專利名稱：重組超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌、產(chǎn)物制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組超氧化物歧化酶(SOD)基因序列以及工程菌的制備和產(chǎn)物的純化方法。
自絲狀蘭藻-魚腥藻(Anabaena sP.PCC7120)中獲得一種超氧化物歧化酶，它是屬于Fe-SOD類型，F(xiàn)e-SOD在其199個氨基酸組成的肽鏈中與一個鐵原子結合，由于鐵的價態(tài)變化，能與超氧化物作用，從而減少超氧化物(O2·-，·OH和H2O2)對生物體內(nèi)含有的雙鍵物質(zhì)的破壞，如對不飽的脂肪酸、核酸、堿基等。因此，SOD是生物體內(nèi)維持各種代謝正常運轉(zhuǎn)、抗衰老、抗氧化的重要參與物質(zhì)，它催化的反應有
H2O2在體內(nèi)過氧化氫酶或過氧化物酶的作用下產(chǎn)生水。因此，如用在皮膚表面可防止超氧化物對皮膚細胞的破壞，也防止對一些細胞中的氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸等的氧化產(chǎn)生黑色素，而使皮膚著色。皮膚或其它組織不正常地著色是黑色素類物質(zhì)積累所致，名為黑變(melanism)。從而，SOD可用于化裝品中起抗氧化作用，強光和紫外光可產(chǎn)生超氧化物。
也有些報道，在生物體中由于SOD減少或突變后可使腫瘤發(fā)生；微生物實驗也表明它可延長微生物的壽命，抗衰老，在高的氧濃度下可起保護作用；也有報道SOD可保護神經(jīng)細胞不受損傷。有些國家除外用外，還做成內(nèi)服制劑來提高人的抗衰老作用。因此，這一蛋白將在醫(yī)藥上和農(nóng)業(yè)上有潛在的應用前景。目前，SOD多從牛血中提取，由于含量少，提取制備產(chǎn)物屬于勞動力密集型產(chǎn)品。
本發(fā)明目的是提供一種重組超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌、產(chǎn)物制備方法。本方法系生物工程方法，簡便、產(chǎn)量高用人少、價廉。
為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案重組超氧化物歧化酶的工程菌和產(chǎn)物制備方法包括以下幾個步驟①制備魚腥藻總DNA；②依純化SOD蛋白的N端序列設計了5′端簡并引物，又依其它來源的SOD蛋白保守區(qū)，設計了3′端引物；引物序列為xbaI
引物1.5′TCTAGA(AG) CA(AG) TA(TC) GG(AGCT) ATG AA 3′Bgl II引物2.3′AGATCTA (AG)TA (AGCT)GC (AG)TG (CT)TC CCA 5′③以總DNA為模板，以上述引物PCR擴增得SOD基因部分片段；④以SOD基因部分片段為探針與pSE380 DNA雜交，獲得蛋白基因全序列；⑤從SOD全序列cDNA中，依成熟SOD蛋白基因序列設計引物，引物序列為NcoI引物35′TCA CCATGG CA TTT GTA CAG GAA C 3′BamHI引物43′CT GCATCC TA AGC TTT AGC ATA AT 5′以總DNA的SOD基因為模板，PCR擴增，獲得成熟SOD基因序列和相應的氨基酸序列；擴增產(chǎn)物連接在NcoI/BamHI酶切后的pET3d上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選，得陽性克隆的大腸桿菌，即SOD的工程菌；⑥將工程菌在高密度培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IPTG化學誘導表達，收集菌體，高壓細胞破璧，破包含體。
以下結合實施例及附圖對本發(fā)明作詳細說明

圖1.PCR擴增的成熟Fe-SOD基因及其在pET3d克隆后的酶切鑒定圖2.SOD基因的pET3d表達載體的構建圖譜圖3.SOD基因在大腸桿菌BL21(DE3)的表達產(chǎn)物及純化產(chǎn)物的電泳鑒定圖譜。
圖1中，1.標準DNA(入DNA/EcoRI+Hind III)，2.PCR擴增產(chǎn)物。3.克隆在pET3d后的酶切鑒定(NcoI+BamHI酶切)。
圖3中，4.標準蛋白，5.空載pET3d的大腸桿菌全蛋白(對照)，6.含有SOD基因表達的大腸桿菌全蛋白，7.表達并破璧后的上清液，8.包含體蛋白，9.復性后的包含體蛋白，10、11純化的SOD蛋白。
實施例1.
1.Fe-SOD基因的獲得(1).制備魚腥藻的總DNA100ml對數(shù)生長期的魚腥藻，10000xg下收集藻體，在裂解緩沖液中(50mmol/L，Tris-HCl，10mmol/L EDTA，pH8.0)中用液氮凍融，再加入5mg/ml溶菌酶，37℃保溫1小時，再用常規(guī)的抽提DNA方法獲得總DNA。
(2).依純化SOD蛋白的N端序列設計了5′端簡并引物，又依其它來源的SOD蛋白保守區(qū)，設計了3′端引物；引物序列為xbaI引物1.5′TCTAGA(AG) CA(AG) TA(TC) GG(AGCT) ATG AA 3′Bgl II引物2.3′AGATCTA (AG)TA (AGCT)GC (AG)TG (CT)TC CCA 5′(3).以總DNA為模板，以上述引物PCR擴增得SOD基因部分片段。
(4).以SOD基因部分片段為探針與pSE380的DNA雜交，獲得蛋白基因全序列。
(5).從SOD全序列cDNA中，依成熟SOD蛋白基因序列設計引物，引物序列為NcoI引物35′TCA CCATGG CA TTT GTA CAG GAA C 3′BamHI引物43′CT GCATCC TA AGC TTT AGC ATA AT 5′以總DNA的SOD基因為模板，PCR擴增結果見圖1，獲得成熟SOD基因序列和相應的氨基酸序列為5′ ATG GCA TTT GTA CAG GAA CCA CTA CCC TAC GAC TTT AAT GCT TTA GAG CAG TAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Met Ala Phe Val Gln Glu Pro Leu Pro Tyr Asp Phe Asn Ala Leu Glu Gln TyrGGC ATG AAA GGT GAA ACC TTC GAG TAT CAC TAC GGC AAA CAT CAC AAA GCT TAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Met Lys Gly Glu Thr Phe Glu Tyr His Tyr Gly Lys His His Lys Ala TyrGTA GAT AAC CTG AAC AAG CTC ACC GAT GGT ACA GAA TTG GCT GAT AAA TCC TTA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Val Asp Asn Leu Asn Lys Leu Thr Asp Gly Thr Glu Leu Ala Asp Lys Ser LeuGAA GAA GTC ATC CAA ATT GCC TTT AAG GAT GCC TAT AAA GCT GGA ATC TTT AAC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Glu Glu Val Ile Gln Ile Ala Phe Lys Asp Ala Tyr Lys Ala Gly Ile Phe AsnAAC GCT GCT CAA GTG TGG AAC CAC ACC TTC TTC TGG AAT TCT TTA AAG CCC GCA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Asn Ala Ala Gln Val Trp Asn His Thr Phe Phe Trp Asn Ser Leu Lys Pro AlaGGT GGC GGC GCG CCT ACA GGT GAA TTC GCA GCC AAA ATT AAC CAA GAC TTT GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Gly Gly Ala Pro Thr Gly Glu Phe Ala Ala Lys Ile Asn Gln Asp Phe GlyAGC TTC GAC AAA TTG AAA GAA GAA TTT TCC AAC GCT GCT GCA ACT CAG TTC GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Phe Asp Lys Leu Lys Glu Glu Phe Ser Asn Ala Ala Ala Thr Gln Phe GlyAGC GGA TGG GCT TGG CTA ATT GAT GAT GGC GGT ACA CTG AAA GTC ACT AAA ACT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Gly Trp Ala Trp Leu Ile Asp Asp Gly Gly Thr Leu Lys Val Thr Lys ThrCCA AAC GCC GAA AAT CCC CTG GCT CAT GGA CAA AAA GCA CTC TTA ACC TTG GAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Pro Asn Ala Glu Asn Pro Leu Ala His Gly Gln Lys Ala Leu Leu Thr Leu AspGTC TGG GAA CAC GCC TAC TAC ATC GAC TTC AGA AAT GCT CGC CCA GCT TTT ATC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Ile Asp Phe Arg Asn Ala Arg Pro Ala Phe IleAAG AAC TAC TTA GAT AAC TTG GTT AAC TGG GAC TTT GCT GCT GCG AAT TAT GCT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Lys Asn Tyr Leu Asp Asn Leu Val Asn Trp Asp Phe Ala Ala Ala Asn Tyr AlaAAA GCT TAG 3′--- --- ---Lys Ala***2.Fe-SOD基因克隆和表達回收產(chǎn)物連接在經(jīng)NcoI/BamHI酶切的PET3d表達載體上，可以用T4接連酶連接到pET3d的相應位點上(見圖2)。制備大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，進行轉(zhuǎn)化，進行陽性克隆篩選。將工程菌三級培養(yǎng)，一、二級用LB培養(yǎng)基，三級用高密度培養(yǎng)基，工程菌高密度的培養(yǎng)基配方為硫酸銨5.0克/升，磷酸氫二鉀6.0克/升；磷酸二氫鉀3.0克/升，檸檬酸鈉0.5克/升；硫酸鎂1.5克/升，三氯化鐵0.01克/升；胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物2.0-10.0克/升；葡萄糖80.0-100.0克/升；微量元素(銅、鈷、鈣、鋅、鉬、錳)各10-5-10-4克分子/升。
在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基上37℃振蕩培養(yǎng)，菌體達對數(shù)生長期時加入IPTG達0.5mmol/L，再培養(yǎng)2-4小時，收集菌體。表達量用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，鑒定結果見圖3。產(chǎn)物已被大量表達，表達量約占菌體蛋白40％以上。
3.產(chǎn)物純化表達后的濕菌體懸浮于20mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.8)中，內(nèi)含0.1mmol/L EDTA，用高壓細胞破碎儀破細胞璧，離心去細胞碎片，收集包含體，包含體用含有8mol/L尿素的磷酸緩沖液懸浮，離心去不溶物，透析，復性后經(jīng)DEAE-Sephadex A-50柱層析，柱用20mmol/L-200mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8，內(nèi)含0.1mmol/L EDTA)梯度洗脫，收集有SOD活性部分(第三峰)，進行純度鑒定(見圖3)。
4.活性測定依Steward和Bewleyz(1980)方法，在3ml反應混合液中含有13mmol/L蛋氨酸，75μmol/L氮蘭四唑，2μmol/L核黃素，100nmol/LEDTA和適量酶液，照光(30W)30℃下保溫25分鐘，測定560nm的OD值，以不照光的混合液為對照，以照光不加酸的混合液為100％，加酶后反應抑制50％的酶量為一個活性單位。依上方法純化的SOD比活性為2500單位/mg蛋白。
本發(fā)明優(yōu)點①首次從絲狀蘭藻中獲得Fe-SOD基因。
②由于使用高密度培養(yǎng)基，菌體產(chǎn)量高，每升培養(yǎng)基可產(chǎn)濕菌體60-70克。
③載體構建合理，工程菌的產(chǎn)物表達量高，約占菌體可溶蛋白的40％，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
④純化工藝簡單，一步純化即可達到電泳純產(chǎn)品。
本基因序列已在Gen Bank注冊。
權利要求
1.一種重組超氧化物歧化酶基因序列，其特征在于其核苷酸序列和相應的氨基酸序列為5′ ATG GCA TTT GTA CAG GAA CCA CTA CCC TAC GAC TTT AAT GCT TTA GAG CAG TAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Met Ala Phe Val Gln Glu Pro Leu Pro Tyr Asp Phe Asn Ala Leu Glu Gln TyrGGC ATG AAA GGT GAA ACC TTC GAG TAT CAC TAC GGC AAA CAT CAC AAA GCT TAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Met Lys Gly Glu Thr Phe Glu Tyr His Tyr Gly Lys His His Lys Ala TyrGTA GAT AAC CTG AAC AAG CTC ACC GAT GGT ACA GAA TTG GCT GAT AAA TCC TTA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Val Asp Asn Leu Asn Lys Leu Thr Asp Gly Thr Glu Leu Ala Asp Lys Ser LeuGAA GAA GTC ATC CAA ATT GCC TTT AAG GAT GCC TAT AAA GCT GGA ATC TTT AAC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Glu Glu Val Ile Gln Ile Ala Phe Lys Asp Ala Tyr Lys Ala Gly Ile Phe AsnAAC GCT GCT CAA GTG TGG AAC CAC ACC TTC TTC TGG AAT TCT TTA AAG CCC GCA--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Asn Ala Ala Gln Val Trp Asn His Thr Phe Phe Trp Asn Ser Leu Lys Pro AlaGGT GGC GGC GCG CCT ACA GGT GAA TTC GCA GCC AAA ATT AAC CAA GAC TTT GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Gly Gly Ala Pro Thr Gly Glu Phe Ala Ala Lys Ile Asn Gln Asp Phe GlyAGC TTC GAC AAA TTG AAA GAA GAA TTT TCC AAC GCT GCT GCA ACT CAG TTC GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Phe Asp Lys Leu Lys Glu Glu Phe Ser Asn Ala Ala Ala Thr Gln Phe GlyAGC GGA TGG GCT TGG CTA ATT GAT GAT GGC GGT ACA CTG AAA GTC ACT AAA ACT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Gly Trp Ala Trp Leu Ile Asp Asp Gly Gly Thr Leu Lys Val Thr Lys ThrCCA AAC GCC GAA AAT CCC CTG GCT CAT GGA CAA AAA GCA CTC TTA ACC TTG GAT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Pro Asn Ala Glu Asn Pro Leu Ala His Gly Gln Lys Ala Leu Leu Thr Leu AspGTC TGG GAA CAC GCC TAC TAC ATC GAC TTC AGA AAT GCT CGC CCA GCT TTT ATC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Ile Asp Phe Arg Asn Ala Arg Pro Ala Phe IleAAG AAC TAC TTA GAT AAC TTG GTT AAC TGG GAC TTT GCT GCT GCG AAT TAT GCT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Lys Asn Tyr Leu Asp Asn Leu Val Asn Trp Asp phe Ala Ala Ala Asn Tyr AlaAAA GCT TAG 3′--- --- ---Lys Ala***
2.一種重組超氧化物歧化酶基因序列、工程菌及其產(chǎn)物制備方法，其特征在于它包括以下幾個步驟①制備魚腥藻總DNA；②依純化SOD蛋白的N端序列設計了5′端簡并引物，又依其它來源的SOD蛋白保守區(qū)，設計了3′端引物；引物序列為xbaI引物1.5′TCTAGA(AG) CA(AG) TA(TC) GG(AGCT) ATG AA3′Bgl II引物2.3′AGATCTA (AG)TA (AGCT)GC (AG)TG (CT)TC CCA 5′③以總DNA為模板，以上述引物PCR擴增得SOD基因部分片段；④以SOD基因部分片段為探針與pSE380 DNA雜交，獲得蛋白基因全序列；⑤從SOD全序列cDNA中，依成熟SOD蛋白基因序列設計引物，引物序列為NcoI引物35′TCA CCATGG CA TTT GTA CAG GAA C 3′BamHI引物43′CT GCATCC TA AGC TTT AGC ATA AT 5′以總DNA的SOD基因為模板，PCR擴增，獲得成熟SOD基因序列和相應的氨基酸序列；擴增產(chǎn)物連接在NcoI/BamHI酶切后的pET3d上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選，得陽性克隆的大腸桿菌，即SOD的工程菌；⑥將工程菌在高密度培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IPTG化學誘導表達，收集菌體，高壓細胞破璧，破包含體。
3.按權利要求2所述的重組SOD工程菌及其產(chǎn)物的制備方法，其特征在于所述的產(chǎn)物經(jīng)透析后在DEAE-Sephadex A-50柱層析，產(chǎn)品被純化。
4.按權利要求2所述的重組SOD工程菌及其產(chǎn)物的制備方法，其特征在于所述工程菌高密度的培養(yǎng)基配方為硫酸銨5.0克/升，磷酸氫二鉀6.0克/升；磷酸二氫鉀3.0克/升，檸檬酸鈉0.5克/升；硫酸鎂1.5克/升，三氯化鐵0.01克/升；胰蛋白胨10.0-20.0克/升，酵母提取物2.0-10.0克/升；葡萄糖80.0-100.0克/升；微量元素(銅、鈷、鈣、鋅、鉬、錳)各10-5-10-4克分子/升。
全文摘要
一種重組超氧化物歧化酶基因序列及其工程菌產(chǎn)物制備方法。其基因自絲狀蘭藻—魚腥藻的總DNA中獲得,克隆到pET3d載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)上,得工程菌。將工程菌高密度培養(yǎng),用IPTG誘導后,基因大量表面。產(chǎn)物經(jīng)DEAE－SephadexA－50柱層析,產(chǎn)物一種重組超氧化物歧化酶被純化。采用本發(fā)明的方法,準確獲得含有199個氨基酸殘基的成熟蛋白序列,該酶具有抗氧化、抗衰老作用,在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上有潛在的應用前景。本方法菌體產(chǎn)量高,表達量高,產(chǎn)物表達量占菌體可溶蛋白的40%,占包含體約為60%,純化容易,酶活性高。
文檔編號C12P21/02GK1263158SQ9910072
公開日2000年8月16日 申請日期1999年2月11日 優(yōu)先權日1999年2月11日
發(fā)明者趙進東, 吳光耀, 劉迎芳 申請人:吳光耀