷-1，3-二酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后，某些芽胚開始發(fā)白生根8天后，這種變白已相當(dāng)顯著。在8ppm 2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺酰基-4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮，觀察到，含野生型酶的作物僅存活40％，而含SyA 318酶的作物存活72％，含SyN318酶的存活88％。含突變酶的種植物顯示的耐受性優(yōu)于含野生型酶的種植物。
在8ppm 20氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲磺?；?4-三氟甲基苯基)丙烷-1，3-二酮培育，一個(gè)多月以后，野生型HPPD轉(zhuǎn)化的綠色芽胚的數(shù)目為0，而SyN318為17％突變的SyA 318為19％。
如果在5-10ppm濃度的2-氰基-1-[4-(甲磺?；?-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲磺環(huán)丙基)丙烷-1，3-二酮(HPPD較弱的抑制劑EP496630)，平行地進(jìn)行再生試驗(yàn)這三種基因形成的作物可能在形態(tài)上完全一致。這證明如果需要的話，讓突變式未突變的HPPD過量表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)室中有可能獲得耐受性。
這些結(jié)果看來與體外酶動(dòng)力學(xué)獲得的結(jié)果一致，看來顯然可以在體外生化測(cè)定值和體內(nèi)獲得的結(jié)果之間建立一種相關(guān)性。
后一實(shí)施例證實(shí)體外篩選(實(shí)施例11)，生化分析(實(shí)施例6)和作物的耐受性之間至少部分是一致的。序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名羅納-普朗克農(nóng)業(yè)公司(B)街道14-20 Rue Pierre BAIZET(C)城市里昂(E)國(guó)家法國(guó)(F)郵政編碼69009(ⅱ)發(fā)明名稱突變的羥基苯丙酮酸雙氧化酶、其DNA序列和含該基因且耐除草劑的植物的分離(ⅲ)序列數(shù)21(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)序列1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1GAAGTTGCCC TCGCCCCACC CATCGTCGCC CTT33(2)序列2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2GAAGTTGCCC TCGCCRAKCC CATCGTCGCC CTT33(2)序列3的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3CTTGAAGTTG CCCTCCCAAA ACCCATCGTC GCC33(2)序列4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4CTIGAAGTIG CCCTCGTCAA ACCCATCGTC GCC33(2)序列5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5CTTGAAGTTG CCCTCGCTAA ACCCATCGTC GCC33(2)序列6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6:CTTGAAGTTG CCCTCRAKAA ACCCATCGTC GCC33(2)序列7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性
(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7CAGCGCCTTG AAGTTGTCCT CGCCAAACCC ATC33(2)序列8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8CAGCGCCTTG AAGTTYTCCT CGCCAAACCC ATC 33(2)序列9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9CAGCGCCTTG AAGTTCCACT CGCCAAACCC ATC33(2)序列10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10CAGCGCCTTG AAGTTDACTC GCCAAACCCA TC32(2)序列11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度32堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11CGCTTGAAGT TNNNCTCNNN AAACCCATCG TC 32(2)序列12的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12GAACAGCGCC TTGAARAKGC CCTCGCCAAA CCC33(2)序列13的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13GCCTTCCACG GAAGATTCGT CCAGCAGGAT ACC33(2)序列14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14TCGAGAGAGA GGTGACCGAG AGA 23(2)序列15的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15TCGATCTCTC GGTCACCTCT CTC 23(2)序列16的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16ATTATGGAAT TCGACTATCT T 21(2)序列17的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17CAGTATTCAT AATGTTAATT ATG23(2)序列18的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18CGGGCAAAAG GATTTARCCA AGGAAACTTT CAAG34(2)序列19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(xi)序列描述SEQID NO19CGGGCAAAAG GATTTSCNCA AGGAAACTTT CAAG34(2)序列20的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度40堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO20NNNNNNNNNN GGATCCGGTG CATGGAATTC GACTATCTTC40(2)序列21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度39堿基對(duì)(B)類型核苷酸(C)鏈單鏈(D)拓?fù)漕愋途€性(ⅱ)分子類型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21NNNNNNNNNN GGTCACCAGT ATTCATAATG TTAATTATG 39
權(quán)利要求
1．一種功能上突變的HPPD，它對(duì)HPPD抑制劑較不敏感，其特征在于其C末端部分中至少含有一個(gè)突變。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述突變的HPPD，其特征在于酶的C末端部分有一個(gè)連接肽，因而不同于它的N端部分。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述突變的HPPD，其特征在于參照假單胞菌的HPPD，該連接肽存在于HPPD C末端部分的N端，位于161位天門冬氨酸上游5和15個(gè)氨基酸之間。
4．根據(jù)權(quán)利要求1到3之一所述突變的HPPD，其特征在于C一末端部分構(gòu)成了蛋白質(zhì)序列，該蛋白質(zhì)序列一端是連接肽，另一端是此酶的C端。
5．根據(jù)權(quán)利要求1到4之一所述突變的HPPD，其特征在于突變是對(duì)氨基酸進(jìn)行的，所述的氨基酸被具有更大空間位障的氨基酸替代。
6．根據(jù)權(quán)利要求1到5之一所述突變的HPPD，其特征在于突變是針對(duì)空間位阻低的氨基酸進(jìn)行的。
7．根據(jù)權(quán)利要求6所述突變的HPPD，其特征在于空間位阻低的氨基酸是甘氨酸(Gly)。
8．根據(jù)權(quán)利要求1到7之一所述突變的HPPD，其特征在于突變位置的氨基酸被以下氨基酸之一替代谷氨酸胺(Gln)，谷氨酸(Glu)，亮氨酸(Leu)，異亮氨酸(Ile)或色氨酸(Trp)。
9．根據(jù)權(quán)利要求1到8之一所述突變的HPPD，其特征在于突變是對(duì)幾種HPPD序列的C末端部分中共同的氨基酸進(jìn)行的。
10．根據(jù)權(quán)利要求1到9之一所述突變HPPD，其特征為在它的C末端包含有下列肽序列-甘-苯丙-Xaa-Yaa-Xab-天門冬酰胺-苯丙-Yab-Yac-亮-苯丙-其中Xaa和Xab獨(dú)立地各自代表甘氨酸或空間位阻比甘氨酸大的氨基酸，如果Xaa或Xab中的一個(gè)代表甘氨酸，則另一個(gè)不是甘氨酸，Yaa代表任何氨基酸，優(yōu)選的是丙氨酸、賴氨酸或谷氨酸，Yab代表任何氨基酸，優(yōu)選的是賴氨酸、絲氨酸、精氨酸或天門冬酰胺，Yac代表任何氨基酸，優(yōu)選的是丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺。
11．根據(jù)權(quán)利要求10所述突變的HPPD，其特征與至少Xaa或Xab之一為亮氧酸、谷氨酸、色氨酸或異亮氨酸。
12．根據(jù)權(quán)利要求11所述突變的HPPD，萁特征在于Xab代表甘氨酸、色氨酸或異亮氨酸，優(yōu)選的是色氨酸。
13．根據(jù)權(quán)利要求1至12之一所述突變的HPPD，其特在于，參照假單胞菌HPPD的序列，突變氨基酸選自以下氨基酸脯215，甘298，甘332，苯丙333，甘334，甘336和天門冬酰胺337，優(yōu)選的是脯215和336。
14．根據(jù)權(quán)利要求14所述突變的HPPD，其特征是它含有的突變選自以下突變脯215亮；甘336谷氨酸；甘336色氨酸或甘氨酸336異亮氨酸。
15．一種核酸序列，它編碼如權(quán)利要求1到14之一所述的突變HPPD。
16．一種嵌合基因，它在5’和3’位置中包含編碼序列以及異源性調(diào)控元件，能在宿主生物特別是植物細(xì)胞或種植物中起作用，其特征在于該編碼序列含有至少一種編碼前述突變的HPPD的核酸序列。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的嵌合基因，其特征在于宿主生物選自細(xì)菌，如大腸桿菌；酵母菌，特別是酵母菌屬或克氏梭菌屬，畢赤酵母屬；真菌，特別是曲霉菌；桿狀病毒或植物細(xì)胞和植物。
18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的嵌合基因，其特征在于宿主生物是植物或植物細(xì)胞。
19．根據(jù)權(quán)利要求18所述的嵌合基因，其特征在于，在編碼突變HPPD的核酸序列的5’端包含有編碼植物轉(zhuǎn)移肽的核酸序列，這個(gè)序列位于啟動(dòng)子區(qū)和突變HPPD編碼序列之間，使能表達(dá)轉(zhuǎn)移肽和突變HPPD的融合蛋白。
20．一種轉(zhuǎn)移肽/突變HPPD的融合蛋白，突變HPPD為如權(quán)利要求要求1到14之一中所述的HPPD。
21．一種用于轉(zhuǎn)化宿主生物的克隆和/或表達(dá)載體，其特征在于它包含至少一種權(quán)利要求16到19之一所述的嵌合基因。
22．一種轉(zhuǎn)化宿主生物的方法，其特征在于，如權(quán)利要求5所述的至少一種核酸序列，或如權(quán)利要求16到19任一所述的一種嵌合基因被穩(wěn)定地整合到所述宿主生物中。
23．根據(jù)權(quán)利要求22所述方法，其特征在于宿主生物為一種植物細(xì)胞。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述方法，其特征在于從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生植物。
25．一種轉(zhuǎn)化的宿主生物，特別是植物細(xì)胞或植物，其特征在于它含有權(quán)利要求15所述的核酸序列，或權(quán)利要求16到19之一所述的嵌合基因。
26．一種植物細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求15所述的核酸序列或權(quán)利要求16到19之一所述的嵌合基因。
27．一種轉(zhuǎn)化的植物，其特征在于它含有權(quán)利要求26所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
28．根據(jù)權(quán)利要求27所述的種植物，其特征在于它由權(quán)利要求26所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生。
29．一種轉(zhuǎn)化的種植物，其特征在于它來自權(quán)利要求28中所述的再生作物的培育或/和雜交體。
30．根據(jù)權(quán)利要求27到29之一所述的轉(zhuǎn)化植物，其特征在于它們選自單子葉，特別是谷物、甘蔗、水稻和玉米，或選自雙子葉，特別是煙草、大豆、油菜、棉花、甜菜和蓿苜。
31．根據(jù)權(quán)利要求27到30之一所述的轉(zhuǎn)化植物的種子。
32．在種有權(quán)利要求31所述種子或權(quán)利要求27到30之一所述轉(zhuǎn)化植物的一定面積田地中控制野草的方法，該方法包括在所述面積的田中，施加對(duì)野草有毒性劑量的HPPD抑制劑除草劑，但不明顯影響用本發(fā)明所述嵌合基因轉(zhuǎn)化的種子和植物。
33．培育權(quán)利要求27到30之一所述被轉(zhuǎn)化的植物的方法，該方法包括在適宜種植所述植物的田地中，播種權(quán)利要求31所述的轉(zhuǎn)化作物的種子，如果存在野草，在上述面積田地中，施灑對(duì)野草有毒性劑量的，以HPPD為靶子的除草劑，但不明顯影響所述種子或所述轉(zhuǎn)化作物，當(dāng)栽培的作物達(dá)成熟時(shí)，收獲這些作物，可能的話，分離出收獲植物的種子。
34．根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的方法，其特征在于HPPD抑制劑選自異噁唑，特別是isoxaflutole；腈基二酮，特別是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1，3-二酮和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4；2，3 Cl2苯基)-丙烷-1，3-二酮；三酮，特別是sulcotrione或吡唑酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)編碼對(duì)HPPD抑制劑耐受性改善的突變HPPD的核酸序列,含有所述序列作為編碼序列的嵌含基團(tuán)以及它在獲得對(duì)某些除草劑有耐受性的植物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1285875SQ9881304
公開日2001年2月28日 申請(qǐng)日期1998年11月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月7日
發(fā)明者P·布德, H·布爾東, F·迪馬, M·羅杰斯, A·薩利安德 申請(qǐng)人:阿方蒂農(nóng)科股份有限公司