專利名稱：賦予植物茅草枯抗性的dna分子和用該dna分子轉(zhuǎn)化的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用能對除草劑茅草枯(2，2-二氯丙酸)解毒的脫鹵酶的dehal基因轉(zhuǎn)化諸如小麥、大麥、稻、燕麥、triticale、黑麥、高粱和粟的小型谷物的改進(jìn)方法，該方法與茅草枯結(jié)合用于在改進(jìn)的分段方法中篩選所述小型谷物的轉(zhuǎn)化體，具有提高了的轉(zhuǎn)化體再生效率。本發(fā)明還涉及重新設(shè)計(jì)過的dehal基因，并將其用于獲得具有大田水平抗性的小型谷物的轉(zhuǎn)化體，這種抗性使其能用除草劑茅草枯控制窄葉雜草。
背景技術(shù)：
自從大約5000年以前作物被馴化以來，雜草一直是農(nóng)業(yè)的主要限制因素。農(nóng)民將其大量的時(shí)間浪費(fèi)在阻止雜草與作物競爭天然和人工投入的光照、水和礦物質(zhì)上。很多發(fā)達(dá)國家是用選擇性除草劑除草來取代大部分的耕地、機(jī)械栽培，在很多發(fā)展中國家鋤地和用手拔除仍然是主要手段。
綠色革命的到來，使亞洲的小麥和稻品種開始改變。綠色革命的基礎(chǔ)是使用矮化品種來增加收獲“指數(shù)”，即谷物與莖稈的比例。高稈品種和矮化品種的生物量生產(chǎn)相近，但矮化品種以犧牲長的莖稈來產(chǎn)生谷物。綠色革命將產(chǎn)量增加一倍，使得肥料的使用變得經(jīng)濟(jì)，因?yàn)樵诎贩N上肥料能產(chǎn)生比莖稈更多的谷物。
綠色革命品種的改進(jìn)與其繁殖的一樣快。不過，現(xiàn)代高產(chǎn)半矮化和矮化小型谷物，特別是小麥、大麥、以及粟和高粱及稻對雜草的競爭力不如低產(chǎn)的高稈品種，并且，在不使用選擇性除草劑的情況下在大部分地區(qū)種植是不經(jīng)濟(jì)的。化學(xué)工業(yè)在開發(fā)能殺死闊葉雜草的除草劑方面一直十分成功，不過，業(yè)已找到的能控制與小型谷物密切相關(guān)的窄葉雜草的除草劑(graminocides)很少。窄葉雜草和小型谷物之間的關(guān)系有利于產(chǎn)生對最好的graminocides抗性(Gressel，1988a，b；Moss，1992；Powles和Matthews，1992)。窄葉雜草對用于在小麥上控制窄葉雜草的除草劑的交叉抗性的原因可能是由于細(xì)胞色素P450混合功能氧化酶系統(tǒng)的產(chǎn)生，該系統(tǒng)類似于被小麥用于降解除草劑的系統(tǒng)(Gressel，1988a，b)。情況相當(dāng)糟糕，超過1/3的澳大利亞麥田目前受到一年生黑麥草(Lolium rigidum)的侵害，這種雜草不能用最近出現(xiàn)的選擇性除草劑控制。在印度的麥田也產(chǎn)生了對graminocides的抗性，并且抗性雜草已經(jīng)侵害了數(shù)百萬英畝的土地，并且對其他graminocides有少量的抗性(Gressel，1994；Malik和Singh，1995)。野生紅稻和稗屬是侵害稻田的主要雜草。
雜草控制處于波動狀態(tài)，有很多新問題。除草劑占發(fā)達(dá)國家所使用農(nóng)藥總量的60％以上。由于生態(tài)原因和政治上的壓力，很多除草劑已經(jīng)從市場上消失，只有很少的新型除草劑銷售?？朔s草控制問題的一個(gè)出路是生產(chǎn)抗除草劑作物，它能通過賦予新的選擇性，擴(kuò)展市場上僅存的化合物的使用范圍。
業(yè)已有人提出，通過遺傳工程方法賦予小型谷類作物新的抗性，優(yōu)選使用非植物基因，可以制止危害世界糧食供應(yīng)的進(jìn)化趨勢(Gressel1988a，b)。不過，這一點(diǎn)并不容易做到，因?yàn)槿狈τ糜谛←湹挠行У霓D(zhuǎn)化/再生系統(tǒng)，并且現(xiàn)有的選擇標(biāo)記較差，這種選擇標(biāo)記通常是抗生性的(例如，Li等，1993；Fujimoto，1993；Peng等，1992；Bercelo等，1994)，而現(xiàn)在的趨勢是限制含有抗生素抗性的轉(zhuǎn)基因材料在環(huán)境中的傳播。
業(yè)已報(bào)道了5種抗除草劑小型谷物，即含有能產(chǎn)生對glufosinate的抗性的bar基因的小麥、稻、大麥、高粱和燕麥(Cao等，1992；Vasil等，1992；1993；Becker等，1994；Nehra等，1994；Weeks等，1993；Rathore等，1993；Somers，1992；Wan和Lemaux，1994；Rathus等，1997)。Glufosinate是一種昂貴的有機(jī)磷除草劑，其合成是危險(xiǎn)的(通過光氣)，使得它不適用于小型谷物，因?yàn)樾⌒凸任锏纳a(chǎn)成本投入必須很低，并且，這種除草劑的合成是在使用它的發(fā)展中國家進(jìn)行的。
業(yè)已將小麥轉(zhuǎn)化成具有對廉價(jià)除草劑glyphosate的抗性，不過，在澳大利亞一年生黑麥草已經(jīng)產(chǎn)生了對glyphosate的抗性(Gressel1996)，使得在小麥作物上單獨(dú)使用這種除草劑是不明智的。
為了實(shí)用，小麥上的除草劑抗性系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)具有下列特征(1)有關(guān)抗性應(yīng)當(dāng)是針對能控制存在于麥田中的雜草的廉價(jià)除草劑的，例如，在印度的雜草是草蘆屬，而在澳大利亞是一年生黑麥草；(2)應(yīng)當(dāng)不太容易產(chǎn)生對這種除草劑的抗性，就像異丙隆在印度的情形；(3)該除草劑應(yīng)當(dāng)具有可接受的毒理學(xué)和生態(tài)學(xué)特征。
編碼對所述廉價(jià)除草劑茅草枯的抗性的dehal基因很符合上述標(biāo)準(zhǔn)。這種除草劑目前能殺死大部分禾本科類，即小型谷物和侵害小型谷物的窄葉雜草。編碼能降解茅草枯的脫鹵酶的基因業(yè)已從假單胞菌屬中分離，并被用于轉(zhuǎn)化煙草，它在煙草中產(chǎn)生了略有差別的抗性(Buchanan-Wollaston等，1992)。幾年以后又將該基因用于白三葉草中(Derek，White和Ian Gordon，Massey大學(xué)，Palmerston North，新西蘭，個(gè)人通訊1997)。在任一種情況下它都未能充分表達(dá)，以便將其視為可用作選擇性除草劑。因此，該研究小組試驗(yàn)該基因的工作受到了障礙，并由于缺乏商業(yè)價(jià)值而停止了他們的項(xiàng)目，盡管有大量的前期投入。
Nardi-Dei等1997披露了源于假單胞菌屬的脫鹵酶基因，業(yè)已對該基因進(jìn)行了突變，以便研究在酶活性方面的結(jié)果。沒有涉及與適用于小型谷類的密碼子使用相關(guān)的突變的產(chǎn)生。US5780708披露了用非突變型假單胞菌屬dehal基因轉(zhuǎn)化玉米植物，據(jù)說轉(zhuǎn)化過的植物對正常毒性水平的2，2-二氯丙酸有抗性。
上面提到的參考文獻(xiàn)沒有一個(gè)披露或暗示具有適用于小型谷物的密碼子使用的編碼能降解茅草枯的脫鹵酶的分離的DNA分子，該DNA分子適用于轉(zhuǎn)化小麥、稻和其他小型谷物。
獲得除草劑抗性小麥的一個(gè)主要難題是不能轉(zhuǎn)化小麥。單子葉植物的轉(zhuǎn)化，尤其是小麥的轉(zhuǎn)化所取得的進(jìn)展很小(Potrikus，1990)，有關(guān)這種轉(zhuǎn)化的少量的報(bào)導(dǎo)披露了由于再生問題而導(dǎo)致的低效率(Vasil等，1992；Weeks等，1993)。
發(fā)明概述現(xiàn)在業(yè)已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，較差的選擇標(biāo)記、小型谷物上的低效率再生系統(tǒng)、和需要新的選擇性除草劑的問題可以通過將天然或合成形式的dehal基因作為選擇標(biāo)記用于新出現(xiàn)的小型谷物再生系統(tǒng)中而得到解決，并使用其合成形式，以便賦予小型谷物抗性，以便可以將茅草枯用于在小型谷物上選擇性地控制窄葉雜草。
因此，一方面，本發(fā)明涉及編碼能降解除草劑茅草枯的脫鹵酶的分離的DNA分子，所述DNA具有適用于小型谷物的密碼子使用。
為了獲得本發(fā)明的DNA分子，可以通過傳統(tǒng)方法從諸如假單胞菌屬的微生物中獲得茅草枯降解脫鹵酶基因。一旦分離到DNA分子，用標(biāo)準(zhǔn)DNA操作對該基因進(jìn)行鑒定，對開放讀框(編碼序列)進(jìn)行測序，并對該基因進(jìn)行修飾，以便能整合到小型谷物的植物中并在該植物中表達(dá)。所述修飾可以通過用小型谷物的優(yōu)選密碼子使用取代細(xì)菌基因的密碼子，編碼相同的細(xì)菌脫鹵酶，或者編碼具有大體上相同的氨基酸序列的脫鹵酶，并且能使得該小型谷物抗茅草枯。
所述小型谷物可以是小麥、大麥、稻、燕麥、triticale、黑麥、高粱和粟。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述小型谷物是小麥或稻。
在一種實(shí)施方案中，所述DNA分子包括

圖1所示核苷酸序列，本發(fā)明還包括它的具有適用于小型谷物的密碼子使用的遺傳學(xué)變體。圖1的DNA是一種合成基因，它是通過用優(yōu)選的小型谷物密碼子使用取代圖4所示假單胞菌屬衍生的dehal基因的密碼子而獲得的，這顯著提高了其抗性水平。
如圖4所示，假單胞菌屬衍生的dehal基因含有若干密碼子，如GGT(甘氨酸)、GTA(纈氨酸)、AGT(絲氨酸)、ATA(異亮氨酸)、AGC(蘇氨酸)、CTT和TTA(亮氨酸)、CGA和CTT(精氨酸)、和CCT和CCC(脯氨酸)，本發(fā)明人根據(jù)對在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到的45個(gè)小麥基因進(jìn)行的分析發(fā)現(xiàn)其使用頻率在小麥中是很小的(0.11或更低)。
GenBank數(shù)據(jù)庫中列舉了很多細(xì)菌dehal基因，但沒有植物的脫鹵酶基因，因此沒有已知的植物脫鹵酶基因可用于與圖1所示合成基因進(jìn)行比較。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明DNA分子的載體和表達(dá)框，所述載體適用于轉(zhuǎn)化小型谷物的植物的植物細(xì)胞，以便使再生的植物獲得在高于1kg茅草枯/英畝的大田使用水平上，優(yōu)選2-4kg/英畝的水平上對茅草枯的抗性。
所述表達(dá)框含有受植物啟動子片段和調(diào)控元件控制的DNA分子，使得該DNA分子能在植物細(xì)胞中表達(dá)。可將任何小型谷物有效的植物啟動子(如，但不限于CaMV35S啟動子，稻肌動蛋白啟動子和遍在蛋白啟動子)添加在所述DNA分子的編碼序列上游，有可能具有諸如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列的其他調(diào)控序列。所述5’區(qū)可以是所述小型谷物所固有的或者源于其他植物或者是化學(xué)合成的。在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述小型谷物有效的植物啟動子是CaMV35S啟動子，具有源于稻肌動蛋白1啟動子基因的外顯子1和源于玉米皺縮1基因的內(nèi)含子1。
所述表達(dá)框還含有轉(zhuǎn)錄終止序列并可以包括添加在所述DNA分子下游的聚腺苷酸化信號序列。該3’區(qū)可以與所述5’序列源于相同的基因，或者源于不同的基因，或者是化學(xué)合成的，并且優(yōu)選是章魚氨酸合酶終止子(osc.ter.)。
用于將含有所述DNA分子的表達(dá)框?qū)胫参锛?xì)胞的載體的選擇取決于轉(zhuǎn)化方法的選擇，而轉(zhuǎn)化方法的選擇又取決于宿主植物和植物組織來源的選擇。根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何類型的適用于小型谷物的轉(zhuǎn)化方法，如(但不限于)使用電穿孔、微粒、顯微注射、病毒系統(tǒng)、農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，將含有所述DNA分子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，培養(yǎng)所述細(xì)胞，然后從沉淀的細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA并純化，并通過粒子轟擊方法用氦驅(qū)動的輸送槍進(jìn)行小麥細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。用于該方法的表達(dá)框含有圖3所示pCJVW14質(zhì)粒，其中，DEHAL是具有小型谷物密碼子使用的DNA序列，它編碼插入到B1uescript(KS+)克隆載體上的茅草枯降解脫鹵酶。在其他方法中，所述表達(dá)框含有分別如圖5和6所示的pDM804或pDM805質(zhì)粒，其中，wss是具有小型谷物密碼子使用的DNA序列，它編碼茅草枯降解脫鹵酶。
在另一方面，本發(fā)明涉及小型谷物特別是小麥的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，含有具有適用于小型谷物的密碼子使用的外源DNA分子，它編碼能降解茅草枯的脫鹵酶，由所述植物細(xì)胞再生的植物基本上能在高于1kg/英畝，優(yōu)選2-4kg/英畝的大田使用水平上抗茅草枯。所述外源DNA優(yōu)選編碼具有序列1所示氨基酸序列的脫鹵酶或其變體，能賦予小型谷物在所需的大田使用水平上對茅草枯的抗性。所述DNA分子優(yōu)選包括圖1所示編碼核苷酸序列或其遺傳學(xué)變體，它編碼能賦予小型谷物在高于1kg/英畝，優(yōu)選2-4kg/英畝的所需大田使用水平上對茅草枯的抗性。
另一方面，本發(fā)明涉及小型谷物，特別是小麥或稻的種子，該種子具有穩(wěn)定整合在其基因組上的外源DNA分子，該DNA分子具有適用于小型谷物的密碼子使用，能夠在足于使該谷物在高于1kg/英畝，優(yōu)選2-4kg/英畝的大田使用水平上抗茅草枯的水平上表達(dá)能夠降解除草劑茅草枯的脫鹵酶。
另一方面，本發(fā)明涉及小型谷物特別是小麥的植物，這種植物能在高于1kg/英畝，優(yōu)選2-4kg/英畝的大田使用水平上抗茅草枯，該植物具有穩(wěn)定整合在其基因組上的外源DNA分子，該DNA分子具有適用于小型谷物的密碼子使用，它編碼能降解茅草枯的脫鹵酶。
另一方面，本發(fā)明提供了一種使小型谷物，特別是小麥或稻的植物在高于1kg/英畝，優(yōu)選2-4kg/英畝的大田使用水平上抗除草劑茅草枯的方法，該方法包括(a)用具有小型谷物密碼子使用、編碼茅草枯降解脫鹵酶的DNA分子轉(zhuǎn)化小型谷物的植物細(xì)胞；(b)篩選其生長抗茅草枯的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；和(c)由步驟(b)的所述植物細(xì)胞再生能在高于1kg/英畝，優(yōu)選2-4kg/英畝的大田使用水平上抗茅草枯的小型谷類植物。
用于轉(zhuǎn)化的合適的植物組織來源包括，但不限于愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、和胚胎等，所述組織是具有在轉(zhuǎn)化之后再生完整的、可育的小型谷類植物能力的組織。
所述轉(zhuǎn)化是在如下條件下進(jìn)行的，即緩沖液、培養(yǎng)基、和培養(yǎng)時(shí)間適用于所選擇的組織。在用質(zhì)粒DNA處理之后，可以將植物細(xì)胞或組織在篩選之前培養(yǎng)不同的時(shí)間，或者可以作為選擇標(biāo)記馬上用茅草枯處理。在存在正常抑制濃度的茅草枯的條件下生長的細(xì)胞或愈傷組織被推測為轉(zhuǎn)化過的并且用已知的植物再生方法進(jìn)行處理，并在相同的培養(yǎng)基上繼代若干次之后去除非抗性部分。再生分若干步驟在合適的培養(yǎng)基中在有各種濃度的茅草枯和諸如吲哚乙酸(IAA)和玉米醇溶蛋白的植物生長激素的條件下進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明該方面的一種優(yōu)選實(shí)施方案，將具有小型谷物密碼子使用的一個(gè)推測的dehal基因用于轉(zhuǎn)化諸如小麥的小型谷物的胚胎發(fā)生盾片培養(yǎng)物，放置在含有從0.1-0.4mM濃度逐漸提高的培養(yǎng)基上，隨著組織生長與每一種物種區(qū)別，并根據(jù)是采用液體或固體培養(yǎng)基進(jìn)行定義。
從一種培養(yǎng)基向具有不同的除草劑、激素和生長調(diào)節(jié)劑濃度的另一種培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)移是通過使用漂浮在液體培養(yǎng)基上的浮筏輕微振蕩實(shí)現(xiàn)的。因此，根據(jù)本發(fā)明方面的另一種實(shí)施方案，一種提高小型谷物的轉(zhuǎn)化植物的再生效率的方法包括通過逐漸提高的一系列植物激素和茅草枯濃度轉(zhuǎn)移最初的再生體，其中，所述再生體漂浮在液體培養(yǎng)基上的膜筏上。
在另一方面，本發(fā)明涉及在有能在高于1kg/英畝，優(yōu)選2-4kg/英畝的大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物，特別是小麥的大田中將茅草枯用作除草劑的用途，并涉及用除草劑茅草枯在大田中保護(hù)小型谷類植物并殺死雜草的方法，該方法包括將茅草枯用于小型谷物的大田，所述小型谷物含有外源DNA，該外源DNA具有適用于小型谷物分子的密碼子使用，并穩(wěn)定整合到其基因組中，它能在足于使得所述小型谷物在高于1kg/英畝，優(yōu)選2-4kg/英畝的大田使用水平上抗茅草枯的水平表達(dá)降解茅草枯的脫鹵酶。
在另一方面涉及用茅草枯取代常用的抗生素作為選擇標(biāo)記用于由外源基因?qū)χ参镞M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，所述外源基因能賦予所述植物需要的性狀，并涉及將需要的性狀導(dǎo)入植物的方法，該方法包括(a)用編碼能賦予所述植物需要的性狀的蛋白的DNA分子和編碼能降解除草劑茅草枯的脫鹵酶的DNA分子一起轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b)選擇其生長對茅草枯有抗性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；和(c)用來自步驟(b)的所述植物細(xì)胞再生抗茅草枯的植物，因此，所述植物細(xì)胞還含有表達(dá)所需性狀的DNA。
為此，可以使用天然的茅草枯降解微生物脫鹵酶基因，如源于假單胞菌屬的dehal基因，其序列如圖1所示，并且它可以連續(xù)地或不連續(xù)地存在于所述初級轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的再生過程的大部分階段。
附圖的簡要說明圖1表示具有小麥密碼子使用、編碼茅草枯降解脫鹵酶的合成dehal基因的核苷酸序列及其所編碼的脫鹵酶的氨基酸序列。
圖2表示用于構(gòu)建合成茅草枯降解脫鹵酶基因的框pCJ14(左)和pVW264(右)。
圖3表示含有圖1所示合成的茅草枯降解脫鹵酶(dehal)基因的茅草枯抗性框pCJVW14。
圖4表示編碼茅草枯降解脫鹵酶的熒光假單胞屬dehal基因的核苷酸序列及其所編碼的脫鹵酶的氨基酸序列。在小麥上罕見的密碼子下面劃線并加粗。
圖5表示含有圖1所示合成的茅草枯降解脫鹵酶(dehal)基因的茅草枯抗性框pDM840。
圖6表示含有圖1所示合成的茅草枯降解脫鹵酶(dehal)基因以及超氧化物歧化酶(SOD)的基因的抗茅草枯框pDM805。
發(fā)明詳述通過下面的非限定性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明。
例1．含有天然dehal基因的轉(zhuǎn)基因小麥(ⅰ)分離未成熟的胚胎。從開花后11天的未成熟的谷粒中分離小麥(Triticum aestivum cv.Deganit)的未成熟胚胎。對整個(gè)麥穗進(jìn)行表面消毒，其做法是在3％的四氯酸鈉溶液中連續(xù)攪拌24分鐘，然后用無菌水洗滌3次。在雙目顯微鏡下從所述谷粒上分離胚胎，并將盾片側(cè)放在盛在培養(yǎng)皿中的固化(含有0.6％瓊脂，pH5.8)添加了2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)上。
(ⅱ)轟擊之前的預(yù)培養(yǎng)。在25℃下在黑暗中培養(yǎng)未成熟的胚胎5-7天。在轟擊之前將盾片組織開始增殖的胚胎轉(zhuǎn)移到滲透處理培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基在含有0.25M甘露糖醇的補(bǔ)充了2mg/L 2，4-D的MS上。
(ⅲ)構(gòu)建抗茅草枯框-pCJVW14。通過用DraⅢ和BamHⅠ裂解從pCJ14(圖2)上分離調(diào)節(jié)單體表達(dá)啟動子。該1.6Kb DNA片段含有35S CaMV啟動子，源于稻肌動蛋白1啟動子基因的外顯子1，和源于玉米皺縮基因的內(nèi)含子1。Maas等(1993)報(bào)導(dǎo)該啟動子單獨(dú)在大麥原生質(zhì)體中誘導(dǎo)標(biāo)記基因CAT的表達(dá)比常用的35S啟動子強(qiáng)100倍。通過用BagⅡ和SphⅠ裂解從質(zhì)粒pVW264中分離編碼能降解茅草枯的脫鹵酶的從假單胞菌屬中分離的天然dehal基因的DNA片段(圖4)(由Buchanan-Wollaston等，1992技露，并由V.Buchanan-Wollaston博士饋贈，倫敦大學(xué))。使用章魚氨酸合酶終止子。然后將所述DNA片段插入克隆載體pBluescript(KS+)。用SalⅠ和PstⅠ從所述新的載體上切除一個(gè)片段，并將其插入用SalⅠ和PstⅠ裂解過的pCJ14上。將所得到的質(zhì)粒pCJVW14轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(圖3)中，例如品系DH5α。用標(biāo)準(zhǔn)方法在LB培養(yǎng)基(Difco實(shí)驗(yàn)室，美國)上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
(ⅳ)用質(zhì)粒制備DNA。將大約1.00D的100ml轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的過夜培養(yǎng)物放在冰上冷卻，并通過低速離心使細(xì)胞沉淀。按照生產(chǎn)商的說明用Qiagen質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒DNA。
(Ⅴ)轉(zhuǎn)化。使用杜邦PDS1000氦Biolistic輸送轟擊系統(tǒng)。在1ml 100％乙醇中將鎢顆粒(60毫克，直徑1.0微米)中消毒過夜，然后用無菌水洗滌鎢顆粒3次，并保存在1ml 50％的無菌甘油中。將鎢顆粒(60毫克，直徑1.0微米)保存在1ml 100％乙醇中過夜，然后用無菌水洗滌3次，并保存在1ml 50％的無菌甘油中。
用于轟擊的混合物包含1)50微升顆粒懸浮液；(2)10微升質(zhì)粒DNA(1微克/微升)；3)25微升2.5M氯化鈣；4)20微升0.1M亞精胺。在室溫下培養(yǎng)所述懸浮液10分鐘。在離心5秒鐘之后棄上清液，并用140微升70％乙醇洗滌該混合物。在經(jīng)過短暫離心之后除去上清液，然后加入50微升100％乙醇，制備最終懸浮液。將一滴6微升的該懸浮液放在塑料大型轟擊儀中心。將40-50個(gè)胚胎放置在每一個(gè)板的1厘米直徑的孔中，位于直擋網(wǎng)的下面9厘米處，使用1100p.s.i.(磅/平方英寸)的壓力，并對胚胎轟擊3次，在黑暗中在高滲透培養(yǎng)基上放置24小時(shí)。
(ⅵ)再生。在轟擊24小時(shí)之后，將所述胚胎轉(zhuǎn)移到新的含有2mg/l2，4-D和60mg/l茅草枯(0.36mM，能抑制轉(zhuǎn)化過的愈傷組織在固體培養(yǎng)基上在這一階段生長的最低濃度的茅草枯)的新鮮的MS固體培養(yǎng)基上，在25℃下在黑暗中培養(yǎng)。讓所述胚胎在該選擇培養(yǎng)基上保持2-4周，并且每2周更換培養(yǎng)基。在此階段，培養(yǎng)的胚胎產(chǎn)生愈傷組織。在選擇期間，分離并分裂存活的愈傷組織。然后將疏松淺顏色愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有10微克/毫升玉米醇溶蛋白和60微克/毫升茅草枯的固體MS培養(yǎng)基上，在25℃下給以16小時(shí)光照。
在綠色幼苗達(dá)到0.5厘米長之后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到裝有含有10微克/毫升玉米醇溶蛋白和20微克/毫升茅草枯(0.12mM，能抑制未轉(zhuǎn)化過的愈傷組織在固體培養(yǎng)基上生長的最低濃度的茅草枯)的液體MS培養(yǎng)基的筏(Osmotek公司，Rehovot76120，以色列)上，并在16小時(shí)光照和緩慢搖動(50rpm)條件下保持。14天之后，將同一種選擇培養(yǎng)基中的玉米醇溶蛋白的濃度降低到6微克/毫升，然后用含有1微克/毫升玉米醇溶蛋白、1微克/毫升IAA(吲哚乙酸)和20微克/毫升茅草枯的液體MS培養(yǎng)基培養(yǎng)14天，然后將IAA的濃度降低到0.2微克/毫升，將茅草枯降低到10微克/毫升。當(dāng)幼苗和根足夠健壯(大約5厘米長)時(shí)，將小植株轉(zhuǎn)移到含有20微克/毫升茅草枯的0.5 MS固體培養(yǎng)基上。當(dāng)植株達(dá)到大約10厘米高度(植株達(dá)到容器頂部)時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到Jiffy花盆中，在小盒子中用少量水在室溫和弱光照條件下培養(yǎng)2天，用塑料袋蓋住所述盒。最后將植物種植在花盆中，用一個(gè)放置在溫室中的塑料盒覆蓋直到植株健壯。
(ⅶ)用轉(zhuǎn)基因花粉對非轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)诜邸Ｔ陂_花之后2天收集推測為轉(zhuǎn)化小麥植株的花粉。在開花之前將未轉(zhuǎn)化過的小麥品種Deganit植株去雄。用推測為轉(zhuǎn)化植株的花粉對非轉(zhuǎn)化小麥植株授粉。在雜交之后用袋覆蓋麥穗。然后同樣對推測的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行套袋以便自交。
(ⅷ)轉(zhuǎn)基因后代的生物學(xué)分析。將來自自交R0轉(zhuǎn)化植株的R1轉(zhuǎn)基因谷粒播種到花盆中。在每一個(gè)花盆中播種3個(gè)谷粒。同時(shí)播種非轉(zhuǎn)化小麥的谷粒作為對照植物的谷粒。在第一個(gè)葉片出現(xiàn)3周之后，用幾種濃度對R1推測的轉(zhuǎn)基因后代植物進(jìn)行噴霧。用濃度范圍在0.12-1．2mM之間的茅草枯(添加0.2％Tween20)噴灑所述植物。用0.24mM茅草枯或更高濃度噴灑的非轉(zhuǎn)基因植物在處理之后2周死亡。用0.24-1.2mM茅草枯噴霧的大多數(shù)推測的轉(zhuǎn)基因植物在茅草枯處理之后2周是綠色的并存活下來。在3-4周之后，除了用0.24mM茅草枯處理過的植物之外幾乎所有植株都死亡。因此，我們用該處理處理授粉的后代。R1自交后代中抗性與易感植株的比例接近3∶1(表1)。回交后代用0.24mM茅草枯噴霧，作為鑒別濃度。在用0.24mM茅草枯噴灑雜交后代之后出現(xiàn)接近1∶1的分離比例(表2)。
表1．在R1自花授粉后代中茅草枯抗性的分離0mM 0.12mM 0.24mM 0.40mM 0.75mM 1.2mMpNaSbPNaSbPNaSbPNaSbPNaSbPnaSb411 88 9 89681907O412 99 8 795908O9O413 99 - -----9O90414 99 8 7979291804161 1O 9 - -----10 08O4162 88 - -----909042 12 1110811 71O 112 O10 0總計(jì) 65 643530 38 25 36 466 160 OCK 55 6 26060606O注Pna-種植在花盆中的植株數(shù)；Sb-存活植株數(shù)量；CK-未轉(zhuǎn)化過的植株數(shù)。
表2.通過用噴灑0.24mM茅草枯的未轉(zhuǎn)化過的植株回交R0證實(shí)基因的整合。
例2由于例1中的轉(zhuǎn)基因植株不能承受2kg/ha的茅草枯(正如本文前面所披露的現(xiàn)有技術(shù)中煙草和白三葉草的情形)，我們通過RNA印跡分析了該基因是否充分轉(zhuǎn)錄，并證實(shí)是這樣。然后我們又分析了假單胞菌屬產(chǎn)生的dehal基因(由Buehanan-Wollaston博士提供)的密碼子序列，并將其與小麥的45個(gè)基因的平均密碼子使用進(jìn)行比較，后者是從GenBank 63中的數(shù)據(jù)計(jì)算的。很多密碼子使用明顯不是優(yōu)選的或者在小麥中十分罕見。在圖4中通過加粗的方法標(biāo)出了基因中分布的超過30個(gè)小麥罕見密碼子。
然后我們根據(jù)小麥的優(yōu)選密碼子使用重新設(shè)計(jì)了該基因，并添加了制備結(jié)構(gòu)所必須的限制裂解位點(diǎn)，以及其他改變，并具有委托合成的(Operon技術(shù)公司，Alameda，CA，美國)圖1所示的合成的脫鹵酶基因序列。
然后按照例1所述方法連接具有適合于小型谷物的密碼子使用的新的合成dehal基因，以便形成分別如圖5和6所示的新的結(jié)構(gòu)pDM804和pDM805。然后通過諸如披露于例1中的標(biāo)準(zhǔn)方法或通過農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將所述結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入小麥或其他小型谷物中，以便產(chǎn)生對大田使用量的茅草枯(2-4kg/ha)的足夠的抗性。
質(zhì)粒pDM804具有下列特征質(zhì)粒大小-9.28kb；在質(zhì)粒內(nèi)部對所述基因進(jìn)行標(biāo)記，并說明如下actin-源于稻的肌動蛋白啟動子；gus-β-葡糖醛酸酶；內(nèi)含子1-源于玉米皺縮基因的內(nèi)含子；nos3’-胭脂氨酸合酶終止子；rbcs3’-rubiSco小亞基終止子；Ubil-玉米遍在蛋白啟動子；wss-合成脫鹵酶基因。該質(zhì)粒的限制位點(diǎn)表示在外側(cè)。
質(zhì)粒pDM805具有下列特征質(zhì)粒大小-8.15kb；在質(zhì)粒內(nèi)部對所述基因進(jìn)行標(biāo)記，并說明如下actin-源于稻的肌動蛋白啟動子；gus-β-葡糖醛酸酶；內(nèi)含子1-源于玉米皺縮基因的內(nèi)含子；nos3’-胭脂氨酸合酶終止子；rbcs3’-rubisco小亞基終止子；Sod-Cu、Zn超氧化物歧化酶；Ubil-玉米遍在蛋白啟動子；wss-合成脫鹵酶基因。該質(zhì)粒的限制位點(diǎn)表示在外側(cè)。
例3將含有圖1的合成dehal基因(wss)的質(zhì)粒pDM804(圖5)用于按例1所述方法轉(zhuǎn)化小麥，但最初的再生培養(yǎng)基含有0.6mM茅草枯，該用量對含有天然假單胞菌屬dehal基因的轉(zhuǎn)化體有毒性并能阻止芽的形成(圖4)。在該用量下在轉(zhuǎn)化的愈傷組織上開始出現(xiàn)大量新芽。
參考文獻(xiàn)1．Becker，D_Brettschneider，R和Lorz，H.1994。源于盾片組織的微粒轟擊的可育轉(zhuǎn)基因小麥，植物雜志5299-307。
2．Bercelo，P_Hagel，C_Becker，D_Martin，A.和Lorz，H.1994。通過微粒轟擊花序組織高效率獲得的轉(zhuǎn)基因禾本科(tritodeum)植物，植物雜志5583-592。
3．Buchanan-Wollaston，V_Snape，A.和Cannon，F(xiàn).1992?；诔輨┟┎菘莸慕舛咀饔玫闹参飿?biāo)記選擇基因，植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)11627-631。
4．Cao，J.Xuan，X_McElroy，D.和Wu，R.1992。在微粒轟擊介導(dǎo)的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化之后除草劑抗性轉(zhuǎn)基因稻植株的再生，植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)11586-591。
5．Christensen，A.H.和Quail，P.H.1996。用于在單子葉植物中高水平表達(dá)選擇和/或篩選標(biāo)記基因的遍在蛋白啟動子基載體，轉(zhuǎn)基因研究5213-218。
6．Christon，P.1992。用微粒轟擊對作物進(jìn)行遺傳學(xué)轉(zhuǎn)化，植物雜志2275-281。
7．Gressel，J.(1996)比原先披露的對glyphosate抗性雜草產(chǎn)生的更少的限制，抗性病蟲害控制8(1)2-5。
8．Gressel，J.1988a。對小麥選擇性除草劑的多重抗性分子生物學(xué)的新挑戰(zhàn)，植物分子細(xì)胞生物學(xué)牛津綜述5195-203。
9．Gressel，J.1988b。小麥除草劑對抗性產(chǎn)生的挑戰(zhàn)，生物技術(shù)分支，Checkendon/Reading，247頁。
10．Gressel，J_L.Gianessi，C.P.Darby，L.Saari，A.Seth(1994)抗除草劑雜草在印度對小麥生產(chǎn)的威脅。討論論文PS-94-3國家食品和農(nóng)業(yè)政策中心，華盛頓特區(qū)，37頁。
11．Li，L_Qu，R_Kochko，A_Fauquet，C.和Beachy，R.N.1993。使用biolistic方法的改進(jìn)的稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，植物細(xì)胞報(bào)導(dǎo)12250-255。
12．Maas，C_Topffer，R_Horicke-Grandpierre，C_Schell，J_和Steinbiss，H.H.1993。用于在雙子葉和單子葉植物中進(jìn)行高水平基因表達(dá)的表達(dá)載體，酶學(xué)方法21767-78。
13．Malik R.K.和Singh,S.1995。印度抗異丙隆的小籽芒草。雜草技術(shù)9419-425。
14．Moss，S.(1992)。雜草看麥娘對除草劑的抗性，現(xiàn)有狀態(tài)。應(yīng)付農(nóng)藥抗性的成就和發(fā)展，倫敦，Elsevier。
15．Murashige，T.和Skoog,J.1962。用于煙草組織培養(yǎng)的快速生長和生物分析的改進(jìn)培養(yǎng)基，植物生理學(xué)15473-497。
16．Nari-Dei，V.等1997。源于假單胞菌菌株113的細(xì)菌DL-2-鹵酸脫鹵酶基因克隆和與D-和L-2-鹵酸脫鹵酶的結(jié)構(gòu)比較，細(xì)菌學(xué)雜志1794232-4238。
17．Nehra，N.S_Chibbar，R.N_Leung，N_Caswell，K_Mallard，C_Steinhauer，L_Baga，M.和Kartha，K.K.1994。在用兩個(gè)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行微粒轟擊之后由分離的盾片組織再生的自身可育的轉(zhuǎn)基因小麥植物，植物雜志5285-297。
18．Peng，J_Konowicz，H.和Hodges，T.K.1992。轉(zhuǎn)基因印度稻植物。理論應(yīng)用遺傳學(xué)83855-863。
19．Perl，A_K1ess，H_Blumenthal，A_Galili，G.和Galun，E.1992。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和DNA微粒轟擊輸送方法改進(jìn)植物再生和GUS在盾片小麥愈傷組織中的表達(dá)，分子和普通遺傳學(xué)235279-285。
20．Potrykus，I.1990a?；蛳蚝坦阮惖霓D(zhuǎn)移評價(jià)。生物/技術(shù)8535-542。
21．Powles，S.B.和Matthews，J.M.(1992)。一年生黑麥草的多重除草劑抗性。改良整合雜草的動力。應(yīng)付農(nóng)藥抗性的成就和進(jìn)展。倫敦，E1sevier。
22．Rathore，K.S_Chowdhury，V.K.和Hodges，T.K.1993。用bar作為選擇標(biāo)記基因由原生質(zhì)體產(chǎn)生抗除草劑稻植株。植物分子生物學(xué)21871-884。
23．Rathus，C_Gray，S.J_Adkins，A.L_Godwin，I.D.PIG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因高粱。文摘，ISPMB，新加坡。
24．Ritala，A_Asprgren，K_Kurten，U_Samenkaliio-Martila，M_Mannonen，L_Hanus，R_Kauppinen，V_Teeri，V_和Enari，T_1994。通過轟擊未成熟胚胎獲得的可育轉(zhuǎn)基因大麥。植物分子生物學(xué)24317-325。
25．Somers，D.A_Rines，H.W_Gu，W_Kaeppler，H.F.和Bushnell，W.R.1992?？捎霓D(zhuǎn)基因燕麥植物，生物/技術(shù)101589-1594。
26．Vasil，V_Srivastaba，B_Castillo，A.M_Fromm，M.E.和Vasil，I.K.1992。通過對可再生的胚胎發(fā)生愈傷組織進(jìn)行微粒轟擊獲得的抗除草劑可育轉(zhuǎn)基因小麥植物，植物/技術(shù)10667-674。
27．Vasil，V_Srivastaba，B_Castillo，A.M_Fromm，M.E.和Vasil，I.K.1993。通過直接轟擊培養(yǎng)的未成熟胚胎快速生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小麥植物，植物/技術(shù)111553-1558。
28．Wan，Y.和Lemaux，P.G.1994。生產(chǎn)大量獨(dú)立的轉(zhuǎn)化可育大麥植物，植物生理學(xué)10437-48。
29．Weeks，J.T_Anderson，O.D.和Blechl，A.E.1993?？焖偕a(chǎn)多種獨(dú)立的可育轉(zhuǎn)基因小麥品系，植物生理學(xué)1021077-1084。
權(quán)利要求
1．一種編碼能降解除草劑茅草枯的脫鹵酶的分離的DNA分子，所述DNA分子具有適合于小型谷物的密碼子使用。
2．如權(quán)利要求1的分離的DNA分子，其中，所述茅草枯降解脫鹵酶具有大體上如圖1所示的氨基酸序列，及其具有適于在小型谷物中表達(dá)的密碼子使用的合成變體。
3．如權(quán)利要求2的分離的DNA分子，包括圖1所示核苷酸序列。
4．如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的分離的DNA分子，其中，所述小型谷物是小麥、大麥、稻、triticale、燕麥、黑麥、高粱或粟。
5．如權(quán)利要求4的分離的DNA分子，具有小麥密碼子使用。
6．一種載體，它含有如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的DNA分子。
7．一種表達(dá)框，包括如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的DNA分子或如權(quán)利要求6所述的載體，該表達(dá)框適于轉(zhuǎn)化小型谷物的植物細(xì)胞和植物，并賦予所再生的植株茅草枯抗性。
8．如權(quán)利要求7的表達(dá)框，其中，所述DNA分子受一個(gè)植物啟動子區(qū)和調(diào)控元件的控制，使得所述DNA分子能在小型谷物的植物細(xì)胞中表達(dá)。
9．如權(quán)利要求8的表達(dá)框，其中，將一種小型谷物有效的植物啟動子添加在圖1所示DNA分子的編碼序列的上游，并將一個(gè)終止子片段添加在其下游。
10．如權(quán)利要求9的表達(dá)框，其中，所述小型谷物有效的植物啟動子是CaMV35S啟動子，具有源于稻肌動蛋白1啟動子基因的外顯子1和源于玉米皺縮1基因的內(nèi)含子1。
11．如權(quán)利要求10的表達(dá)框，如圖3、5或6所示。
12．一種小型谷物的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，含有外源DNA分子，該DNA分子具有適于在小型谷物中表達(dá)的密碼子使用，它編碼能降解茅草枯的脫鹵酶，所述植物細(xì)胞基本上能在大田使用水平上抗茅草枯。
13．如權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中，所述外源DNA編碼具有圖1所示氨基酸序列的脫鹵酶或具有小型谷物密碼子使用的其變體，它能賦予小型谷物在大田使用水平上對茅草枯的抗性。
14．如權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中，所述DNA分子包括圖1所示編碼核苷酸序列或其遺傳變體，它編碼能賦予小型谷物在大田水平上對茅草枯抗性的脫鹵酶。
15．如權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中，所述小型谷物是小麥。
16．小型谷物的種子，它具有穩(wěn)定整合在其基因組上的外源DNA分子，該DNA分子具有小型谷物密碼子使用，并表達(dá)能夠降解除草劑茅草枯的脫鹵酶，其表達(dá)水平足于使該小型谷物在大田使用水平上抗茅草枯。
17．如權(quán)利要求16的種子，其中，所述DNA分子包括圖1所示編碼核苷酸序列或其遺傳學(xué)變體，該變體具有小型谷物密碼子使用，并編碼能賦予小型谷物在大田水平上對茅草枯抗性的脫鹵酶。
18．如權(quán)利要求16或17的種子，其中，所述小型谷物是小麥。
19．在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物植物，它具有穩(wěn)定整合在其基因組上的外源DNA分子，該DNA分子具有小型谷物密碼子使用并編碼能降解茅草枯的脫鹵酶。
20．如權(quán)利要求19的小型谷物植物，其中，所述DNA分子包括圖1所示編碼核苷酸序列或其遺傳學(xué)變體，該變體具有小型谷物密碼子使用，并編碼能賦予小型谷物在大田水平上對茅草枯抗性的脫鹵酶。
21．如權(quán)利要求19或20的小型谷物植物，其中，所述小型谷物是小麥。
22．一種使小型谷物植物在大田使用水平上抗除草劑茅草枯的方法，該方法包括(a)用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的DNA分子或如權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)所述的表達(dá)框轉(zhuǎn)化小型谷物的植物細(xì)胞；(b)選擇其生長抗茅草枯的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；和(c)由源于所述步驟(b)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生能在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物。
23．如權(quán)利要求21的方法，其中，在再生步驟(c)中轉(zhuǎn)移原始再生體，使其通過階梯式的一系列植物激素和茅草枯濃度，其中將所述再生體漂浮在液體培養(yǎng)基中的一個(gè)膜筏上。
24．如權(quán)利要求23的方法，其中，茅草枯的濃度從0.1到0.4mM增加。
25．如權(quán)利要求21-24中任一項(xiàng)的方法，其中，所述小型谷物是小麥。
26．將茅草枯作為選擇性除草劑用于含有能在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物植物的大田中的用途。
27．如權(quán)利要求26的用途，其中，所述在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物植物是權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化的植物。
28．將茅草枯作為選擇性除草劑用于含有茅草枯抗性小麥的大田中的用途。
29．一種用除草劑茅草枯在大田中保護(hù)小型谷物植物并殺死雜草的方法，包括將茅草枯噴灑到含有外源DNA分子的小型谷物的大田中，所述外源DNA分子具有適于在小型谷物中表達(dá)的密碼子使用，并穩(wěn)定整合到其基因組上，所述外源DNA能表達(dá)茅草枯降解脫鹵酶，其表達(dá)水平足于使得所述小型谷物在大田使用水平上抗茅草枯。
30．如權(quán)利要求29的方法，其中，所述大田使用水平上抗茅草枯的小型谷物業(yè)已用含有圖1所示編碼核苷酸序列的DNA分子或其遺傳學(xué)變體轉(zhuǎn)化過，所述DNA分子或其遺傳變體編碼賦予小型谷物能在大田使用水平上抗茅草枯的脫鹵酶。
32．如權(quán)利要求30或31的方法，其中，所述小型谷物是小麥。
全文摘要
編碼能降解除草劑茅草枯的脫鹵酶、并具有適用于小型谷物的密碼子使用和DNA分子,可將其用于轉(zhuǎn)化小型谷物的植物細(xì)胞,并由所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生能在大田使用水平上抗茅草枯的小型谷類植物。優(yōu)選的小型谷物是小麥和稻。
文檔編號C12N15/82GK1284133SQ98813222
公開日2001年2月14日 申請日期1998年11月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月20日
發(fā)明者J·格雷賽爾, E·加倫, J·張 申請人:耶達(dá)研究及發(fā)展有限公司