專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)l－天冬氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用天冬氨酸酶從富馬酸生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)加至隨后反應(yīng)的起始溶液中，從分離出晶體L-天冬氨酸的母液中再循環(huán)未結(jié)晶的L-天冬氨酸的方法。
結(jié)晶并收集DL-天冬氨酸的方法已公開(kāi)于日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)卦S公開(kāi)48-56618中，其中富馬酸被加至DL-天冬氨酸二鈉溶液中。該方法包括將富馬酸二鈉與過(guò)量氨反應(yīng)以形成DL-天冬氨酸，從反應(yīng)溶液中除去過(guò)量的氨，然后將富馬酸加至反應(yīng)溶液中以結(jié)晶并分離DL-天冬氨酸。
在該方法中，加入富馬酸前的溶液是DL-天冬氨酸鈉溶液，向其中加入富馬酸以沉淀DL-天冬氨酸。分離晶體DL-天冬氨酸后的母液(即濾液)是富馬酸二鈉溶液。隨后，將比富馬酸過(guò)量很多的氨加至富馬酸二鈉溶液中，將所得的溶液再作為下步反應(yīng)的起始溶液再循環(huán)。
總之，在用酶從富馬酸銨生產(chǎn)L-天冬氨酸的反應(yīng)中，需要加入與起始物質(zhì)(即富馬酸)等摩爾量或過(guò)量的氨。為了使反應(yīng)的平衡向L-天冬氨酸側(cè)移動(dòng)，通常使用的氨量是常規(guī)所用富馬酸摩爾量的2至2.3倍。另一方面，催化所述反應(yīng)的天冬氨酸酶的最佳pH為約8.3。在比該pH值高很多的pH范圍內(nèi)，可能會(huì)降低酶活性。
在日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)卦S公開(kāi)48-56618公開(kāi)的方法中，為了進(jìn)行再循環(huán)，大大過(guò)量的氨被加至富馬酸二鈉溶液中。
所述富馬酸二鈉溶液的pH為8.4。在30℃，以與富馬酸等摩爾的量向該溶液中加入氨時(shí)，溶液的pH升至12.1，在此pH天冬氨酸酶會(huì)變性。因此，對(duì)于用天冬氨酸酶進(jìn)行的酶促反應(yīng)來(lái)說(shuō)，加入所述量的氨是不適宜的。
日本專(zhuān)利2524306公開(kāi)了通過(guò)將富馬酸加至L-天冬氨酸單銨溶液中而結(jié)晶并分離L-天冬氨酸的方法。在該方法中，用天冬氨酸酶將富馬酸二銨溶液轉(zhuǎn)變成L-天冬氨酸單銨溶液，將富馬酸加至所得的溶液中以結(jié)晶L-天冬氨酸，然后過(guò)濾分離，然后將氨加至濾液中以進(jìn)行隨后的反應(yīng)。
在該方法中，由于富馬酸被加至L-天冬氨酸單銨溶液中，所以是在存在富馬酸或L-天冬氨酸或兩者同時(shí)存在的多相條件下進(jìn)行L-天冬氨酸和富馬酸之間鹽的交換反應(yīng)。
此外，在該方法中，首次加入的富馬酸量是反應(yīng)溶液中L-天冬氨酸鹽摩爾量的0.5倍。但是，為了在分離晶體L-天冬氨酸后，將反應(yīng)溶液作為隨后反應(yīng)的起始溶液進(jìn)行再循環(huán)，必須向反應(yīng)溶液中補(bǔ)充額外量的富馬酸以便再調(diào)整減少的底物濃度，使其達(dá)到起始濃度。即，需加入兩次固體組分(即富馬酸)。在該方法中，處理固體組分的復(fù)雜步驟的次數(shù)增加可導(dǎo)致所產(chǎn)生的L-天冬氨酸的可加工性差和純度低。
因此，本發(fā)明的目的是解決上述問(wèn)題并提供通過(guò)天冬氨酸酶的作用，生產(chǎn)高純度晶體L-天冬氨酸的方法。
我們進(jìn)行了深入的研究以解決上述問(wèn)題。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了下列事實(shí)當(dāng)用于結(jié)晶L-天冬氨酸而加入的富馬酸量與L-天冬氨酸銨溶液中的的L-天冬氨酸鹽的量基本上等摩爾時(shí)，加入富馬酸后形成的富馬酸鹽是富馬酸單銨，所述富馬酸單銨的溶解度較小；部分富馬酸單銨作為晶體出現(xiàn)在溶液中并被包含在L-天冬氨酸晶體中，成為其中的雜質(zhì)；因此，降低了晶體L-天冬氨酸的純度。
為了改進(jìn)這種缺陷，我們發(fā)現(xiàn)了用于生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，其中將氨加至通過(guò)天冬氨酸酶的酶促反應(yīng)而得到的L-天冬氨酸銨溶液中以便使反應(yīng)溶液達(dá)到氨溶解過(guò)量的狀態(tài)，然后將富馬酸以反應(yīng)溶液中富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽總摩爾量0.6-1.2倍的量加至反應(yīng)溶液中以便將富馬酸溶解于溶液并使L-天冬氨酸從溶液中結(jié)晶出。
我們還發(fā)現(xiàn)了另一種生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，其中將氨加至通過(guò)天冬氨酸酶的酶促反應(yīng)而得到的L-天冬氨酸銨溶液中，將反應(yīng)溶液加熱，將富馬酸加至加熱的反應(yīng)溶液中以加速富馬酸在溶液中的溶解，然后將所得的不含晶體的均勻溶液結(jié)晶，只有L-天冬氨酸從溶液中結(jié)晶出。
用這些方法，通過(guò)將氨加至反應(yīng)溶液中，在加入富馬酸后，可產(chǎn)生不僅僅是富馬酸單銨，而是富馬酸單銨和富馬酸二銨的混合物。富馬酸二銨由于其高溶解度而不會(huì)被包含在L-天冬氨酸晶體中。就作為反應(yīng)產(chǎn)物的一部分而生產(chǎn)出的富馬酸單銨而言，隨富馬酸二銨的形成其在溶液中的濃度降低，它以完全溶解的狀態(tài)存在于反應(yīng)溶液中。結(jié)果，由于可以避免將富馬酸單銨晶體包含在晶體L-天冬氨酸中，因此可得到高純度的L-天冬氨酸晶體。
此外，我們還發(fā)現(xiàn)利用氨和堿金屬氫氧化物(如氫氧化鈉)組合中和天冬氨酸酶的底物溶液(即起始富馬酸溶液)，可提高晶體L-天冬氨酸的產(chǎn)率，而且加入的堿金屬氫氧化物的量對(duì)于用天冬氨酸酶的酶促反應(yīng)有最佳范圍。
基于上述發(fā)現(xiàn)，我們完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面，提供生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，該方法包括制備含富馬酸、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液，將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液，然后將L-天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出來(lái)，其中再將額外量的氨加至含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中，隨后將富馬酸加至反應(yīng)溶液中以結(jié)晶L-天冬氨酸。
在此，在L-天冬氨酸結(jié)晶后，可分離仍留在反應(yīng)溶液中的未結(jié)晶的天冬氨酸，可將氨加至該溶液中，將所得反應(yīng)溶液作為生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸方法的部分起始反應(yīng)溶液，用于再循環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，該方法包括制備含富馬酸、L-天冬氨酸銨、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液，將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液，然后將L-天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出，其中再將額外量的氨加至含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中，隨后將富馬酸加入以結(jié)晶L-天冬氨酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，該方法包括制備含富馬酸、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液，將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液，然后將L-天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出，其中再將額外量的氨加至含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中，隨后將所述反應(yīng)溶液冷卻以結(jié)晶L-天冬氨酸。
在此，在L-天冬氨酸結(jié)晶后，可分離仍留在反應(yīng)溶液中的未結(jié)晶的天冬氨酸，可將氨加至該溶液中，將所得反應(yīng)溶液作為生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸方法的部分起始反應(yīng)溶液，用于再循環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，該方法包括制備含富馬酸、L-天冬氨酸銨、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液，將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液，然后將L-天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出，其中再將額外量的氨加至含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中，將反應(yīng)溶液加熱，將富馬酸加至反應(yīng)溶液中，將所述反應(yīng)溶液冷卻以結(jié)晶L-天冬氨酸。
在此，混合溶液中堿金屬氫氧化物的量為溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽總摩爾量的0.1-1倍。
用于結(jié)晶L-天冬氨酸所加入的富馬酸量可以是含L-天冬氨酸的反應(yīng)溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽總摩爾量的0.6-1.2倍。
天冬氨酸酶可以是通過(guò)將攜帶天冬氨酸酶基因的轉(zhuǎn)化體或從所述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的產(chǎn)物固定于載體上而制備出的固定化天冬氨酸酶。
含富馬酸、L-天冬氨酸、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液以富馬酸計(jì)，含有濃度為8-20％的富馬酸和L-天冬氨酸，將該混合溶液以2-20的液體時(shí)空速流過(guò)含固定化天冬氨酸酶的反應(yīng)器，所述固定化天冬氨酸酶的活性為250U或更高。本文所用“1U”指每分鐘每毫升固定化天冬氨酸酶產(chǎn)生1μmol L-天冬氨酸，“LHSV”表示“液體時(shí)空速”并表示每體積填充的催化劑(以毫升計(jì))每小時(shí)流過(guò)溶液的體積(以毫升計(jì))。
通過(guò)將有天冬氨酸酶活性的微生物細(xì)胞或所述微生物細(xì)胞的產(chǎn)物吸附到離子交換樹(shù)脂上或通過(guò)將含微生物細(xì)胞或所述微生物細(xì)胞之產(chǎn)物的聚合物包被到離子交換樹(shù)脂上可制備固定化天冬氨酸酶。
通過(guò)將有天冬氨酸酶活性的微生物細(xì)胞或所述微生物細(xì)胞的產(chǎn)物與式(Ⅰ)聚合物混合，然后將混合物包被到球形苯乙烯/二乙烯基苯共聚物離子交換樹(shù)脂顆粒的表面上，可制備固定化天冬氨酸酶
其中Y是直接鍵或由下列分子式代表的雙功能基團(tuán)
或
R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子或有機(jī)殘基，X是陰離子，n是100-5000的整數(shù)。
本說(shuō)明書(shū)包括日本專(zhuān)利申請(qǐng)10-31857和10-31858說(shuō)明書(shū)和/或附圖
所公開(kāi)的部分或全部?jī)?nèi)容，這兩個(gè)申請(qǐng)是本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)文件。
下文將詳細(xì)地描述本發(fā)明。
在本發(fā)明中，天冬氨酸酶可以是具有天冬氨酸酶活性的含天冬氨酸酶物質(zhì)。含天冬氨酸酶物質(zhì)的實(shí)例包括已知具有高天冬氨酸酶活性的微生物，如大腸桿菌和屬于短桿菌和假單胞菌科的微生物，以及通過(guò)例如超聲、摩擦、凍融、用酶或表面活性劑處理細(xì)胞而產(chǎn)生的其產(chǎn)物。也可以從細(xì)胞產(chǎn)物中通過(guò)常規(guī)技術(shù)如硫酸銨分離和丙酮沉淀部分純化天冬氨酸酶，或通過(guò)常規(guī)技術(shù)如色譜從細(xì)胞產(chǎn)物中完全純化?？梢允褂萌魏晤?lèi)型的天冬氨酸酶，只要它有天冬氨酸酶活性。
但是，在本發(fā)明中，特別優(yōu)選使用已用攜帶天冬氨酸酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過(guò)的重組大腸桿菌細(xì)胞，以便所述細(xì)胞可產(chǎn)生增加量的天冬氨酸酶。這是因?yàn)楫?dāng)用堿金屬氫氧化物(如氫氧化鈉)中和部分富馬酸時(shí)，相對(duì)于反應(yīng)溶液中的堿金屬氫氧化物量，氨在反應(yīng)溶液中的數(shù)量減少，從而會(huì)導(dǎo)致富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率降低。
可用于本發(fā)明的天冬氨酸酶基因可衍生于任已知其基因與大腸桿菌基因天然雜交(cross)并具有天冬氨酸酶活性的微生物，所述微生物包括大腸桿菌，熒光假單胞菌和屬于腸桿菌科和檸檬酸桿菌科的微生物。天冬氨酸酶基因可得自例如大腸桿菌菌株K-12(IFO3301)或熒光假單胞菌(IFO3081)的染色體DNA，并用基于已知天冬氨酸酶基因序列制備的引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。
對(duì)用于整合天冬氨酸酶基因的質(zhì)粒沒(méi)有限制，可以使用任何質(zhì)粒，只要該質(zhì)?？梢栽趯儆诖竽c桿菌的微生物中復(fù)制。所述質(zhì)粒的實(shí)例包括pUC18和pKK223-3。用于導(dǎo)入攜帶天冬氨酸酶基因之質(zhì)粒的宿主微生物優(yōu)選大腸桿菌菌株K-12。
在本發(fā)明中，可以用常規(guī)方法將具有天冬氨酸酶活性的微生物細(xì)胞、其產(chǎn)物或天冬氨酸酶本身固定在載體上。所述載體的實(shí)例包括天然聚合物如纖維素、藻酸、角叉菜膠和甘露聚糖凝膠；和合成聚合物如離子交換樹(shù)脂，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺。其中，優(yōu)選由苯乙烯/二乙烯基苯共聚物制備的球形離子交換樹(shù)脂顆粒，該顆粒用上述式(Ⅰ)聚合物與上述微生物細(xì)胞或其產(chǎn)物的混合物包被。例如，優(yōu)選通過(guò)將微生物細(xì)胞與水溶性聚合物(例如PAS-880)的混合物包被在載體上，然后干燥包被層從而將所述細(xì)胞固定在水不溶性載體上，所述水溶性聚合物可在聚合物分子間或聚合物與細(xì)胞表面間形成交聯(lián)鍵。
用該方法制備的固定化天冬氨酸酶由于其擴(kuò)散層薄而具有低壓力損失和低擴(kuò)散障礙，因此適用于具有高液體時(shí)空速(LHSV)的反應(yīng)。
用于本發(fā)明的起始底物溶液是富馬酸和富馬酸-中和的鹽的水溶液。所用的堿是氨和堿金屬氫氧化物的組合。堿金屬氫氧化物的量為底物溶液中所含L-天冬氨酸鹽和富馬酸鹽總摩爾量的0.1-1.2倍，優(yōu)選0.3-1.0倍，最佳為0.4-0.8倍。在此，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解表達(dá)方式“底物溶液中所含L-天冬氨酸鹽和富馬酸鹽的總摩爾量”指在底物溶液中不含有L-天冬氨酸鹽時(shí)“在底物溶液中所含的富馬酸鹽摩爾量”，實(shí)際上是加至底物溶液中的“富馬酸”本身的摩爾量。在考慮底物溶液的再循環(huán)的情況下，從本發(fā)明的性質(zhì)看，在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中使用該表達(dá)方式是為了方便。這同樣適用于下述表示氨量的表達(dá)方式。如果堿金屬氫氧化物的量在范圍以下，晶體L-天冬氨酸的回收率將降低。但如果堿金屬氫氧化物的量在所述范圍之上，則底物溶液的pH就會(huì)很高，而且所加的氨量減少，從而導(dǎo)致富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率降低，并可導(dǎo)致天冬氨酸酶失活。
就工業(yè)實(shí)用性而言，優(yōu)選本發(fā)明所用的氨是水溶液的形式。但是液體氨和氨氣均可使用。起始底物溶液中的氨量是底物溶液中L-天冬氨酸鹽和富馬酸鹽總摩爾量的1～2倍，優(yōu)選1.1-1.8倍，更優(yōu)選1.2-1.5倍。在本發(fā)明中，優(yōu)選在加入堿金屬氫氧化物后，將氨以一定的量加至底物溶液中以便將所得溶液的pH調(diào)至至6-9.5，優(yōu)選7-9.3，最佳為8-9。富馬酸在底物溶液中的濃度優(yōu)選為5-20％重。但是就所產(chǎn)生的晶體L-天冬氨酸的生產(chǎn)率和純度而言，特別有效的是使用濃度為8-15％重的富馬酸。
底物溶液還可含有二價(jià)金屬鹽，例如錳，例如氯化錳，硫酸錳；鎂鹽，例如氯化鎂，硫酸鎂；和鈷鹽，所述二價(jià)金屬鹽的濃度為0.1-50mM，優(yōu)選1-10mM。
在本發(fā)明中，可使用任何類(lèi)型的反應(yīng)器，包括常規(guī)的間歇式或柱型反應(yīng)器。所述反應(yīng)器可單個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)組合使用。
為了在工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸，柱型反應(yīng)器是特別優(yōu)選的。在用柱型反應(yīng)器完成的反應(yīng)中，當(dāng)使用固定化天冬氨酸酶時(shí)，可將底物溶液以2-20LHSV的流速流過(guò)所述柱以便使溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)，所述固定化天冬氨酸酶是通過(guò)將式(Ⅰ)聚合物與大腸桿菌細(xì)胞的混合物包被到球形苯乙烯/二乙烯基苯共聚物離子交換樹(shù)脂上而制備的，所述大腸桿菌細(xì)胞已用攜帶天冬氨酸酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以便產(chǎn)生增加量的天冬氨酸酶。
當(dāng)使用其中天然大腸桿菌被固定的固定化天冬氨酸酶時(shí)，需要延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或降低底物溶液的流速(LHSV)，因?yàn)樘烊淮竽c桿菌的天冬氨酸酶活性不是很高。相反，當(dāng)使用其中大腸桿菌已用天冬氨酸酶基因轉(zhuǎn)化的固定化天冬氨酸酶時(shí)，甚至以上述流速也可得到令人滿(mǎn)意的轉(zhuǎn)化率，因?yàn)樗龉潭ɑ於彼崦赣袠O高的天冬氨酸酶活性。
反應(yīng)溫度優(yōu)選為約10℃-約50℃，更優(yōu)選15℃-40℃。如果反應(yīng)溫度低于所述范圍，則反應(yīng)速率可能降低。而反應(yīng)溫度高于所述范圍，則天冬氨酸酶可能被失活。
富馬酸與氨的反應(yīng)在上述條件下完成。盡管優(yōu)選以較高的轉(zhuǎn)化率進(jìn)行反應(yīng)，但對(duì)于隨后L-天冬氨酸的結(jié)晶來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)化率約90％是令人滿(mǎn)意的，即使反應(yīng)不能達(dá)到平衡。
然后，將氨加至反應(yīng)溶液中以便將溶液的pH調(diào)至9或更高，優(yōu)選pH9.1或更高，最佳為pH9.3或更高。所加氨量的上限與反應(yīng)溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽的總量是等摩爾的，具體為反應(yīng)溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽的總摩爾量的0.1-0.9倍，優(yōu)選0.3-0.7倍。氨量低于上述范圍，在晶體L-天冬氨酸中會(huì)出現(xiàn)富馬酸單銨的污染。氨量高于上述范圍，晶體L-天冬氨酸的產(chǎn)率將降低。
在本發(fā)明一方面，加入氨后，再將富馬酸加至反應(yīng)溶液中。富馬酸的量為反應(yīng)溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽總摩爾量的0.6-1.2倍，優(yōu)選0.7-1.1倍，最佳0.8-1.0倍。當(dāng)加入的富馬酸量低于上述范圍時(shí)，晶體L-天冬氨酸的產(chǎn)率降低。當(dāng)加入的富馬酸量高于上述范圍時(shí)，在晶體L-天冬氨酸中會(huì)出現(xiàn)富馬酸鹽的污染。
加入富馬酸后，在45℃或低于45℃的溫度攪拌反應(yīng)溶液。如果溫度太低，低溶解度的富馬酸單銨晶體就可能被包含在晶體L-天冬氨酸中。因此，反應(yīng)溶液的溫度優(yōu)選為10-40℃，最佳為25-35℃。加入富馬酸后，再將反應(yīng)溶液攪拌1秒至1小時(shí)，優(yōu)選1-15分鐘，以便使L-天冬氨酸從溶液中結(jié)晶出。用常規(guī)方法如抽濾和離心過(guò)濾可從溶液中分離出結(jié)晶的L-天冬氨酸。離心過(guò)濾是優(yōu)選的，因?yàn)檫@樣可得到液體含量低的晶體L-天冬氨酸餅。
在本發(fā)明的另一方面，加入氨后，將反應(yīng)溶液加熱至45℃或45℃以上，優(yōu)選50℃或更高。盡管加熱溫度沒(méi)有具體上限，但是通常，將反應(yīng)溶液加熱至其在常壓下的沸點(diǎn)溫度。隨后，將富馬酸加至反應(yīng)溶液中。加入的富馬酸量為反應(yīng)溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽總摩爾量的0.6-1.2倍，優(yōu)選0.65-1.1倍，最佳0.7-1.0倍。當(dāng)加入的富馬酸量低于上述范圍時(shí)，晶體L-天冬氨酸的產(chǎn)率降低。當(dāng)加入的富馬酸量高于上述范圍時(shí)，在晶體L-天冬氨酸中會(huì)出現(xiàn)富馬酸鹽。加入富馬酸后，再將反應(yīng)溶液在45℃或45℃以上攪拌1秒至1小時(shí)，優(yōu)選1-15分鐘，以完全溶解富馬酸。該溶液是不含富馬酸或L-天冬氨酸晶體的均勻溶液。然后將該反應(yīng)溶液冷卻以便從溶液中結(jié)晶出L-天冬氨酸。繼續(xù)冷卻直到懸浮液(即，含晶體L-天冬氨酸的溶液)的溫度達(dá)到10-45℃。當(dāng)溫度高于該范圍時(shí)，晶體L-天冬氨酸的產(chǎn)率降低。當(dāng)溫度低于該范圍時(shí)，晶體L-天冬氨酸中含富馬酸鹽。
冷卻后，將溶液繼續(xù)攪拌1秒至1小時(shí)，優(yōu)選5-15分鐘以便使L-天冬氨酸從溶液中結(jié)晶。用常規(guī)方法如抽濾和離心過(guò)濾可從溶液中分離出產(chǎn)生的晶體L-天冬氨酸。離心過(guò)濾是優(yōu)選的，因?yàn)檫@樣可得到液體含量低的晶體L-天冬氨酸餅。
如果需要，將由此分離的L-天冬氨酸晶體(即餅)用水洗滌。通過(guò)洗滌，可降低在L-天冬氨酸晶體中所含的富馬酸鹽的量，從而得到高純度晶體L-天冬氨酸。但是，就從溶液中分離L-天冬氨酸晶體后的母液的再循環(huán)而言，最好不用大量水洗滌晶體。用于洗滌晶體的水量，以L(fǎng)-天冬氨酸晶體計(jì)，為5-500％重，優(yōu)選10-200％。用這種方法，可得到含痕量例如0.1-3％重，優(yōu)選0.2-2％重富馬酸鹽的L-天冬氨酸。即使制成細(xì)粉，由此得到的含富馬酸鹽的晶體L-天冬氨酸也很難在空中傳播，因此易于處理并對(duì)于作為L(zhǎng)-天冬氨酸用于工業(yè)用途是極有用的。
通過(guò)進(jìn)一步的重復(fù)純化，可將L-天冬氨酸用作食品、藥物添加劑等。
可將分離L-天冬氨酸晶體后的母液再循環(huán)，通過(guò)與餅洗滌溶液混合并向其中加入氨作為隨后反應(yīng)的起始底物溶液。如果需要，可對(duì)母液和洗滌溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砣鐫饪s。例如，底物溶液的體積由于洗滌溶液和氨水溶液中水的體積而增加。因此，加入氨后，通過(guò)濃縮母液和洗滌溶液，可將底物溶液的總體積調(diào)整至預(yù)定的起始體積。通過(guò)從作為晶體分離出的L-天冬氨酸摩爾量中減去加入富馬酸前加入的氨的摩爾量，可確定補(bǔ)充的氨摩爾量。因此，將底物溶液中的氨量調(diào)整至溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽總摩爾量的1-2倍。該溶液的pH為6-11。用該方法，可將母液制成用于隨后反應(yīng)的起始底物溶液。即，在本發(fā)明一方面，重復(fù)一系列過(guò)程，該過(guò)程包括將底物溶液與具有天冬氨酸酶活性的含天冬氨酸酶物質(zhì)反應(yīng)，將氨加至反應(yīng)溶液中，將富馬酸加至反應(yīng)溶液中以便從溶液中結(jié)晶出L-天冬氨酸，分離L-天冬氨酸晶體，從母液制備下步起始底物溶液。在本發(fā)明的另一方面，重復(fù)一系列過(guò)程，該過(guò)程包括將底物溶液與具有天冬氨酸酶活性的含天冬氨酸酶物質(zhì)反應(yīng)，將氨加至反應(yīng)溶液中，將反應(yīng)溶液加熱，將富馬酸加至熱反應(yīng)溶液中，冷卻反應(yīng)溶液以便從溶液中結(jié)晶出L-天冬氨酸，分離L-天冬氨酸晶體，從母液制備下步起始底物溶液。根據(jù)本發(fā)明，可將母液再循環(huán)10次或更多。
以下描述通過(guò)遺傳工程技術(shù)制備衍生于大腸桿菌的天冬氨酸酶的方法。
(ⅰ)用重組天冬氨酸酶基因生產(chǎn)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體將從發(fā)酵研究所(Institute for Fermentation,Osaka,Japan(IFO))購(gòu)買(mǎi)的大腸桿菌菌株IFO3301接種至表1所示的LB培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)8小時(shí)。從1毫升培養(yǎng)物中，收集大腸桿菌細(xì)胞并懸浮在1毫升蒸餾水中。用1微升細(xì)胞懸浮液作為模板DNA用于擴(kuò)增天冬氨酸酶基因。
表1LB培養(yǎng)基的組成聚胨 10g酵母提取物 5gNaCl 10g蒸餾水 1升(用高壓消毒鍋在121℃滅菌15分鐘)(ⅱ)用PCR擴(kuò)增天冬氨酸酶基因并制備插入片段為了擴(kuò)增大腸桿菌的天冬氨酸酶基因，以已知大腸桿菌菌株K-12的天冬氨酸酶基因(SEQ ID NO:1)(Biochem.J.237(2),547-557)為基礎(chǔ)，制備下列兩個(gè)引物引物F:GGATAATCGTCGGTCGAAAA引物R:CGTCATCTGACGTGCCTTT用KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)制備含有下列組成的反應(yīng)溶液以便在下列條件下通過(guò)PCR擴(kuò)增天冬氨酸酶基因組成10x緩沖液5μldNTPs混合物 5μlMgCl22μl模板DNA 1μlKOD DNA聚合酶1μl引物F(25pmol)1μl引物R(25pmol)1μl無(wú)菌水 34μl總量50μl
PCR條件(1)98℃,5分鐘(2)98℃,30秒(3)53℃,30秒(4)68℃,1分鐘(其中將(2)至(4)重復(fù)30個(gè)循環(huán))在PCR反應(yīng)結(jié)束后，在1％瓊脂糖凝膠上電泳擴(kuò)增的DNA片段并用溴化乙錠染色。結(jié)果，證實(shí)擴(kuò)增了預(yù)期的約1600bp片段。
從瓊脂糖凝膠上切下含DNA片段的部分以用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(ⅲ)將插入片段與載體連接存在限制酶Srf和DNA連接酶的條件下，將以上得到的DNA片段連接至pCR-Script Amp SK(+)克隆載體中。
將攜帶含插入的DNA片段之載體的轉(zhuǎn)化體命名為PUaspE1菌株。將菌株P(guān)UaspE1接種至3毫升含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中并在37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。從1.5ml培養(yǎng)物收集細(xì)胞，再用堿SDS方法從細(xì)胞中回收質(zhì)粒。將得到的質(zhì)粒命名為pUaspE1。
對(duì)插入片段的核苷酸序列分析該質(zhì)粒。結(jié)果表明以與載體啟動(dòng)子相反的方向插入了天冬氨酸酶基因。
為了相對(duì)于啟動(dòng)子，以向前的方向，再連接天冬氨酸酶基因，用限制酶SacⅠ和BamHⅠ從質(zhì)粒pUaspE1中裂解出插入片段以導(dǎo)入質(zhì)粒pUC19。即，用BamHⅠ消化質(zhì)粒pUaspE1，然后，通過(guò)乙醇沉淀收集DNA片段。再用SacⅠ消化DNA片段，將所得片段在1％瓊脂糖凝膠上電泳以分離DNA片段，然后從凝膠上切下含DNA片段的部分并用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)回收DNA。
(ⅳ)制備載體將1μg質(zhì)粒pUC19(Nippon Gene Co.,Ltd.)用BamHⅠ消化，然后通過(guò)乙醇沉淀回收所得的DNA片段，再用SacⅠ消化DNA片段。在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離所得的DNA片段，然后從凝膠上切下含DNA片段的部分并用Prep-A-Gene(Bio-Rad Laboratories,Inc.)收集DNA。將收集的DNA作為載體。
(ⅴ)將插入片段與載體相連在16℃，經(jīng)30分鐘，用Ligation High(Toyobo Co.,Ltd.)已用限制酶裂解過(guò)的插入片段和載體相連。
(ⅵ)轉(zhuǎn)化大腸桿菌為了轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將2μl反應(yīng)混合物加至2009l感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(由Stratagene生產(chǎn)的XL2-Blue MRF’超感受態(tài)細(xì)胞)中，所述反應(yīng)混合物含有與載體連接的插入片段。將大腸桿菌轉(zhuǎn)化體鋪在含100ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
撿出出現(xiàn)的20個(gè)菌落，接種至含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。將IPTG(異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷)加至培養(yǎng)基中達(dá)到1mM的濃度，然后在30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。從1毫升培養(yǎng)物中回收細(xì)胞。
作為對(duì)照，按照與上述相同的方法，將用不含插入片段的質(zhì)粒pUC18轉(zhuǎn)化的大腸桿菌鋪在含100ppm氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。撿出在培養(yǎng)基上出現(xiàn)的一個(gè)對(duì)照轉(zhuǎn)化體菌落并培養(yǎng)，用與上述相同的方法收集細(xì)胞。
將收集的細(xì)胞加至1毫升表2所示的20％富馬酸銨底物溶液，懸浮于其中，然后使其在30℃反應(yīng)1小時(shí)。
表2:20％富馬酸銨底物溶液的組成富馬酸200g25％氨水 200g七水硫酸鎂2.5g離子交換水500g(在用25％氨水將反應(yīng)混合物的pH調(diào)整至8.3后，加入離子交換水達(dá)到l升的總體積。)反應(yīng)完成后，分析各反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在含攜帶插入片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的反應(yīng)液中，富馬酸轉(zhuǎn)變成L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.5％，而含有不帶插入片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的反應(yīng)液轉(zhuǎn)化率為5％。
將含插入片段的一個(gè)轉(zhuǎn)化體命名為PUaspE2。
將PUaspE2轉(zhuǎn)化體接種至3毫升含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，然后在37℃培養(yǎng)8小時(shí)。從1.5ml培養(yǎng)物中，用堿SDS方法回收質(zhì)粒，將其命名為pUaspE2。用SmaⅠ消化質(zhì)粒pUaspE2，然后用HindⅢ消化，接著用1％瓊脂糖凝膠電泳以確定所得片段的大小。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了大小分別為約2960bp和約1600bp的兩個(gè)片段。
用PUaspE2菌株接種3毫升含100ppm氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，然后在37℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。將IPTG加至培養(yǎng)基中達(dá)到1mM的濃度，然后在30℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。從1毫升培養(yǎng)物中回收細(xì)胞。培養(yǎng)物在OD660nm的細(xì)胞密度為8.0。
將收集的細(xì)胞懸浮在10毫升20％富馬酸銨底物溶液中，然后在30℃反應(yīng)1小時(shí)。用HPLC(高效液相色譜)分析反應(yīng)混合物。以L(fǎng)-天冬氨酸產(chǎn)量和細(xì)胞密度為基礎(chǔ)計(jì)算反應(yīng)液天冬氨酸酶活性，其活性為2,000,0009M L-天冬氨酸/小時(shí)/OD660nm細(xì)胞密度。
用同樣的方法，培養(yǎng)不含插入片段的一個(gè)對(duì)照轉(zhuǎn)化體菌落并從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。確定在OD660nm的細(xì)胞密度。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物的細(xì)胞密度為8.5。
將收集的對(duì)照轉(zhuǎn)化體細(xì)胞懸浮在10毫升20％富馬酸銨底物溶液中，然后在30℃反應(yīng)1小時(shí)，用HPLC分析反應(yīng)。按上述確定反應(yīng)溶液的天冬氨酸酶活性為10,0009M L-天冬氨酸/小時(shí)/OD660nm細(xì)胞密度。
因此，轉(zhuǎn)化體PUaspE2的天冬氨酸酶活性是不含天冬氨酸酶基因插入片段之菌株的200倍。
(ⅶ)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體大腸桿菌用經(jīng)大腸桿菌天冬氨酸酶基因轉(zhuǎn)染的重組體大腸桿菌菌株P(guān)UaspE2接種10個(gè)試驗(yàn)試管，每個(gè)試管含有3毫升用100ppm氨芐青霉素補(bǔ)充的表1所示培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)8小時(shí)。用試驗(yàn)試管中的培養(yǎng)物分別接種10個(gè)Sakaguchi燒瓶，每個(gè)燒瓶含100毫升用1mMIPTG補(bǔ)充的上述表1培養(yǎng)基，然后在30℃培養(yǎng)過(guò)夜。將燒瓶離心以從中收集細(xì)胞。測(cè)量各燒瓶中細(xì)胞的天冬氨酸酶活性，發(fā)現(xiàn)為1.05mol L-天冬氨酸/小時(shí)/g細(xì)胞。
用經(jīng)天冬氨酸酶基因轉(zhuǎn)染的重組大腸桿菌制備固定化天冬氨酸酶將用堿將pH調(diào)至7.0左右的70g PAS-880(Nitto Boseki Co.,Ltd.)和230g去離子水徹底混合，在其中將在上步收集的重組大腸桿菌細(xì)胞分散均勻。將300毫升離子交換樹(shù)脂(由Organo,Japan生產(chǎn)的AmberliteIRA-94SBC1型，平均顆粒直徑為0.5mm)和200 Teflon球(粒徑0.5英寸)放在6L茄形燒瓶中。向燒瓶中加入1/6上述細(xì)胞分散液，在30℃用蒸發(fā)器經(jīng)1小時(shí)蒸發(fā)至干同時(shí)旋轉(zhuǎn)燒瓶。用這種方法，用細(xì)胞包被離子交換樹(shù)脂。該步驟重復(fù)6次。除去Teflon球以得到珠形的固定化天冬氨酸酶。該固定化天冬氨酸酶珠的酶活性為3500U(1U=1μmol L-天冬氨酸酶/分鐘/ml固定化酶)。下文為了方便，將所述固定化天冬氨酸酶珠稱(chēng)為“重組固定化天冬氨酸酶珠”或“重組固定化天冬氨酸酶”。
培養(yǎng)大腸桿菌IFO3301除不向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素和IPTG外，按照與上述相同的方法，培養(yǎng)未用天冬氨酸酶基因轉(zhuǎn)染的大腸桿菌菌株IFO3301，從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。
制備非重組固定化天冬氨酸酶除使用上述得到的大腸桿菌菌株IFO3301外，按照與上述相同的方法制備非固定化天冬氨酸酶。該非重組固定化天冬氨酸酶的活性為180U(1U=1μmol L-天冬氨酸酶/分鐘/ml固定化酶)。
將用下列實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明不構(gòu)成限制。實(shí)施例實(shí)施例1將按上述用重組天冬氨酸酶基因制備的重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將70g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量61.3g；純度98.4％)。
表3富馬酸100gNaOH 20g(富馬酸摩爾量的0.58倍)25％氨水溶液 87.9g(富馬酸摩爾量的1.5倍)硫酸鎂0.25g(用去離子水加至1升)實(shí)施例2將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(LHSV=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將80g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量72.5g；純度98.6％)。實(shí)施例3將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將90g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量84.1g；純度98.7％)。實(shí)施例4將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入34.6g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.8。將100g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量94.1g；純度98.5％)。
上述實(shí)施例1-4的結(jié)果表明，優(yōu)選以70g或更多的量加入富馬酸，這樣可使回收率達(dá)60％或更高。實(shí)施例5將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表4的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入17.6g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.1。將70g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量88.3g；純度98.6％)。
表4富馬酸 100gNaOH30g(富馬酸摩爾量的0.87倍)25％氨水溶液70.0g(富馬酸摩爾量的1.2倍)硫酸鎂 0.25g(用去離子水加至1升)實(shí)施例6將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表4的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入17.6g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.1。將90g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量97.2g；純度98.1％)。實(shí)施例7將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為10毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=0.2)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后10小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.0％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將90g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量83.1g；純度98.7％)。實(shí)施例8將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向3升該反應(yīng)溶液中加入87.9g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將270g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用300毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量252.4g；純度98.7％)。將除去晶體后所得的濾液和用于洗滌所述餅的溶液合并并減壓濃縮。用70.0g25％氨水溶液補(bǔ)充該溶液并用去離子水制成3升。
將該溶液用作隨后反應(yīng)的起始底物溶液。即通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將該溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后30分鐘，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向2升該反應(yīng)溶液中加入58.6g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將180g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用200毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量189.3g；純度98.7％)。將除去晶體后所得的濾液和用于洗滌所述餅的溶液合并并減壓濃縮。用46.7g 25％氨水溶液補(bǔ)充該溶液并用去離子水制成2升。
將該溶液用作隨后反應(yīng)的起始底物溶液。即通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將該溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后30分鐘，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將90g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用200毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量95.9g；純度98.7％)。實(shí)施例9將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液和50g(0.5mol)富馬酸。將反應(yīng)溶液攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量51.6g；純度98.8％)。實(shí)施例10將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表5的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為100毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=2.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為10.8％。
表5富馬酸 100gNaOH69.0g(富馬酸摩爾量的2.0倍)25％氨水溶液58.4g(富馬酸摩爾量的1.0倍)硫酸鎂 0.25g(用去離子水加至1升)實(shí)施例11將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表6的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為100毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=2.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為80.2％。
表6富馬酸 100gNaOH60g(富馬酸摩爾量的1.74倍)25％氨水溶液58.4g(富馬酸摩爾量的1.0倍)硫酸鎂 0.25g(用去離子水加至1升)比較實(shí)施例1將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表7的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.7％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入58.6g的25％氨水溶液和100g富馬酸。將反應(yīng)溶液攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量56.1g；純度98.7％)。
表7富馬酸 100g25％氨水溶液 129.0g(富馬酸摩爾量的2.2倍)硫酸鎂 0.25g(用去離子水加至1升)。
以上結(jié)果表明，不用NaOH的反應(yīng)導(dǎo)致以低產(chǎn)率產(chǎn)生晶體L-天冬氨酸。實(shí)施例12將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表8的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.4％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入14.7g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.1。將70g富馬酸加至反應(yīng)溶液中并攪拌1小時(shí)以得到含晶體L-天冬氨酸的懸浮液。此時(shí)，懸浮液的溫度為30℃。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量30.1g；純度98.8％)。
表8富馬酸100gNaOH 10g(富馬酸摩爾量的0.29倍)25％氨水溶液 102.6g(富馬酸摩爾量的1.75倍)硫酸鎂0.25g(用去離子水加至1升)。實(shí)施例13將按上述制備的非重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為100毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=2.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為80.2％。實(shí)施例14將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將70g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量59.7g；純度99.1％)。實(shí)施例15將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將80g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量71.2g；純度99.1％)。實(shí)施例16將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將90g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。向懸浮液中加入90g富馬酸并攪拌1小時(shí)。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量83.2g；純度99.1％)。實(shí)施例17將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入34.6g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.8。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將100g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量93.6g；純度99.1％)。
從上述實(shí)施例14-17的結(jié)果看出，優(yōu)選加入70g或更多的富馬酸，這樣可使L-天冬氨酸的回收率為60％或更高。實(shí)施例18將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表4的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入17.6g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.1。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將70g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量87.1g；純度99.0％)。實(shí)施例19將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表4的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入17.6g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.1。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將90g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量96.7g；純度98.5％)。實(shí)施例20將按上述制備的非重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為10毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=0.2)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后10小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.0％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將90g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量82.8g；純度99.2％)。實(shí)施例21將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向3升該反應(yīng)溶液中加入87.9g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將270g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用300毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量251.1g；純度99.2％)。將除去晶體后所得的濾液和用于洗滌所述餅的溶液合并并減壓濃縮。用70.0g 25％氨水溶液補(bǔ)充該溶液并用去離子水制成3升。
將該溶液用作隨后反應(yīng)的起始底物溶液。即通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將該溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后30分鐘，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向2升該反應(yīng)溶液中加入58.6g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將180g富馬酸加至反應(yīng)溶液。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸晶體完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用200毫升水洗滌餅并干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量188.6g；純度99.2％)。將除去晶體后所得的濾液和用于洗滌所述餅的溶液合并并減壓濃縮。用46.7g25％氨水溶液補(bǔ)充該溶液并用去離子水制成2升。
將該溶液用作隨后反應(yīng)的起始底物溶液。即通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將該溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后30分鐘，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.5。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將90g富馬酸加至反應(yīng)溶液。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸晶體完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用200毫升水洗滌餅并干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量95.6g；純度99.2％)。實(shí)施例22將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表3的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.2％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入29.3g的25％氨水溶液。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將50g(0.5mol)富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量50.3g；純度99.3％)。比較實(shí)施例2將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表7的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.7％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入58.6g的25％氨水溶液。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將100g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量55.5g；純度99.2％)。
該結(jié)果表明，不用NaOH的反應(yīng)導(dǎo)致以低產(chǎn)率生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸。實(shí)施例23將上述重組固定化天冬氨酸酶珠浸在20％富馬酸銨溶液(pH8.3)中過(guò)夜。將其中的50毫升裝到柱中，用泡沫聚苯乙烯制成的熱絕緣材料覆蓋柱外層以保持柱內(nèi)部溫度的恒定。通過(guò)用熱絕緣材料纏繞的Teflon管，將表8的底物溶液(已用恒溫水浴保持在20℃)加至柱中，底物通過(guò)柱的流速為500毫升/小時(shí)(液體時(shí)空速(LHSV)=10.0)。由此，完成連續(xù)反應(yīng)。
反應(yīng)開(kāi)始后3小時(shí)，分析反應(yīng)溶液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-天冬氨酸作為反應(yīng)產(chǎn)物與消耗的富馬酸約等摩爾，其中富馬酸向L-天冬氨酸的轉(zhuǎn)化率為99.4％。
向1升該反應(yīng)溶液中加入14.7g的25％氨水溶液。反應(yīng)溶液的pH為9.1。將反應(yīng)溶液加熱至60℃，然后將70g富馬酸加至反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)混合物以得到富馬酸完全溶解的均勻溶液。將該溶液逐漸冷卻并同時(shí)攪拌。在溫度為45℃左右時(shí)，在溶液中開(kāi)始出現(xiàn)L-天冬氨酸晶體。將該懸浮液進(jìn)一步冷卻至30℃并在此溫度再攪拌30分鐘。將懸浮液過(guò)濾，徹底壓緊所得的餅以從中除去液體成分。用100毫升水洗滌餅然后干燥得到晶體L-天冬氨酸(產(chǎn)量29.3g；純度99.4％)。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可以以良好的加工性生產(chǎn)高純度的晶體L-天冬氨酸而無(wú)需任何復(fù)雜步驟。
已參考許多實(shí)施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明，在本發(fā)明較寬的方面，可進(jìn)行改變和修飾而不偏離本發(fā)明，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，因此，本發(fā)明權(quán)利要求覆蓋落在本發(fā)明真正精神內(nèi)的所有所述改變和修飾。
本文所引用的所有文獻(xiàn)、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)均全文引入本文作為參考。
以下是本文所述序列的資料序列表SEQ ID NO:1的資料(Ⅰ)序列特征(A)序列長(zhǎng)度1573(B)序列類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA到mRNA(ⅵ)來(lái)源大腸桿菌(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1ggggataatc gtcggtcgaa aaacattcga aaccacatat attctgtgtg tttaaagcaa 60atcattggca gcttgaaaaa gaaggttcac atg tca aac aac att cgt atc gaa 114Met Ser Asn Asn Ile Arg Ile Glu1 5gaa gat ctg ttg ggt acc agg gaa gtt cca gct gat gcc tac tat ggt 162Glu Asp Leu Leu Gly Thr Arg Glu Val Pro Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly10 15 20gtt cac act ctg aga gcg att gta aac ttc tat atc agc aac aac aaa 210Val His Thr Leu Arg Ala Ile Val Asn Phe Tyr Ile Ser Asn Asn Lys25 30 35 40atc agt gat att cct gaa ttt gtt cgc ggt atg gta atg gtt aaa aaa 258Ile Ser Asp Ile Pro Glu Phe Val Arg Gly Met Val Met Val Lys Lys
45 50 55gcc gca gct atg gca aac aaa gag ctg caa acc att cct aaa agt gta 306Ala Ala Ala Met Ala Asn Lys Glu Leu Gln Thr Ile Pro Lys Ser Val60 65 70gcg aat gcc atc att gcc gca tgt gat gaa gtc ctg aac aac gga aaa 354Ala Ash Ala Ile Ile Ala Ala Cys Asp Glu Val Leu Asn Asn Gly Lys75 80 85tgc atg gat cag ttc ccg gta gac gtc tac cag ggc ggc gca ggt act 402Cys Met Asp Gln Phe Pro Val Asp Val Tyr Gln Gly Gly Ala Gly Thr90 95 100tcc gta aac atg aac acc aac gaa gtg ctg gcc aat atc ggt ctg gaa 450Ser Val Asn Met Asn Thr Asn Glu Val Leu Ala Asn Ile Gly Leu Glu105 110 115 120ctg atg ggt cac caa aaa ggt gaa tat cag tac ctg aac ccg aac gac 498Leu Met Gly His Gln Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Leu Asn Pro Asn Asp125 130 135cat gtt aac aaa tgt cag tcc act aac gac gcc tac ccg acc ggt ttc 546His Val Asn Lys Cys Gln Ser Thr Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Gly Phe140 145 150cgt atc gca gtt tac tct tcc ctg att aag ctg gta gat gcg att aac 594Arg Ile Ala Val Tyr Ser Ser Leu Ile Lys Leu Val Asp Ala Ile Asn155 160 165caa ctg cgt gaa ggc ttt gaa cgt aaa gct gtc gaa ttc cag gac atc 642Gln Leu Arg Glu Gly Phe Glu Arg Lys Ala Val Glu Phe Gln Asp Ile170 175 180ctg aaa atg ggt cgt acc cag ctg cag gac gca gta ccg atg acc ctc 690Leu Lys Met Gly Arg Thr Gln Leu Gln Asp Ala Val Pro Met Thr Leu185 190 195 200ggt cag gaa ttc cgc gct ttc agc atc ctg ctg aaa gaa gaa gtg aaa 738Gly Gln Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ile Leu Leu Lys Glu Glu Val Lys205 210 215aac atc caa cgt acc gct gaa ctg ctg ctg gaa gtt aac ctt ggt gca 786Asn Ile Gln Arg Thr Ala Glu Leu Leu Leu Glu Val Asn Leu Gly Ala220 225 230aca gca atc ggt act ggt ctg aac acg ccg aaa gag tac tct ccg ctg 834Thr Ala Ile Gly Thr Gly Leu Asn Thr Pro Lys Glu Tyr Ser Pro Leu235 240 245gca gtg aaa aaa ctg gct gaa gtt act ggc ttc cca tgc gta ccg gct 882Ala Val Lys Lys Leu Ala Glu Val Thr Gly Phe Pro Cys Val Pro Ala250 255 260gaa gac ctg atc gaa gcg acc tct gac tgc ggc gct tat gtt atg gtt 930Glu Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asp Cys Gly Ala Tyr Val Met Val265 270 275 280cac ggc gcg ctg aaa cgc ctg gct gtg aag atg tcc aaa atc tgt aac 978His Gly Ala Leu Lys Arg Leu Ala Val Lys Met Ser Lys Ile Cys Asn
285 290 295gac ctg cgc ttg ctc tct tca ggc cca cgt gcc ggc ctg aac gag atc 1026Asp Leu Arg Leu Leu Ser Ser Gly Pro Arg Ala Gly Leu Asn Glu Ile300 305 310aac ctg ccg gaa ctg cag gcg ggc tct tcc atc atg cca gct aaa gta 1074Asn Leu Pro Glu Leu Gln Ala Gly Ser Ser Ile Met Pro Ala Lys Val315 320 325aac ccg gtt gtt ccg gaa gtg gtt aac cag gta tgc ttc aaa gtc atc 1122Asn Pro Val Val Pro Glu Val Val Ash Gln Val Cys Phe Lys Val Ile330 335 340ggt aac gac acc act gtt acc atg gca gca gaa gca ggt cag ctg cag 1170Gly Asn Asp Thr Thr Val Thr Met Ala Ala Glu Ala Gly Gln Leu Gln345 350 355 360ttg aac gtt atg gag ccg gtc att ggc cag gcc atg ttc gaa tcc gtt 1218Leu Asn Val Met Glu Pro Val Ile Gly Gln Ala Met Phe Glu Ser Val365 370 375cac att ctg acc aac gct tgc tac aac ctg ctg gaa aaa tgc att aac 1266His Ile Leu Thr Asn Ala Cys Tyr Asn Leu Leu Glu Lys Cys Ile Asn380 385 390ggc atc act gct aac aaa gaa gtg tgc gaa ggt tac gtt tac aac tct 1314Gly Ile Thr Ala Asn Lys Glu Val Cys Glu Gly Tyr Val Tyr Asn Ser395 400 405atc ggt atc gtt act tac ctg aac ccg ttc atc ggt cac cac aac ggt 1362Ile Gly Ile Val Thr Tyr Leu Asn Pro Phe Ile Gly His His Asn Gly410 415 420gac atc gtg ggt aaa atc tgt gcc gaa acc ggt aag agt gta cgt gaa 1410Asp Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala Glu Thr Gly Lys Ser Val Arg Glu425 430 435 440gtc gtt ctg gaa cgc ggt ctg ttg act gaa gcg gaa ctt gac gat att 1458Val Val Leu Glu Arg Gly Leu Leu Thr Glu Ala Glu Leu Asp Asp Ile445 450 455ttc tcc gta cag aat ctg atg cac ccg gct tac aaa gca aaa cgc tat 1506Phe Ser Val Gln Asn Leu Met His Pro Ala Tyr Lys Ala Lys Arg Tyr460 465 470act gat gaa agc gaa cag taatcgtaca gggtagtaca aataaaaaag 1554Thr Asp Glu Ser Glu Gln475gcacgtcaga tgacgtgcc 1573SEQ ID NO:2的資料(Ⅰ)序列特征(A)序列長(zhǎng)度20
(B)序列類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO:2ggataatcgt cggtcgaaaaSEQ ID NO:3:(Ⅰ)序列特征(A)序列長(zhǎng)度19(B)序列類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3cgtcatctga cgtgccttt
權(quán)利要求
1．生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，該方法包括下列步驟制備含富馬酸、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液，將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液并使L-天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出，其中再將額外量的氨加至含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中，然后將富馬酸加至其中以結(jié)晶L-天冬氨酸。
2．權(quán)利要求1的方法，其中將L-天冬氨酸結(jié)晶后仍留在反應(yīng)溶液中的未結(jié)晶的天冬氨酸分離出來(lái)，將氨加至溶液中，將所得溶液作為生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸過(guò)程中的部分起始反應(yīng)溶液再循環(huán)。
3．生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，該方法包括下列步驟制備含富馬酸、L-天冬氨酸銨、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液，將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液并使L-天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出，其中再將額外量的氨加至含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中，然后將富馬酸加至其中以結(jié)晶L-天冬氨酸。
4．生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，該方法包括下列步驟制備含富馬酸、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液，將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液并使L-天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出，其中再將額外量的氨加至含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中，將反應(yīng)溶液加熱，將富馬酸加至反應(yīng)溶液中，將反應(yīng)溶液冷卻以結(jié)晶L-天冬氨酸。
5．權(quán)利要求4的方法，其中將L-天冬氨酸結(jié)晶后仍留在反應(yīng)溶液中的未結(jié)晶的天冬氨酸分離出來(lái)，將氨加至溶液中，將所得溶液作為生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸過(guò)程中的部分起始反應(yīng)溶液再循環(huán)。
6．生產(chǎn)晶體L-天冬氨酸的方法，該方法包括下列步驟制備含富馬酸、L-天冬氨酸銨、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液，將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液并使L-天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出，其中將額外量的氨加至含L-天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中，將反應(yīng)溶液加熱，將富馬酸加至反應(yīng)溶液中，將反應(yīng)溶液冷卻以結(jié)晶L-天冬氨酸。
7．權(quán)利要求1-6的任一方法，其中混合溶液中堿金屬氫氧化物的量是溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽總摩爾量的0.1-1倍。
8．權(quán)利要求1-7的任一方法，其中用于結(jié)晶L-天冬氨酸所加的富馬酸量是含有L-天冬氨酸的反應(yīng)溶液中所含富馬酸鹽和L-天冬氨酸鹽總摩爾量的0.6-1.2倍。
9．權(quán)利要求1-8的任一方法，其中的天冬氨酸酶是通過(guò)將攜帶天冬氨酸酶基因的轉(zhuǎn)化體或所述轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)物固定到載體上而制得的固定化天冬氨酸酶。
10．權(quán)利要求1-9的任一方法，其中使含富馬酸、L-天冬氨酸、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液以2-20的液體時(shí)空速流過(guò)反應(yīng)器，所述混合溶液含有以富馬酸計(jì)濃度為8-20％的富馬酸和L-天冬氨酸，所述反應(yīng)器含具有250U或更高天冬氨酸酶活力的固定化天冬氨酸酶。
11．權(quán)利要求1-10的任一方法，其中通過(guò)將具有天冬氨酸酶活性的微生物細(xì)胞或所述微生物細(xì)胞的產(chǎn)物吸附到離子交換樹(shù)脂上或通過(guò)將含微生物細(xì)胞或所述微生物細(xì)胞之產(chǎn)物的聚合物包被到離子交換樹(shù)脂上，來(lái)制備固定化天冬氨酸酶。
12．權(quán)利要求1-11的任一方法，其中通過(guò)將具有天冬氨酸酶活性的微生物細(xì)胞或所述微生物細(xì)胞的產(chǎn)物與式(Ⅰ)聚合物混合，然后將所述混合物包被到球形苯乙烯/二乙烯基苯共聚物離子交換樹(shù)脂顆粒的表面來(lái)制備所述固定化天冬氨酸酶L
其中Y表示直接鍵或選自下列分子式的雙功能基團(tuán)
或
R1和R2各自獨(dú)立地是氫原子或有機(jī)殘基，X是陰離子，n是100-5000的整數(shù)。
全文摘要
公開(kāi)了生產(chǎn)晶體L－天冬氨酸的方法,該方法主要由下列步驟組成:制備含富馬酸、氨和堿金屬氫氧化物的混合溶液,將混合溶液與天冬氨酸酶反應(yīng)以得到含L－天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液并使L－天冬氨酸從反應(yīng)溶液中結(jié)晶出,其中將額外量的氨加至含L－天冬氨酸鹽的反應(yīng)溶液中,然后將富馬酸加至其中以結(jié)晶L－天冬氨酸。所述方法可以良好的加工性提供高純度晶體L－天冬氨酸而無(wú)需任何復(fù)雜步驟。
文檔編號(hào)C12P13/00GK1229143SQ9910074
公開(kāi)日1999年9月22日 申請(qǐng)日期1999年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月13日
發(fā)明者向山正治, 小松崎聡美 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日本觸媒