專(zhuān)利名稱(chēng)：：人蛋白激酶抑制因子γ及其編碼序列、以及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及人蛋白激酶抑制因子γ(humanProteinKinaseInhibitorγ，簡(jiǎn)稱(chēng)為“hPKIγ”)的cDNA序列，該蛋白是PKI家族的成員。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。cAMP依賴(lài)的蛋白激酶(PKA)是蘇氨酸／絲氨酸家族的一個(gè)亞家族。這個(gè)家族的成員在細(xì)胞對(duì)激素和神經(jīng)遞質(zhì)作出反應(yīng)的過(guò)程中作用重要。當(dāng)cAMP低濃度的時(shí)候，PKA由兩個(gè)調(diào)節(jié)(R)亞基和兩個(gè)催化(C)亞基組成全酶形式，并處于非活性狀態(tài)(McKnight，G．S．Curr．Opin．CellBiol．3213—317，1991)；當(dāng)cAMP達(dá)到一定濃度時(shí)，每個(gè)R亞基都與cAMP結(jié)合，從而釋放C亞基。然后C亞基能使蛋白底物的蘇氨酸和絲氨酸殘基磷酸化，引起一系列生物功能的變化，例如，改變細(xì)胞分裂速度、細(xì)胞形態(tài)、膜離子通透性、參與代謝的酶活性或者基因轉(zhuǎn)錄水平(Francis，S．H．etal．Annu．Rev．Physiol．56237—272，1994Lee，K．A．W．Curr．Opin．CellBiol．3953—959，1991)。C亞基有三種同工型，R亞基有四種，它們的組織表達(dá)情況不同，并且與R亞基的結(jié)合能力也不同。C亞基除了能被R亞基抑制活性外，還被蛋白激酶抑制因子(PKI)抑制(Walsh，D．A．etal．Curr．Opin．CellBiol．4241—251，1992)。PKI是C亞基專(zhuān)一的、有效的抑制因子，PKI的抑制不能被cAMP緩解，因?yàn)樗缓衏AMP結(jié)合位點(diǎn)，這一點(diǎn)與R亞基的抑制情況不同。與C亞基的情況相似，迄今為止已發(fā)現(xiàn)多種PKI的異構(gòu)體。cDNA的克隆與鑒定研究表明，哺乳動(dòng)物中至少有兩個(gè)基因編碼PKI，根據(jù)組織分布特性的不同，分別被命名為PKIα和PKIβ。PKIα在心臟、骨骼肌、大腦皮層、小腦高度表達(dá)(Olsen，S．R．etalJ．Biol．Chem．26611158—11162，1991；VanPatten，S．M．etal．Mol．Endocrinol．62114—2122，1992)，PKIβ主要在睪丸中高度表達(dá)(VanPatten，S．M．etal．Mol．Endocrinol．62114—2122，1992)。對(duì)PKI的研究是從兔的骨骼肌開(kāi)始的，從中分離到的PKI(PKIα)蛋白由75個(gè)氨基酸殘基組成，測(cè)序工作在1985年完成(Scott，J．D．etal．Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．825732—5736，1985)。VanPatten等人從大鼠中克隆到PKIβ，編碼70個(gè)氨基酸殘基組成，與C亞基特異性結(jié)合，并且其關(guān)鍵的假底物位點(diǎn)(pseudosubstratesite)的氨基酸殘基保守，與PKIα相同(VanPatten，S．M．etalProc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．885383—5387，1991)。最近又從小鼠腦cDNA文庫(kù)中克隆鑒定出兩種PKIβ，被命名為PKIβ1和PKIβ2(Marco，A．etal．J．Biol．Chem．26610927—10931，1995)。前不久，有報(bào)道在鼠中克隆鑒定又一同工型PKIγ，能有效抑制PKA且廣泛表達(dá)(Sean，P．etal．J．Biol．Chem．27218169—18178，1997)。在人體中也有關(guān)于PKI克隆的報(bào)道，與兔骨骼肌PKI蛋白的同一性達(dá)到100％，其表達(dá)能抑制PKA活性(Olsen，S．R．etal．Mol．Endocrinol．51246—1256，1991)。PKI是PKA的C亞基的專(zhuān)一的、有效的抑制因子。正如前所述，PKA在生物體內(nèi)具有廣泛而重要的作用，諸如改變細(xì)胞形態(tài)、基因轉(zhuǎn)錄水平、膜離子通透性等，因此，PKI可能在由依賴(lài)cAMP激活的PKA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)時(shí)序調(diào)節(jié)中發(fā)揮必要的作用(Wiley，J．C．Etal．J．Biol．Chem．2746381—6387，1997)(Wiley，J．C．Etal．J．Biol．Chem．2746381—6387，1997)。另外，PKA在神經(jīng)遞質(zhì)的第二信使系統(tǒng)中有著重要的調(diào)節(jié)作用，PKI能抑制PKA的活性，協(xié)助PKA參與的信號(hào)傳遞。體內(nèi)微量注射PKI實(shí)驗(yàn)表明，PKI可有效抑制PKA的活性，因此PKI可能成為研究PKA體內(nèi)特定功能的一個(gè)強(qiáng)有力的工具(Fernandez，A．etalExp．Cell．Res．195468—477，1991)。然而，在本發(fā)明之前尚沒(méi)有分離出，也沒(méi)有公開(kāi)過(guò)人蛋白激酶γ的氨基酸序列和相應(yīng)的編碼序列。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼PKI家族的一個(gè)新成員，本發(fā)明的PKI家族成員被命名為人蛋白激酶抑制因子γ(humanProteinKinaseInhibitorγ，簡(jiǎn)稱(chēng)為“hPKIγ”)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的人的PKI家族成員，該蛋白被命名為hPKIγ蛋白。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的hPKIγ多肽的方法。本發(fā)明還提供了這種人的hPKIγ核酸序列和多肽的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人hPKIγ蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQIDNO．4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人hPKIγ蛋白多肽，它包括具有SEQIDNO．4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO．4序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人hPKIγ蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人hPKIγ蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hPKIγ蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hPKIγ蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人hPKIγ蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人hPKIγ蛋白活性的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長(zhǎng)為354個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見(jiàn)SEQIDNO．3，其中開(kāi)放讀框位于28—258位核苷酸。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hPKIγ蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hPKIγ蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO．3中28—258位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQIDNO．3序列的編碼框28—258位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDNO．3中28—258位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQIDNO．4所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語(yǔ)還包括與SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人hPKIγ相同功能的蛋白的、SEQIDNO．4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1—30個(gè)，較佳地1—20個(gè)，更佳地1—10個(gè)，最佳地1—5個(gè))核苷酸的缺失、插入和／或取代，以及在5’和／或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi)，最佳地為3個(gè)以?xún)?nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hPKIγ蛋白多肽”指具有人hPKIγ蛋白活性的SEQIDNO．4序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人hPKIγ相同功能的、SEQIDNO．4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1—15個(gè)，較佳地1—10個(gè)，更佳地1—5個(gè)，最佳地1—3個(gè))氨基酸的缺失、插入和／或取代，以及在C末端和／或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為10個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為5個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為3個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和／或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人hPKIγ蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人hPKIγDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hPKIγ多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hPKIγ多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人hPKIγ多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hPKIγ多肽序列的至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約60個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約70個(gè)連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供人hPKIγ蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然人hPKIγ多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L—氨基酸的殘基(如D—氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ—氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“人hPKIγ保守性變異多肽”指與SEQIDNo．4的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表1<tablesid="table1"num="001"><table>最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val；Leu；IleValArg(R)Lys；Gln；AsnLysAsn(N)Gln；His；Lys；ArgGlnAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro；AlaAlaHis(H)Asn；Gln；Lys；ArgArgIle(I)Leu；Val；Met；Ala；PheLeuLeu(L)Ile；Val；Met；Ala；PheIleLys(K)Arg；Gln；AsnArgMet(M)Leu；Phe；IleLeuPhe(F)Leu；Val；Ile；Ala；TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThr(T)SerSer</table></tables><tablesid="table2"num="002"><table>Trp(W)Tyr；PheTyrTyr(Y)Trp；Phe；Thr；SerPheVal(V)Ile；Leu；Met；Phe；AlaLeu</table></tables>本發(fā)明還包括人hPKIγ多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人hPKIγ的表達(dá)。本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人hPKIγ多肽編碼序列的8—100個(gè)，較佳地15—50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼人hPKIγ的核酸分子。本發(fā)明還包括檢測(cè)人hPKIγ核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于人hPKIγ多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15—50個(gè)核苷酸。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人hPKIγDNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人hPKIγ基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人hPKIγ基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人hPKIγ蛋白的分子，也包括那些并不影響人hPKIγ蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人hPKIγ基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專(zhuān)利No．4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人hPKIγ基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人hPKIγ或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類(lèi)單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6511，1976；Kohler等人，Eur．J．Immunol．6292，1976；Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier，N．Y．，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人hPKIγ功能的抗體以及不影響人hPKIγ功能的抗體。本發(fā)明的各類(lèi)抗體可以利用人hPKIγ基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人hPKIγ基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E．Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。本發(fā)明的人hPKIγ核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列(尤其因?yàn)閔PKIγ的片段較短)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，人hPKIγ的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人睪丸λgt11cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A5′—ACAGGCCTGAGGAGCGATGCAC—3′(SEQIDNO．1)為正向引物，寡核苷酸B5′—GGAGCTCAGAGAAGAGGCTGCTG—3′(SEQIDNO．2)為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的PCR片斷約為350bp的目的片段(SEQIDNO3)。PKI是PKA的C亞基的專(zhuān)一的、有效的抑制因子。本發(fā)明hPKIγ可能在神經(jīng)系統(tǒng)的第二信使系統(tǒng)中有著重要的調(diào)節(jié)作用，因?yàn)镻KA在神經(jīng)系統(tǒng)中是重要的第二信使，而hPKIγ的同源物PKI能抑制PKA的活性。本發(fā)明hPKIγ還可能在由依賴(lài)cAMP激活的PKA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)時(shí)序調(diào)節(jié)中發(fā)揮必要的作用(Wiley，J．C．Etal．J．Biol．Chem．2746381—6387，1997)。另外，本發(fā)明hPKIγ也可能在體內(nèi)有效抑制PKA活性，因而是研究PKA體內(nèi)特定功能的一個(gè)強(qiáng)有力的工具。此外，由于本發(fā)明的hPKIγ具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來(lái)源于其他物種的同族蛋白相比，預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有更高的活性和／或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒(méi)有)。在附圖中，圖1為本發(fā)明的人hPKIγ與小鼠PKIγ的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用“丨”標(biāo)出，相似的氨基酸用“”標(biāo)出。相似的氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。圖2為本發(fā)明的人hPKIγ與小鼠PKIγ(mPKIγ)、人PKIα(hPKIα)、和大鼠PKIβ(rPKIβ)等4種蛋白的氨基酸序列同源比較圖。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”標(biāo)出，相似的氨基酸用“*”標(biāo)出。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1人hPKIγ的cDNA序列的克隆和測(cè)定1．引物擴(kuò)增以人睪丸λgt10cDNA文庫(kù)(購(gòu)自Clontech公司)為模板，用一對(duì)寡核苷酸為引物——A5′—ACAGGCCTGAGGAGCGATGCAC—3′(SEQIDNO．1)為正向引物，寡核苷酸B5′—GGAGCTCAGAGAAGAGGCTGCTG—3′(SEQIDNO．2)為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的PCR片斷約為350bp的目的片段。2．PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑸鲜鯬CR擴(kuò)增產(chǎn)物A／B與pGEM—T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprepPlasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用SequiThermEXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(EpicentreTechnologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共354bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQIDNO3，其中開(kāi)放讀框位于28—258位核苷酸。根據(jù)得到的全長(zhǎng)基因組序列推導(dǎo)出人hPKIγ的氨基酸序列，共76個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見(jiàn)SEQIDNO4。實(shí)施例2同源比較用本發(fā)明的人hPKIγ的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白，在Non—redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Non—redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST程序進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在核苷酸水平上與小鼠的PKIγ(gb|U97170)有較高同源，同一性為86％以上。同源蛋白比較也支持此序列的正確，在氨基酸水平上hPKIγ推導(dǎo)蛋白氨基酸與小鼠的PKIγ同一性達(dá)91％，相似性達(dá)92％(人、小鼠兩者的PKIγ同源比較見(jiàn)圖1)。hPKIγ具有在PKIα和PKIβ中特異性保守的氨基酸殘基(Phe10，Arg15)(Glass，D．B．etal．J．Biol．Chem．2648802—8810)以及對(duì)PKI結(jié)合抑制作用重要的假底物位點(diǎn)(Arg18—Arg19—Asn20—Ala21)(Scott，J．D．etal．Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．824379—4383，1985)。另外，PKI能把C亞基定位于細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)表明，C—PKI復(fù)合物運(yùn)出核外時(shí)比C亞基單獨(dú)運(yùn)出時(shí)要快(Wen，W．etal．J．Biol．Chem．26932214—32220，1994)，在hPKIγ中存在一段與核遷出信號(hào)(nuclearexportsignal)“L37XL39XL41XXL44XHy46(X為任意氨基酸，Hy為疏水性氨基酸)”類(lèi)似的序列L38XG40XM42XXL45XL47，這段富含亮氨酸的序列在PKIα和PKIβ中也保守(人PKIγ和人PKIα、鼠PKIβ、鼠PKIγ的同源比較見(jiàn)圖2)。因此，hPKIγ具有cAMP依賴(lài)的蛋白激酶抑制因子的基本分子結(jié)構(gòu)，可能具有相似的抑制PKA的C亞基的功能。根據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)相似功能相關(guān)的生物學(xué)原理，可以根據(jù)已知的不同物種中的PKI基因及其編碼蛋白的功能來(lái)推測(cè)本發(fā)明hPKIγ的生物學(xué)功能。PKI能抑制PKA的活性。腦中C亞基的高水平反映出其作為許多神經(jīng)遞質(zhì)的第二信使的重要性。PKI同工體在腦中廣泛表達(dá)，在小鼠實(shí)驗(yàn)中，PKIα主要分布于小腦、下丘腦、海馬和皮層，且含量豐富，PKIβ則在大部分區(qū)域水平比PKIα低的多，但在腦橋、髓質(zhì)、下丘腦的細(xì)胞核及小腦中含量豐富(Seasholtz，A．F．etal．Prot．Natl．Acad．Sci．U．S．A．921734—1738，1995)。PKI還能運(yùn)輸C亞基。PKA全酶位于胞質(zhì)中，只有釋放后的C亞基才能進(jìn)入細(xì)胞核，這是激活PKA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵。而PKI能自由進(jìn)入細(xì)胞核，阻斷C亞基在核中的積累，將其運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)從而終止基因誘導(dǎo)，使C亞基與R亞基結(jié)合恢復(fù)為無(wú)活性的全酶參與下一輪依賴(lài)cAMP的細(xì)胞調(diào)節(jié)。這表明PKI在由cAMP參與的基因表達(dá)時(shí)序調(diào)節(jié)中發(fā)揮必要的作用(Wiley，J．C．Etal．J．Biol．Chem．2746381—6387，1997)。本發(fā)明hPKIγ可能有類(lèi)似的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。PKA在很多細(xì)胞的必要功能中發(fā)揮作用，例如基因激活、蛋白合成、DNA合成、有絲分裂。但PKA的特定功能研究卻由于無(wú)法降低胞內(nèi)基本PKA水平而受到阻礙。PKI的發(fā)現(xiàn)將有助于這方面的工作。將PKA的C亞基微量注射到大鼠胚胎成纖維細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)激酶水平的提高會(huì)引起細(xì)胞形狀和細(xì)胞骨架的巨大變化，這是由于蛋白磷酸化狀態(tài)的改變導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白微絲以及中間絲網(wǎng)的徹底重排(Lamb，N．J．etal．J．Cell．Biol．1061955—1971，1989；Lamb，N．J．etal．J．Cell．Biol．1082409—2423，1989)。而將純化的、修飾過(guò)的PKI微量注釋到細(xì)胞中，能阻止激酶激活后引起的細(xì)胞形狀和細(xì)胞骨架的變化，且修飾過(guò)的PKI的半衰期比未修飾的PKI長(zhǎng)5倍，非常穩(wěn)定(Fernandez，A．etalExp．Cell．Res．195468—477，1991)。本發(fā)明hPKIγ也能在體內(nèi)有效抑制PKA活性，是研究PKA體內(nèi)功能的一個(gè)強(qiáng)有力的工具。鼠PKIγ的克隆鑒定研究表明，PKIγ在心臟、骨骼肌、睪丸等組織廣泛高度表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中能有效抑制PKA的活性以及cAMP依賴(lài)的基因轉(zhuǎn)錄，還能抑制C亞基的核中積累。PKIγ的發(fā)現(xiàn)有助于解釋以前觀察到的PKI活力與PKImRNA水平之間的差異(Collins，S．P．etal．1997，J．Biol．Chem．27218169—18178)。本發(fā)明的人hPKIγ除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hPKIγ還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人hPKIγ的C端與小鼠PKIγ的C端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。針對(duì)本發(fā)明人hPKIγ的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。此外，本發(fā)明人hPKIγ核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hPKIγ的表達(dá)水平或者抑制人hPKIγ的過(guò)度表達(dá)。本發(fā)明的人hPKIγ蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hPKIγ缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。實(shí)施例3人hPKIγ在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A／B為模板，將編碼人hPKIγ的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人hPKIγcDNA作為插入片段。PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′—TCAAGTCGACATGATGGAGGTCGAGTCCT—3′(SEQIDNO．5)，該引物含有SalI限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的人hPKIγ編碼序列的19個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5′—TTGGAAGCTTTCAAGACGAGGTGGTCCC—3′(SEQIDNO．6)，該引物含有HindIII限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人hPKIγ的部分編碼序列。引物上的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE—9(QiagenInc．，Chatsworth，CA)上的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG—可調(diào)啟動(dòng)子／操縱子(P／O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6—組氨酸標(biāo)記物(6—His)以及限制性?xún)?nèi)切酶克隆位點(diǎn)。用SalI和HindIII消化pQE—9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE—9載體并保持開(kāi)放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購(gòu)自Qiagen，商品名為M15／rep4的E．coli菌株，M15／rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證人hPKIγ的cDNA片段已正確插入了載體。在補(bǔ)加Amp(100μg／ml)和Kan(25μg／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子克隆。過(guò)夜(O／N)培養(yǎng)物以1∶100—1∶250的稀釋率稀釋?zhuān)缓蠼臃N到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0．4—0．6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代—β—D—半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過(guò)使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P／O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3—4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過(guò)在能使含6—His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳—螯合柱層析從溶液中純化溶解的hPKIγ。用6M鹽酸胍(pH5．0)從柱中洗脫hPKIγ。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳—螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5．0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w／v)甘油的貯存液中。用12％的SDS—PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約8kDa。此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQIDNO．4的序列一致。實(shí)施例4人hPKIγ在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A／B為模板，將編碼人hPKIγ的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人hPKIγcDNA作為插入片段。PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′—TCAGAAGCTTATGATGGAGGTCGAGTCCT—3′(SEQIDNO．7)該引物含有HindIII限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的人hPKIγ編碼序列的17個(gè)核苷酸；3′端引物序列為5′—TTGGGGATCCTCAAGACGAGGTGGTCCC—3′(SEQIDNO．8)該引物含有BamHI限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人hPKIγ的部分編碼序列。引物上的限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P—CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。用HindIII和BamHI消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E．coliDH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(O／N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證人hPKIγ的cDNA片段已正確插入了載體。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBcoLife)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2—3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋?zhuān)x擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽(yáng)性亞克隆。48小時(shí)后，開(kāi)始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0．05％Triton的50mMTris·HCl(pH7．6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的SuperdexG—75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8．0)平衡的DEAE—Sepharose柱，以含0—1MNaCl的50mMTris·HCl(pH8．0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7．4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。用12％的SDS—PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為8kDa。此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQIDNO．4的序列一致。實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS—PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50—100μg／0．2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50—100μg／0．2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人hPKIγ基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生沉淀。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人復(fù)旦大學(xué)(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)人蛋白激酶抑制因子γ及其編碼序列、以及制法和用途(ⅲ)序列數(shù)目8(2)SEQIDNO．1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO．1ACAGGCCTGAGGAGCGATGCAC22(2)SEQIDNO．2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO2GGAGCTCAGAGAAGAGGCTGCTG23(2)SEQIDNO．3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度354bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型cDNA(ⅲ)序列描述SEQIDNO．3ACAGGCCTGAGGAGCGATGCACTAGGCATGATGGAGGTCGAGTCCTCCTACTCGGACTTC60ATCTCCTGTGACCGGACAGGCCGTCGGAATGCGGTCCCTGACATCCAGGGAGACTCAGAG120GCTGTGAGCGTGAGGAAGCTGGCTGGAGACATGGGCGAGCTGGCACTCGAGGGGGCAGAA180GGACAGGTGGAGGGAAGCGCCCCAGACAAGGAAGCTGGCAACCAGCCCCAGAGCAGCGAT240GGGACCACCTCGTCTTGAATCTGACCTTGTCCAAGAAGGCTGGACGAGAGACCTTCTGTC300CCCTCCCAGAGGGGAAACCCTGGCACTGGCCCAGCAGCCTCTTCTCTGAGCTCC354(2)SEQIDNO．4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度76個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO．4MetMetGluValGluSerSerTyrSerAspPheIleSerCysAsp15ArgThrGlyArgArgAsnAlaValProAspIleGlnGlyAspSer30GluAlaValSerValArgLysLeuAlaGlyAspMetGlyGluLeu45AlaLeuGluGlyAlaGluGlyGlnValGluGlySerAlaProAsp60LysGluAlaGlyAsnGlnProGlnSerSerAspGlyThrThrSer75Ser76(2)SEQIDNO．5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO．5TCAAGTCGACATGATGGAGGTCGAGTCCT29(2)SEQIDNO．6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類(lèi)型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO．6TTGGAAGCTTTCAAGACGAGGTGGTCCC28(2)SEQIDNO．7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO．7TCAGAAGCTTATGATGGAGGTCGAGTCCT29(2)SEQIDNO．8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO．8TTGGGGATCCTCAAGACGAGGTGGTCCC28權(quán)利要求1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hPKIγ蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列雜交。2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQIDNO．4所示的序列。3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列。4．一種分離的人hPKIγ蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNO．4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQIDNO．4序列的多肽。6．一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。8．一種產(chǎn)生具有人hPKIγ蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人hPKIγ蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hPKIγ蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO．3中從核苷酸28—258位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hPKIγ蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人hPKIγ蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人hPKIγ蛋白活性的多肽。9．一種能與權(quán)利要求4所述的人hPKIγ蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。10．一種探針?lè)肿?，其特征在于，它含有?quán)利要求1所述的DNA分子中8—100個(gè)連續(xù)核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供了人蛋白激酶抑制因子γ(humanProteinKinaseInhibitorγ,簡(jiǎn)稱(chēng)為“hPKIγ”)的cDNA序列,該蛋白是PKI家族的成員。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。文檔編號(hào)C12P21/02GK1278557SQ9910885公開(kāi)日2001年1月3日申請(qǐng)日期1999年6月22日優(yōu)先權(quán)日1999年6月22日發(fā)明者余龍,張宏來(lái),傅強(qiáng),趙勇,趙壽元申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)