專利名稱：抗ca125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)，是一種新型導(dǎo)向免疫抗癌藥物。它屬于生物工程在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
生物技術(shù)是生命科學(xué)的技術(shù)前沿之一，當(dāng)今世界各國都把生物工程制藥視為一種高科技和下個世紀(jì)的朝陽產(chǎn)業(yè)，在科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新中占有重要的地位。最近十年，生物技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，為制藥工業(yè)帶來一場新的革命，特別是在開發(fā)新型抗癌藥物方面，利用生物工程技術(shù)所研制的免疫和靶向藥物，正在成為癌癥治療的主要發(fā)展方向，并將逐步取代毒副作用較大傳統(tǒng)化療藥物。
癌癥的導(dǎo)向治療是在雜交瘤技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，利用細(xì)胞工程生產(chǎn)單克隆抗體做為導(dǎo)向藥物的載體應(yīng)用于臨床已取得了一定的進(jìn)展，但并沒有達(dá)到人們所預(yù)期的理想效果。由于目前所制備的單抗多是鼠源性的，反復(fù)使用會產(chǎn)生抗鼠抗體(HAMA)，而作為載體所交聯(lián)的藥物或毒素主要是以化學(xué)鏈連接，常常會由于體內(nèi)環(huán)境的變化而使藥物或毒素丟失而無法到達(dá)靶部位并對機(jī)體產(chǎn)生副作用，而且由于分子量過大而導(dǎo)致穿透力差，這些缺點(diǎn)使單抗作為導(dǎo)向藥物載體在臨床應(yīng)用上受到了一定限制，而人源化抗體存在建株難的問題，同時，由于細(xì)胞工程工藝過程十分復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高。上述問題在一定程度上也限制了單抗藥物在臨床上的應(yīng)用和發(fā)展。為了克服單克隆抗體的上述缺點(diǎn)，目前世界上發(fā)達(dá)國家許多實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行將抗體改造或修飾的研究，以期得到小型高效低毒的導(dǎo)向抗癌藥物，目前該領(lǐng)域以已為抗癌藥物研究的前沿核心。
本發(fā)明的目的是利用基因工程技術(shù)研制開發(fā)一種新型導(dǎo)向抗癌藥物，通過運(yùn)用分子生物學(xué)、免疫化學(xué)、生物化學(xué)及生物發(fā)酵等技術(shù)手段，在分子水平構(gòu)建一種可分泌型表達(dá)具有抗癌活性的目的蛋白的基因工程菌。該工程菌通過表達(dá)產(chǎn)生一種融合蛋白，該蛋白具有特異性識別癌細(xì)胞表面抗原CA125和通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷癌細(xì)胞的雙重活性。研究的途徑為通過雜交瘤技術(shù)制備抗CA125抗原的單克隆抗體，從該抗體中克隆出可變區(qū)基因，序列驗(yàn)證無誤后，用一個15個氨基酸的肽將可變區(qū)基因連接起來，構(gòu)建成單鏈抗體(ScFv)，再將單鏈抗體(ScFv)基因與內(nèi)源性免疫肽Tuftsin基因結(jié)合，整合到質(zhì)粒載體中，轉(zhuǎn)入酵母表達(dá)系統(tǒng)Pichia pastoris中，構(gòu)建可分泌表達(dá)融合蛋白質(zhì)的工程菌，并對其進(jìn)行特性鑒定，同時對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化和活性檢測。
1.用雜交瘤方法制備抗CA125抗原的單克隆抗體。
2.用PCR方法克隆抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因。
3.對已克隆的抗體可變區(qū)基因進(jìn)行測序分析。
4.構(gòu)建單鏈抗體(ScFv)。
5.雙功能ScFv-tuftsin分子的設(shè)計(jì)選擇表達(dá)載體；克隆ScFv基因；克隆tuftsin基因。
6.表達(dá)載體的構(gòu)建7.重組表達(dá)質(zhì)粒在酵母表達(dá)系統(tǒng)Pichia pastoris中的轉(zhuǎn)化及選擇。
8.重組融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及活性檢測。
本發(fā)明的附圖有

圖1a，b抗CA125雙功能基因工程抗體構(gòu)建的工藝流程及操作方案圖2質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)及特性圖3質(zhì)粒載體的構(gòu)建過程圖4酵母菌在不同培養(yǎng)基中表達(dá)BACF(ScFv-Tuftsin)融合蛋白的電泳結(jié)果圖5利用免疫方法雜交蛋白質(zhì)顯色圖6重鏈可變區(qū)核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列圖7輕鏈可變區(qū)核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列圖8單鏈抗體(ScFv)結(jié)構(gòu)圖9a，b基因重組雙功能抗癌因子(ScFv-tuftsin)的全部核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列圖10基因重組雙功能抗癌因子(ScFv-tuftsin)的氨基酸組成本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的我們開始在分子水平上進(jìn)行藥物的設(shè)計(jì)，該藥物由兩個功能部分構(gòu)成，一部分是導(dǎo)向識別部分，另一部分是效應(yīng)因子部分。對于導(dǎo)向識別部分，我們選擇的是針對CA125抗原的抗體，從該抗體上克隆出可變區(qū)的VH和VL基因，將二者用一個短肽(Linker)連結(jié)成VL-Linker-VH基因，即重組單鏈抗體(SinleChain FV，ScFv)基因。在抗癌功能的設(shè)計(jì)上，通過比較實(shí)驗(yàn)和查閱有關(guān)文獻(xiàn)報道，我們選擇了一種人源性天然四肽促吞噬肽(Tuftsin)。Tuftsin是一種高效的免疫調(diào)節(jié)劑，它可以激活體內(nèi)的巨噬細(xì)胞并增強(qiáng)其吞噬作用，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)殺滅癌細(xì)胞，且無毒副作用。經(jīng)過40多次的反復(fù)實(shí)驗(yàn)，我們成功地克隆出Tuftsin基因，并將單鏈抗體基因(ScFv)與Tuftsin基因連接起來，用基因重組技術(shù)克隆出來，連入質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)入到酵母表達(dá)系統(tǒng)中，其表達(dá)產(chǎn)物是一個融合蛋白。
本發(fā)明抗CA125雙功能基因抗體將結(jié)合附圖詳細(xì)闡述如下圖1表示抗CA125雙功能基因工程抗體構(gòu)建的工藝流程及操作方案用卵巢癌細(xì)胞表面抗原CA125對小鼠體進(jìn)行免疫，在體外同骨髓瘤細(xì)胞融合制備出抗CA125的雜交瘤細(xì)胞，從雜交瘤細(xì)胞中提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR引物VHIFOR，VHIBACK，VLIFOR，VLIBACK，應(yīng)用PCR擴(kuò)增技術(shù)得到完整的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因片斷。通過15個氨基酸的短肽將VH和VL連接構(gòu)成VL-Linker-VH(ScFv)基因，通過質(zhì)粒整合到大腸桿菌中，所表達(dá)的單鏈抗體含有親本抗體的識別癌細(xì)胞表面抗原的功能。應(yīng)用基因工程手段克隆ScFv和Tuftsin基因，將ScFv和Tuftsin基因連接，構(gòu)建為一個重組的ScFv-Tuftsin DNA片斷。將這個片斷整合到表達(dá)質(zhì)粒pPIC-9中，該質(zhì)粒含有AOX1強(qiáng)啟動子，可使目的基因高效表達(dá)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母Pichia pastoris細(xì)胞中，成為分泌型酵母表達(dá)系統(tǒng)。經(jīng)生物發(fā)酵，并在誘導(dǎo)劑甲醇的存在下，基因工程菌表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)，即ScFv-Tuftsin。該蛋白質(zhì)分泌到酵母培養(yǎng)基中，經(jīng)分離純化后得到的產(chǎn)物即為“基因重組雙功能抗癌因子”(Recombinant Bi-functional Anticancer Factor，BACF)。
圖2表示質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)及特性將ScFv-Tuftsin重組基因轉(zhuǎn)化入Pichia pastoris所利用質(zhì)粒載體是pPIC-9，該質(zhì)粒具有如下特征帶有Amp和HIS4選擇標(biāo)記；8023bp；具有高分泌α-因子分泌誘導(dǎo)信號；被克隆的基因受控于AOX1啟動因子；帶有多克隆位點(diǎn)(polylinker site)。
圖3表示質(zhì)粒載體的構(gòu)建過程重組質(zhì)粒pPIC-ScFv-Tuftsin是這樣構(gòu)建的抗CA125的抗體可變區(qū)DNA序列使用特定的PCR引物擴(kuò)增后，插入Pichia pastoris分泌型表達(dá)系統(tǒng)中的載體pPIC-9質(zhì)粒中，稱為pPIC-ScFv，然后將Tuftsin氨基酸順序，N-SerGlyGlyThrLysProArg-c，編碼的DNA堿基序列通過內(nèi)切酶(EcoRI和EagI)酶切以后直接插入pPIC-ScFv質(zhì)粒中，該質(zhì)粒被稱為pPIC-ScFv-Tuftsin。它含有雙功能引導(dǎo)基因(N-端帶有分泌因子信號)受控制于AOX1啟動子。此質(zhì)粒帶有的Amp和HIS4基因，用于在大腸桿菌及酵母菌中選擇。
表達(dá)系統(tǒng)的選擇目前用于重組DNA的表達(dá)系統(tǒng)都有其局限性及長處，可以通過評價目的蛋白的表達(dá)水平來確定最佳的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)及生產(chǎn)條件。為了快速表達(dá)并有利于目的蛋白質(zhì)的分離純化，我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用了酵母菌Pichia pastoris高效分泌型表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)已成功用于表達(dá)許多難以在大腸桿菌表達(dá)的真核基因。首先，將在體外構(gòu)建的質(zhì)粒中轉(zhuǎn)化到Pichia pastoris細(xì)胞株GS115中，通過組氨酸缺乏的培養(yǎng)基平板選擇陽性克隆結(jié)果，通常5微克的DNA可得到大約200個陽性轉(zhuǎn)化菌落，這些陽性菌落需要在含有葡萄糖的培養(yǎng)基平板上進(jìn)行選擇，在含有甲醇的培養(yǎng)基平板上不生長的菌點(diǎn)為最終陽性菌，通常第二種選擇陽性結(jié)果為5％左右。
圖4表示酵母菌在不同培養(yǎng)基中表達(dá)BACF(ScFv-Tuftsin)融合蛋白的電泳結(jié)果。
圖中所示的1.ScFv于BMGY培養(yǎng)液中；2.ScFv-tuftsin在BYGY培養(yǎng)液中；3.ScFv-tuftsin于Buffer 3培養(yǎng)液中；4.ScFv-tuftsin濃縮10倍于Buffer 3培養(yǎng)液中；M是分子量標(biāo)準(zhǔn)。
分離以后的最終陽性菌落在BMGY培養(yǎng)基中接種，在30℃搖動培養(yǎng)兩天，振動頻率為300轉(zhuǎn)/分鐘。兩天后，檢查OD600，當(dāng)吸光值在10-20之間時，離心收集菌體轉(zhuǎn)入200毫升甲醇誘導(dǎo)液BMMY或者Buffer3中，30℃搖動培養(yǎng)二至五天。所需要的蛋白質(zhì)分泌在此培養(yǎng)誘導(dǎo)液中，我們采用常規(guī)的SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白質(zhì)的純度、分子量和表達(dá)量。通常BACF(ScFv-Tuftsin)的表達(dá)量至少為100-150毫克/升，此蛋白質(zhì)的分子量大小為33-35kDa。
圖5表示利用免疫方法雜交蛋白質(zhì)顯色1到5為BACF在不同的選擇分泌培養(yǎng)液中的電泳結(jié)果，其中1為BMGY，3為Buffer 3，6為負(fù)對照。
BACF(ScFv-Tuftsin)融合蛋白的表達(dá)及純化生物技術(shù)的一個主要優(yōu)勢就是能迅速地為重組蛋白的制備提供較簡化的方案，這樣，最好的方法是簡化培養(yǎng)組成成份，例如，我們所提到的Buffer3。蛋白質(zhì)的純化主要是應(yīng)用傳統(tǒng)的離子交換柱法分離純化，它的主要優(yōu)勢在于簡捷、快速，能大體積制備，而且該方法可以排除培養(yǎng)液中有可能出現(xiàn)的清蛋白、傳遞蛋白、蛋白酶等非親和性蛋白。
目前所報道的重組蛋白在Pichia中表達(dá)均能保持其生物活性。用競爭性體外免疫學(xué)方法(RIA)，我們可以檢測BACF(ScFv-tuftsin)的結(jié)合活性。方法如下將800單位的CA125涂在固相上(200微升，濃度為4000單位/毫升的CA125)，加入5微克I125標(biāo)記的抗CA125的單抗(100毫升，濃度為50微克/毫升的抗體)與BACF(ScFv-tuftsin)樣品進(jìn)行競爭反應(yīng)。在此競爭反應(yīng)后所得到的差值顯示出BACF(ScFv-tuftsin)特有的生物結(jié)合活性。
圖6表示重鏈可變區(qū)核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列圖7表示輕鏈可變區(qū)核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列圖8表示單鏈抗體(ScFv)結(jié)構(gòu)圖9a，b表示基因重組雙功能抗癌因子(SeFv-tuftsin)的全部核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列圖10表示基因重組雙功能抗癌因子(ScFv-tuftsin)的氨基酸組成本發(fā)明抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于工程菌的構(gòu)建和完整的氨基酸序列1.該序列是將抗CA125免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因片段構(gòu)建成單鏈抗體，再將單鏈抗體基因與人源Tuftsin基因直接融合，該基因所表達(dá)雙功能基因工程抗體由259個氨基酸組成；該抗體具有與CA125抗原特異性結(jié)合并通過調(diào)節(jié)免疫機(jī)制抑殺癌細(xì)胞的雙重功能，它能廣泛用于與CA125相關(guān)的腫瘤的導(dǎo)向治療；本發(fā)明還提供了有上述核苷酸序列的重組表達(dá)載體，以及含有這種載體的畢奇酵母菌Pichia pastoris。
2.菌株及質(zhì)粒菌株P(guān)ichia pastoris Gs115(His4- Mut+)。質(zhì)粒pPIC-9，該質(zhì)粒帶有Amp和HIS4選擇標(biāo)記；8023bp；具有高分泌α-因子分泌誘導(dǎo)信號；目的基因受控于所含的AOX1啟動因子；帶有多克隆位點(diǎn)(polylinker site)?？瞻拙昙百|(zhì)粒購自美國Invitrogene公司。啟動子AOX1，甲醇誘導(dǎo)型。
3.抗CA125雜交瘤的獲取采用傳統(tǒng)的細(xì)胞融合技術(shù)。CA125通過人卵巢癌細(xì)胞Ovcar-3分泌經(jīng)分離純化而成。用CA125對小鼠進(jìn)行免疫，將免疫后脾細(xì)胞分離，融合于雜交瘤SP2/O，通過ELISA方法選取具有高親和力抗體的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行培養(yǎng)至對數(shù)生長期，所分泌的抗CA125單克隆抗體為IgGIK型。
4.雜交瘤細(xì)胞總RNA的提取與純化和cDNA合成采用鹽酸胍-酚-氯方法(Guanidium thiocyanate-phenol-chloroform)提取總RNA，由得到的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄即為cDNA。
5.用PCR方法克隆抗體可變區(qū)基因抗體可變區(qū)含重、輕兩條鏈，因此可變區(qū)基因有兩個，即VH和VL基因，提取VH基因的PCR引物為VHIFOR和VHIBACKVHIFOR5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT CCC TTG GCC CCA G-3’VHIBACK5’-CAG GTC/G A/CAA/G CTG CAG C/GAG TCA/T GG-3’提取VL基因的PCR引物為VLIFOR和VLIBACKVLIFOR5’-GTT TGA TCT CCA GCT TGG TCC C-3’
VLIBACK5’-GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA-3’在這些PCR引物的序列中，VLIFOR含BglII切點(diǎn)，VLIBACK含有PvuII切點(diǎn)。應(yīng)用Touchtown程序進(jìn)行40個周期的PCR反應(yīng)，反應(yīng)后取反應(yīng)液上樣于1％的DNA瓊脂糖凝膠，從瓊脂糖凝膠電泳中提取出PCR產(chǎn)物，得到的PCR-DNA含350bp。
6.克隆PCR產(chǎn)物由于PCR產(chǎn)物得到的DNA片斷為平末端，因此可直接克隆到質(zhì)粒載體(pBluescript II Ks)的EcoRV切點(diǎn)位置上，此載體為1961bp，含有位于715bp的EcoRV切點(diǎn)和2個分別位于529bp和977bp Pvu II切點(diǎn)。克隆的步驟為a.連接質(zhì)粒和插入片斷比例為1∶3，用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。
b.轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α用0.1M的CaCl2處理為感受態(tài)細(xì)胞，20ul連接液加入100ul DH5α細(xì)胞，處理后在37℃條件下培養(yǎng)過夜。
c.選擇采用限制性內(nèi)切酶法，選擇陽性克隆。
7.可變區(qū)基因序列分析a.提取質(zhì)粒DNAVH和VLDNA片斷插入載體后稱為pBKS-VH和pBKS-VL，我們采用的是Qiagen公司的質(zhì)粒提取方法。
b.測序方法主要采用《United States Biochemical》所提供的實(shí)驗(yàn)方案，所用的引物為T3和T7(Stratagene)，將測得的DNA序列用Genework軟件處理，同已知的Data Base Gene Bank做對比得到準(zhǔn)確的VH和VL序列，VH的序列見圖7，VL的序列見圖8。
7.單鏈抗體ScFv的構(gòu)建將VH和VL組合成單鏈分子，應(yīng)考慮VH和VL的方向，我們的研究結(jié)果表明VL-Linker-VH比較穩(wěn)定且容易表達(dá)，同時要考慮Linker的長短及順序，我們采用15個氨基酸(SerGlyGly)5序列。ScFv的構(gòu)建步驟如下采用兩步PCR方式將VH和VL組合成ScFv，并在5’端帶有EcoRV切點(diǎn)，在3’端帶有EcoRI切點(diǎn)。PCRI和PCRII所用條件一致為30周期，每周期為94℃ 1min；50-55℃，min；72℃，1min。經(jīng)過PCRI以后從膠上提取PCR片斷，將兩個PCRI的片斷1∶1混和后，做為PCRII的模板。PCRII則用VL-EcoRV和VH-EcoRI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，組成的單鏈ScFv基因?yàn)?52bp，兩端含有EcoRV和EcoRI的酶切位點(diǎn)。測序后得到完整準(zhǔn)確的VL-Linker-VH核苷酸序列(見圖8)。
8.雙功能ScFv-tuftsin的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及表達(dá)載體的構(gòu)建將雙功能抗體(ScFv-tuftsin)基因克隆在酵母菌分泌型表達(dá)載體中的過程，分為兩個步驟，首先將ScFv基因克隆到pPIC-9質(zhì)粒中(Invitrogene)， 所需的酶切位點(diǎn)為SnaBI/EcoRV和EcoRI，然后再將tuftsin基因克隆在pPIC-9-ScFv的COOH端，所需的酶切位點(diǎn)為EcoRI和EagI，同時，我們考慮到在ScFv和tuftsin基因之間需要有一定空間序列(spacer)使ScFv和tuftsin各自功能互不影響對方。
a.表達(dá)載體的選擇我們選擇的是購自Invitrogene公司的表達(dá)載體，質(zhì)粒pPIC-9，其圖譜及特征見圖2。
b.克隆ScFv基因?qū)⒁褬?gòu)建好的含有752bp的ScFv DNA片段用EcoRV和EcoRI同時酶解后，克隆到粒pPIC-9的SnaBI和EcoRI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素進(jìn)行選擇，得到的陽性克隆為pPIC-9-ScFv。
c.克隆Tuftsin基因在設(shè)計(jì)tuftsin基因時，需要在tuftsin基因5’和3’端安裝EcoRI和EagI酶切位點(diǎn)。同時還要構(gòu)建負(fù)對照分子。合成tuftsin基因的寡核苷酸(Oligo)引物設(shè)計(jì)如下人(H-tuftsin)5’-AAT TCT GGA GGT GGT ACC AAG CCT AGG TAGGA CCT CCA CCA TGG TTC GGA TCC ATC GCC GG-5’鼠(m-tuftsin)5’-AAT TCT GGA GGT GGT ACC CAG CCT AGG TAG CGA CCT CCA CCA TGG GTC GGA TCC ATC GCC GG-5’負(fù)對照(G4C)5’-AAT TCA GCT GGA GGT GGT GGA TGT GC
GT CGA CCT CCA CCA CCT ACA CGC CGG-5’其中H-tuftsin序列中含有KpnI位點(diǎn)，M-tuftsin序列中含有KpnI位點(diǎn)，G4C序列中含有PvuII位點(diǎn)。
將三組oligo標(biāo)記好后，分別進(jìn)行5’端磷酸化反應(yīng)(Phosphorylation)。反應(yīng)停止后，用乙醇沉淀oligo DNA。
c.表達(dá)載體的構(gòu)建1pmol的載體DNA(pPIC-ScFv)用EcoRI和EagI同時進(jìn)行消化，分別與三組1pmol的Oligo DNA進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)后，將含有所需ScFv-tuftsin的pPIC9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5α，所形成的質(zhì)粒分別命名為pDL-6(pPIC9-ScFv-m-tuftsin)pDL-10(pPIC9-ScFv-G4c)pDL-11(pPIC9-ScFv-H-tuftsin)分別提取三種質(zhì)粒DNA，并做內(nèi)切酶檢測結(jié)果如下酶 切點(diǎn)片斷pDL-6 kpnI4 612bp，635bp，970bp，6633bppDL-10PvaII 3 245bp，2900bp，5700bppDL-11KpnI4 612bp，635bp，970bp，6633bp同時，用5’-AOX1和3’-AOX1為引物進(jìn)行序列分析，進(jìn)一步證明DNA序列無誤，測序引物為5’-AOX15’-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3’3’-AOX15’-GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3’測序結(jié)果見圖9。根據(jù)測序的結(jié)果分析，該序列由259個氨基酸組成，BACF(ScFv-tuftsin)的氨基酸組成詳見圖10。
10.表達(dá)質(zhì)粒pPIC-ScFv-H-tuftsin在酵母菌Pichia pastoris中的轉(zhuǎn)化與選擇酵母菌株P(guān)ichia pastoris為GS115(His4- Mut+)。用電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒pPIC-ScFv-H-tuftsin轉(zhuǎn)化入酵母菌株GS115細(xì)胞中。
a.線性化質(zhì)粒的制備用BglII消化重組粒后，乙醇沉淀，即可得到線性化質(zhì)粒。
b.電轉(zhuǎn)化將GS115在500mlYPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為1.3-1.5，離心收集菌體，處理后的細(xì)胞溶于1ml Sorbitol液中，加入5ul用BglII消化的質(zhì)粒DNA(5ug)，放入0.2um的電轉(zhuǎn)化管中，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(1800V pulse)，然后加入1ml的Sorbitol，混勻細(xì)胞，取200ul涂RDB平板，30℃培養(yǎng)兩天。
c.轉(zhuǎn)化子的選擇將在RDB平板上生成的菌落分別接種于MM和MD培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)兩天。通常，我們接種100個菌落左右，一般能得到點(diǎn)5-25個His+ Mut-菌落。將這些His+ Mut-型的菌在YPD培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜(30℃，200rpm)，然后分別保存菌種。
11.ScFv-tuftsin融合蛋白質(zhì)表達(dá)及活性分析篩選以后的菌種在MGY培養(yǎng)液中接種，在30℃培養(yǎng)48小時，檢查OD600，應(yīng)在10-20之間。然后離心收集菌體，將菌體用200ml甲醇誘導(dǎo)液BMMY或Buffer3中30℃培養(yǎng)2-5天，啟動子AOX1在甲醇誘導(dǎo)下啟動目的基因，將所需的目的蛋白分泌在誘導(dǎo)培養(yǎng)液中。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在分子量35KD左右有一條區(qū)帶(圖4，5)，表達(dá)量達(dá)100-150mg/L。純化后進(jìn)行生物活性測定，用體外免疫競爭法(RIA)檢測ScFv-tuftsin與抗原的結(jié)合活性，結(jié)果表明，ScFv-tuftsin具有與親本抗體相同的特異性和親合力。
與目前世界上應(yīng)用較多的單抗類導(dǎo)向治療藥物相比，本產(chǎn)品具有分子量小，穩(wěn)定性強(qiáng)，不易產(chǎn)生抗鼠抗體，與抗原親和性強(qiáng)，效應(yīng)因子與載體結(jié)合牢固等顯著優(yōu)點(diǎn)。另外，在制備工藝上本產(chǎn)品是基因工程產(chǎn)品，而單抗類產(chǎn)品是細(xì)胞工程產(chǎn)品，工藝過程比單抗類產(chǎn)品大為簡化。與目前世界上一些實(shí)驗(yàn)室正在研究的同類產(chǎn)品比較，本產(chǎn)品的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在(1)本產(chǎn)品是在酵母菌Pichia pastoris中分泌型高效表達(dá)，表達(dá)量和純度都較高，目的蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中并自動折疊成天然構(gòu)象，無須復(fù)性，同時降低了成本。而其它同類產(chǎn)品多是在E.coli中表達(dá)，所得到的融合蛋白往往是以包涵體的形式存在，須經(jīng)復(fù)性后才有生物活性。
(2)本產(chǎn)品單鏈抗體所連接的是內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)劑tuftsin，即使由于體內(nèi)環(huán)境作用與單鏈抗體斷開，也不會對機(jī)體造成任何毒副作用。而其它同類產(chǎn)品所連接的多是細(xì)胞毒素，一旦與單鏈抗體斷開，易產(chǎn)生毒副作用，在使用上對劑量的要求極為嚴(yán)格。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于工程菌的構(gòu)建和工程菌所表達(dá)的融合蛋白的完整的核苷酸和氨基酸序列，該序列是將抗CA125免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因片段構(gòu)建成單鏈抗體，再將單鏈抗體基因與人源Tuftsin基因直接融合，該基因所表達(dá)雙功能基因工程抗體由259個氨基酸組成；該抗體具有與CA125抗原特異性結(jié)合并通過調(diào)節(jié)免疫機(jī)制抑殺癌細(xì)胞的雙重功能，它能廣泛用于與CA125相關(guān)的腫瘤的導(dǎo)向治療；本發(fā)明還提供了有上述核苷酸序列的重組表達(dá)載體，以及含有這種載體的畢奇酵母菌Pichia pastoris。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于菌株及質(zhì)粒，菌株P(guān)ichia pastoris Gs115(His4- Mut+)；質(zhì)粒pPIC-9，該質(zhì)粒帶有Amp和HIS4選擇標(biāo)記，8023bp，具有高分泌α-因子分泌誘導(dǎo)信號，目的基因受控于所含的AOX1啟動因子，帶有多克隆位點(diǎn)(polylinker site)；空白菌株及質(zhì)粒購自美國Invitrogene公司；啟動子AOX1，甲醇誘導(dǎo)型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于抗CA125雜交瘤的獲取采用傳統(tǒng)的細(xì)胞融合技術(shù)，CA125通過人卵巢癌細(xì)胞Ovcar-3分泌經(jīng)分離純化而成；用CA125對小鼠進(jìn)行免疫，將免疫后脾細(xì)胞分離，融合于雜交瘤SP2/O，通過ELISA方法選取具有高親和力抗體的雜交瘤細(xì)胞株，進(jìn)行培養(yǎng)至對數(shù)生長期，所分泌的抗CA125單克隆抗體為IgGIK型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于雜交瘤細(xì)胞總RNA的提取與純化和cDNA合成采用鹽酸胍-酚-氯方法(Guanidium thiocyanate-phenol-chloroform)提取總RNA，由得到的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄即為cDNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于用PCR方法克隆抗體可變區(qū)基因抗體可變區(qū)含重、輕兩條鏈，因此可變區(qū)基因有兩個，即VH和VL基因，提取VH基因的PCR引物為VHIFOR和VHIBACKVHIFOR5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT CCC TTG GCC CCA G-3’VHIBACK5’-CAG GTC/G A/CAA/G CTG CAG C/GAG TCA/T GG-3’提取VL基因的PCR引物為VLIFOR和VLIBACKVLIFOR5’-GTT TGA TCT CCA GCT TGG TCC C-3’VLIBACK5’-GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA-3’在這些PCR引物的序列中，VLIFOR含BglII切點(diǎn)，VLIBACK含有PvuII切點(diǎn)。應(yīng)用Touchtown程序進(jìn)行40個周期的PCR反應(yīng)，反應(yīng)后取反應(yīng)液上樣于1％的DNA瓊脂糖凝膠，從瓊脂糖凝膠電泳中提取出PCR產(chǎn)物，得到的PCR-DNA含350bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于克隆PCR產(chǎn)物由于PCR產(chǎn)物得到的DNA片斷為平末端，因此可直接克隆到質(zhì)粒載體(pBluescript II Ks)的EcoRV切點(diǎn)位置上，此載體為1961bp，含有位于715bp的EcoRV切點(diǎn)和2個分別位于529bp和977bp PvuII切點(diǎn)。克隆的步驟為a.連接質(zhì)粒和插入片斷比例為1∶3，用T4-DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)；b.轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α用0.1M的CaCl2處理為感受態(tài)細(xì)胞，20ul連接液加入100ul DH5α細(xì)胞，處理后在37℃條件下培養(yǎng)過夜；c.選擇采用限制性內(nèi)切酶法，選擇陽性克隆。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于可變區(qū)基因序列分析a.提取質(zhì)粒DNAVH和VLDNA片斷插入載體后稱為pBKS-VH和pBKS-VL，我們采用的是Qiagen公司的質(zhì)粒提取方法。b.測序方法主要采用《United States Biochemical》所提供的實(shí)驗(yàn)方案，所用的引物為T3和T7(Stratagene)，將測得的DNA序列用Genework軟件處理，同已知的Data Base Gene Bank做對比得到準(zhǔn)確的VH和VL序列，VH的序列見圖6，VL的序列見圖7。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于單鏈抗體ScFv的構(gòu)建將VH和VL組合成單鏈分子，應(yīng)考慮VH和VL的方向，我們的研究結(jié)果表明VL-Linker-VH比較穩(wěn)定且容易表達(dá)，同時要考慮Linker的長短及順序，我們采用15個氨基酸(SerGlyGly)5序列。ScFv的構(gòu)建步驟如下采用兩步PCR方式將VH和VL組合成ScFv，并在5’端帶有EcoRV切點(diǎn)，在3’端帶有EcoRI切點(diǎn)。PCRI和PCRII所用條件一致為30周期，每周期為94℃1min；50-55℃，min；72℃，1min。經(jīng)過PCRI以后從膠上提取PCR片斷，將兩個PCRI的片斷1∶1混和后，做為PCRII的模板。PCRII則用VL-EcoRV和VH-EcoRI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，組成的單鏈ScFv基因?yàn)?52bp，兩端含有EcoRV和EcoRI的酶切位點(diǎn)。測序后得到完整準(zhǔn)確的VL-Linker-VH核苷酸序列(見圖8)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于雙功能ScFv-tuftsin的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及表達(dá)載體的構(gòu)建將雙功能抗體(ScFv-tuftsin)基因克隆在酵母菌分泌型表達(dá)載體中的過程，分為兩個步驟，首先將ScFv基因克隆到pPIC-9質(zhì)粒中(Invitrogene)，所需的酶切位點(diǎn)為SnaBI/EcoRV和EcoRI，然后再將tuftsin基因克隆在pPIC-9-ScFv的COOH端，所需的酶切位點(diǎn)為EcoRI和EagI，同時，我們考慮到在ScFv和tuftsin基因之間需要有一定空間序列(spacer)使ScFv和tuftsin各自功能互不影響對方a.表達(dá)載體的選擇我們選擇的是購自Invitrogene公司的表達(dá)載體，質(zhì)粒pPIC-9，其圖譜及特征見圖2；b.克隆ScFv基因?qū)⒁褬?gòu)建好的含有752bp的ScFv DNA片段用EcoRV和EcoRI同時酶解后，克隆到粒pPIC-9的SnaBI和EcoRI位點(diǎn)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，用氨芐青霉素進(jìn)行選擇，得到的陽性克隆為pPIC-9-ScFv；c.克隆Tuftsin基因在設(shè)計(jì)tuftsin基因時，需要在tuftsin基因5’和3’端安裝EcoRI和EagI酶切位點(diǎn)。同時還要構(gòu)建負(fù)對照分子。合成tuftsin基因的寡核苷酸(Oligo)引物設(shè)計(jì)如下人(H-tuftsin)5’-AAT TCT GGA GGT GGT ACC AAG CCT AGG TAGGA CCT CCA CCA TGG TTC GGA TCC ATC GCC GG-5’鼠(m-tuftsin)5’-AAT TCT GGA GGT GGT ACC CAG CCT AGG TAG CGA CCT CCA CCA TGG GTC GGA TCC ATC GCC GG-5’負(fù)對照(G4C)5’-AAT TCA GCT GGA GGT GGT GGA TGT GCGT CGA CCT CCA CCA CCT ACA CGC CGG-5’其中H-tuftsin序列中含有KpnI位點(diǎn)，M-tuftsin序列中含有KpnI位點(diǎn)，G4C序列中含有PvuII位點(diǎn)，將三組oligo標(biāo)記好后，分別進(jìn)行5’端磷酸化反應(yīng)(Phosphorylation)，反應(yīng)停止后，用乙醇沉淀oligo DNA；c.表達(dá)載體的構(gòu)建1pmol的載體DNA(pPIC-ScFv)用EcoRI和EagI時進(jìn)行消化，分別與三組1pmol的Oligo DNA進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)后，將含有所需ScFv-tuftsin的pPIC9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5α，所形成的質(zhì)粒分別命名為pDL-6(pPIC9-ScFv-m-tuftsin)pDL-10(pPIC9-ScFv-G4c)pDL-11(pPIC9-ScFv-H-tuftsin)分別提取三種質(zhì)粒DNA，并做內(nèi)切酶檢測結(jié)果如下酶 切點(diǎn) 片斷pDL-6 kpnI4612bp，635bp，970bp，6633bppDL-10 PvaII 3245bp，2900bp，5700bppDL-11 KpnI4612bp，635bp，970bp，6633bp同時，用5’-AOX1和3’-AOX1為引物進(jìn)行序列分析，進(jìn)一步證明DNA序列無誤，測序引物為5’-AOX15’-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3’3’-AOX15’-GCA AAT GGC ATT CTG ACA TCC-3’測序結(jié)果見圖9；根據(jù)測序的結(jié)果分析，該序列由259個氨基酸組成，BACF(ScFv-tuftsin)的氨基酸組成詳見圖10。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于表達(dá)質(zhì)粒pPIC-ScFv-H-tuftsin在酵母菌Pichia pastoris中的轉(zhuǎn)化與選擇酵母菌株P(guān)ichia pastoris為GS115(His4- Mut+)，用電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒pPIC-ScFv-H-tuftsin轉(zhuǎn)化入酵母菌株GS115細(xì)胞中a.線性化質(zhì)粒的制備用BglII消化重組粒后，乙醇沉淀，即可得到線性化質(zhì)粒；b.電轉(zhuǎn)化將GS115在500mlYPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為1.3-1.5，離心收集菌體，處理后的細(xì)胞溶于1ml Sorbitol液中，加入5ul用BglII消化的質(zhì)粒DNA(5ug)，放入0.2um的電轉(zhuǎn)化管中，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(1800Vpulse)，然后加入1ml的Sorbitol，混勻細(xì)胞，取200ul涂RDB平板，30℃培養(yǎng)兩天；d.轉(zhuǎn)化子的選擇將在RDB平板上生成的菌落分別接種于MM和MD培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)兩天，通常，我們接種100個菌落左右，一般能得到點(diǎn)5-25個His+ Mut-菌落，將這些His+ Mut-型的菌在YPD培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜(30℃，200rpm)，然后分別保存菌種。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá)其特征在于ScFv-tuftsin融合蛋白質(zhì)表達(dá)及活性分析篩選以后的菌種在MGY培養(yǎng)液中接種，在30℃培養(yǎng)48小時，檢查OD600，應(yīng)在10-20之間，然后離心收集菌體，將菌體用200ml甲醇誘導(dǎo)液BMMY或Buffer3中30℃培養(yǎng)2-5天，啟動子AOX1在甲醇誘導(dǎo)下啟動目的基因，將所需的目的蛋白分泌在誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在分子量35KD左右有一條區(qū)帶(圖4，5)，表達(dá)量達(dá)100-150mg/L，純化后進(jìn)行生物活性測定，用體外免疫競爭法(RIA)檢測ScFv-tuftsin與抗原的結(jié)合活性，結(jié)果表明，ScFv-tuftsin具有與親本抗體相同的特異性和親合力。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗CA125雙功能基因工程抗體的克隆與表達(dá),屬于一種新型導(dǎo)向抗癌藥物。提供了一種抗CA125雙功能基因工程抗體的分子導(dǎo)向藥物的核苷酸序列。該序列是將抗CA125免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因片段構(gòu)建成單鏈抗體,再將單鏈抗體基因與人源Tuftsin基因直接融合,該基因所表達(dá)雙功能基因工程抗體由259個氨基酸組成。該抗體具有與CA125抗原特異性結(jié)合并通過調(diào)節(jié)免疫機(jī)制抑殺癌細(xì)胞的雙重功能,它能廣泛用于與CA125相關(guān)的腫瘤的治療。本發(fā)明還提供了有上述核苷酸序列的重組表達(dá)載體,以及含有這種載體的畢奇酵母菌pichia pastoris。
文檔編號C12N15/13GK1276428SQ9910787
公開日2000年12月13日 申請日期1999年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月4日
發(fā)明者羅冬, 李宏實(shí), 白云鵬, 蘇忠 申請人:長春邁靈生物工程有限公司