專利名稱：生產(chǎn)重組人體乳鐵蛋白的制作方法
本申請是1993年4月24日申請的，申請?zhí)枮镃N93105290.4的分案申請。
本發(fā)明主要涉及結(jié)合鐵的糖蛋白領(lǐng)域。更具體地，涉及生產(chǎn)重組人體乳鐵蛋白。
人體乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)是結(jié)合鐵的單體糖蛋白中轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一員。它最初在牛奶中發(fā)現(xiàn)，在初乳中的含量可達7克/升。此后，在其他外部液體中，例如眼淚、唾液以及粘液分泌物都檢測到LF，它還存在于分葉核白細胞的次級顆粒中。
LF是分子量為78千道爾頓(KDa)的糖蛋白，具有二葉瓣結(jié)構(gòu)，C末端和N末端有很大程度的同源性，該同源性無論從氨基酸順序還是三維結(jié)構(gòu)水平上看，都是很明顯的。每一葉瓣都能高親和性地與一個三價鐵離子可逆結(jié)合，這種結(jié)合同時伴隨著碳酸氫根(bicarbonate)的結(jié)合。已提出的乳鐵蛋白的生物學(xué)功能包括抵抗微生物感染、增強嬰幼兒對鐵的腸吸收、促進細胞生長、調(diào)節(jié)骨髓生成以及調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答。
絲狀真菌已被成功地作為宿主用于工業(yè)生產(chǎn)胞外糖蛋白。某些工業(yè)用菌株能分泌數(shù)以克計的糖蛋白。此外，絲狀真菌能正確地進行真核蛋白翻譯后的修飾，而且許多菌株已獲美國食品和藥物管理局(FDA)的許可。更進一步，大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)和下游加工技術(shù)都是具備的。
現(xiàn)在，還沒有有效而經(jīng)濟的方法生產(chǎn)人體LF。所以，隨著有效的生產(chǎn)人體乳鐵蛋白的方法上的進展，使乳鐵蛋白應(yīng)用于營養(yǎng)和藥物以及進一步研究工作以闡明其作用機理，將能解決本技術(shù)領(lǐng)域長期存在的需要，并描述有關(guān)的生產(chǎn)乳鐵蛋白的方法。
在一個實施例中，本發(fā)明提供了含有人體乳鐵蛋白cDNA的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的該質(zhì)粒適合在真核細胞中表達，并且含有人體乳鐵蛋白cDNA在該真核細胞中表達所必需的調(diào)控因子。
在另一個實施例中，本發(fā)明提供了含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的真核細胞。真核細胞選自包括曲霉屬(Aspergillus)在內(nèi)的一組絲狀真菌。該質(zhì)粒含有一個質(zhì)粒載體，其中插有編碼人體乳鐵蛋白的多聚脫氧核糖核苷酸片段。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了產(chǎn)生重組人體乳鐵蛋白的方法。該方法包括培養(yǎng)真核細胞的轉(zhuǎn)化株，該轉(zhuǎn)化的真核細胞含有重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有一個質(zhì)粒載體，其中包含編碼人體乳鐵蛋白的多聚脫氧核糖核苷酸片段。在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)直至形成人體乳鐵蛋白，隨后分離人體乳鐵蛋白。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種重組表達載體。該載體含有一個轉(zhuǎn)錄單位，包括下列元件(1)一個或多個在基因表達中具調(diào)控作用的遺傳因子；(2)編碼人體乳鐵蛋白的cDNA；(3)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始及終止序列；和(4)一個遺傳因子，該因子用于將那些被載體轉(zhuǎn)化的曲霉屬孢子篩選出來。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種產(chǎn)生具生物學(xué)活性的重組乳鐵蛋白的方法。該方法包括合成一段序列，該序列含有一個可供選擇的標記基因，一個啟動子，一個轉(zhuǎn)錄終止序列和一個接頭序列；克隆所述的序列，形成質(zhì)粒；用限制性核酸內(nèi)切酶消化該質(zhì)粒；將編碼乳鐵蛋白的cDNA插入限制性位點；和用能表達乳鐵蛋白cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化真核細核。
為了能詳盡地理解并獲得上面提及本發(fā)明的特征、優(yōu)點和目的，以及更好地理解其它事宜，可以對照本發(fā)明的實施例參見前面曾簡要概括的本發(fā)明的更具體的描述，那些實施例在附圖中有闡述。這些附圖是本說明書的一部分。必須注意，盡管如此，附圖闡述的只是本發(fā)明的較佳實施例，因此不能被用來限定本發(fā)明的范圍。其他相同的有效等價的實施例也被本發(fā)明承認。


圖1 米曲霉(Aspergillus oryzae)表達載體(pAhlfg.)的簡圖示意圖。
圖2 轉(zhuǎn)化的米曲霉(Aspergillus oryzae)菌株的Southern印跡分析。
圖3 轉(zhuǎn)化菌株相對對照的A07的RNA分析。
圖4 重組的LF的分泌和純化的銀染SDS-丙烯酰胺凝膠分析。
圖5 重組人體LF的特征。
圖6 編碼人體LF的cDNA序列。
出于本申請的目的，術(shù)語“轉(zhuǎn)鐵蛋白的家族”意指包括血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白在內(nèi)的一族鐵轉(zhuǎn)遞蛋白。這些蛋白質(zhì)都是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的。
出于本申請的目的，術(shù)語“載體”意指能允許乳鐵蛋白cDNA插入，增殖和表達的質(zhì)粒運載工具。
出于本申請的目的，術(shù)語“宿主”意指任何一種真核細胞，只要它能允許乳鐵蛋白表達質(zhì)粒整合到它的基因組中。
出于本申請的目的，術(shù)語“啟動子”意指控制乳鐵cDNA轉(zhuǎn)錄的DNA調(diào)控序列。
現(xiàn)于本申請的目的，術(shù)語“多克隆盒”意指一段DNA片段，該DNA片段含有多種限制性內(nèi)切酶切點，從后允許插入不同的cDNA。
出于本申請的目的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意指質(zhì)粒被有關(guān)的真核細胞攝入。
出于本申請的目的，術(shù)語“結(jié)合鐵能力”意指結(jié)合59Fe的能力。功能完整的乳鐵蛋白。每分子LF能結(jié)合兩個鐵原子。
出于本申請的目的，術(shù)語“生物活性(的)”意指以其結(jié)合鐵的能力為度量的乳鐵蛋白的生物活性。乳鐵蛋白起鐵傳遞蛋白的作用，必須結(jié)合鐵才具有生物活性。
在本說明書中引用的所有文獻在此處統(tǒng)一以參考形式表達。
給出下列實施例的目的在于闡述本發(fā)明的不同的實施，并不意味著以任何形式作為本發(fā)明的限制(因素)。
實施例1真菌菌株及轉(zhuǎn)化用于研究的pyr G突變菌株是從A.oryzae(A07 11488)衍生而來的。來自A.oryzae的pyrG基因用4-硝基喹啉-1-氧化進行誘變。根據(jù)Osmani，et al.，J.Cell.Biol.1041495-1504(1987)的轉(zhuǎn)化程序略作改進，轉(zhuǎn)化曲霉。將分生孢子(1×106/ml)接種于50ml含5mM尿嘧啶和10mM尿嘧啶核苷的YG培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物，2％葡萄糖)。32℃生長14-16小時直至看見萌發(fā)管。發(fā)芽的分生孢子通過離心方式收獲，然后再懸浮于40ml的溶菌混合液中[含有0.4M(NH4)2SO4，50mM檸檬酸鉀(pH6.0)，0.5％酵母提取物，0.12gnovozyme，0.1g Driselase，100μlβ葡糖苷酸酶，0.5％蔗糖和10mM MgSO4]。在32℃和150rpm下原生質(zhì)體化2-3小時。在原生質(zhì)體化之后，有必要用無菌的米拉布(miracloth)進行過濾，以去除所有未消化的菌絲。原生質(zhì)體通過離心收獲并在4℃用10毫升的0.4M(NH4)2SO4，1％蔗糖和50mM檸檬質(zhì)鉀(pH6.0)洗滌兩次，接著再懸浮于1毫升的0.6M KCl；50mM CaCl2；10mM Tris-HCl(pH7.5)中，并置于冰上。在原生質(zhì)體的制備之后，立刻進行轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體(100μl)加入3μg DNA和50μl的40％聚乙二醇(PEG)6000，50mM CaCl2，0.6M KCl和10mM Tris-HCl，(pH7.5)。樣品在冰上保溫15分鐘后，再加入1ml PEG溶液，然后在室溫繼續(xù)保溫30分鐘。上述混合物分成小份，分置于3ml 0.7％半固體基本培養(yǎng)基中，添加0.4％硫酸銨，倒平板于含同樣成分但用2％瓊脂固化的固體培養(yǎng)基平板上。隨后，所有的平板在32℃培養(yǎng)。
實施例2質(zhì)粒構(gòu)建表達質(zhì)粒的簡要圖解見圖1。編碼人體LF的完整的cDNA用DNA聚合酶I的Klenow片段進行修補，然后亞克隆入經(jīng)Acc I消化并補平的pGEM4質(zhì)粒，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pGEMhLFc。為了去除LF的信號(肽)序列(Signal sequence)和產(chǎn)生一個與α-淀粉酶序列同框架的5′末端，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增pGEMhLFc質(zhì)粒DNA，從而獲得一段252堿基對(bp)的含有HindII/AccI末端的乳鐵蛋白片段。使用的寡聚核苷酸引物如下
5′末端的寡核苷酸，如序列識別編號No.1中所示(SEQ.ID.No.1)\(CTGGGTCGACGTAGGAGAAGGAGTGTTCAGTGGTGC)3′末端的寡核苷酸，如序列識別編號No.2中所示(SEQ.ID.No2)(GCCGTAGACTFCCGCCGCTACAGG).
PCR擴增的片段用Hind II和AccI消化，再亞克隆入Hind II/AccI消化的pGEMhLFc，產(chǎn)生pGEMhLF。編碼啟動子，信號肽序列和位于成熟的α-淀粉酶II基因起始處的丙氨酸殘基的帶有Asp 718/Pvu II末端的681 bp的α-淀粉酶片段，是用PCR擴增A.oryzae基因組DNA而得到的。寡聚核苷酸引物如下5′末端的寡核苷酸，如序列識別編號No.3中所示(SEQ.ID.No3)(GAGGTACCGAATTCATGGTGTITTG-ATCATTTTAAATTTTTATAT)3′末端的寡核苷酸，如序列識別編號No.4中所示(SEQ.ID.No4)(AGCAGCTGCAGCCAAAGCAGGTGCC-GCGACCTGAAGGCCGTACAG).
擴增得到的DNA用Asp 718和Pvu II消化，并在克隆到Asp 718/Hind II消化的pGEMhLF。構(gòu)成的質(zhì)粒pGEMAhLF用EcoRI消化，得到的2.8Kb的α-淀粉酶-乳鐵蛋白片段亞克隆到pAL3的唯一的EcoR I位點，由此產(chǎn)生pAhLF*。用人工合成的寡核苷酸提供在pAhLF*中缺失的乳鐵蛋白羧基末端的最后5個密碼子(核苷酸2138-2153)；同樣用人工合成的寡核苷酸提供源自黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶基因的3′端不翻譯序列中前180bp。構(gòu)成的質(zhì)粒pAhL FG用來轉(zhuǎn)化米曲霉(A.oryzae)的pyrG突變菌株。
參見圖1，米曲霉(Aspergillus oryzae)表達質(zhì)粒pAhLFG含有A.oryzae AMY II基因序列的681 bp 5′-旁側(cè)序列，該序列包括信號肽序列和成熟的α-淀粉酶的第一個密碼子。編碼成熟的人體乳鐵蛋白的cDNA亞克隆在這些序列的下游同一框架中，從而可以通過在培養(yǎng)基中加入淀粉而產(chǎn)生重組蛋白。黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶的3′端非翻譯區(qū)域提供轉(zhuǎn)錄終止子和多聚腺苷化信號。該質(zhì)粒還含有粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)pyr 4選擇標記以及氨芐青霉素抗性基因。
用于表達人體乳鐵蛋白的質(zhì)粒構(gòu)件pAhLFG，包含一個681的片段，該片段編碼米曲霉的α-淀粉酶II基因(AMY II)的啟動子和分泌信號肽。信號序列還含有一個位于成熟α-淀粉酶蛋白質(zhì)的起始處的丙氨酸(Ala)密碼子，從而形成信號肽序列切除位點，該位點(Leu Ala Ala)可被內(nèi)源的α-淀粉酶肽酶識別。編碼成熟的蛋白質(zhì)的人體乳鐵蛋白cDNA被亞克隆入緊挨著AMY II基因的下游的同一框架中，使之處在高效的可用淀粉誘導(dǎo)的啟動子的控制下。為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的人體LF mRNA，將編碼黑曲霉(Aspergillus miger)的葡糖淀粉酶基因的3′端不翻譯區(qū)域的180 bp的片段連接入多克隆盒的單一BamHI位點，緊挨著人體LFcDNA的下游，從而提供轉(zhuǎn)錄終止子和聚腺苷化的信號。該質(zhì)粒還含有粗糙鏈孢霉pyr 4選擇標記。py r4與A.oryzae的pyr G營養(yǎng)缺陷突變互補，從而可以通過在缺乏尿嘧啶核苷時的生長，將那些被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的孢子選出。
實施例3基因組DNA的操作A.oryzae DNA，按照Rafmussen，et al.，J.Biol.Chem.，26513767-13775(1990)所描述的方法，從200mg冷凍干燥的菌絲中分離得到。DNA用EcoRI消化，片段大小在0.8％瓊脂糖凝膠上分級分開，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。用于Southern印跡分析的硝酸纖維素濾膜的預(yù)雜交和雜交在6×SSC，0.1％SDS和0.5％干牛奶中，65℃進行16小時。雜交溶液含有1×107cpm32P-標記的乳鐵蛋白cDNA探針(2.1kb)。濾膜在2×SSC，0.5％SDS中，室溫下洗滌30分鐘，接著在0.5×SSC，0.5％SDS中68℃洗滌兩次各30分鐘。濾膜經(jīng)干燥，通過放射自顯影術(shù)，于-70℃曝光兩小時，然后顯影。
參見圖2，Southern印跡分析是用轉(zhuǎn)化的米曲霉菌株進行的。來自各個轉(zhuǎn)化子和作對照的A 07的基因組DNA與放射性標記的hL F cDNA探針(2.1kb)進行雜交。箭頭所指的是放射性標記的片段(2.8kb)。該片段是EcoRI消化表達質(zhì)粒產(chǎn)生的。存在于所有的轉(zhuǎn)化子中(#1-9)但是在對照的非轉(zhuǎn)化的A07中不存在。噬菌體λ經(jīng)Hind III消化的片段的分子量列于左邊。
實施例4Northern印跡分析用購得的RHazolB(Biotecx Laboratories，INC，Houston，TX)，并依照廠商的說明書，將RNA從200mg冰凍干燥的菌絲中分離出來。20μg總RNA在含2.2M甲醛的0.8％瓊脂糖凝脂中電泳。接著RNA被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上并和2.1kb的乳鐵蛋白cDNA雜交或者和與α-淀粉酶II基因的編碼區(qū)域相對應(yīng)的1.8kb的基因組α-淀粉酶片段雜交。探針是用缺口翻譯法用32p標記的(比活2×108cpm/μg)。雜交用2×106cpm探針/毫升，在2×SSC，0.5％干牛奶中，65℃進行。
洗滌的方式和前面用于Southern印跡分析的洗滌方式相同。濾膜經(jīng)干燥，于-70℃曝光2小時，然后放射性自顯形。RNA點印跡用硝酸纖維素膜和多用途點印跡體系(manifold dot blot syste m)進行。雜交和洗滌的條件與前面Souethern印跡分析中描述的相同。放射性計數(shù)采用β粒子印跡分析儀(betagon blot analyzer)。
重組乳鐵蛋白的產(chǎn)生已經(jīng)在它的最佳實施例中描述過了。但是，重組產(chǎn)物也可從其他許多來源得到，例如采用真菌來源，比如酸灑酵母或巴斯德畢赤酵母，或者昆蟲細胞，比如SF9。
參見圖3，列出了轉(zhuǎn)化子相對對照的A 07的RNA印跡分析。圖3A，對照A07和轉(zhuǎn)化子#1的RNA(20μg)與放射性標記的人體LFcDNA的雜交的Northern印跡分析。人體LF mRNA(2.3kb)可在轉(zhuǎn)化子#1中檢測到，但在對照未轉(zhuǎn)化的A07中沒有。28s和18srRNA的位置列于左邊。圖3B，對照A07對轉(zhuǎn)化子#1的RNA(5和10μg)的點印跡，采用放射性標記的α-淀粉酶基因組DNA探針。圖3C，對照A07對轉(zhuǎn)化子#1的RNA(5μg和10μg)的點印跡，采用說明過的放射性標記的人體LFcDNA探針。
進行Northern印跡分析以確定，在我們的表達質(zhì)粒的調(diào)控因子的控制下，乳鐵蛋白mRNA是否在A.orzyae中正確且高效地轉(zhuǎn)錄。來自轉(zhuǎn)化子#1和對照的未轉(zhuǎn)化的孢子(1×106/ml)被接種在真菌培養(yǎng)基上，真菌培養(yǎng)基含1.5％的葡萄糖作為碳源。于30℃小搖瓶中培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)物經(jīng)洗滌，再接種于真菌培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含3％的淀粉以誘導(dǎo)人體LF mRNA的轉(zhuǎn)錄。24小時后，收獲細胞并分離RNA?？俁NA(20μg)在含2.2M甲醛的1.0％瓊脂糖凝脂上分級，然后印跡在硝化纖維上。
用32P標記的人體LF cDNA(2.0kb)探針檢測人體LFmRNA。與放射性標記的人體LFcDNA探針的雜交檢測到一條特異的放射性標記的條帶，對應(yīng)于轉(zhuǎn)化子的LF mRNA(2.3kb)的正確位置，但在對照的未轉(zhuǎn)化菌株中卻沒有(圖3A)。用點分析定量分析mR NA表明對照的A07與轉(zhuǎn)化子#1的內(nèi)源的α-淀粉酶mRNA的表達水平基本相同(圖3B)。此外，在轉(zhuǎn)化子#1可以看到α-淀粉酶和人體LF mRNA的表達水平大致相等(圖3B和3C)。
實施例5重組人體LF的純化從生長培養(yǎng)基中純化LF采用CM Sephadex C50，基本上按照St owell，et al.，BiochemJ.，276349-59(1991)所述的方法。層析柱用500ml 0.025M Tris HCl，pH 7.50，1M NaCl預(yù)平衡。在上柱(預(yù)平衡的)之前，培養(yǎng)基的pH調(diào)整至pH7.4。層析柱用500ml平衡緩沖液洗滌，隨后用鹽梯度線性從0.1增至1.1M NaCl洗滌。分部洗滌液(共7ml)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS/PAGE)和銀染法分析乳鐵蛋白的含量和純度。含有LF的分部用0.025M Tris HCl，pH 7.5/0.1M NaCl透析，并冰凍干燥。
實施例6人體LF的定量重組乳鐵蛋白的定量采用ELISA分析，基本上按照Vilja etal.，J.Immunol.Methods，7673-83(1985)所描述的方法。使用非競爭性的抗生物素蛋白-生物素分析，靈敏度可達5ng乳鐵蛋白。以從乳奶中分離的人體LF(Sigma公司的)作為標準。生物素化的人體乳鐵蛋白Ig得自Jackson Immunoresearch laboratories，West Grove，PA。
實施例7N-末端測序5μg純化的重組人體LF經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，然后按制造廠商的說明書(Applied Biosystems.(注公司名稱))，將其轉(zhuǎn)移到Problott，一種聚偏二氟乙烯型膜(Applied Biosyste ms產(chǎn)品)。人體LF用考馬斯亮藍染色檢測，然后脫色。切下人體LF條帶，用蒸餾水充分洗滌，風(fēng)干。人體LF N-末端的最初十個氨基酸的順序，用自動的Edman降解程序測出，使用Applied Biosyste ms的脈沖-液相測序儀(Model 477A)。
參見圖4，圖4A顯示重組人體LF分泌和純化的銀染SDS-聚丙烯酰酸凝膠分析結(jié)果。道1含乳奶人體LF作為標準(500ng)。道2和3分別含有來自經(jīng)誘導(dǎo)的對照A07和轉(zhuǎn)化子#1的生長培養(yǎng)基樣品(40μg)。道4-8含有各100μl的洗脫分部(分別為#25，30，35，40和45)，洗脫分部是從轉(zhuǎn)化子#1的生長培養(yǎng)基，在CM-Sephade x上純化重組LF時收集到的。分子量標記(BioRad laboratories R ichmond，CA)的位置列于左側(cè)。分子量大小以千道爾頓計。圖4B顯示了與圖4A相同的樣品的Western免疫印跡分析結(jié)果，采用特異的針對人體LF的多克隆抗體，該抗體可用125I標記的蛋白質(zhì)A檢測出。圖4C顯示#6重組人體LF的N-末端氨基酸序列。重組人體LF從N-末端開始10個殘基被測序，并且證實與乳奶人體LF的相同，除了額外的丙氨酸。這個丙氨酸存在于我們的構(gòu)建中，提供α-淀粉酶信號肽序列的切除位點。
實施例8去糖基化去糖基化用N-糖苷酶F(Boehringer Mannheim)進行。含有0.5μg乳鐵蛋白的A.oryzae生長培養(yǎng)基，在0.01％SDS的存在下，于100℃變性3分鐘。從人奶中得到的標準LF同樣處理。樣品隨后置于冰上5分鐘。N-糖苷酶F反應(yīng)在下列條件進行0.4M磷酸鈉，(pH6.8)；0.08％Triton；0.1％β-巰基2醇和1單位的酶，37℃保溫16小時。用特異性針對人體LF的IgG進行PAGE和Western印跡分析，從而檢定消化過的樣品在遷移率方面的增加。
參見圖5，重組人體LF的特性。圖A顯示了LF的去糖基化。采用特異性的針對人體LF的多克隆抗體，該抗體能用125I-蛋白質(zhì)A檢測出，進行糖基化和去糖基化的乳鐵蛋白的Western印跡分析。第一張圖為真乳奶人體LF(500ng)，包括未用N-糖苷酶F處理(-)和用N-糖苷酶F處理的(+)。第二張圖為純化的重組人體LF(500ng)包括未用N-糖苷酶F處理(-)和用N-糖苷酶F處理的(+)。糖基化的人體LF的分子量大小用箭頭標出。圖B顯示了重組LF在結(jié)合鐵的能力方面的功能測試。圖A和圖B分別顯示了完全相同的真乳奶人體LF和純化的人體LF樣品的59Fe濾膜結(jié)合分析，按圖中標明的濃度進行。兩張圖的第一道(lane)都含BSA(5μg)作為陰性對照。
乳鐵蛋白含有兩個N-乙酰乳糖胺型聚糖，它們通過N-糖苷鍵連接。為了確定重組LF是否正確糖基化，用N-糖苷酶F處理重組乳鐵蛋白，在SDS-聚丙烯酰胺電泳上分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，用針對人體LF的特異性的IgG作為探針檢測(圖5A)。N-糖苷酶F在糖胺鍵(glycosylamine linkage)處的水解產(chǎn)生一個分子量較小的不含糖類的多肽。比較重組LF和從人奶中純化的LF，可以看出兩種蛋白用N-糖苷酶F消化后共同遷移，這意味著重組蛋白具有與天然LF相似的糖基化模式。
乳鐵蛋白具有二葉瓣結(jié)構(gòu)，每一個葉瓣具有牢固且可逆地結(jié)合一個3Fe3+離子的能力。乳鐵蛋白結(jié)合鐵的特性對于其功能是很關(guān)鍵的。為了測試在A.oryzae中表達和分泌的重組人體LF是否具有與真的LF相似的結(jié)合鐵的能力，發(fā)展了一種59Fe微濾膜結(jié)合分析技術(shù)。從轉(zhuǎn)化子#1的生長培養(yǎng)基中分離得到的純化的人體LF用0.1M檸檬酸(pH2.0)滲析，產(chǎn)生脫輔基一人體LF。來自人奶的天然LF同樣處理。加入過量的59Fe(0.2mCi)于兩種樣品中(樣品溶于相同體積的1M碳酸氫鹽中)，接著在37℃保溫30分鐘。樣品隨后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用碳酸氫鹽溶液洗滌數(shù)次。濾膜經(jīng)放射性自顯影，接著用β粒子印跡分析儀定量分析鐵的結(jié)合量。如圖5B所示，在所有測試的濃度下，重組LF和天然LF的結(jié)合鐵的水平相似。結(jié)果表明，重組人體LF在結(jié)合鐵的能力方面與天然人體LF沒有區(qū)別。
參見圖6，顯示了人體乳鐵蛋白的完整的cDNA序列，編碼乳鐵蛋白的cDNA被用來構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化真核細胞和產(chǎn)生乳鐵蛋白。
用于本發(fā)明的曲霉屬菌株是營養(yǎng)缺陷突變型，它們含有缺陷的pyr 4基因，因而不能合成乳清酸核苷5′-磷酸(OMP)脫羧酶。該酶是尿嘧啶核苷合成所必需的。因而缺陷型菌株不能在缺乏尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基上生長。質(zhì)粒含有可供選擇的標記基因，即編碼OMP脫羧酶基因的序列。因此曲霉屬菌攝入這種質(zhì)粒就能因為能在缺乏尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基上生長而選擇出。用這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化曲霉屬菌，使之可以在缺乏尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基上生長。
在本發(fā)明的一個實施例中，產(chǎn)生了具生物學(xué)活性的重組乳鐵蛋白。該方法包括合成一段序列，該序列含有一個可供選擇的標記基因，一個啟動子，一個轉(zhuǎn)錄終止序列和一個接頭序列；隨后將該序列克隆形成一質(zhì)粒，并用限制性核酶內(nèi)切酶消化該質(zhì)粒；將編碼乳鐵蛋白的cDNA插入限制性酶切位點；然后用表達乳鐵蛋白cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化真核細胞。
用于本發(fā)明方法的可供選擇用的標記基因可以是任何一種基因，只要它能將用LFcDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞分離出來。較佳地，可供選擇用的標記基因選自pyr4，pyrG，argB，trpC和andS。
用于本發(fā)明的啟動子可以是任何一種啟動子，只要它能允許進行LFcDNA的轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，較佳地，啟動子選自乙酵脫氫酶，argB，α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。
用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄終止序列可以是任何一種轉(zhuǎn)錄終止序列，只要它能穩(wěn)定LFmRNA。較佳地，轉(zhuǎn)錄終止序列是從α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脫氫酶或ben A衍生而來。
用于本發(fā)明方法的接頭序列可以是任何一種接頭序列，只要它含有一個翻譯起始密碼子，一個分泌信號和一個限制性酶切位點。較佳地，接頭序列從α-淀粉酶，葡糖淀糖酶或乳鐵蛋白衍生而來。
用于本發(fā)明的真核細胞可以是任何一種真核細胞，只要它能被含有LF cDNA的質(zhì)粒整合并且表達LF cDNA。較佳地，真核細胞是真菌細胞或昆蟲細胞。諸如SF 9之類的昆蟲細胞能用于本發(fā)明方法。更佳地，真菌細胞是酵母細胞。最佳地，用于本發(fā)明的真核細胞是曲霉屬菌株，例如米曲霉(A.oryzae)，黑曲霉(A.niger)，構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和阿瓦莫利曲霉(A.awamori)。
綜上所述，可以看出，此處公開的本發(fā)明及實施例能很好地用來實現(xiàn)發(fā)明目的，并且獲得在本申請中規(guī)定的結(jié)果。在方法和設(shè)備方面能作某些變動，而不違離本發(fā)明的精髓，也不超出本發(fā)明的范圍。應(yīng)該意識到這些變動是可能的。更深入地，應(yīng)該意識到，在此申請的任一權(quán)利要求中的每一個因素或步驟，都應(yīng)被理解為包括了所有的等價因素或步驟，這些等價因素或步驟以本質(zhì)上相同或等價的方式完成本質(zhì)上相同的結(jié)果。本發(fā)明的原則，不論以任何形式應(yīng)用，都可以預(yù)期只是更廣泛地應(yīng)用本發(fā)明而已。因此，本發(fā)明能出色地實現(xiàn)發(fā)明目的并獲得提及的結(jié)果和好處，以及其他內(nèi)部固有的結(jié)果和好處。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)乳鐵蛋白的方法，其特征在于，包括在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的真菌細胞直至形成乳鐵蛋白，所述的質(zhì)粒含有一質(zhì)粒載體，該載體帶有編碼乳鐵蛋白的聚脫氧核糖核苷酸；然后分離出人體乳鐵蛋白。
2.一種重組表達載體，其特征在于，所述的載體含有一個轉(zhuǎn)錄單位，該單位由以下一系列組成(1)一個或多個在基因于真菌細胞中表達時起調(diào)控作用的遺傳因子；(2)編碼人體乳鐵蛋白的cDNA；和(3)合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯的起始和終止序列。
3.如權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，所述的遺傳因子是啟動子。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，所述的啟動子選自乙醇脫氫酶、argB、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和benA基因。
5.如權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)錄終止序列選自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脫氫酶和benA基因。
6.一種用如權(quán)利要求1所述的方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
7.一種具有生物學(xué)活性的重組人乳鐵蛋白，其特征在于，它是用包括以下步驟的方法生產(chǎn)的1)在適合曲霉屬真菌細胞表達重組人乳鐵蛋白和將該重組人乳鐵蛋白分泌入培養(yǎng)基的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)曲霉屬真菌細胞，其中，該曲霉屬真菌細胞被表達載體所轉(zhuǎn)化，該表達載體含有可操作地連于多肽編碼核苷酸序列的真菌啟動子序列，該多肽編碼序列含有融合于編碼重組人乳鐵蛋白的多聚核苷酸的、編碼分泌信號肽的核苷酸序列并提供單一的開放閱讀框架，該載體還含有調(diào)控該多肽編碼核苷酸序列的翻譯的核苷酸序列元件，以及2)從該培養(yǎng)基中分離該分泌的重組人乳鐵蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供全新的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染的真核細胞,以及產(chǎn)生這些質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染的真核細胞的方法,新的質(zhì)粒含有人體乳鐵蛋白的cDNA。同時提供了在A.oryzae中產(chǎn)生人體乳鐵蛋白的方法。從而,本發(fā)明提供了產(chǎn)生重組人體乳鐵蛋白的有效而經(jīng)濟的途徑。
文檔編號C12N15/06GK1250055SQ99108659
公開日2000年4月12日 申請日期1993年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月24日
發(fā)明者奧爾拉·莫伊利奧薩·康尼利, 丹尼斯·羅伯特·黑登, 伯特·威廉·奧馬利, 格雷戈里·斯圖爾特·梅 申請人:貝勒醫(yī)學(xué)院