專利名稱：制備核酸物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵制備核酸物質(zhì)的方法。核酸物質(zhì)在工業(yè)上用作調(diào)味劑等。
在通過發(fā)酵制備核酸物質(zhì)如肌苷、鳥苷及其堿基(次黃嘌呤和鳥嘌呤等)時，通常使用具有腺嘌呤營養(yǎng)缺陷和核酸類似物抗性的突變菌株(日本特許公告昭55-2956和昭55-45199)，其培養(yǎng)基中含有限量的腺嘌呤物質(zhì)。
通過常規(guī)誘變方法獲得的突變菌株經(jīng)常是在其靶基因以外的基因中導(dǎo)入突變。此外，因為核酸物質(zhì)的生物合成途徑中涉及復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，很難獲得產(chǎn)生顯著量核酸物質(zhì)的微生物。因此，通過常規(guī)培養(yǎng)方法獲得的突變菌株不一定是滿意的菌株。
另一方面，已經(jīng)公開了利用芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌制備肌苷或鳥苷的方法，其中的芽孢桿菌屬細(xì)菌由于對編碼涉及嘌呤生物合成的酶的基因序列(嘌呤操縱子)進(jìn)行了修飾而表現(xiàn)出增強(qiáng)的嘌呤操縱子表達(dá)(未審查的日本特許公開平3-164185)。此方法特征在于嘌呤操縱子的啟動子或操縱基因受到修飾從而增加了該操縱子的表達(dá)水平，因而增加了肌苷或鳥苷的產(chǎn)量。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)嘌呤操縱子(purEKBC(ORF)OLFMNHD，其中的ORF代表未知功能的開放閱讀框)的表達(dá)受過量的腺嘌呤抑制，并且也受由鳥嘌呤所致弱化作用(attenuation)的調(diào)節(jié)。此外，與嘌呤操縱子5′側(cè)翼區(qū)域結(jié)合的阻抑蛋白以及編碼該蛋白的基因(purR)已被分離，并且已報導(dǎo)purR基因斷裂的枯草芽孢桿菌菌株中，腺嘌呤對整合入嘌呤操縱子中的purC-lacZ融合基因的表達(dá)的抑制降至約1/10(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，7455-7549(1995))。
在枯草芽孢桿菌中，已知該阻抑蛋白除了調(diào)節(jié)嘌呤操縱子的基因表達(dá)外，還調(diào)節(jié)涉及腺嘌呤生物合成的purA基因及涉及嘧啶生物合成的嘧啶操縱子基因的表達(dá)(1997，J.Bacteriol.179，7394-7402，H.Zalkin)。
另一方面，在大腸桿菌中，已報導(dǎo)嘌呤操縱子阻抑蛋白除了影響嘌呤操縱子基因表達(dá)外，也影響涉及甘氨酸(為5＇-IMP(肌苷酸)生物合成底物)生物合成的glyA基因的表達(dá)(1990，J.Bacteriol.172，3799-3803，H.Zalkin等)以及涉及來自甘氨酸的C1與CO2產(chǎn)生的gcv操縱子基因的表達(dá)(1993，J.Bacteriol.175，5129-5134，G.V.Stauffer等)。
如上所述，已有許多有關(guān)嘌呤操縱子與肌苷或鳥苷產(chǎn)生間關(guān)系的報導(dǎo)。然而，存在各種涉及purR基因的生物合成途徑。此外，枯草芽孢桿菌的嘌呤操縱子編碼10種酶，并參與許多反應(yīng)。因此，核酸物質(zhì)的生物合成途徑很復(fù)雜，并且人們對purR基因與核酸物質(zhì)積累之間的關(guān)系知之甚少。
鑒于核酸物質(zhì)的工業(yè)重要性，本發(fā)明的目的是提供較常規(guī)方法更為優(yōu)越的制備核酸物質(zhì)的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人深入地進(jìn)行了有關(guān)purR基因功能的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，purR基因斷裂的枯草芽孢桿菌菌株積累了核酸物質(zhì)。這樣，本發(fā)明得以完成。
即，本發(fā)明提供(1)一種制備核酸物質(zhì)的方法，包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)其嘌呤操縱子阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物，從而在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累核酸物質(zhì)，并從該培養(yǎng)基中收集該物質(zhì)；(2)上面(1)中定義的方法，其中的阻抑蛋白不以正常方式起作用是因為位于此微生物染色體上的編碼該阻抑蛋白的基因被斷裂；(3)上面(1)中定義的方法，其中的阻抑蛋白具有示于SEQ IDNO6中的氨基酸序列；(4)上面(1)中定義的方法，其中的微生物為芽孢桿菌屬的細(xì)菌；(5)上面(4)中定義的方法，其中的微生物為枯草芽孢桿菌；(6)上面(1)中定義的方法，其中的核酸物質(zhì)為核酸堿基、核苷或核苷酸；(7)上面(6)中定義的方法，其中的核酸物質(zhì)選自次黃嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤及腺嘌呤。
為本發(fā)明的目的，術(shù)語“嘌呤操縱子阻抑蛋白不以正常方式起作用”意為此阻抑蛋白結(jié)合到嘌呤操縱子的5′側(cè)翼區(qū)，因此與正常水平比較，抑制該操縱子轉(zhuǎn)錄的功能降低，或該功能基本上已不具備。
在本發(fā)明中，核酸物質(zhì)包括核酸堿基如次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶；核苷如肌苷、腺苷、鳥苷、尿苷、胸苷及胞苷；核苷酸如肌苷酸、腺苷酸、鳥苷酸、尿苷酸、胸苷酸及胞苷酸；以及由其核糖被脫氧核糖置換的任一核苷或核苷酸所組成的化合物。在這些物質(zhì)中，核酸堿基是優(yōu)選的。在本發(fā)明中，此核酸物質(zhì)同時包括嘌呤化合物與嘧啶化合物。該嘌呤化合物包括嘌呤堿基和具有嘌呤堿基的核苷及核苷酸。嘧啶化合物包括嘧啶堿基和具有嘧啶堿基的核苷及核苷酸。在本發(fā)明中，作為嘌呤化合物，次黃嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤是優(yōu)選的；作為嘧啶化合物，尿嘧啶是優(yōu)選的。


圖1顯示質(zhì)粒pHSG 398 BSPR的結(jié)構(gòu)。粗線表示來自枯草芽孢桿菌SB112的purR基團(tuán)。括號中的數(shù)字代表當(dāng)起始位置定為1時在編碼區(qū)中的位置。正常線表示質(zhì)粒pHSG398。
圖2表示用HincII和EcoRV完全消化pHSG398 BSPR而獲得的片段。
圖3表示用于purR基因斷裂的質(zhì)粒pHSG398ΔBSPRSpr的結(jié)構(gòu)。粗線表示枯草芽孢桿菌SB112的斷裂的purR基團(tuán)(ΔpurR)。括號中的數(shù)字表示當(dāng)起始位置定為1時在編碼區(qū)中的位置。正常線表示壯觀霉素抗性基因，虛線表示質(zhì)粒pHSG398。
本發(fā)明將在下面進(jìn)行詳細(xì)解釋。
用于本發(fā)明方法的微生物為嘌呤操縱子阻抑蛋白(以下也簡稱為“阻抑蛋白”)不以正常方式起作用的微生物。該微生物沒有特別的限制，只要求其嘌呤化合物生物合成的酶基因形成操縱子并且具有編碼涉及該操縱子(purR)調(diào)節(jié)的阻抑蛋白的基因。此微生物的實例包括芽孢桿菌屬的細(xì)菌等。此芽孢桿菌屬細(xì)菌的具體實例包括，例如，枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。
阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物可用以下方法獲得修飾其purR基因從而使該阻抑蛋白的活性降低或缺失，或者使purR基因的轉(zhuǎn)錄降低或缺失。例如，經(jīng)過基于遺傳重組技術(shù)的同源重組，以不以正常方式起作用的purR基因(以后偶爾稱為“斷裂purR基因”)置換染色體purR基因，可獲得這樣的微生物(《分子遺傳學(xué)實驗》，冷泉港實驗室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，162，1196(1985))。
在同源重組中，當(dāng)將帶有與染色體序列表現(xiàn)出同源性的序列的質(zhì)粒等導(dǎo)入相應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞中時，重組以一定的頻率在同源序列的某個位點發(fā)生，因此導(dǎo)入的質(zhì)粒作為整體整合入染色體中。然后，通在該染色體中此同源序列位點處再次造成重組，可從該染色體中切下此質(zhì)粒。然而，依據(jù)導(dǎo)致重組的位置，此斷裂基因可能維持在該染色體上，而原始的正?；蚩赡芘c該質(zhì)粒一起從染色體中切除。通過選擇這樣的菌株，可獲得其中的正常purR基因被斷裂purR基因置換的細(xì)菌菌株。
已經(jīng)建立了基于同源重組的這種基因斷裂技術(shù)，并且為此可采用利用線性DNA的方法、利用溫度敏感性質(zhì)粒的方法等。也可通過用含有purR基因并插入標(biāo)記基因如藥物抗性基因且不能夠在靶微生物細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒來斷裂purR基因。即，在已用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化且因此獲得藥物抗性的轉(zhuǎn)化子中，標(biāo)記基因被整合入染色體DNA中。很有可能此標(biāo)記基因是通過存在于該標(biāo)記兩側(cè)的purR基因與染色體上的purR基因之間的同源重組而被整合的，因此可有效地選擇出斷裂基因菌株。
具體地，用于基因斷裂的斷裂purR基因可通過以下方式獲得，即以限制酶消化并重新連接方法缺失purR基因的某個區(qū)域；插入另一個DNA片段(標(biāo)記基因等)進(jìn)入purR基因；用定點誘變方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，酶學(xué)方法，154，350(1987))或以化學(xué)試劑如次磺酸鈉及羥胺處理(Shortle，D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，270(1978))等方法，在purR基因編碼區(qū)、其啟動子區(qū)等區(qū)域的核苷酸序列中導(dǎo)入一個或更多個核苷酸的置換、缺失、插入、添加或倒位，從而使所編碼的阻抑蛋白的活性降低或缺失，或者使purR基因的轉(zhuǎn)錄降低或缺失。在這些實施方案中，就可靠性和穩(wěn)定性而言，優(yōu)選采用通過以限制酶消化并重新連接而缺失purR基因的某個區(qū)域或插入另一個DNA片段至purR基因中的方法。
用根據(jù)purR基因已知的核苷酸序列制備的寡核苷酸作為引物，用PCR法可從具有嘌呤操縱子的微生物染色體DNA中獲得purR基因。也可用根據(jù)purR基因已知的核苷酸序列制備的寡核苷酸作探針，通過雜交技術(shù)從具有嘌呤操縱子微生物的染色體DNA文庫中獲取purR基因。枯草芽孢桿菌168Marburg菌株的purR基因的核苷酸序列已有報導(dǎo)(GenBank編號D26185(編碼區(qū)相應(yīng)于核苷酸號118041-118898)、DDBB編號Z99104(編碼區(qū)相應(yīng)于核苷酸號54439-55296)。purR基因的核苷酸序列與該基因所編碼的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO5和6中。對于本發(fā)明的目的，因為purR基因用于制備斷裂的purR基因，它不一定需要含有全長，可能只含有導(dǎo)致基因斷裂所需的長度。
用于獲取purR基因的微生物沒有特別的限制，只要求其purR基因與用于建立斷裂基因菌株的微生物的purR基因之間的同源性達(dá)到能產(chǎn)生同源重組的程度。然而，使用相同的微生物一般是優(yōu)選的。
用于PCR的引物可以是能夠擴(kuò)增purR基因的任何引物，其具體的實例包括具有示于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中的核苷酸序列的寡核苷酸。
標(biāo)記基因的實例包括，例如，藥物抗性基因如壯觀霉素抗性基因。通過從可從枯草桿菌遺傳保藏中心(BGSC)買到的大腸桿菌ECE101菌株中制備質(zhì)粒pDG1726并從該質(zhì)粒中切下此基因作為表達(dá)盒，可得到壯觀霉素抗性基因。
當(dāng)藥物抗性基因用作標(biāo)記基因時，通過插入藥物抗性基因至質(zhì)粒中所帶purR基因的適當(dāng)位點中，以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化微生物并選擇藥物抗性轉(zhuǎn)化子，可獲得purR基因斷裂菌株。通過Southern印跡、PCR等分析位于染色體上的purR基因或標(biāo)記基因，可證實位于染色體上的purR基因的斷裂。用能夠擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因的引物(如具有示于SEQ IDNO3和4的核苷酸序列的寡核苷酸)，用PCR法可證實壯觀霉素抗性基因整合到染色體DNA中。
通過在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)按上述獲得的其阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物，可在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累核酸物質(zhì)。
作為用于本發(fā)明的培養(yǎng)基，可以使用含有碳源、氮源、礦物鹽及有機(jī)微量營養(yǎng)物如所需的氨基酸和維生素的普通營養(yǎng)培養(yǎng)基，并且可以常規(guī)方式進(jìn)行培養(yǎng)?？梢允褂煤铣膳囵B(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。只要可被待培養(yǎng)的細(xì)菌菌株利用，用于此培養(yǎng)基的碳源和氮源可以是任何的種類。
作為碳源，可以使用糖類如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物及糖蜜，并且可使用有機(jī)酸本身如乙酸和檸檬酸或?qū)⑵渑c另一種碳源聯(lián)合使用。
作為氮源，可以使用氨、銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨、硝酸鹽等。
作為微量營養(yǎng)物，可以使用氨基酸、維生素、脂族酸、核酸以及含有前述物質(zhì)的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白分解產(chǎn)物等。當(dāng)使用需要氨基酸等用于其生長的營養(yǎng)缺陷型突變體時，補(bǔ)充所需的營養(yǎng)物是必需的。
作為礦物鹽，可以使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。
培養(yǎng)條件依賴于待用微生物的種類。例如，枯草芽孢桿菌用通氣培養(yǎng)法培養(yǎng)，同時調(diào)整發(fā)酵溫度至20-50℃及pH至4-9。當(dāng)培養(yǎng)過程中pH降低時，可用堿如氨氣中和培養(yǎng)基。通過如上所述培養(yǎng)約40小時到3天，核酸物質(zhì)便積累于培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)完成后，可通過已知的方法回收此培養(yǎng)基中積累的核酸物質(zhì)。例如，可通過沉淀、離子交換層析等方法進(jìn)行分離。
如果使用于本發(fā)明的微生物的編碼核苷酶或核苷酸酶的基因有缺陷，則可以積累相應(yīng)的核苷或核苷酸。如果使其成為腺嘌呤或鳥嘌呤營養(yǎng)缺陷型，則可以積累這些物質(zhì)及相關(guān)物質(zhì)生物合成途徑中的前體物質(zhì)。
此外，通過以嘌呤核苷磷酸化酶或磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶處理由本發(fā)明方法制備的核酸堿基，可得到相應(yīng)于該堿基的核苷或核苷酸。
參考下面的實施例更為具體地解釋本發(fā)明。<1>purR基因的克隆含有枯草芽孢桿菌168Marburg菌株(ATCC 6051)purR基因的DNA片段通過用該細(xì)菌的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR而獲得。
按下述方法制備染色體DNA。將枯草芽孢桿菌ATCC6051菌株接種于50ml LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過夜，然后收集并用含有1mg/ml溶菌酶的裂解液裂解。以苯酚處理裂解物，然后用常規(guī)方式通過乙醇沉淀法沉淀NDA。通過將其纏繞到玻棒上來收集得到的DNA沉淀物，洗滌后用于PCR。
作為PCR引物，可以使用具有示于SEQ ID NO1與2中的核苷酸序列的寡核苷酸(其合成是委托Japan Bioservice Co.，Ltd完成的)，這些寡核苷酸是根據(jù)枯草芽孢桿菌168Marburg菌株purR基因的已知核苷酸序列(GenBank編號D26185(編碼區(qū)相應(yīng)于核苷酸號118041-118898)、DDJB編號Z99104(編碼區(qū)相應(yīng)于核苷酸號54439-55296))設(shè)計的。這些引物分別在靠近5′末端和3′末端具有HindIII及PstI限制酶識別序列。
用以下方法進(jìn)行PCR在0.1ml含有6ng/μl染色體DNA和3μM引物的PCR反應(yīng)液中重復(fù)30次下面的循環(huán)94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘，72℃延伸反應(yīng)1分鐘。
用HindIII及PstI消化此反應(yīng)產(chǎn)物及質(zhì)粒pHSG398(TakaraShuzo)，并用連接試劑盒(Takara Shuzo)連接。用得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將轉(zhuǎn)化子于含有30μ/ml氯霉素(Cm)及X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子的白色菌落。從上述得到的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，并將插入有靶DNA片段的質(zhì)粒命名為pHSG398BSPR(圖1)。<2>含有斷裂purR(ΔpurR)的質(zhì)粒的構(gòu)建從可從芽孢桿菌遺傳保藏中心(BGSC)買到的大腸桿菌ECE101菌株中制備質(zhì)粒pDG1726。從該質(zhì)粒中可切出壯觀霉素抗性(Spr)基因作為表達(dá)盒。
將在<1>中獲得的質(zhì)粒pDG1726和pHSG 398 BSPR分別用限制酶HincII和EcoRV完全(圖2)和部分消化，并用苯酚處理。用連接試劑盒連接每種DNA，用此連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109并培養(yǎng)于含有50μg/ml氯霉素及100μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。從得到的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，得到其purR基因由于插入壯觀霉素抗性基因而被斷裂的質(zhì)粒pHSG398ΔBSPRSpr(圖3)。<3>purR基因斷裂菌株的建立用在前述<2>中獲得的質(zhì)粒pHSG398ΔBSPRSpr轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌SB112(BGSC1A227)。用根據(jù)Ishiwa方法(Ishiwa H.等，1986，Jpn.J.Genet.61515-528)制備的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒pHSG398ΔBSPRSpr不能夠在枯草芽孢桿菌細(xì)胞中復(fù)制DNA。然而，由于該質(zhì)粒具有與壯觀霉素抗性基因5′端與3′端的染色體purR基因同源的區(qū)域，它可通過雙交換重組與染色體purR基因之間進(jìn)行基因置換。
將前述的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于含有100μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，對所培養(yǎng)的菌株進(jìn)行選擇，得到其中的染色體purR基因被ΔBSPRSpr基因置換的菌株。通過用候選菌株的染色體DNA作為模板，用purR基因的引物(SEQ ID NO1和2)及具有示于SEQ IDNO3和4的核苷酸序列的Spr基因引物(其合成委托Japan BioserviceCo.，Ltd完成)進(jìn)行PCR，根據(jù)ΔBSPRSpr部分的大小及壯觀霉素抗性基因的插入，證實預(yù)期的基因置換已發(fā)生。將按上述獲得的其中一個基因置換菌株命名為枯草芽孢桿菌SB112K。<4>用purR陷型菌株制備核酸將在前述<3>中制備的枯草芽孢桿菌SB112K菌株及母本菌株枯草芽孢桿菌SB112，于37℃下在含100μg/ml壯觀霉素的LB及LB瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并將3環(huán)細(xì)胞接種于20ml示于表1中的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于32℃培養(yǎng)72小時。
表1發(fā)酵培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基組分濃度葡萄糖100g/LNH4C120g/LKH2PO40.5g/LMgSO4·7H2O 0.4g/LFeSO4·7H2O 2ppmMnSO4·5H2O 2ppmL-色氨酸 300mg/LL-苯丙氨酸300mg/LL-谷氨酸 15.0g/LDL-甲硫氨酸 0.3g/L大豆?jié)饪s物(T-N) 1.5g/L消泡劑(GD-113)0.05mL/LpH調(diào)節(jié)劑(KOH) 7.2g/L
培養(yǎng)完成后，通過高效液相色譜測定培養(yǎng)基中積累的次黃嘌呤、尿嘧啶、鳥苷、鳥嘌呤、腺苷及腺嘌呤的量。結(jié)果示于表2中。在purR缺陷型菌株SB112K中，積累了顯著量的次黃嘌呤，即大約600mg/L，因此與母本菌株相比，其積累量表現(xiàn)出約20倍的增加。尿嘧啶與母本菌株相比積累增加5倍。此外，在母本菌株中沒有見到的腺嘌呤與鳥嘌呤的積累也在purR缺陷型菌株中見到。
表2發(fā)酵的評估菌株 產(chǎn)物(mg/L)次黃嘌呤尿嘧啶鳥嘌呤腺嘌呤SB112K 585 16620 127SB112 3030 00(母本菌株)
序列表<110>味之素株式會社<120>制備核酸物質(zhì)的方法<130>OP853<140><141><150>JP10-165704<151>1998-06-12<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>1ctcaagcttg aagttgcgat gatcaaaa28<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>2ctcctgcaga catattgttg acgataat28<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>3gtgaggagga tatatttgaa t41<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>4ttataatttt tttaatctgt t21<210>5<211>1200<212>DNA<213>枯草芽孢桿菌<220><221>CDS<222>(259)..(1113)<400>5atatgcatcc tgaagttgcg atgatcaaaa accagatgaa acgctttggt gcagatgccg 60tgttaatgag cgggagcggc ccgacagtgt ttggactggt tcagtatgag tcgaaggtgc 120agagaattta taacgggtta agaggcttct gcgatcaagt ttatgcggtg agaatgatcg 180gcgaacagaa cgctcttgat taaatccgta tgttaagtta tattgatctt aaaatattcg 240gattttgggg gtgagttc atg aag ttt cgt cgc agc ggc aga ttg gtg gac 291Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp1 5 10tta aca aat tat ttg tta acc cat ccg cac gag tta ata ccg cta acc 339Leu Thr Asn Tyr Leu Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr15 20 25ttt ttc tct gag cgg tat gaa tct gca aaa tca tcg atc agt gaa gat 387Phe Phe Ser Glu Arg Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp30 35 40tta aca att att aaa caa acc ttt gaa cag cag ggg att ggt act ttg 435Leu Thr Ile Ile Lys Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu45 50 55ctt act gtt ccc gga gct gcc gga ggc gtt aaa tat att ccg aaa atg 483Leu Thr Val Pro Gly Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met60 65 70 75aag cag gct gaa gct gaa gag ttt gtg cag aca ctt gga cag tcg ctg 531Lys Gln Ala Glu Ala Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu80 85 90gca aat cct gag cgt atc ctt ccg ggc ggt tat gta tat tta acg gat 579Ala Asn Pro Glu Arg Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp95 100 105atc tta gga aag cca tct gta ctc tcc aag gta ggg aag ctg ttt gct 627Ile Leu Gly Lys Pro Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala110 115 120tcc gtg ttt gca gag cgc gaa att gat gtt gtc atg acc gtt gcc acg 675Ser Val Phe Ala Glu Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr125 130 135aaa ggc atc cct ctt gcg tac gca gct gca agc tat ttg aat gtg cct 723Lys Gly Ile Pro Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro140 145 150 l55gtt gtg atc gtt cgt aaa gac aat aag gta aca gag ggc tcc aca gtc 771Val Val Ile Val Arg Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val160 165 170agc att aat tac gtt tca ggc tcc tca aac cgc att caa aca atg tca 819Ser Ile Asn Tyr Val Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser175 180 185ctt gcg aaa aga agc atg aaa acg ggt tca aac gta ctc att att gat 867Leu Ala Lys Arg Ser Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp190 195 200gac ttt atg aaa gca ggc ggc acG att aat ggt atg att aac ctg ttg 915Asp Phe Met Lys Ala Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu205 210 215gat gag ttt aac gca aat gtg gcg gga atc ggc gtc tta gtt gaa gcc 963Asp Glu Phe Asn Ala Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala220 225 230 235gaa gga gta gat gaa cgt ctt gtt gac gaa tat atg tca ctt ctt act 1011Glu Gly Bal Asp Glu Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr240 245 250ctt tca acc atc aac atg aaa gag aag tcc att gaa att cag aat ggc 1059Leu Ser Thr Ile Asn Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly255 260 265aat ttt ctg cgt ttt ttt aaa gac aat ctt tta aag aat gga gag aca 1107Asn Phe Leu Arg Phe Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr270 275 280gaa tca tgacaaaagc agtccacaca aaacatgccc cagcggcaat cgggccttat1163Glu Ser285tcacaaggga ttatcgtcaa caatatgttt tacagct 1200<210>6<211>285<212>PRT<213>枯草芽孢桿菌<400>6Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp Leu Thr Asn Tyr Leu1 5 10 15Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg20 25 30Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile lle Lys35 40 45Gla Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly50 55 60Ala Ala 0ly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala65 70 75 80Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asa Pro Glu Arg85 90 95Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro100 105 110Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu115 120 125Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu130 135 140Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg145 150 155 160Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val165 170 175Ser Gly Ser Sar Asa Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser180 185 190
Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala195 200 205Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala210 215 220Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu225 230 235 240Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn245 250 255Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe260 265 270Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser275 280 28權(quán)利要求
1.一種用于制備核酸物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)其嘌呤操縱子阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物，從而在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累核酸物質(zhì)；從該培養(yǎng)基中收集此物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的阻抑蛋白不以正常方式起作用是因為該微生物染色體上編碼此阻抑蛋白的基因被斷裂。
3.權(quán)利要求1的方法，其中的阻抑蛋白具有示于SEQ ID NO6中的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的微生物為芽孢桿菌屬的細(xì)菌。
5.權(quán)利要求4的方法，其中的微生物為枯草芽孢桿菌。
6.權(quán)利要求1的方法，其中的核酸物質(zhì)為核酸堿基、核苷或核苷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的核酸物質(zhì)選自次黃嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤和腺嘌呤。
全文摘要
通過以下方法有效地制備核酸物質(zhì)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)其嘌呤操縱子阻抑蛋白不以正常方式起作用的微生物，優(yōu)選其染色體上編碼阻抑蛋白的基因(purR)被斷裂的菌株，使核酸物質(zhì)在培養(yǎng)基中積累，并從該培養(yǎng)基中收集此物質(zhì)。
文檔編號C12N1/21GK1239143SQ99108379
公開日1999年12月22日 申請日期1999年6月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月12日
發(fā)明者佐藤勝明, 臼田佳弘 申請人:味之素株式會社