專利名稱：可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物和測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有攜帶淬滅熒光部分的可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物的試劑，制備該試劑的方法以及采用該試劑的試驗方法。
背景技術(shù)：
核酸酶(DNA酶和RNA酶)是水解切割斷裂多核苷酸(即核酸如DNA和RNA)的酶。這些酶存在于每個活細胞中，執(zhí)行著核酸代謝、復制、重組、修復和修飾許多必要功能。核酸酶可以根據(jù)其底物特異性來區(qū)分一些核酸酶切割DNA和RNA，其它的僅作用于一種核苷酸；一些是序列特異性的，其它的則不是；一些作用于單鏈核酸，其它的需要雙鏈DNA才能起作用。它們可能在其它方面也具有選擇性，例如它們所切割的鍵的位置；它們在細胞中的位置，即在細胞內(nèi)還是細胞外；離子和pH的需求；以及對熱處理的耐受能力。核酸酶在Linn,S.M.,Lloyd,R.S.,Roberts,R.J.,Nuclease(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY,1994中有進一步的說明。
抗生素抗性細菌菌株和食物引起的疾病是公眾非常關(guān)注的。在保健、美容、食物和飲料工業(yè)中，微生物污染危險的控制是一個嚴重的健康和安全問題。細菌測試是控制微生物污染危險綜合措施的一部分。通常通過細菌產(chǎn)生的酶來測試該細菌的存在。微生物產(chǎn)生核酸酶水解并斷裂核酸的能力在很久以前就已認識到。該酶尤其可用來檢測非增殖性細菌細胞，因為該酶每秒能催化多達數(shù)百萬的底物分子發(fā)生斷裂反應(yīng)，從而能夠檢測少量的細菌細胞。細菌產(chǎn)生的某些核酸酶可廣泛用來鑒定和特性分析某些種類的病原性。
測定核酸酶活性的已知方法包括UV吸收和電泳或?qū)游龇蛛x經(jīng)消化的DNA片段，然后進行熒光染色。已經(jīng)發(fā)展了采用天然DNA、合成的底物以及DNA-結(jié)合性分子的其它方法(ⅰ)比色的DNA-結(jié)合性分子。在天然DNA與合適生長培養(yǎng)基的混合物中可加入甲苯胺藍(TB)或甲基綠(MG)。這些染料與DNA形成了呈藍色(TB)或綠色(MG)的復合物。DNA酶水解該復合物釋放出染料，從而產(chǎn)生一個顏色不同(紅色(TB)或無色(MG))的區(qū)域。
(ⅱ)熒光DNA-結(jié)合性分子。在天然DNA與生長培養(yǎng)基的混合物中可加入吖啶橙(AO)或其它合適的染料，例如Hoescht染料33258或從MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR獲得的商標名為TOTOTM或YOYOTM的二聚花菁核酸。這些化合物在水溶液中有微弱的熒光，但是在與DNA結(jié)合后變成強熒光。DNA酶水解DNA導致熒光被完全除去，看上去細菌菌落周圍是無熒光的光暈。
(ⅲ)產(chǎn)色素的合成性底物。該方法中采用兩類合成底物來檢測核酸酶活性。第一類是胸苷5′-單磷酸對硝基苯酯銨鹽。在經(jīng)芽孢桿菌類的純化的胞外核酸酶水解后，它釋放出對硝基苯酚，這表現(xiàn)為410nm的吸光度增加。第二類是5-溴-4-氯-吲哚基-胸苷-3′-磷酸，它在水解時釋放出吲哚酚基團，該基團經(jīng)自氧化作用產(chǎn)生藍-綠靛藍顏色。
(ⅳ)熒光原性(fluorogenic)合成性底物。它有兩類。第一類是采用聚(脫氧(亞乙烯基)腺苷酸)(聚(脫氧腺苷酸)的衍生物)的熒光測定方法。該多核苷酸在完整時有微弱的熒光。然而，在DNA酶水解時，由于釋放出有熒光的亞乙烯基單核苷酸，因此可以觀察到熒光增強(激發(fā)波長Ex為320納米(nm)，發(fā)射波長Em為410納米)。該信號可以連續(xù)監(jiān)測，并能與產(chǎn)生的單核苷酸數(shù)量相關(guān)聯(lián)。已知另一種熒光測定方法是利用熒光“反淬滅(dequenching)”技術(shù)?？捎脽晒馑?-異硫氰酸酯(Ex=490nm，Em=520nm)標記14-聚多核苷酸。在與未標記的互補鏈雜交后，由于DNA與熒光團之間的相互作用，50％的熒光被淬滅。用限制性內(nèi)切核酸酶切斷雜交的物質(zhì)(即鏈分裂)使熒光強度因“反淬滅”而增加2倍。
DNA-結(jié)合分子通常并非是序列特異性的，其信號可能會受樣品中存在的內(nèi)源DNA的影響。在一些情況下，它們可能還會受表面活性劑、EDTA或細胞碎片存在的影響。產(chǎn)色素的合成底物通常需要較大的量(毫摩爾的量)，這可能會增加試驗成本，在一些情況下會導致不溶解。同樣，以吸收為基礎(chǔ)的方法的靈敏度本身也比熒光為基礎(chǔ)的方法低幾個數(shù)量級。至于熒光原性底物，可獲得的核酸酶試劑很少。另外，已經(jīng)報道的方法要么性能一般，要么受限于特異性的酶，如外切核酸酶。
目前可行的最靈敏的檢測技術(shù)之一是熒光檢測方法。用熒光微量試驗已經(jīng)研究了則托摩爾(zeptomolar，10-21M)量的酶分子。已經(jīng)用熒光顯微術(shù)檢測到油分散液滴中的單個酶分子。用電泳方法在毛細管中操縱單個酶分子并用熒光分光術(shù)監(jiān)測。見Xue，Q.,Yeung,E.S.,“單個酶分子的化學反應(yīng)性的差別”，Nature，1995，373，681-683。已經(jīng)發(fā)展了用β-半乳糖苷酶作為標記酶來檢測大腸桿菌的試驗。發(fā)現(xiàn)該熒光測定的靈敏度比比色方法提高250倍，檢測時間減少5小時。見Van Poucke,S.O.,Neils,H.J.,“開發(fā)一種靈敏的化學發(fā)光測定試驗來檢測透化的大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶并與熒光測定以及比色測定進行比較”，Appl.Env.Microbiol.,1995，61，4505-4509。
發(fā)明公開簡言之，本發(fā)明提供一種試劑，該試劑包含至少一個可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物，該底物攜帶的至少一個熒光部分(moiety)與至少一個其它毗鄰的熒光部分緊密靠近，此毗鄰的熒光部分相互淬滅熒光，在底物斷裂時，該熒光部分很容易用熒光測定技術(shù)來檢測。
該試劑可包含一種可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物該底物包括一條自身互補的單鏈多核苷酸，它的3′和5′端各自攜帶了一個熒光部分；該底物也可包含兩條互補雜交的多核苷酸鏈，每條鏈有3′和5′端，其中一個或兩個3′/5′配對的每一端攜帶了一個熒光部分；或該底物包含單鏈多核苷酸，該單鏈多核苷酸沿其長度至少有兩個懸垂的毗鄰的熒光部分。
本發(fā)明還提供了一種生物試驗方法，該方法包括下列步驟合并(1)一種試劑和(2)一種測試樣品，其中該試劑包含至少一種可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物，該底物攜帶的至少一個熒光部分與至少一個其它毗鄰的熒光部分緊密靠近，所述毗鄰的熒光部分相互淬滅熒光，但是在分開時很容易用熒光測定技術(shù)來檢測；該測試樣品可能含有受測試的特異性酶，其中受測試特異性酶的存在將導致多核苷酸斷裂、熒光部分分開以及熒光強度升高。
本方法的另一個實施方案包括測定熒光強度升高的額外步驟。
熒光很容易通過常規(guī)技術(shù)，如輻射能照射、熒光顯微鏡、96孔板讀數(shù)儀或流式細胞計數(shù)儀來進行觀察。
本發(fā)明還提供了制備攜帶淬滅性熒光部分的可特異性酶切斷裂的多核苷酸試劑的方法。該方法包括制備一種試劑，該試劑包含攜帶熒光部分的可特異性酶切斷裂的多核苷酸，該熒光部分通過染料二聚化而相互淬滅，在分開時可用熒光測定技術(shù)來檢測，所述方法包括下列步驟使一種或多種攜帶一個或多個熒光部分以及一個或多個反應(yīng)性基團的熒光化合物與可特異性酶切斷裂的多核苷酸合并，該多核苷酸選自以下(1)自身互補的單鏈多核苷酸，它具有與一個或多個熒光化合物起反應(yīng)性的一個或多個末端基團，(2)單鏈多核苷酸，在該多核苷酸中非末端的其它位置上有兩個或多個部分具有與一個或多個熒光化合物反應(yīng)的懸垂基團；和(3)互補的多核苷酸，每條鏈在一個或兩個3′/5′配對的3′和/或5′端分別具有至少一個與一個或多個熒光化合物反應(yīng)的反應(yīng)性末端基團，這種合并在產(chǎn)生所述試劑的反應(yīng)條件下發(fā)生。
在本文的描述中“染料二聚化”指兩個染料基團之間形成非共價結(jié)合的復合物；“染料堆積(stack)”指兩個或多個染料基團之間形成非共價結(jié)合的復合物，兩個復合的染料基團稱為“二聚體”，三個復合的染料基團稱為“三聚體”；“可特異性酶切斷裂的多核苷酸”指核苷酸的線狀序列，該核苷酸包含易受特異性酶斷裂的特異性鍵；“熒光”指物質(zhì)在吸收不同波長的光時發(fā)出的給定波長的光，其中光發(fā)射僅僅在光吸收期間發(fā)生；“熒光量子產(chǎn)額”指發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的熒光光子數(shù)目與該物質(zhì)吸收的總光子數(shù)之比。
“熒光原性(fluorogenic)底物”指基本上沒有熒光的材料，其受酶作用時會產(chǎn)生一種有熒光的化合物；“熒光團”、“染料部分”、或“染料基團”指，由于吸收當受不同波長(通常較短)的光受激發(fā)后，能發(fā)射給定波長的光的分子或該分子的一部分。
本發(fā)明為檢測和鑒定微生物提供了比常規(guī)試驗方法更好的優(yōu)點。本發(fā)明提供了一種迅速和簡便的方法，該方法采用具有熒光部分的可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物(在本文也稱為熒光原性核酸酶底物)來測定胞外和胞內(nèi)酶的活性和/或檢測它的存在。該方法還可修改成依賴于序列或不依賴于序列的測試。本發(fā)明的方法和試劑提高了準確性，加快了檢測，降低了檢測和鑒定微生物的總體成本。在各實施方案中，本發(fā)明利用可測定的熒光差別來檢測核酸酶。在較佳的實施方案中，本發(fā)明提供了熒光原性指示劑，該指示劑斷裂時顯示出的信號水平較高，與之相比淬滅時的信號水平則要低得多。這最好在可見光波長范圍內(nèi)進行，以最大程度地減小生長培養(yǎng)基背景熒光的干擾。
通過將發(fā)射波長從遠紫外區(qū)(約350至400納米)向紅光移動(red-shift)至電磁光譜的500-600納米區(qū)域，從而減少完整試劑背景信號水平的作用，本發(fā)明能更準確地、靈敏地測定在其它因素中核酸酶的存在。本發(fā)明的另一個優(yōu)點是它是均相生物學試驗方法，不需要顯影劑。因此，不需要象諸如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和生物發(fā)光等試驗方式那樣進行耗時的分離步驟。用基礎(chǔ)分離培養(yǎng)基就能檢測并鑒定微生物。
可以看出，本發(fā)明的試驗方法其特征在于更有效地利用了試劑、勞力、時間和裝置。通過合理地設(shè)計和選擇多核苷酸以及與其連接的熒光團，本發(fā)明還可能同時測定幾種細菌和/或酶。本發(fā)明描述的試驗方法可用來檢測和鑒定微生物、滅菌保障、藥物發(fā)現(xiàn)、臨床試驗、核酸雜交、測序和擴增。
附圖簡述

圖1示意性地描述了熒光原性核酸酶底物被細菌產(chǎn)生的酶斷裂的概念化機理，其中熒光原性核酸酶底物是自身互補的單鏈多核苷酸，該多核苷酸表現(xiàn)出分子內(nèi)二聚化作用并淬滅了連接在多核苷酸3′和5′端的熒光部分，在多核苷酸斷裂時，該熒光部分分開并容易被檢測。
圖2示意性地描述了熒光原性核酸酶底物被細菌產(chǎn)生的酶斷裂的概念化機理，其中熒光原性核酸酶底物是具有懸垂熒光部分的單鏈多核苷酸，懸垂的熒光部分緊密靠近地足以通過染料堆積而相互淬滅，在多核苷酸斷裂時，這些熒光部分分開并容易被檢測。
圖3示意性地描述了熒光原性核酸酶底物被細菌產(chǎn)生的酶斷裂的概念化機理，其中熒光原性核酸酶底物包含兩條互補的雜交的多核苷酸鏈，這兩條鏈表現(xiàn)出發(fā)生分子間二聚化作用并淬滅分別標記在兩個互補多核苷酸之3′端和5′端的兩個熒光部分，這些熒光部分在多核苷酸斷裂時分開并容易被檢測。
圖4是四甲基羅丹明-標記的25聚雙鏈多核苷酸在與100毫摩爾pH 8.9的碳酸氫鹽緩沖液配的微球菌核酸酶37℃培育前(線條b)后(線條a)相對的熒光強度。
圖5是四甲基羅丹明-標記的24聚自身互補的單鏈寡核苷酸在與100毫摩爾pH8.9的碳酸氫鹽緩沖液配的微球菌核酸酶37℃培育前(線條c)后(線條d)的吸收光譜圖線。
詳細描述在本發(fā)明中，描述了一種提供包含核酸酶底物的試劑的新方法。該底物在接觸受測試核酸酶時其淬滅的熒光部分得以分開，從而使可檢測的熒光增加。
制備該核酸酶底物首先是指定一個待用的多核苷酸。這可通過選擇多核苷酸內(nèi)含的堿基或堿基對(A/T或G/C)來實現(xiàn)?？墒怪T熒光部分緊密靠近的任何構(gòu)型均可采用?？捎秒s交來獲得合適的構(gòu)型。當多核苷酸互補堿基對相互吸引時，產(chǎn)生雜交?？赡艿臉?gòu)型例如包括3′和5′端連接了熒光染料部分的自身互補的單鏈多核苷酸，它會自身雜交(即折疊起來)，從而使多核苷酸各端連接的熒光部分緊密靠近。另一種構(gòu)型包括兩條相互互補的單鏈多核苷酸，它們各自具有3′和5′端，其中一個或兩個3′/5′配對的末端各攜帶了一個熒光部分，當兩條多核苷酸雜交形成雙鏈多核苷酸時，各單鏈多核苷酸的一端或兩端所連接的熒光部分相互緊密靠近。另一種方法涉及一條單鏈多核苷酸，其中在該多核苷酸鏈上懸垂了兩個或多個熒光染料部分，這些染料部分以合適長度沿鏈間隔開但非常靠近，從而使得這些熒光部分有可能靠得很緊而淬滅熒光。
對于雜交的構(gòu)型而言，雜交程度只需是以使連接的染料部分緊密靠近即可。通常，靠近到距離連接有熒光部分的3′/5′端大約5個堿基對發(fā)生雜交就足夠了。該數(shù)目在很大程度上取決于以下因素，例如多核苷酸中的堿基對類型以及熒光部分的二聚化常數(shù)。
還可指定多核苷酸含有一個或多個能被測試的核酸酶切割斷裂的鍵。策略上應(yīng)使這些鍵位于多核苷酸中，這樣斷裂將會使熒光部分分開。對于形成雙鏈多核苷酸的自身互補單鏈多核苷酸或兩條相互互補的多核苷酸，可斷裂的鍵通常應(yīng)位于連接熒光部分的多核苷酸一端或兩端附近。對于具有懸垂部分的單鏈多核苷酸，可斷裂的鍵通常應(yīng)位于染料部分之間。
另外，可在多核苷酸中熒光部分理想的具體位置上插入針對所選熒光部分的結(jié)合位點。這些位點可以在多核苷酸的末端(在多核苷酸發(fā)生雜交的情況下)，或在多核苷酸鏈上(即骨架上)(在懸垂的染料連接單鏈多核苷酸的情況下)。這些結(jié)合位點含有反應(yīng)性基團，如脂肪族伯胺，它很容易與包含待連接到多核苷酸的熒光部分的熒光化合物反應(yīng)。
一旦確定了多核苷酸，就可以用例如已知的人工或自動化DNA合成方法來合成該多核苷酸。然后使該多核苷酸與包含熒光部分的一種或多種化合物反應(yīng)。熒光化合物通常還含有反應(yīng)基團，能包含與多核苷酸上的反應(yīng)性基團反應(yīng)。該反應(yīng)在合適的濃度、攪拌狀況、pH、離子和溫度條件下進行，從而使熒光部分連接到多核苷酸的所選部位上。具體需要的條件將分別根據(jù)多核苷酸中的反應(yīng)性基團以及使用的熒光化合物而不同。用緩沖液(如碳酸鹽或碳酸氫鹽緩沖液)控制pH。本發(fā)明所用的熒光部分具有二聚化或堆積而淬滅熒光的能力。
本發(fā)明還提供了一種生物學試驗方法，該方法包括下列步驟合并(1)一種試劑和(2)一種測試樣品，該試劑包含至少一種可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物，該底物攜帶的至少一個熒光部分與至少另一個毗鄰的熒光部分緊密靠近，所述這些毗鄰的熒光部分相互淬滅熒光，但是在分開時很容易用熒光測定技術(shù)來檢測；該測試樣品可能含有受測定的特異性酶，其中受測特異性酶的存在將導致該多核苷酸斷裂、熒光部分彼此分開以及熒光強度升高。
該方法的另一個實施方案包括測定熒光強度增加的額外步驟。這可通過輻射能照射、熒光顯微鏡、96孔板讀數(shù)儀或流式細胞計數(shù)儀來進行。
圖1示出了本發(fā)明的較佳實施方案?？梢院铣勺陨砘パa的多核苷酸10，即，該多核苷酸發(fā)生鏈內(nèi)自身雜交。當熒光染料部分11和12連接在3′和5′端時，只觀察到微弱的熒光，因為染料部分靠得非常近，從而導致相互淬滅。在用細菌14產(chǎn)生的核酸酶13處理時，多核苷酸10例如會在15、16和17位發(fā)生斷裂，這樣就破壞了自身雜交的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生核苷酸片段18和解離的、自由發(fā)出熒光的非二聚化染料部分11′和12′。在該實施方案中，多核苷酸鏈必須足夠長，以便允許多核苷酸折疊起來并使熒光染料部分相互緊密靠近。通常，大約15個堿基對就足夠了。
圖2顯示了本發(fā)明的第二個較佳的實施方案。將多個熒光染料部分22連接到多核苷酸20上，該多核苷酸20含有易發(fā)生酶促切割斷裂的不同位點24。染料部分22相互緊密靠近得足以使染料部分22的熒光淬滅。用細菌28產(chǎn)生的核酸酶26處理該偶聯(lián)物(包含多核苷酸20和熒光染料部分22)來切割斷裂多核苷酸20。斷裂產(chǎn)生了核苷酸片段29，并使染料部分22′在基質(zhì)中相互分開，因此它們可以自由地發(fā)出熒光并很容易被檢測。在該實施方案中，較佳的是熒光部分22的間隔沿多核苷酸骨架小于堿基與堿基間測得的10納米。該長度是根據(jù)已知的或估計的多核苷酸堿基長度通過間接方法測得的。圖2所示的構(gòu)型可用來測試多種類型的細菌或酶，其方法是使其具有一系列不同種類的成對或成組的熒光部分，每一類可用熒光測定技術(shù)與其它類區(qū)分開來，每對或每組的單個部分由易被不同細菌的酶切斷裂的可斷裂性鍵連接，或是在該鍵的相對側(cè)。
圖3顯示了本發(fā)明還有一個較佳的實施方案?；パa的雜交的多核苷酸30和31在其3′和5′端分別連接熒光熒光染料部分32和33。細菌38產(chǎn)生的核酸酶36在斷裂位點34處斷裂多核苷酸30和/或31，產(chǎn)生了核苷酸片段39和容易被檢測的非二聚化的染料部分32′和33′。還有一個實施方案可以包括使染料部分與各互補多核苷酸的每個3′和5′端相連。圖3所示的構(gòu)型可用來同時測試兩種類型的細菌或酶，其方法是用不同類型的熒光部分標記每個互補的3′/5′末端對，每一類可用熒光測定技術(shù)來與其它類區(qū)分，以及構(gòu)建雙鏈多核苷酸，使雙鏈多核苷酸的每個末端附近具有易被不同種類的細菌酶斷裂的可斷裂位點。
熒光原性底物是一類在酶促水解時從基本上沒有熒光變成有高度熒光的分子。它們可作為分子探針廣泛地用于研究和測試病毒和細菌的酶(如蛋白酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶和激酶)。底物的熒光很容易用常規(guī)的技術(shù)(例如輻射能照射、熒光顯微鏡、96孔板讀數(shù)儀或流式細胞計數(shù)儀)來進行觀察。
通過使多核苷酸與會發(fā)生二聚化或堆積的熒光染料(如熒光素和羅丹明)發(fā)生化學反應(yīng)，就可制得用于本發(fā)明的攜帶熒光部分的可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物或熒光原性核酸酶底物。有用的多核苷酸可從商業(yè)上獲得(例如購自GeneMedBiotechnologies，South San Francisco，CA)。為了制備本發(fā)明的試劑，將兩個或多個熒光部分與該多核苷酸連接，使得熒光部分能夠發(fā)生二聚化或堆積(例如通過牢固地雜交、靠近、鏈間雜交、鏈內(nèi)雜交等)，從而相互淬滅(當熒光部分相同時稱為“自身淬滅(self-quenching)”)熒光部分的熒光。
熒光染料淬滅可通過眾多已知的機理(包括能量轉(zhuǎn)移和染料二聚化)中任一機理而發(fā)生。在這些情況下，當熒光染料分子或部分被輸入的能量(通常是受特定長度的光輻照)激發(fā)時，能量從該染料部分轉(zhuǎn)移到另一部分上，而不是通過發(fā)出熒光而消散。能量轉(zhuǎn)移(又稱為 Frster型偶極-偶極相互作用)在熒光供體和受體之間發(fā)生，熒光受體可能會或可能不會發(fā)出熒光。能量轉(zhuǎn)移通常在沿底物骨架距離約為10納米的供體與受體之間發(fā)生。通過能量轉(zhuǎn)移，供體部分的熒光被淬滅。另一方面，當兩個或多個熒光部分相互緊密靠近得足以使它們的平面芳香族環(huán)相互作用形成基態(tài)(groundstate)復合物(如二聚體和三聚體)時，會發(fā)生染料二聚化或染料堆積。每個熒光部分作用于另一熒光部分，從而導致相互淬滅。處于二聚體或堆積狀態(tài)的染料的吸收光譜與在能量轉(zhuǎn)移配對中的同一染料的吸收光譜大不相同。染料二聚體吸收光譜顯示，隨著染料濃度的增加，主要吸收峰的吸光度有特征性的降低，而肩峰的吸光度特征性地升高。圖5中描述了該現(xiàn)象。對于圖5曲線中的染料分子，主要吸收峰出現(xiàn)在約560納米處，而肩峰出現(xiàn)在約530納米處。二聚化樣品(c)表現(xiàn)出主要吸收峰和肩峰均為約0.03吸收單位(AU)的吸收峰，而未二聚化的樣品(d)顯示出主要吸收峰約為0.06AU，而肩峰變得平坦，約為0.028AU。二聚化樣品中出現(xiàn)的該現(xiàn)象通常稱為“頻帶分裂”。二聚化或堆積通過形成基態(tài)復合物(即通過物理性緊密靠近)產(chǎn)生，而能量轉(zhuǎn)移相互作用則通過空間而產(chǎn)生。因此，通過能量轉(zhuǎn)移機理相互作用的染料不會觀察到染料二聚化作用所特有的光譜變化。
本發(fā)明所用的二聚化的或堆積的染料對或染料組的淬滅機理與熒光能量轉(zhuǎn)移供體和受體的淬滅機理明顯不同。當與多核苷酸結(jié)合且染料相互充分靠近時表現(xiàn)出二聚化或堆積特征的染料類型包括這樣一些染料，它們具有一個基本上平的芳香族結(jié)構(gòu)，因此在溶液中以足夠高的染料濃度(例如10-2至10-4M)下能夠形成均二聚體或異二聚體。顯然，該現(xiàn)象對于許多應(yīng)用來說是不希望的，但它用于本發(fā)明中卻有益處?？赏ㄟ^增加單位體積內(nèi)的染料量或使兩個(或多個)染料部分物理性地一起緊密地局限于(例如)多核苷酸或其它小分子上來增加濃度。當染料部分緊密靠近時，這將導致局部濃度有效增加，無論總濃度如何，攜帶熒光部分的多核苷酸都將被淬滅。
熒光素和羅丹明家族的平面芳香族染料(如熒光素、四甲基羅丹明(TMR)、羅丹明B和X-羅丹明)是能在足夠高的濃度下二聚化的典型染料。其它合適的熒光染料例如包括花菁和硼-雜環(huán)染料如4，4-二氟-4-硼雜(borata)-3a-氮鎓-4a-氮雜-s-二氫化茚(indacene)(商標為BODIPYTM，購自Molecular Probes，Inc.of Eugene，OR)。羅丹明家族的染料如四甲基羅丹明、X-羅丹明和羅丹明B在可見光波長范圍(400-700納米)內(nèi)具有非常高的熒光量子產(chǎn)額(約為0.85)。出于這個原因，它們通常用來檢測微量的物質(zhì)。
本發(fā)明所用的染料部分另外還包含幫助熒光部分連接到多核苷酸上的反應(yīng)性末端基團。這些末端基團可能包括琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞胺酯、硫代異氰酸酯、異氰酸酯和碘代乙酰亞胺。已經(jīng)連接有這些反應(yīng)性基團的染料分子例如可從MolecularProbes，Inc.(Eugene，OR)購得。
用于本發(fā)明的多核苷酸必須具有一個或多個可被特異性酶切的位點。當攜帶兩個或多個熒光部分的熒光淬滅的多核苷酸發(fā)生斷裂時，由于二聚化或堆積的熒光部分解離，熒光強度會增強。這樣就容易檢測熒光部分，從而表明存在特異性的酶，如果適用的話，還可表明存在產(chǎn)生該酶的細菌。由于諧振性二聚體或堆積結(jié)構(gòu)的躍遷偶極子(transition dipole)之間相互作用，因此二聚體或堆積結(jié)構(gòu)在多核苷酸完整時的熒光量子產(chǎn)額是相當?shù)偷?。當多核苷酸被酶促斷裂后，二聚體或堆積結(jié)構(gòu)發(fā)生解離時，熒光部分分開，從而由于內(nèi)在的高度熒光，將會觀察到水溶液中有顯著較高的熒光量子產(chǎn)額。通過這種方式，就可以確定熒光的增加和水解性酶的存在。根據(jù)這一結(jié)果，就可以設(shè)計一個不需要顯影劑和分離步驟的均相酶試驗，其中將攜帶熒光部分的可特異性酶切斷裂的多核苷酸置于溶液中，加入酶分析物，這樣分析物中的酶會斷裂該多核苷酸，減少二聚化或堆積作用，同時伴有熒光增加。因此，酶活性與熒光強度的凈增量直接相關(guān)。如果酶由代謝活躍的細胞分泌，則熒光強度可能與該細胞的代謝活性有關(guān)。
一個酶分子轉(zhuǎn)變(turn over)數(shù)百萬試劑分子的能力是擴增過程。當該酶來自活的細胞培養(yǎng)物時，這種擴增得到進一步的增強，因為隨著細胞的生長，產(chǎn)生了更多的酶分子。這兩個因素與熒光技術(shù)結(jié)合可提供一種迅速、靈敏和特異性檢測細菌的前景良好的方法。
用來產(chǎn)生熒光原性核酸酶底物的典型多核苷酸必須具有受待測核酸酶攻擊的化學鍵。例如，如下所述，已知微球菌核酸酶在磷酸二酯鍵處水解多核苷酸，因此具有此特征的任何多核苷酸都可作為微球菌底物。
用核苷酸類似物和DNA合成試劑對多核苷酸進行化學修飾。例如，可以通過自動化DNA合成儀(例如核酸合成和純化系統(tǒng)(#ABI 3948型，Perkin-Elmer AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City,CA))將含有脂肪族伯胺的亞磷酰胺導入多核苷酸鏈所需位置處?？梢詮纳虡I(yè)途徑購得末端修飾劑和氨基-修飾的-脫氧胸苷(dT)，以在多核苷酸的3′和/或5′端導入具有三碳、六碳或九碳連接部分的脂肪族胺。然后，使該胺與各種標記(如生物素、熒光染料或堿性磷酸酶)反應(yīng)，形成多核苷酸偶聯(lián)物。這些修飾的多核苷酸的常見應(yīng)用包括(ⅰ)無放射活性的雜交探針；(ⅱ)DNA的序列特異性斷裂；(ⅲ)自動化DNA測序和(ⅳ)親和層析。可加到多核苷酸末端上與待連接的染料部分反應(yīng)的其它部分包括具有反應(yīng)性H基團的那些部分(例如游離的巰基(SH)、羧基和羥基)。胺和硫醇是較佳的。
使熒光原性核酸酶底物(即試劑)與待測的特異性酶接觸，實現(xiàn)酶促斷裂。適用于本發(fā)明的目標酶包括通常歸為核酸酶的所有酶，即水解核苷酸鍵的那些酶，例如包括耐熱核酸酶或葡萄球菌核酸酶。
當酶在細胞內(nèi)時，可利用增加攜帶該酶細菌外膜(OM)通透性的試劑，使酶與熒光原性核酸酶底物接觸。乙二胺四乙酸(EDTA)常用于此目的，它能作用于革蘭陰性腸細菌外膜屏障。在某些條件下，可破壞外膜，釋放出胞內(nèi)的酶。
對于迅速和靈敏的測試，重要的是要最大程度地增加信噪比，即使所需信號盡量大于不需要的背景信號(例如在細菌和生長培養(yǎng)基自體發(fā)熒光的情況下)。大多數(shù)傳統(tǒng)的熒光原性底物在遠紫外波長區(qū)(350-450納米)內(nèi)發(fā)光，而大多數(shù)細菌生長培養(yǎng)基在該區(qū)域內(nèi)有明顯的自身熒光。例如，典型的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基在360納米下激發(fā)后在425納米和475納米下有兩個明顯的最大發(fā)射光。為了避免該問題，通常是采用高的底物濃度。這會導致試驗成本較高，對生物的毒性較高，有時還會使底物沉淀。本發(fā)明克服了自身熒光干擾的難題，其方法是采用發(fā)射波長比背景熒光波長長得多的熒光染料(例如四甲基羅丹明Ex=550納米，Em=580納米)將檢測波長向紅光移動(red-shift)至可見光譜。另外，本發(fā)明描述的內(nèi)容可適用于也能將發(fā)射光向紅光移動至更長波長處的其它染料。通常，有用的染料可能具有下列特征消光系數(shù)高(＞80，000cm-1M-1)、光量子產(chǎn)額高(在水溶液中＞0.85)、光譜對溶劑和pH不敏感、可溶于水中、對光穩(wěn)定、以及二聚化常數(shù)宜大于10-3。
許多葡萄球菌菌株表現(xiàn)出DNA酶活性。組織學上曾經(jīng)用于鑒定目的的一種酶是金黃色葡萄球菌(S.aureus)的胞外DNA酶。金黃色葡萄球菌核酸酶被大量分泌，對熱穩(wěn)定，其活性需要Ca2+，但不需要Mg2+。這些特征可在檢測食物中葡萄球菌污染時用來區(qū)別金黃色葡萄球菌和其它葡萄球菌。鏈球菌屬、沙雷菌屬和芽孢桿菌屬也產(chǎn)生胞外DNA酶。
用微球菌核酸酶(金黃色葡萄球菌的一種胞外酶)作為模型系統(tǒng)來證明本發(fā)明的用途。該酶酶切多核苷酸鏈的5′磷酸二酯鍵，在升高的溫度下(＞60℃)保持穩(wěn)定并有活性，通常用作金黃色葡萄球菌的指示物。在60℃下存在核酸酶活性是金黃色葡萄球菌的確認性試驗。微球菌核酸酶發(fā)揮作用不需要輔因子-該特征能減少試驗復雜性和成本。
總之，本發(fā)明提供了新的核酸酶試劑、采用該試劑的試驗方法和制備該試劑的方法。該試劑包含攜帶了兩個或多個熒光部分的合成的單鏈或雙鏈多核苷酸，該熒光部分可以是染料分子(例如四甲基羅丹明)。核酸酶水解和斷裂后的熒光增強在2至6倍之間，這取決于試劑的具體構(gòu)型。這些試劑與“雙級聯(lián)”現(xiàn)象(每個酶分子能周轉(zhuǎn)數(shù)百萬個試劑分子，且隨著細菌細胞呈指數(shù)型分裂和生長而釋放出更多的酶分子)的結(jié)合提供了能迅速、靈敏、特異地檢測細菌的前景良好的方法。本發(fā)明適用于(但不局限于)檢測和鑒定微生物、滅菌保障、藥物發(fā)現(xiàn)、酶試驗和免疫試驗。
下列實施例將進一步描述本發(fā)明的目的和優(yōu)點，但是應(yīng)理解這些實施例中引述的具體材料和用量以及其它條件和細節(jié)并沒有構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
發(fā)明實施例測試方法熒光光譜所有熒光測定在購自Spex Instruments of Edison，NJ的商品名為FLUOROLOGTM的熒光分光光度計中進行。在一個典型的測定中，在石英比色杯中放置3毫升試驗溶液，將比色杯置于熒光分光光度計的樣品支座中。然后室溫下以固定的激發(fā)波長下測定測試溶液的熒光發(fā)射光譜。熒光分光光度計的激發(fā)和發(fā)射縫隙寬度均定為0.5毫米。在相同的儀器條件下測定有核酸酶存在和沒有核酸酶存在的試驗溶液的熒光光譜。
實施例1在本實施例中，將兩個四甲基羅丹明(TMR)染料部分與自身互補的24聚多核苷酸的3′端和5′端相連接。鏈內(nèi)雜交使兩染料部分相互緊密靠近并因此淬滅熒光。多個位點處的酶促切割導致該有序的結(jié)構(gòu)被破壞。然后，染料分子脫二聚化，使熒光明顯增強。圖1示意性地描述了此原理。
自身互補的多核苷酸NH2CH2CH2CH2-5′-AAC AAA GGA TAA TTA TCC TTTGTT-3′-CH2CH2CH2NH2購自GeneMed Biotechnologies,Inc.(South San Francisco,CA)，通過DNA測序確認其化學結(jié)構(gòu)。將大約270納摩爾(nmol)的上述多核苷酸溶解在600微升去離子(D.I.)水中。使90納摩爾(200微升)的該多核苷酸溶液與預先溶解在一滴二甲基亞砜(DMSO)中的4毫克四甲基羅丹明(TMR)琥珀酰亞胺酯(購自Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)在100毫摩爾(mM)pH 8.3碳酸氫鈉緩沖液中室溫反應(yīng)。該混合物具有充足的體積來維持合適的pH-體積約為2毫升。在該酰胺化過程中，TMR部分的酯與連接于多核苷酸的胺部分反應(yīng)。
將反應(yīng)混合物從移液管導入含有表氯醇交聯(lián)(堿性條件)的葡聚糖凝膠(一種堆積材料，以SEPHADEXTMG25的商品名購自Pharmacia Biotech,Inc.)分子大小排阻層析柱(PD-10型，Pharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,NJ)中，以便將標記的多核苷酸和未反應(yīng)的染料分開反應(yīng)混合物靠重力通過該柱。在C18反相柱(600E型HPLC，WatersCorp.,Milford,MA)上用高效液相色譜(HPLC)對DNA組分作進一步純化。柱中的流動相是水配制的乙腈(ACN)和0.1M三乙胺乙酸(TAA)梯度，其中TEAA與ACN的體積比從92∶8起在30分鐘內(nèi)線性降低至8∶92。所得的偶聯(lián)物具有上述多核苷酸結(jié)構(gòu)，3′和5′端各個脂肪族胺連接部分上添加了TMR部分。
合并含有純化的偶聯(lián)物的各HPLC組分，干冰冷凍，然后室溫真空干燥。然后將干的偶聯(lián)物溶解在5毫升100mM pH 8.9碳酸鈉緩沖液中。如圖5所示，用分光光度計(MPC-3100型，Shimadzu Scientific Instruments,Columbia,MD)測得的吸收光譜顯示出二聚化四甲基羅丹明具有特征性的頻帶分裂。在3毫升上述緩沖液中加入少量(約0.5毫克)微球菌核酸酶(購自Sigma,Chemical Co.,St.Louis,MO)。37℃培育混合物過夜，使攜帶熒光部分的多核苷酸的5′磷酸二酯鍵發(fā)生酶促水解。然后將溶液冷卻至室溫。然后用FLUOROLOGTM熒光分光光度計在室溫下測定熒光光譜。酶促切割導致當用520納米的光激發(fā)時，580納米下的熒光強度有相當?shù)脑鰪?從12000增強到28000)，560納米下的吸收值從0.03吸收單位(AU)升高到0.06AU。
在另一個測試中，增加5′端脂肪族胺連接部分的長度，使兩個染料部分之間發(fā)生更有效的堆積。從GeneMed獲得具有較長脂肪族胺連接部分的下列多核苷酸，作標記，并在類似于本實施例前述的條件下測試。
H2N-(CH2-CH2O)6-(CH2)3-5′-AAC AAA GGA TTA TAA TCC TTT GTT-3′-CH2CH2CH2-NH2H2N-(CH2CH2O)9-(CH2)3-5′-AAC AAA GGA TTA TAA TCC TTT GTT-3′-CH2CH2CH2-NH2每種情況下均觀察到熒光增強兩倍。
實施例2在本實施例中，將懸垂的四甲基羅丹明染料部分連接到多核苷酸序列的多個部位。由于緊密靠近，染料部分堆積在一起淬滅了熒光。在多處位點酶切該多核苷酸使偶聯(lián)物分裂，釋放出從二聚或堆積的狀態(tài)變成單個部分的染料部分，同時導致熒光強度增加。圖2中示意性地描述了這一原理。
設(shè)計多核苷酸鏈，使其在交替的堿基中含有總共4個氨基基團如下5′-TTT TTTZ T Z T Z T Z TTT TTT-3′，其中Z是脫氧胸苷(dT)的胺修飾的C6衍生物(目錄號10-1039-90，Glen Research,Sterling,VA)。多核苷酸鏈由GeneMed Biotechnologies,Inc.合成。將約45納摩爾的多核苷酸溶解在去離子水中，并在100mM pH 8.3碳酸氫鈉緩沖液中室溫下與預先溶解在一滴DMSO中的1毫克四甲基羅丹明琥珀酰亞胺酯反應(yīng)。在實施例1的相同條件下純化偶聯(lián)物。用少量(約0.5毫克)100mM pH 8.9碳酸氫鈉配的微球菌核酸酶37℃酶促水解過夜。在室溫下用520納米的激發(fā)波長測定熒光光譜，酶促水解后獲得575納米熒光強度大約增強2倍。
實施例3(對比例)在本實施例中，通過能量轉(zhuǎn)移而不是染料二聚化來淬滅(一個染料部分)。
用從GeneMed Biotechnologies,Inc.獲得的下列兩個多核苷酸通過熒光能量轉(zhuǎn)移來測定DNA酶活性A.5′TTA XTA AYT CCG TTT AA3′B.5′TTA ZTA AYT CCX TTT AA3′其中X是四氯熒光素(受體)，Y是熒光素(供體)，Z是脫氧胸苷(dT)的氨基修飾的C6(允許連接另一個受體四甲基羅丹明(TMR)，該受體懸垂在Z上)。在A構(gòu)型中，將兩種不同的染料-供體和受體-X和Y插入多核苷酸序列中。與實施例2中所有染料部分均懸垂在多核苷酸上不同的是，在本實施例中供體和一個受體被插入多核苷酸骨架本身。構(gòu)型B與A相似，只是第二個受體(TMR)懸垂在Z上。當多核苷酸完整時，供體和受體處于能量轉(zhuǎn)移的相互距離內(nèi)。熒光素的激發(fā)態(tài)能量被非輻射轉(zhuǎn)移至四氯熒光素(和/或B情況下的四甲基羅丹明)，引起供體熒光被淬滅。受體熒光不淬滅。在酶促水解DNA后，供體和受體分開，能量轉(zhuǎn)移變得無足輕重。在微球菌核酸酶水解后，490納米激發(fā)的化合物A在530納米的供體熒光增加大約30％。肉眼觀察，熒光從橙藍變成深藍，表明能量轉(zhuǎn)移效率降低?；衔顱也觀察到類似的結(jié)果。
實施例4在本實施例中，將四甲基羅丹明分別與兩個互補多核苷酸的3′和5′端的脂肪族胺連接部分相連。鏈間雜交使得染料部分相互緊密接觸并淬滅熒光。沿雙鏈多核苷酸的多個位點的酶促切割使有序的結(jié)構(gòu)分解，使二聚體變?yōu)閱误w而釋放出染料部分，導致熒光明顯增加。圖3示意性地描述了該原理。
兩個互補的25聚多核苷酸由GeneMed Biotechnologies,Inc.合成NH2-(CH2)3-5’-AAC AAA GGA TTA TAG TGG GAA ATC A-3’NH2-(CH2)3-3’-TTG TTT CCT AAT ATC ACC CTT TAG T-5’使各多核苷酸約22.5納摩爾分開與100mM pH9.0碳酸鈉緩沖液配的1毫克四甲基羅丹明(TMR)異硫氰酸酯23℃攪拌(振蕩)反應(yīng)過夜。在與多核苷酸混合前，先將染料溶解在一滴DMSO中。TMR部分的異硫氰酸酯和連接于多核苷酸的胺基團形成硫脲鍵。使每個反應(yīng)混合物通過如實施例1所述的分子大小排阻柱(PD-10，Pharmacia Biotech，Inc.,Piscataway,NJ)，以將標記的物質(zhì)與未反應(yīng)的染料分子分開。采用下式，根據(jù)多核苷酸鏈中GC對含量百分數(shù)和雜交溶液(目錄號F123A，PromegaCorp.,Madison,WI)的離子強度計算解鏈溫度TmTm=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％GC)-(600/N)其中N是表示多核苷酸鏈中堿基數(shù)的整數(shù)。該公式預計此Tm非常適合長度為14至60-70核苷酸的多核苷酸。Promega雜交溶液的Na+濃度為0.39。根據(jù)該公式，計算出上述多核苷酸的Tm為63.8℃。在低于Tm 5-10℃下在短的多核苷酸之間形成的雜交物是可逆的，容易解鏈。因此，反應(yīng)溫度應(yīng)至少比Tm低10℃。另外，為了制備穩(wěn)定的雜交物，應(yīng)用高濃度(0.1-1.0皮摩爾/毫升)的多核苷酸在嚴謹條件下進行短的多核苷酸雜交。在本實施例中，攜帶熒光染料的兩條鏈是在45℃(低于Tm 19℃)、高嚴謹雜交溶液(Promega溶液)中進行雜交。偶聯(lián)物溶液顯示在575納米(Ex=550納米)處具有熒光強度，其在和100mM pH8.9碳酸氫鹽緩沖液配的微球菌核酸酶(目錄號N-3755，Sigma Chemical,Co.,St.Louis,MO)37℃培育過夜后的熒光強度，比核酸酶處理前高大約6倍。這在圖4中有所描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然能在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)對本發(fā)明作各種改動和變化。應(yīng)理解本發(fā)明并不局限于本文所述的描述性實施方案。
權(quán)利要求
1．一種試劑，它包含至少一種可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物，該底物攜帶的至少一個熒光部分與至少另一個毗鄰的熒光部分緊密靠近，所述的這些毗鄰熒光部分相互淬滅熒光，所述熒光部分在所述底物斷裂時很容易被熒光測定技術(shù)檢測到。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其中所述熒光部分包含熒光染料基團。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述熒光部分是相同的。
4．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述多核苷酸底物包含大約24個堿基對。
5．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述多核苷酸底物包含一個自身互補的單鏈多核苷酸，該多核苷酸的3′和5′端各攜帶了一個熒光部分。
6．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述多核苷酸底物包含兩條互補雜交的多核苷酸鏈，每條鏈具有3′和5′端，其中一個或兩個3′/5′配對的每個末端攜帶一個熒光部分。
7．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述多核苷酸底物包含一條單鏈多核苷酸，該多核苷酸在其長度上攜帶至少兩個懸垂的毗鄰的熒光部分。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑，其中所述毗鄰的熒光部分相互隔開的距離小于沿多核苷酸骨架測得的堿基與堿基間10納米。
9．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑，其中所述可特異性酶切斷裂的多核苷酸底物可被選自DNA酶和RNA酶的酶切割。
10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑，其中所述DNA酶是細菌DNA酶。
11．根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其中所述熒光染料基團包含兩個或多個二聚化的或堆積的熒光染料基團。
12．根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其中每個所述染料基團包含一個平面部分。
13．根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其中每個所述染料基團選自熒光素、羅丹明、花菁和硼雜環(huán)染料基團。
14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑，其中每個所述羅丹明染料選自四甲基羅丹明、X-羅丹明和羅丹明B。
15．一種生物學試驗方法，該方法包括下列步驟合并(1)權(quán)利要求1或2所述的試劑，和(2)一種可能含有待測的試特異性酶的測試樣品，其中待測試的特異性酶的存在將導致多核苷酸斷裂，熒光部分分開，以及熒光強度增加。
16．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，該方法還包括測定熒光強度增加的步驟。
17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中熒光強度的增加用選自輻射能照射、熒光顯微鏡、96孔平板讀數(shù)儀和流式細胞計數(shù)儀的手段來測定。
18．根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述酶來自細菌。
19．一種制備某試劑的方法，該試劑包含攜帶熒光部分的可特異性酶切斷裂的多核苷酸，這些熒光部分通過染料二聚化相互淬滅，并在分開時可用熒光測定技術(shù)來檢測，所述方法包括下列步驟合并攜帶一個或多個熒光部分以及一個或多個反應(yīng)性基團的一種或多種熒光化合物與可特異性酶切斷裂的多核苷酸，該多核苷酸選自下列(1)自身互補的單鏈多核苷酸，它具有與一個或多個熒光化合物有反應(yīng)性的一個或多個末端基團，(2)單鏈多核苷酸，在該多核苷酸中非末端的其它位置上有兩個或多個部分具有與一個或多個熒光化合物反應(yīng)的懸垂基團；和(3)互補的多核苷酸，每條鏈在一個或兩個3′/5′配對的3′和/或5′端，分別具有至少一個與一個或多個熒光化合物反應(yīng)的反應(yīng)性末端基團，這種合并在產(chǎn)生所述試劑的反應(yīng)條件下發(fā)生。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中攜帶所述熒光部分的所述化合物選自熒光素、羅丹明、花菁和硼雜環(huán)染料基團。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種試劑,該試劑包含攜帶淬滅的熒光部分(32,33)的可特異性酶切斷裂的多核苷酸(30,31)底物,以及制備該試劑的方法。多核苷酸(30,31)包括的至少一個熒光部分(32)與另一熒光部分(33)充分靠近,從而基本上淬滅了熒光部分(32、33)的熒光,其中在通過斷裂多核苷酸分開熒光部分后,熒光部分(32,33)很容易用熒光測定技術(shù)來檢測。本發(fā)明還提供了一種生物學試驗方法,其中將該試劑與可能含有待測試酶(36)的測試樣品合并,其中酶(36)將斷裂多核苷酸釋放出熒光部分(32,33),并導致熒光強度增加。該試驗方法可用于檢測和鑒定微生物,滅菌保障、藥物發(fā)現(xiàn)、酶試驗、免疫試驗和其它生物學試驗。
文檔編號C12N15/09GK1285879SQ98813050
公開日2001年2月28日 申請日期1998年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月9日
發(fā)明者魏愛平, P·A·馬赫 申請人:美國3M公司 被以下專利引用 (2),