專利名稱：：人p47蛋白及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子內(nèi)分泌學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、生殖生物學(xué)、腫瘤學(xué)和基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在人類腎上腺中表達(dá)的P47蛋白及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。無論是外分泌如唾液或胰消化酶原的分泌，還是內(nèi)分泌過程如兒茶酚氨從腎上腺髓質(zhì)嗜酪細(xì)胞的釋放，胰島素從胰島β細(xì)胞的分泌，催乳素等多肽激素從垂體前葉的釋放以及神經(jīng)遞質(zhì)從神經(jīng)末稍的釋放，它們均涉及一個共同的過程，即可調(diào)性胞吐過程，該過程涉及細(xì)胞的分泌顆粒包被膜與細(xì)胞質(zhì)膜的搭聯(lián)及融合。1993年Soller(SollerTetalNature1993362318-314)等人提出SNARE假說，該假說認(rèn)為(突觸)小泡相關(guān)膜蛋白VAMP(Vesicleassociatedmembraneprotein)與細(xì)胞質(zhì)突觸融合蛋白(syntaxin)及25kD的突觸小體相關(guān)蛋白SNAP-25(synaptosome-associatedproteinof25KD)形成一個蛋白復(fù)合，成為胞漿可溶性膜融合蛋白NSF(N-ethylmaleimidesensitivefactor，N-乙基馬來酰亞胺敏感因子)和SNAP(solubleNSFattachmentprotein，可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白)受體(SNARE)。SNAP受體(SNAPreceptor，簡稱為“SNARE”)蛋白復(fù)合物的形成及其與NSF、SNAP的相互作用，直接導(dǎo)致分泌顆粒與細(xì)胞質(zhì)膜的搭聯(lián)及融合，也即胞吐作用的發(fā)生。眾所周知，蛋白質(zhì)的合成發(fā)生在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而加工和分泌過程則往往通過高爾基體，從橫向角度講，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸也是一個泡運(yùn)輸過程，需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的出泡以及泡膜與高爾基體膜的搭聯(lián)和融合。而從縱向角度講，細(xì)胞的每一次分裂過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體均形成大量的碎片，以便它們重新分配在兩個子細(xì)胞中，在子細(xì)胞中，這些碎片需要重新聚集形成新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，而碎片膜系統(tǒng)之間的搭聯(lián)和融合是形成新高爾基體的一個重要環(huán)節(jié)，在這個環(huán)節(jié)中，ATP被用來提供能量，分別由ATP酶P97和NSF催化的膜融合細(xì)節(jié)已基本清楚，即α-SNAP與高爾基體碎片上的syntaxin5結(jié)合后，由NSF催化ATP水解釋放能量，導(dǎo)致新的高爾基池形成。目前對P97所催化的融合途徑研究不多，實(shí)驗(yàn)證實(shí)(KondoHetalnature1998Vol388(3)75-78)在P97融合途徑中，P47三聚體和P97六聚體形成一個定量復(fù)合物，再與syntaxin5結(jié)合而導(dǎo)致融合事件的發(fā)生從而形成新的高爾基體。在缺乏P47的細(xì)胞內(nèi)，P97不能與syntaxin5結(jié)合也不能發(fā)生由P97介導(dǎo)的高爾基池再生，說明P47在細(xì)胞分裂后高爾基體再生過程中起重要作用，也對隨后由高爾基體發(fā)生的胞吐作用發(fā)生重要的影響。雖然NSF途徑和P97途徑都能介導(dǎo)高爾基池的再生，但兩者功能并不一致。NSF存在于高爾基池的周邊，而P97則主要存在于高爾基池的內(nèi)核。目前認(rèn)為NSF途徑主要控制高爾基池內(nèi)外貨物的流動，而P97途徑則與高爾基體的形態(tài)發(fā)生有關(guān)。兩條途徑存在著一定的競爭關(guān)系，其比率取決于細(xì)胞類型，一種極端類型是在高度分化的分泌細(xì)胞內(nèi)存在著較高的物質(zhì)流動，但僅存在較少的細(xì)胞器生成，另一類則是處于迅速分裂的腫瘤細(xì)胞，其內(nèi)具有較低的物質(zhì)流動但卻有較多的細(xì)胞器生成。通過控制P47的量，可以調(diào)整這兩條途徑的相對比例，從而控制分泌細(xì)胞的分泌以及腫瘤細(xì)胞的惡性分裂，因此P47可以作為治療腫瘤和內(nèi)分泌相關(guān)疾病的靶基因。從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)以及高爾基體的再生是胞吐作用的生物學(xué)基礎(chǔ)，胞吐作用是生物體內(nèi)的普遍現(xiàn)象，具有重要的生物學(xué)意義。神經(jīng)信號傳輸神經(jīng)信號的傳遞有賴于神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，而神經(jīng)遞質(zhì)的釋放是通過胞吐作用進(jìn)行的(JacobssonGetalEndocrinology1996137(2)5344-56．實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在老年癡呆癥的神經(jīng)衰老斑中一些控制胞吐作用和神經(jīng)傳輸?shù)牡鞍资侨狈Φ?FerrerIetalJ．Neuropathol．Exp．Neurol．199857(3)218-25．)一些神經(jīng)毒素如破傷風(fēng)毒素(TeT)，肉毒毒素(BoT)A，B，Cl，D，E，F(xiàn)，G是Zn2+依賴性蛋白水解酶，它們特異的神經(jīng)毒性是因?yàn)槠鋵Π碌鞍讖?fù)合體中SNARE的水解而阻斷了乙酰膽堿(指BoT)或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(指TeT)的釋放，這些多肽內(nèi)切酶有高度特異性，對SNARE復(fù)合體的不同部分具有不同的親和力(HunterWBNature1993365104-105)．組織分泌體內(nèi)存在著很多分泌酰，它們均與胞吐作用有關(guān)，胰島素的釋放是一個重要的例子，已經(jīng)證實(shí)其胞吐作用依賴于葡萄糖的濃度(MartinFetalBiochem．Biophys．Res．Commun199824883-6，JacobssonGetalPNASUSA19949112487-91)．同樣胞吐作用也存在于胃酸分泌的細(xì)胞(ZhaoCMCellTissueRes．1997290539-51)以及腦垂體(AguadoFEur．J．CellBiol．199669351-9)．相應(yīng)地這些組織中胞吐作用的缺乏會導(dǎo)致一系列與之相關(guān)的疾病。減數(shù)分裂除參與細(xì)胞的胞吐作用外，P47的另一個作用與男性精子生成有關(guān)，在整個哺乳動物精子生成過程中，其性染色體都形成一種被叫作xy小體的結(jié)構(gòu)(又稱性泡〕，該結(jié)構(gòu)位于粗線期精母細(xì)胞的核周邊。和常染色體不同，xy小體伴有染色質(zhì)濃縮和轉(zhuǎn)錄滅活。分析顯示，在精子生成過程中，編碼P47蛋白的mRNA高度富集于粗線期精母細(xì)胞的xy小體中，P47蛋白相關(guān)于xy小體的軸元素，因此P47又稱xy小體相關(guān)蛋白(SmithAetalPro．Natl．Acad．Sci．1992896938-42)。實(shí)驗(yàn)還表明，P47與男性性染色體減數(shù)分裂的異染周期性行為有關(guān)，有可能可用于男性計劃生育以及男性不育癥的治療(AisheimerMetalChomosoma1997106308-14)。不論從其在減數(shù)分裂過程中的作用還是參與胞吐過程中的作用來看，P47還可能與卵子受精過程中的頂體反應(yīng)有關(guān)。在本申請之前，尚沒有公開或報道過本發(fā)明所涉及的人hP47蛋白。本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的人基因hP47(GenbankAccessionNo．AF112371)，該基因是一個P47蛋白基因。本發(fā)明的第二目的是提供一種新的人蛋白hP47。本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人P47蛋白和核酸序列的方法。本發(fā)明還提供了這種P47蛋白多肽和編碼序列的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hP47蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQIDNO．7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人hP47蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQIDNO．7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO．7序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個實(shí)例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人hP47蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人hP47蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hP47蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hP47蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hP47蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hP47蛋白活性的多肽。較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO．6中第5-1120位的序列。本發(fā)明還提供了與hP47蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術(shù)語“人hP47蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hP47蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO．6中第5-1120位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO．6序列的編碼框第5-1120位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO．6中第5-1120位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQIDNO．7所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。該術(shù)語還包括能編碼具有與人hP47相同功能的蛋白的、SEQIDNO．6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5’和／或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。在本發(fā)明中，術(shù)語“人hP47蛋白或多肽”指具有hP47蛋白活性的SEQIDNO．7序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人hP47相同功能的、SEQIDNO．7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hP47蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明人hP47多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人hP47DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hP47多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hP47多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括人hP47多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hP47多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。在本發(fā)明中，“hP47保守性變異多肽”指與SEQIDNO．7的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表1<tablesid="table1"num="001"><table>最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeu</table></tables><tablesid="table2"num="002"><table>Pro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu</table></tables>發(fā)明還包括人hP47蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hP47多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人hP47多肽時，可以將hP47編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成人hP47蛋白表達(dá)載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等，常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。本發(fā)明還提供了對人hP47特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對hP47特異的抗體。例如，將提純的人hP47基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人hP47或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohleretal．，Nature256495，1975；Kohleretal．，Eur．J．Immunol．6511，1976；Kohleretal．，Eur．J．Immunol．6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑hP47功能的抗體，也可以是不影響人hP47功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人hP47基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人hP47基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的hP47基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過用在原核細(xì)胞例如E．coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來免疫動物而得到。本發(fā)明的人hP47抗體可以用來鑒定表達(dá)人hP47蛋白或多肽的細(xì)胞，如JurkatT細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標(biāo)記hP47特異抗體，然后讓人hP47特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測出與hP47特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。除了在細(xì)胞表面檢測人hP47外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如腎上腺中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時將提純的人hP47多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測hP47多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對照。還可用Nothern印跡法技術(shù)分析hP47基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析人hP47的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。人hP47DNA的Nothern印跡分析和人hP47特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實(shí)人hP47在生物樣本中的表達(dá)。人hP47DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hP47核苷酸編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hP47的核酸分子。本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在hP47核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于hP47核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。此外，根據(jù)本發(fā)明的hP47核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選hP47同源基因或同源蛋白。為了得到與hP47基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對hP47的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自人腎上腺組織的文庫。來自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫也可用于篩選目的。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，PaloAlto，Cal．。這種篩選方法可以識別與hP47相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。根據(jù)核苷酸相似性篩選hP47同源物可以按如下方法完成。人體腎上腺cDNA文庫，例如ClontechCat．#7430-1(Clontech，PaloAlto，Cal．)可以使用一段包含hP47基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對與hP47序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0．5×SSC和0．1％SDS清洗。用這種方法識別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序來評價它與hP47基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。hP47同源物也可以用針對hP47蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來自細(xì)胞或者組織例如腎上腺的表達(dá)文庫進(jìn)行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人hP47抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測序進(jìn)行分析以評價它與hP47基因的相似性。新識別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。本發(fā)明的人hP47核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因具有與已發(fā)表并被確認(rèn)為大鼠P47蛋白的基因高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有大鼠P47蛋白高度保守的氨基酸序列。所以，本發(fā)明的hP47是大鼠P47蛋白基因的一個同源基因而具有相似的功能。圖1為本發(fā)明的人hP47與大鼠P47基因核酸序列(GenBankAccessionNo．AB002086)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用“丨”標(biāo)出。圖2為本發(fā)明的人hP47蛋白與大鼠P47蛋白的氨基酸序列(SwissProtAccessionNo．035987)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，相似的氨基酸用“+”標(biāo)出。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。2．mRNA的分離(mRNAisolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzolReagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligod(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。3．cDNA文庫的構(gòu)建(ConstructionofcDNAlibrary)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見SEQIDNO．1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRⅠ切點(diǎn)的接頭，接頭序列分別見SEQIDNO．2和3。磷酸化EcoRⅠ末端后，用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶消化1．5小時，再進(jìn)行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚—氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAPXR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNAGigapackⅢGoldCloningKit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XLl-BlueMRF’(Stratagene，CA9203，USA)細(xì)菌．涂板并測定滴度。4．測序及數(shù)據(jù)庫建立(SeqencingandDatabaseConstructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3′端和5′端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測序。測序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UNUltra450Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫。5．基因的全長克隆(CloningofFull-lengthcDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(ElectronicCloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(ExpressedSequenceTag，簡稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensussequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(OpenReadingFrame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通?？色@取hP47基因的全長序列。(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5′或3′端設(shè)計引物，在人類腎上腺M(fèi)arathon-ReadycDNA文庫(ClontechLab，Inc，USA)中進(jìn)行長距離PCR反應(yīng)。然后對PCR產(chǎn)物克隆、測序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復(fù)上述過程直至獲得全長。(3)RT-PCR對于5′和3′端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數(shù)據(jù)庫或自身數(shù)據(jù)庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5′端設(shè)計引物，3′端引物采用Oligo-dT，在腎上腺總RNA庫中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序。最后拼接并獲得全長。通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hP47蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計引物R15′-GAAGATGGCGGCGGCGACA-3′(SEQIDNO．4)為正向引物，寡核苷酸R25′-CACAAAAACCCAGGAAATGC-3′(SEQIDNO．5)為反向引物，以腎上腺組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1／R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、55℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為1309bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序，獲得SEQIDNO．6所示的序列。實(shí)施例2hP47基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人hP47全長cDNA(GenBankAccessionNo．AF112371。因申請保密，故在本申請之前未對公眾公開)的長度為1309bp，詳細(xì)序列見SEQIDNO．6，其中開放讀框位于5-1120位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出hP47的氨基酸序列，共371個氨基酸殘基，分子量40949．38，pI為5．05。詳細(xì)序列見SEQIDNO．7。將hP47的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與大鼠的基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與大鼠P47基因的mRNA全編碼序列(GenBankAccessionNo．AB002086)的105-1403位堿基有79．7％的相同性(圖1)，在氨基酸水平上，它與大鼠P47蛋白(SwissProtAccessionNo．O35987)的第1-370位氨基酸殘基有84．8％的相同性和90％的相似性(圖2)。由上可見，hP47基因與大鼠P47基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。本發(fā)明的人hP47除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hP47還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人hP47蛋白的N端與大鼠P47蛋白的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。針對本發(fā)明人hP47的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。此外，本發(fā)明人hP47核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hP47的表達(dá)水平或者抑制人hP47的過度表達(dá)。本發(fā)明的人hP47蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hP47缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。由于本發(fā)明的人hP47蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種(如大鼠)的同族蛋白相比，預(yù)計在施用于人時將具有更高的活性和／或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒有)。實(shí)施例3hP47蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1．將bP47蛋白的氨基酸序列在PROSITE數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http／／expasy．hcuge．ch／sprot／scnpsitl．html)中檢索基序(motif)，得到以下結(jié)果1MAAATATALREFVAVTGAEEDRARFFLESAGWDLQIALEPSYEDGGDEDI51VTISQATPSSVSRGTAPSDNRVTSFRDLIHDQDEDEEEEEGQRSRFYAGG101SERSGQQIVGPPRKKSPNELVDDLFKGAKEHGAVACWKRVTQEPWGETSK151PRPYLQGGGYPLGPAPEEDSFLLLAGEKRQHFOQDGSCSMKLWKSGYSLD201NGDLRSYKPSNAQFWSYRRGESTIRRLATVTVNLDMEDHRDEDFVKPKGA251FKAFTGEGQKLGSTAPQVLSTSSPAQQAENEAKASSSILIDESEPTTNIQ301IRLADGGRLVQKFNHSHRISDIRLFIVDARPAMAATSFILMTTFPNKELA351DESQTLKEANLLNAVIVQRLT(1)在氨基酸序列中，存在以下功能基序(ⅰ)波浪下劃線區(qū)(113-116,138-141)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(cAMP-andcGMP-dependentproteinkinasephosphorylationsite)(ⅱ)黑體區(qū)(74-76，101-103，148-150，189-191，206-208，216-218，223-225，316-318，355-357)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(ProteinkinaseCphosphorylationsite)(ⅲ)斜體區(qū)(16-19，41-44，74-77，116-119，355-358)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(CaseinkinaseⅡphosphorylationsite)(ⅳ)下劃線區(qū)(64-69，100-105，132-137，249-254，258-263)N-豆蔻酰化位點(diǎn)(N-myristoylationsite)(ⅴ)著重號區(qū)(314-317)N-糖基化位點(diǎn)(N-glycosylationsite)(2)功能分析cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，N-豆蔻?；稽c(diǎn)，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)均與翻譯后修飾(post-translationalmodifications)有關(guān)。2．將hP47蛋白的氨基酸序列在blocks數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http／／www．blocks．fhcrc．org)中檢索結(jié)構(gòu)域，得到以下結(jié)果1MAAATATALREFVAVTGAEEDRARFFLESAGWDLQIALEPSYEDGGDEDI51VTISQATPSSVSRGTAPSDNRVTSFRDLIHDQDEDEEEEEGQRSRFYAGG101SERSGQQIVGPPRKKSPNELVDDLFKGAKEHGAVACWKRVTQEPWGETSK151PRPYLQGGGYPLGPAPEEDSFLLLAGEKRQHFQQDGSCSMKLWKSGYSLD201NGDLRSYKPSNAQFWSYRRGESTIRRLATVTVNLDMEDHRDEDFVKPKGA251FKAFTGEGQKLGSTAPQVLSTSSPAQQAENEAKASSSILIDESEPTTNIQ301IRLADGGRLVQKFNHSHRISDIRLFIVDARPAMAATSFILMTTFPNKELA351DESQTLKEANLLNAVIVQRLT(1)在氨基酸序列中，存在以下結(jié)構(gòu)域區(qū)(ⅰ)下劃線區(qū)(76-94)甲狀腺激素受體功能模塊(THYROIDHORMONERECEPTOR)(ⅱ)黑體區(qū)(215-226，325-338)細(xì)胞色素c和cl血紅素裂解酶蛋白功能模塊(Cytochromecandclhemelyasesproteins)(2)功能分析在該基因氨基酸序列中存在甲狀腺激素受體功能模塊，預(yù)示著該蛋白參與膜泡分泌的功能可能受一些內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)。綜上所述，從hP47蛋白的結(jié)構(gòu)和理化特性進(jìn)一步證實(shí)了該基因與大鼠P47蛋白的相似性。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了功能特異性的生物化學(xué)原理，因此本發(fā)明的人P47具有大鼠P47相似或相同的功能。該基因在胞吐過程發(fā)揮著重要作用。實(shí)施例4hP47基因的組織表達(dá)譜1．電子Northern表達(dá)譜。按TonC．等人的方法(TonCetal．，BiochemBiophysResCommun1997Dec18；241(2)589-594；HwangDM，etal．，Circulation1997Dec16；96(12)4146-4203)，將hP47cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有81個，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在腎上腺、腦、乳腺、結(jié)腸、B細(xì)胞生發(fā)中心(Bcellgerminalcenter)、心臟、腎、肝、肺、黑色素細(xì)胞、子宮、松果體、胎盤、前列腺、脾臟和睪丸中均有表達(dá)，表明它在人體許多組織器官中都發(fā)揮著重要作用。實(shí)施例5hP47多肽的制備和提純在該實(shí)施例中，將全長的hP47編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。1．將hP47多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)人hP47的全長編碼序列(SEQIDNO．6)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應(yīng)于編碼序列5′和3′端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pGEX-2T載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hP47基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hP47表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hP47。表達(dá)GST-hP47重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hP47工程菌于3ml含100μg／ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg／ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時，至OD600達(dá)0．5后，加入IPTG至終濃度1mmol／L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時。取培養(yǎng)時間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hP47融合蛋白的工程菌。GST-hP47融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hP47融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hP47。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20mlPBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm／min離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-hP47的谷胱苷肽Sepharose4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μlPBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm／min離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在41kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為hP47蛋白。實(shí)施例6hP47蛋白或多肽在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1．hP47桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞株根據(jù)人hP47的全長編碼序列(SEQIDNO．6)，設(shè)計擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hP47cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPVDNA，Pharmingen，SanDiego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。2．轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106／lml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細(xì)胞。收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的MultiphorⅡ半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗hP47的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗hP47一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。挑取高表達(dá)hP47的Sf9細(xì)胞克隆。3．hP47蛋白的提取純化用高表達(dá)hP47的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0．5％Tritonx-100，20mMNa3PO4(磷酸鈉，pH7．8)，500mMNaCl，1mMNa3VO4(釩酸鈉)，1mMPefabloc，1μg／ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108的細(xì)胞加入2mlNTA-瓊脂糖(Qiagen,Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mMN，N′-二哌嗪，500mMNaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測提取的hP47蛋白的純度。在41kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為hP47蛋白。實(shí)施例7抗人hP47抗體的制備1．免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實(shí)施例5和實(shí)施例6中獲得的hP47蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。取6-8周齡Balb／C雌鼠，用50-100μg／0．2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg／0．2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁。2．按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第371頁中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。3．按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。4．抗體的檢測在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長，就應(yīng)用hP47蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗(yàn)、發(fā)射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人國家人類基因組南方研究中心(ⅱ)發(fā)明名稱人P47蛋白及其編碼序列(ⅲ)序列數(shù)目7(2)SEQIDNO．1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQIDNO．1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT50(2)SEQIDNO．2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQIDNO．2AATTCGGCACGAG13(2)SEQIDNO．3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度9bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQIDNO．3GCCGTGCTC9(2)SEQIDNO．4的信息(ⅰ)．序列特征(A)長度19bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)．分子類型寡核苷酸(ⅸ)．序列描述SEQIDNO．4GAAGATGGCGGCGGCGACA19(2)SEQIDNO．5的信息(ⅰ)．序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)．分子類型寡核苷酸(ⅸ)．序列描述SEQIDNO．5CACAAAAACCCAGGAAATGC20(2)SEQIDNO．6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1309bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型核苷酸(ⅸ)序列描述SEQIDNO．61GAAGATGGCGGCGGCGACAGCGACGGCGCTGAGGGAGTTCGTGGCGGTGA51CGGGCGCCGAGGAGGACCGGGCCCGCTTCTTTCTCGAGTCGGCCGGCTGG101GACTTGCAGATCGCGCTAGAGCCTTCTTATGAGGACGGAGGGGATGAAGA151CATTGTGACCATTTCGCAGGCAACCCCCAGTTCAGTGTCCAGAGGCACAG201CCCCCAGTGATAATAGAGTGACATCCTTCAGAGACCTCATTCATGACCAA251GATGAAGATGAGGAGGAAGAGGAAGGCCAGAGGAGCAGGTTTTATGCTGG301GGGCTCAGAGAGAAGTGGACAGCAGATTGTTGGCCCTCCCAGGAAGAAAA351GTCCCAACGAGCTGGTTGATGATCTCTTTAAAGGTGCCAAAGAGCATGGA401GCTGTAGCTTGTTGGAAGCGAGTGACCCAAGAGCCCTGGGGAGAGACCAG451TAAACCGAGACCCTATTTGCAAGGAGGTGGCTACCCCTTGGGGCCAGCAC501CAGAGGAAGACTCTTTCCTATTGTTGGCAGGAGAAAAGAGGCAGCATTTC551CAGCAAGATGGTTCATGTAGTATGAAACTCTGGAAGAGTGGATACAGCCT601GGATAATGGAGACCTCAGAAGCTACAAGCCATCCAATGCCCAGTTCTGGA651GTTATCGCAGAGGGGAGTCCACAATTCGGAGGCTAGCTACGGTGACAGTG701AACTTGGATATGGAGGACCATCGGGACGAGGACTTTGTGAAGCCCAAAGG751AGCCTTCAAAGCCTTCACTGGCGAGGGTCAGAAACTGGGCAGCACTGCCC801CCCAGGTGTTGAGTACCAGCTCTCCAGCCCAACAGGCAGAAAATGAAGCC851AAAGCCAGCTCTTCCATCTTAATCGACGAATCAGAGCCTACCACAAACAT901CCAAATTCGGCTTGCAGACGGCGGGAGGCTGGTGCAGAAATTTAACCACA951GCCACAGGATCAGCGACATCCGACTCTTCATCGTGGATGCCCGGCCAGCC1001ATGGCTGCCACCAGCTTTATCCTCATGACTACTTTCCCGAACAAAGAGCT1051GGCTGATGAGAGCCAGACCCTGAAGGAAGCCAACCTGCTCAATGCTGTCA1101TCGTGCAGCGGTTAACATAACCGCCCAGCCAGCTGCCTGGCCTCCCTCCT1151GTGTTTCCCATGCCAGTGGCCATGCCCCATGGGGATCGCCCCTCCTGCCC1201CCTTGTGCACACCCAGCAGTCCAGTGCAACGTCTCCTCCATAGCTCTGGG1251TTCTTAGATCTTGGTTGGACGTTTGTTTTCTCCTTAGTTGCATTTCCTGG1301GTTTTTGTG(2)SEQIDNO．7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度371氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅸ)序列描述SEQIDNO．71MetAlaAlaAlaThrAlaThrAlaLeuArgGluPheValAlaVal16ThrGlyAlaGluGluAspArgAlaArgPhePheLeuGluSerAla31GlyTrpAspLeuGlnIleAlaLeuGluProSerTyrGluAspGly46GlyAspGluAspIleValThrIleSerGlnAlaThrProSerSer61ValSerArgGlyThrAlaProSerAspAsnArgValThrSerPhe76ArgAspLeuIleHisAspGlnAspGluAspGluGluGluGluGlu91GlyGlnArgSerArgPheTyrAlaGlyGlySerGluArgSerGly106GlnGlnIleValGlyProProArgLysLysSerProAsnGluLeu121ValAspAspLeuPheLysGlyAlaLysGluHisGlyAlaValAla136CysTrpLysArgValThrGlnGluProTrpGlyGluThrSerLys151ProArgProTyrLeuGlnGlyGlyGlyTyrProLeuGlyProAla166ProGluGluAspSerPheLeuLeuLeuAlaGlyGluLysArgGln181HisPheGlnGlnAspGlySerCysSerMetLysLeuTrpLysSer196GlyTyrSerLeuAspAsnGlyAspLeuArgSerTyrLysProSer211AsnAlaGlnPheTrpSerTyrArgArgGlyGluSerThrIleArg226ArgLeuAlaThrValThrValAsnLeuAspMetGluAspHisArg241AspGluAspPheValLysProLysGlyAlaPheLysAlaPheThr256GlyGluGlyGlnLysLeuGlySerThrAlaProGlnValLeuSer271ThrSerSerProAlaGlnGlnAlaGluAsnGluAlaLysAlaSer286SerSerIleLeuIleAspGluSerGluProThrThrAsnIleGln301IleArgLeuAlaAspGlyGlyArgLeuValGlnLysPheAsnHis316SerHisArgIleSerAspIleArgLeuPheIleValAspAlaArg331ProAlaMetAlaAlaThrSerPheIleLeuMetThrThrPhePro346AsnLysGluLeuAlaAspGluSerGlnThrLeuLysGluAlaAsn361LeuLeuAsnAlaValIleValGlnArgLeuThr權(quán)利要求1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hP47蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列雜交。2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQIDNO．7所示的序列的多肽。3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列。4．一種分離出的人hP47蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNO．7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQIDNO．7序列的多肽。6．一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。8．一種產(chǎn)生具有人hP47蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(1)將編碼具有人hP47蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hP47蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO．6中從核苷酸第5-1120位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hP47蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hP47蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hP47蛋白活性的多肽。9．一種能與權(quán)利要求7所述的人hP47蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。10．一種探針分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供了一種在人體正常腎上腺組織中表達(dá)的新的人P47蛋白hP47及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法,以及在樣品中檢測hP47核酸序列和多肽的方法。文檔編號C12N15/12GK1279289SQ9910853公開日2001年1月10日申請日期1999年6月23日優(yōu)先權(quán)日1999年6月23日發(fā)明者李月彬,李明,任雙喜,徐淑華,傅剛,韓澤廣申請人:國家人類基因組南方研究中心