專利名稱：生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的方法
本申請是申請?zhí)枮?4191435.6、申請日為1994年11月9日、發(fā)明名稱為“紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)方法以及獲得以高產(chǎn)量產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
本發(fā)明涉及適于用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治療劑的紫杉烷類雙萜(包括紫杉酚)的生產(chǎn)方法，以及獲得以高產(chǎn)量產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
紫杉醇適于用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治療劑，它是從短葉紫杉中分離后鑒定出的紫杉烷類雙萜，短紫杉是一種紫杉屬、紫杉科植物，并且具有與其活性相關(guān)的復(fù)合酯基。在短葉紫杉的植物體的所有部分中均可發(fā)現(xiàn)紫杉醇，但是據(jù)報(bào)道，樹皮中紫衫醇的含量超過了所有其它部分中的含量。目前，從天然的或培養(yǎng)的植物體中收集紫杉醇，但是紫杉屬植物生長緩慢，而且其生長至距地20cm需要10年以上，這還不算剝掉樹皮后樹會死亡，因此不易得到大量紫杉醇。如果能夠通過組織培養(yǎng)制備紫杉烷類雙萜如紫杉醇和作為紫杉醇前體的漿果赤霉素III，那么可以容易地獲得大量紫杉醇而不需要砍樹，因此是有利的。
作為通過利用培養(yǎng)的植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的常規(guī)方法，美國專利公開了利用培養(yǎng)的短葉紫杉的生產(chǎn)方法(US5,019,504)，但是，其中所述紫杉醇的產(chǎn)率為1-3mg/l，這不足以工業(yè)化生產(chǎn)。此外，通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇不穩(wěn)定，甚至當(dāng)可以通過選擇得到高生產(chǎn)率的初生細(xì)胞時(shí)，也難以通過傳代培養(yǎng)保持其含量[E.R.M.Wickremesine等，細(xì)胞與組織培養(yǎng)國際會儀(1992)]。
另一方面，作為紫杉醇生產(chǎn)的現(xiàn)有技術(shù)，Holton等的US5,015,744說明書中描述了由漿果赤霉素III(紫杉醇生物合成中的前體)開始的半合成方法。通過使用植物組織培養(yǎng)物，可以制備用于半合成方法的原料如漿果赤霉素III，因此該植物組織培養(yǎng)物也可以通過上述半合成方法用于生產(chǎn)紫杉醇。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供通過植物組織培養(yǎng)物生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的簡單方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供獲得以高產(chǎn)量產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。
本申請的第一個(gè)發(fā)明是生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的方法，其中在至少一種選自茉莉酮酸類化合物(jasmonic acids)、含重金屬的化合物、含重金屬的復(fù)合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯(antiethylene)劑的物質(zhì)存在下，培養(yǎng)產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞，然后從所得培養(yǎng)物中回收紫杉烷類雙萜。
本申請的第二個(gè)發(fā)明是生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的方法，其中通過自培養(yǎng)開始階段控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度低于大氣中氧的濃度，或者通過自培養(yǎng)開始階段控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解的氧濃度低于此溫度下飽和溶解的氧的濃度，對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后從所得培養(yǎng)物中回收紫杉烷類雙萜。
本申請的第三個(gè)發(fā)明是獲得以高產(chǎn)量產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物細(xì)胞因其比重不同而分成許多層，雙至少一層中的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后從培養(yǎng)細(xì)胞中選擇以高產(chǎn)量產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞。
下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明的紫杉烷類雙萜沒有具體限定為任何雙萜，只要它具有紫杉烷骨架即可，其說明性實(shí)例包括紫杉醇、7-表紫杉醇、漿果赤霉素III、7-表漿果赤霉素III、cephalomannine、7-epicephalomannine、10-脫乙?；鶟{果赤霉素III、10-脫乙?；鵦ephalomannine、10-脫乙酰基紫杉醇、taxagifine及其類似物、紫杉烷1a及其類似物、木糖基cephalomannine和木糖基紫杉醇等。
本發(fā)明用于生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的植物是例如紫杉屬，例如歐洲紫杉、東北紫杉、東北紫杉var.nana REHDER、短葉紫杉、加拿大紫杉、紅豆杉和米堤亞紫杉。
按照本申請的第一個(gè)發(fā)明，可以通過已知的方法進(jìn)行上述植物培養(yǎng)，只是要在至少一種下述物質(zhì)存在下培養(yǎng)產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞，這些物質(zhì)是茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的復(fù)合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑。
用于本申請第一個(gè)發(fā)明的茉莉酮酸類化合物的實(shí)例包括通式(I)所示的化合物 ，通式(II)所示的化合物 ，通式(III)所示的化合物 。
優(yōu)選的上述通式(I)所示的茉莉酮酸類化合物的實(shí)例包括通式(I′)所示化合物 ，優(yōu)選的上述通式(II)所示的茉莉酮酸類化合物的實(shí)例包括通式(II′)所示化合物 ，優(yōu)選的上述通式(III)所示的茉莉酮酸類化合物的實(shí)例包括通式(III′)所示化合物 。
在上述通式(I)、(II)和(III)中，以R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6、R6a、R7、R8或R9表示的具有1-6個(gè)碳原子的烷基的實(shí)例包括例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。
在上述通式(I)、(II)和(III)中，以R1a、R1b、R1c、R1d、R1e或R1f表示的具有1-6個(gè)碳原子的烷氧基的實(shí)例包括例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基和正己氧基。
當(dāng)R7是OM時(shí)，以M表示的堿金屬原子或堿土金屬原子的實(shí)例包括例如鈉、鉀和鈣。
當(dāng)R7是NHR8時(shí)，以R8表示的具有1-6個(gè)碳原子的?；梢允侵辨湹幕蛑ф湹?，其實(shí)例包括例如甲?；?、乙?；?、丙?；?、丁?；⑽祯；⒓乎；捅；?。
當(dāng)R7是NHR8時(shí)，以R8表示的氨基酸殘基的實(shí)例包括異亮氨酰基、酪氨?；蜕滨；?。
當(dāng)R7是OR9時(shí)，以R9表示的糖殘基的實(shí)例是吡喃葡糖基，并且當(dāng)上述通式(I)中的R6b是-O-糖殘基時(shí)，糖殘基的實(shí)例是吡喃葡糖基。
在上述通式(I)、(II)和(III)所示的化合物中，可以在五元環(huán)中相鄰的碳原子之間形成雙鍵。
通式(I)所示化合物的說明性實(shí)例包括下述化合物(化合物A)
(化合物B)
(化合物C)
(化合物D)
通式(II)所示化合物的說明性實(shí)例包括下述化合物(化合物E)
(化合物F)
(化合物G)
(化合物H)
通式(III)所示化合物的說明性實(shí)例包括下述化合物(化合物I)R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6HC3與C4之間形成雙鍵R7-OH或-OCH3n1-3(化合物J)R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5、R6HR7-OHn1。
其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e或R1f是羥基或者在五元環(huán)中的相鄰碳原子之間形成雙鍵的通式(III)所示化合物的說明性實(shí)例包括下述化合物(化合物K)
(1)n＝1，R＝H(2)n＝7，R＝H(3)n＝7，R＝OH(化合物L(fēng))
(1)R＝H(2)R＝OH(化合物M)
(化合物N)
通式(I)、(II)或(III)所示化合物的優(yōu)選實(shí)例包括其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6是氫原子，R7是羥基或甲氧基，由C1-C2-C3-C4-C5-C6組成的側(cè)鏈不含雙鍵或者在C1與C2、C2與C3或C3與C4之間含有一個(gè)雙鍵的化合物。
用于本發(fā)明的以通式(I)、(II)或(III)表示的茉莉酮酸類化合物具有各種立體異構(gòu)體(順-反異構(gòu)體和旋光異構(gòu)體)，每個(gè)異構(gòu)體可以單獨(dú)使用或者以混合物的形式使用。
上述所有的茉莉酮酸類化合物都可以改善紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)率，但是，從其高效改善生產(chǎn)率的角度出發(fā)，特別優(yōu)選的是塊根油酮酸(tuberonic acid)、塊根油酮酸甲酯(methyl tuberonate)、南瓜子酸(cucurbic acid)、南瓜子酸甲酯(methyl cucurbate)、茉莉酮酸和茉莉酮酸甲酯(它們是其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6是氫原子，R7是羥基或甲氧基，n是1，且在C3與C4之間形成雙鍵的通式(I)、(II)或(III)所示的化合物)。
這些茉莉酮酸類化合物是通過合成或者提取等方法從植物中產(chǎn)生的(H.Yamane等，Agric.Biol.Chem.，44，2857-2864(1980))。
附帶說一下，有關(guān)于各種植物本身以植物激素類物質(zhì)的形式產(chǎn)生茉莉酮酸類化合物的說明，所述植物激素類物質(zhì)可引起各種與生長促進(jìn)、組織成熟和表現(xiàn)為抵抗疾病有關(guān)的各種反應(yīng)(TeruhikoYoshihara.Shokubutsu Saibo Kogaku，Vol 2，No.4 523-531(1990))。
因此，本發(fā)明所涉及的茉莉酮酸類化合物不僅能從培養(yǎng)體系的外部加入，也可以由培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)組織自身產(chǎn)生。促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)組織產(chǎn)生這種內(nèi)源性茉莉酮酸類化合物的方法的實(shí)例包括向培養(yǎng)基中加入微生物培養(yǎng)物、其提取物或其熱處理的物質(zhì)或者植物提取物，這種方法的說明性實(shí)例是加入真菌細(xì)胞壁部分，參見M.J.Mueller等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.，90(16)，7490-9494(1993))。通過用機(jī)械方法或者用紫外線處理或加熱的方法部分損傷培養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)組織，也可以增加內(nèi)源性茉莉酮酸類化合物的產(chǎn)量，這種方法的一個(gè)說明性實(shí)例是將一部分細(xì)胞機(jī)械破碎(R.A.Cleeman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89(11)，4938-4941(1989))。
由于茉莉酮酸類化合物難溶于水，因此通常將其溶于有機(jī)溶劑如乙醇和甲醇中，或者將其溶于表面活性劑等中，然后加至培養(yǎng)基中?？梢允褂糜坞x形式的茉莉酮酸類化合物本身，或者使用其用堿中和的鹽的形式。
在茉莉酮酸類化合物中，以通式(I)或(III)表示的化合物中傾向于以穩(wěn)定的反式而非不穩(wěn)定的順式形式存在，因?yàn)橥ㄟ^酸、堿或加熱可在五元環(huán)中羰基的α-位發(fā)生差向異構(gòu)作用。在使用天然或合成茉莉酮酸類化合物的平衡試驗(yàn)中，反式茉莉酮酸類化合物以90％的比例存在，而順式茉莉酮酸類化合物以10％的比例存在。一般認(rèn)為順式茉酮酸類化合物具有更高的活性。但是，本發(fā)明所用的茉莉酮酸類化合物包括上述式(I)或(III)所示化合物的所有立體異構(gòu)體及其混合物。
培養(yǎng)基中茉莉酮酸類化合物的濃度需要為0.01-1000μM，并且按照本申請的第一個(gè)發(fā)明，特別優(yōu)選的是控制茉莉酮酸類化合物的濃度為0.1-500μM。
在DE 4122208 C1中描述了通過向植物細(xì)胞培養(yǎng)物中加入茉莉酮酸類化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生某些次級代謝產(chǎn)物，但是，未見有關(guān)在茉莉酮酸類化合物作為培養(yǎng)基添加劑存在下對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道，而且出乎所有預(yù)料的是通過本申請第一個(gè)發(fā)明的方法增加了紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量，這里紫杉烷類雙萜與上述專利中所述次級代謝產(chǎn)物具有完全不同的生物合成途徑或生物合成控制機(jī)理。
在國際專利公開WO 93/17121中描述了茉莉酮或甲基茉莉酮可以有效地誘導(dǎo)紫杉醇產(chǎn)生，這里所述的茉莉酮或甲基茉莉酮具有與式(I)、(II)或(III)所示茉莉酮酸類化合物相似的結(jié)構(gòu)。但是這些化合物不象茉莉酮酸類化合物那樣具有式(I)、(II)或(III)中由式-(CH2)n-CO-R7所示的基團(tuán)例如羧基，而且發(fā)現(xiàn)這些化合物的紫杉醇誘導(dǎo)活性很低(參見比較實(shí)施例24)。
用于本申請第一個(gè)發(fā)明的重金屬沒有特別限定為任何重金屬，只要其屬于銅或鐵族即可，但是作為銅族的金屬，特別優(yōu)選使用銀，作為鐵族的金屬，特別優(yōu)選使用鈷。除此之外，當(dāng)使用銀或鈷時(shí)，優(yōu)選以含有所述重金屬的化合物、含有所述金屬的復(fù)合離子形式或以所述金屬離子的形式使用。這些化合物可以單獨(dú)使用或者結(jié)合使用。
含銀化合物的說明性實(shí)例包括硝酸銀、硫酸銀、氟化銀、氯酸銀、高氯酸銀、醋酸銀、亞硫酸銀、六氟磷酸銀(V)、四氟硼酸銀、硫酸雙胺合銀(I)和二氨基合銀酸(I)鉀(potassium diaminoargentate)等。其中，可以列舉的特別優(yōu)選的化合物是硝酸銀和硫酸銀等。
含銀復(fù)合離子的說明性實(shí)例包括[Ag(S2O3)2]3-、[Ag(S2O3)3]5-、[Ag(NH3)2]+、[Ag(CN)2]-、[Ag(CN)3]2-、[Ag(SCN)2]-和[Ag(SCN)4]3-等。其中，可以列舉的特別優(yōu)選的復(fù)合離子是[Ag(S2O3)2]3-和[Ag(S2O3)3]5-等。
含鈷化合物的說明性實(shí)例包括氯化鈷、硝酸鈷、硫酸鈷、氟化鈷、高氯酸鈷、溴化鈷、碘化鈷、硒酸鈷、硫氰酸鈷、醋酸鈷、硫酸鈷銨、硫酸鈷(II)鉀、氯化六胺合鈷(III)、氯化五胺合鈷(III)、氯化硝基五胺合鈷(III)、氯化二氯四胺合鈷(III)半水合物、氯化二硝基四胺合鈷(III)、氯化碳酸根四胺合鈷(III)、四硝基二胺合鈷酸(III)銨、六硝基合鈷酸(III)鈉、氯化三(乙二胺)合鈷(III)三水合物、氯化二氯二(乙二胺)合鈷(III)、三(草酸根)合鈷酸(III)鉀三水合物、六氰基合鈷酸(III)鉀、(乙二胺四乙酸根)合鈷酸(III)鉀二水合物、氫四羰基合鈷(I)、二羰基(環(huán)戊二烯基)合鈷(I)、八羰基合二鈷(O)、六羰基乙炔合二鈷(O)、二(環(huán)戊二烯基)合鈷(I)和(環(huán)戊二烯基)(1，5-環(huán)辛二烯)合鈷(I)等。
含鈷復(fù)合離子的說明性實(shí)例包括五胺水合(aqua)鈷離子、硝基五胺合鈷離子、二氯四胺合鈷離子、二硝基四胺合鈷離子、碳酸根四胺合鈷離子、四硝基二胺合鈷離子、六硝基合鈷離子、三(乙二胺)合鈷離子、二氯二(乙二胺)合鈷離子、三(草酸根)合鈷離子、六氰基合鈷離子和(乙二胺四乙酸根)合鈷離子等。
在所述重金屬中，含銀化合物、含銀復(fù)合離子或銀離子在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為10-8M-10-1M，進(jìn)一步優(yōu)選的濃度為10-7M-10-2M。含鈷化合物、含鈷復(fù)合離子或鈷離子在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為10-6M-10-1M，進(jìn)一步優(yōu)選的濃度為10-5M-10-2M。
迄今為止，未見有關(guān)在含銀化合物、含銀復(fù)合離子或銀離子作為培養(yǎng)基添加劑存在下對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道。盡管在通常用作紫杉屬植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基(例如linsmaier-Skoog培養(yǎng)基。Murashige-Skoog培養(yǎng)基和Gamborg’s B-5培養(yǎng)基)中包括作為培養(yǎng)基成分之一的含鈷化合物或鈷離子，但是其使用濃度為1×10-7M-4×10-7M[Growth and breeding of a woody plant，由thelatest biotechnology complete works editors committee編輯，NogyoTosho，第265-268頁]，這遠(yuǎn)低于本發(fā)明方法所用的濃度。同時(shí)，象上述銀化合物的情況一樣，未見有關(guān)在本申請第一個(gè)發(fā)明中所用的高濃度的含鈷化合物或鈷離子存在下對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道。此外，出乎所有預(yù)料的是通過在這些重金屬存在下進(jìn)行培養(yǎng)，增加了紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。
按照本申請的第一個(gè)發(fā)明，術(shù)語“胺類”是指胺或其鹽。作為用于本申請第一個(gè)發(fā)明的胺類，可以使用單胺類或多胺類，但是，特別優(yōu)選使用多胺類。
此外，用于本申請第一個(gè)發(fā)明的胺類的實(shí)例包括單-、二-或三烷基胺，其中烷基的部分氫原子可以被羥基取代，例如甲胺、乙胺、二甲胺、二乙胺、三乙胺、二乙醇胺、三乙醇胺或其鹽；多亞甲基二胺，其中多亞甲基部分可以被亞氨基中斷，并且氨基中的氫可以被低級烷基取代，例如腐胺、尸胺、亞精胺、精胺、乙二胺、N，N-二乙基-1，3-丙二胺、三亞乙基四胺或其鹽；環(huán)烷胺例如環(huán)戊胺、環(huán)己胺或其鹽；或環(huán)胺如六亞甲基四胺和哌嗪或其鹽。在這些胺中，可以列舉的優(yōu)選的胺是多胺如腐胺[NH2(CH2)4NH2]、尸胺[NH2(CH2)5NH2]、亞精胺[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2]、精胺[NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2]、乙二胺[NH2(CH2)2NH2]、N，N-二乙基-1，3-丙二胺[(C2H5)2N(CH2)3NH2]、二亞乙基三胺[NH2(CH2)2NH(CH2)2NH2]等或其鹽。
所述胺在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為10-8M-10-1M，進(jìn)一步優(yōu)選的濃度為10-7M-10-2M。
通過向植物組織培養(yǎng)物中加入胺誘導(dǎo)產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的一個(gè)說明性實(shí)例可見于日本專利公開4-262788，其中通過向長春化的培養(yǎng)細(xì)胞中加入胺誘導(dǎo)了吲哚生物堿的產(chǎn)生。但是，未見有關(guān)在胺作為培養(yǎng)基添加劑存在下對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物(這是與長春花不同種的植物)進(jìn)行組織培養(yǎng)的報(bào)道，并且出乎所有預(yù)料的是，由此可以增加紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量，這里紫杉烷類雙萜與吲哚生物堿具有完全不同的生物合成途徑。
用于本申請第一個(gè)發(fā)明的抗乙烯劑沒有特別限定為任何具體的物質(zhì)，只要它是抑制培養(yǎng)物的乙烯生物合成機(jī)理的物質(zhì)和/或去除培養(yǎng)物中保留的乙烯或者去除在含培養(yǎng)物的培養(yǎng)瓶中于氣相中或培養(yǎng)基中存在的乙烯的物質(zhì)即可。
抑制乙烯生物合成機(jī)理的方法的說明性實(shí)例包括如下抑制將S-腺苷甲硫氨酸催化轉(zhuǎn)化為1-氨基環(huán)丙烷-1-甲酸的酶的活性的方法和抑制將1-氨基環(huán)丙烷-1-甲酸催化轉(zhuǎn)化為乙烯的酶的活性的方法，具有前一功能的化合物的說明性實(shí)例包括氨基羥乙酸(aminoxyaceticacid)、乙酰水楊酸、Rhizobitoxine、氨基乙氧基乙烯基甘氨酸、甲氧基乙烯基甘氨酸、α-氨基異丁酸和2，4-二硝基苯酚等。還可以包括所述化合物的鹽、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物。
鹽的說明性實(shí)例包括鈉、鉀、鈣和鎂鹽；酯的說明性實(shí)例包括甲酯、乙酯、丙酯和丁酯；氨基酸衍生物的說明性實(shí)例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的說明性實(shí)例包括葡萄糖和麥芽糖衍生物。本發(fā)明的鹽、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物不僅僅限于上述化合物。
具有后一功能的化合物的說明性實(shí)例包括五倍子酸、其鹽、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物[Hiroshi Hyodo，Society of HorticultureAutumn Convention 1987 Symposium Summary，p.122，SusumuKuraishi，Phytohormone，Tokyo University Publication，p.111]。
鹽的說明性實(shí)例包括鈉、鉀、鈣和鎂鹽；酯的說明性實(shí)例包括甲酯、乙酯、丙酯和丁酯；氨基酸衍生物的說明性實(shí)例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的說明性實(shí)例包括葡萄糖和麥芽糖衍生物。本發(fā)明的鹽、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物不僅僅限于上述化合物。
去除培養(yǎng)物中保留的乙烯或者去除在含培養(yǎng)物的培養(yǎng)瓶中于氣相中或培養(yǎng)基中存在的乙烯的物質(zhì)的說明性實(shí)例包括1，5-環(huán)辛二烯和異硫氰酸及其鹽、酯(例如異硫氰酸烯丙酯和異硫氰酸芐酯)、氨基酸衍生物和糖衍生物[Megumi Mumakata，Chemical control in plants，29(1)，89-93(1994)]。
鹽的說明性實(shí)例包括鈉、鉀、鈣和鎂鹽；酯的說明性實(shí)例包括甲酯、乙酯、丙酯、丁酯和烯丙酯；氨基酸衍生的說明性實(shí)例包括甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸衍生物；糖衍生物的說明性實(shí)例包括葡萄糖和麥芽糖衍生物。本發(fā)明的鹽、酯、氨基酸衍生物和糖衍生物不僅僅限于上述化合物。
抗乙烯劑在培養(yǎng)基中的所需濃度為10-8M-10-1M，特別優(yōu)選的是控制抗乙烯劑的濃度為10-7M-10-2M。
已知乙烯是一種植物激素，參與許多植物中出現(xiàn)的各種生理現(xiàn)象，例如個(gè)體生長、形態(tài)發(fā)生和老化。Kim，Dong II等在Biotechnol.Bioeng.，38(4)，331-339(1991)中報(bào)道了一個(gè)利用乙烯提高植物次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)率的說明性實(shí)例。但是，正如上述報(bào)道中通常表明的那樣，在所有利用控制乙烯來提高次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)率的實(shí)例中，都是控制對植物組織培養(yǎng)物補(bǔ)充乙烯，而迄今為止，未見有關(guān)象本發(fā)明方法一樣利用對抑制乙烯產(chǎn)生的控制來改善次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的報(bào)道。
此外，抗乙烯劑一般用作花、水果和蔬菜的保鮮劑，而未見有關(guān)將抗乙烯劑用于改善次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的報(bào)道。
在這種情況下，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，乙烯通過產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織和細(xì)胞大大抑制了紫杉烷類雙萜的產(chǎn)生。因此，基于上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人在抗乙烯劑存在下對所述組織培養(yǎng)物進(jìn)行了培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗乙烯劑不僅控制了上述抑制作用，而且還明顯提高了從培養(yǎng)物中獲得紫杉烷類雙萜的量。到目前為止，未見有關(guān)通過在抗乙烯劑存在下培養(yǎng)產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織培養(yǎng)物誘導(dǎo)紫杉烷類雙萜產(chǎn)生的報(bào)道，并且出乎所有預(yù)料的是上述次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)率甚至可以通過本申請第一個(gè)發(fā)明的方法得以提高。
用于本申請第一個(gè)發(fā)明的培養(yǎng)基的實(shí)例包括植物組織培養(yǎng)慣用的那些已知培養(yǎng)基，例如Murashige & Skoog培養(yǎng)基(1962)、linsmaier& Skoog培養(yǎng)基(1965)、木本植物培養(yǎng)基(1981)、Gamborg’s B-5培養(yǎng)基和Mitsui’s M-9培養(yǎng)基。
植物激素，以及如果需要，碳源、無機(jī)成分、維生素、氨基酸等也可以加入這些培養(yǎng)基中。
作為碳源，可以使用二糖如蔗糖、麥芽糖和乳糖，單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，淀粉或者以適當(dāng)比例混合的兩種或更多種這些糖源的混合物。
無機(jī)成分的說明性實(shí)例包括磷、氮、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯、鈉、碘和鈷，這些成分可以以化合物的形式加入，例如硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、氯化鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅、鉬酸鈉、三氧化鉬、碘化鉀和氯化鈷等。
作為植物激素，可以使用例如植物生長素如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及細(xì)胞激動素如激動素、玉米素和二氫玉米素。
作為維生素，可以使用例如生物素、硫胺(維生素B1)、吡哆素(維生素B6)、泛酸、肌醇和煙酸等。
作為氨基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸等。
一般來說，碳源的使用濃度約為1-30g/l，無機(jī)成分的使用濃度約為0.1μM-100mM，植物激素的使用濃度約為0.01-10μM，而維生物和氨基酸的使用濃度分別為約0.01-100mg/l。
按照本發(fā)明，液體培養(yǎng)基和通常含有0.1-1％瓊脂和gelan膠的固體培養(yǎng)基都可以使用，但是，一般優(yōu)選使用液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明的組織培養(yǎng)可以使用所述植物的一部分根的組織或細(xì)胞、生長點(diǎn)、葉、莖、種子、花粉、花藥及花萼等，或者使用在上述培養(yǎng)基或其它常用培養(yǎng)基中通過其組織培養(yǎng)得到的培養(yǎng)細(xì)胞。
本發(fā)明還可以用于通過用根瘤土壤桿菌或發(fā)根病土壤桿菌感染植物獲得的贅生性細(xì)胞/或發(fā)根。
通過在至少一種選自茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的復(fù)合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑的物質(zhì)存在下對這些組織和細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以得到比在一般培養(yǎng)條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)所得到的培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細(xì)胞具有更高紫杉烷類雙萜生產(chǎn)率的培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細(xì)胞。
當(dāng)至少一種選自含重金屬的化合物、含重金屬的復(fù)合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑的物質(zhì)與上述通式(I)、(II)或(III)所示的茉莉酮酸類化合物一起使用時(shí)，本申請第一個(gè)發(fā)明的作用得以加強(qiáng)。
通過用有機(jī)溶劑如甲醇萃取，可以從培養(yǎng)物例如按照上述方法獲得的培養(yǎng)組織、培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基中分離出紫杉烷類雙萜。通過使合適的吸附劑或有機(jī)溶劑共存于培養(yǎng)基中，還可以在培養(yǎng)過程中連續(xù)回收紫杉烷類雙萜。
對本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的組織培養(yǎng)實(shí)例可以進(jìn)行如下說明。
將一片紫杉屬植物的植物體，例如根、生長點(diǎn)、葉、莖、和種子等滅菌，置于用gelan膠固化的木本植物培養(yǎng)基中，于10-35℃保持約14-60天，這樣一部分組織碎片就變成了愈傷組織。通過將如此得到的愈傷組織傳代培養(yǎng)，生長速度逐漸增加，并且得到穩(wěn)定的愈傷組織。術(shù)語穩(wěn)定的愈傷組織是指在培養(yǎng)過程中保持愈傷組織狀態(tài)而沒有分化成莖葉或根，并且它的細(xì)胞生長速度均勻的愈傷組織。
將這種穩(wěn)定的愈傷組織轉(zhuǎn)入適于生長的液體培養(yǎng)基例如液體木本植物培養(yǎng)基中，并使其生長。在液體培養(yǎng)基中生長速度進(jìn)一步增加。按照本發(fā)明，使穩(wěn)定的愈傷組織或構(gòu)成上述愈傷組織的細(xì)胞在至少一種選自茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的復(fù)合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑的物質(zhì)存在下，于固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中生長。而且，還可以根據(jù)穩(wěn)定的愈傷組織或構(gòu)成所述愈傷組織的細(xì)胞的比重的不同將其分成多層，并且使至少一層中所含有的細(xì)胞在含有至少一種選自茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的復(fù)合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑的物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長。
在一般的按其比重將細(xì)胞分層的已知方法中，由用于離心分離的培養(yǎng)基形成密度梯度，將細(xì)胞在其上分層，然后進(jìn)行離心分離。
作為離心分離用的培養(yǎng)基，可以使用Ficoll、Percoll(均由Pharmacia LKB Biotechnology Co.Ltd.生產(chǎn))、蔗糖和氯化銫等。在包括實(shí)施例5在內(nèi)的實(shí)施例中，通過使用Ficoll產(chǎn)生密度梯度，培養(yǎng)基沒有特別限定為任何物質(zhì)，只要其不損傷細(xì)胞即可。
形成密度梯度的層數(shù)沒有別限定。對各層的比重之差沒有具體限制，而且各層的比重之差可以相同或不同。
因此，密度梯度的定義包括其中梯度連續(xù)變化的情況(即其中形成密度梯度的層數(shù)接近于無窮大，而且各層間的比重差接近于0)。
通過如此形成密度梯度、使細(xì)胞分層和進(jìn)行離分分離，可以按其比重的差別將細(xì)胞分成多層。
所形成的層的比重一般為1.00-1.20g/ml、優(yōu)選1.03-1.11g/ml。作為用于培養(yǎng)的層，至少選擇一層，但是也可以選擇所有的層，并對其進(jìn)行培養(yǎng)。
當(dāng)選擇了多層并對所選層中所含的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以將細(xì)胞在各層中分別培養(yǎng)，但是，也可以將所選多層的兩層或更多層中的細(xì)胞混合并進(jìn)行培養(yǎng)。
通過培養(yǎng)比重為1.07或更低的層中所含的細(xì)胞，一般可以得到具有高紫杉烷類雙萜生產(chǎn)率的培養(yǎng)細(xì)胞，但是也不總是限定在這樣的比重范圍內(nèi)，因?yàn)楸戎貢S所培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)條件而波動。還有一種趨勢，就是當(dāng)按比重差異進(jìn)行分層時(shí)，較高比重層中的細(xì)胞具有較高的紫杉烷類雙萜含量。因此，為了確?？梢缘玫揭愿弋a(chǎn)量生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞，需要將分配在所有層中的細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，然后測定各層細(xì)胞中紫杉烷類雙萜的濃度，并從這些層中選擇含有以高產(chǎn)量生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞的層。
通過制備具有特定比重(如1.07g/ml)的離心分離用培養(yǎng)基并按上述方法進(jìn)行離心分離，也可以按比重的差異將細(xì)胞分成多層。
再者，本申請第一個(gè)發(fā)明可以與本申請第二個(gè)發(fā)明一起使用，其中通過自培養(yǎng)的開始階段控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度低于大氣中氧的濃度、或者通過自培養(yǎng)的開始階段控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度低于在同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，進(jìn)行培養(yǎng)。
在這里，術(shù)語“培養(yǎng)的開始階段”是指從開始培養(yǎng)至培養(yǎng)開始后的第7天這一段時(shí)間，而控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度或者控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度優(yōu)選從培養(yǎng)開始時(shí)進(jìn)行。控制時(shí)間沒有特別的限制，并且在所述條件下的控制可以在整個(gè)培養(yǎng)期間進(jìn)行，或者只是在整個(gè)培養(yǎng)期間的一部分時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，但是優(yōu)選在整個(gè)培養(yǎng)期間至少控制3天。
培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度需要控制在4-15％、特別優(yōu)選控制在6-12％。液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度需要控制在于同樣溫度下飽和溶解氧濃度的1-75％、特別優(yōu)選控制在10-75％。
還可以將本申請的第一個(gè)發(fā)明、本申請的第二個(gè)發(fā)明與本中請的第三個(gè)發(fā)明全部結(jié)合在一起。
按照本申請的第一個(gè)發(fā)明，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞處于指數(shù)生長期或平穩(wěn)期時(shí)加入茉莉酮酸類化合物是有效的，并且特別優(yōu)選在從指數(shù)生長期至平穩(wěn)期的過渡階段中加入茉莉酮酸類化合物。同樣可以述及的是旨在增加內(nèi)源性茉莉酮酸類化合物產(chǎn)量的處理時(shí)間。例如，當(dāng)對細(xì)胞進(jìn)行各為21天的傳代培養(yǎng)時(shí)，第7-16天是加入茉莉酮酸類化合物或者進(jìn)行處理以增加內(nèi)源性茉莉酮酸類化合物產(chǎn)量的適宜時(shí)間，而且當(dāng)細(xì)胞在指數(shù)生長期、例如在7-14天進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，適宜的時(shí)間是移植后的當(dāng)即。加入茉莉酮酸類化合物或者進(jìn)行處理以增加內(nèi)源性茉莉酮酸類化合物產(chǎn)量可以一次性、分多次或連續(xù)進(jìn)行。
在培養(yǎng)開始后以及在培養(yǎng)細(xì)胞從指數(shù)生長期至平穩(wěn)期的過渡階段前加入含重金屬的化合物、含重金屬的復(fù)合離子或重金屬離子是有效的，特別優(yōu)選在培養(yǎng)開始時(shí)加入。所述化合物或離子的加入可以一次性或分多次進(jìn)行。
在細(xì)胞從指數(shù)生長期至平穩(wěn)期的過渡階段前加入胺是有效的，特別優(yōu)選在培養(yǎng)開始時(shí)加入。所述化合物的加入可以一次性或分多次進(jìn)行。
在細(xì)胞從指數(shù)生長期至平穩(wěn)期的過渡階段前加入抗乙烯劑是有效的，特別優(yōu)選在過渡到平穩(wěn)期后立即加入。所述化合物的加入可以一次性或分多次進(jìn)行。
本申請第一個(gè)發(fā)明的組織培養(yǎng)溫度一般為約10-35℃，根據(jù)高生長速度，優(yōu)選約23-28℃。培養(yǎng)周期優(yōu)選為14-42天。
當(dāng)液體培養(yǎng)基用于本申請第一個(gè)發(fā)明的培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)完成后可以通過例如傾析或過濾等方法從培養(yǎng)基中分離出培養(yǎng)細(xì)胞，并且通過例如用有機(jī)溶劑萃取等方法，可以從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離出所需的紫杉烷類雙萜。
下面說明本申請的第二個(gè)發(fā)明。
按照本申請的第二個(gè)發(fā)明，培養(yǎng)植物是指培養(yǎng)植物的組織或細(xì)胞，其中按常規(guī)的已知方法進(jìn)行培養(yǎng)，不同的是自培養(yǎng)的開始階段通過控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度低于大氣中氧的濃度、或者自培養(yǎng)的開始階段通過控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度低于在同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，進(jìn)行培養(yǎng)。
迄今為止，在生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的植物的培養(yǎng)中，未見有關(guān)在如此條件下進(jìn)行培養(yǎng)的報(bào)道，所述條件是補(bǔ)充給進(jìn)行組織或細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶的氣相氧的濃度或者與組織或細(xì)胞接觸的培養(yǎng)基中溶解氧的濃度低于大氣中氧的濃度或者低于飽和溶解的氧濃度，并且出乎所有預(yù)料的是由此增加了紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。
按照本申請的第二個(gè)發(fā)明，進(jìn)行組織或細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度需要控制在4-15％、特別優(yōu)選控制在6-12％。與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度需要控制在同樣溫度下飽和溶解氧濃度的1-75％、特別優(yōu)選控制在10-75％。
用于本申請第二個(gè)發(fā)明的培養(yǎng)基的實(shí)例包括植物組織培養(yǎng)慣用的那些已知培養(yǎng)基，例如Murashige & Skoog培養(yǎng)基(1962)、Linsmaier& Skoog培養(yǎng)基(1965)、木本植物培養(yǎng)基(1981)、Gamborg’s B-5培養(yǎng)基Mitsui’s M-9培養(yǎng)基等。
植物激素，以及如果需要，碳源、無機(jī)成分、維生素、氨基酸等也可以加入這些培養(yǎng)基中。
作為碳源，可以使用二糖如蔗糖、麥芽糖和乳糖，單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，淀粉或者以適當(dāng)比例混合的兩種或更多種這些糖源的混合物。
無機(jī)成分的說明性實(shí)例包括磷、氮、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯、鈉、碘和鈷，這些成分可以以化合物的形式加入，例如硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、氯化鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅、鉬酸鈉、三氧化鉬、碘化鉀和氯化鈷等。
作為植物激素，可以使用例如植物生長素如吲哚乙酸(LAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及細(xì)胞激素如激動素、玉米素和二氫玉米素。
作為維生素，可以使用例如生物素、硫胺(維生素B1)、吡哆素(維生素B6)、泛酸、肌醇和煙酸等。
作為氨基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸等。
一般來說，碳源的使用濃度約為1-30g/l，無機(jī)成分的使用濃度約為0.1μM-100mM，植物激素的使用濃度約為0.01-10μM，而維生物和氨基酸的使用濃度分別為約0.01-100mg/l。
按照本申請的第二個(gè)發(fā)明，液體培養(yǎng)基和通常含有0.1-1％瓊脂和gelan膠的固體培養(yǎng)基都可以使用。
本申請第二個(gè)發(fā)明的組織培養(yǎng)可以使用所述植物根的組織碎片或細(xì)胞、生長點(diǎn)、葉、莖、種子、花粉、花藥及花萼等，或者使用在上述培養(yǎng)基或其它常用培養(yǎng)基中通過其組織培養(yǎng)得到的培養(yǎng)細(xì)胞。
本申請第二個(gè)發(fā)明還可以用于通過用根瘤土壤桿菌或發(fā)根病土壤桿菌感染植物獲得的贅生性細(xì)胞/或發(fā)根。
當(dāng)自培養(yǎng)的開始階段通過控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度低于大氣中氧的濃度、或者自培養(yǎng)的開始階段通過控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度低于同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，對這些組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以得到比一般培養(yǎng)條件下進(jìn)行組織培養(yǎng)所得到的培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細(xì)胞具有更高紫杉烷類雙萜生產(chǎn)率的培養(yǎng)組織或培養(yǎng)細(xì)胞。
按照本申請的第二個(gè)發(fā)明，“培養(yǎng)的開始階段”是指從開始培養(yǎng)至培養(yǎng)開始后的第7天這一段時(shí)間，而控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度、或者控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度優(yōu)選從培養(yǎng)開始時(shí)進(jìn)行。
控制時(shí)間沒有特別的限制，并且在所述條件下的控制可以在整個(gè)培養(yǎng)期間進(jìn)行，或者只是在整個(gè)培養(yǎng)期間的一部分時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，但是優(yōu)選在整個(gè)培養(yǎng)期間至少控制3天。
可以將本申請第二個(gè)發(fā)明的制備方法與在各種紫杉烷類雙萜生產(chǎn)促進(jìn)物質(zhì)存在下進(jìn)行的培養(yǎng)方法一起使用，以進(jìn)一步提高紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)率。
紫杉烷類雙萜生產(chǎn)促進(jìn)物質(zhì)的實(shí)例包括例如用于上述本申請第一個(gè)發(fā)明的、上述通式(I)、(II)或(III)所示的茉莉酮酸類化合物、含重金屬的化合物、含重金屬的復(fù)合離子、重金屬離子、胺和抗乙烯劑。
還可以將申請的第二個(gè)發(fā)明與下面將要詳述的本申請的第三個(gè)發(fā)明一起使用，其中按照其比重的差異將細(xì)胞分配于多層中，并且對至少一層中所含的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
可以將本申請第二個(gè)發(fā)明的制備方法與所述本申請第一個(gè)發(fā)明的方法(其中在茉莉酮酸類化合物等存在下進(jìn)行培養(yǎng))以及本申請第三個(gè)發(fā)明的方法(其中按照其比重的差異將細(xì)胞分配于多層中，并且對至少一層中所含的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng))一起使用。
通過用有機(jī)溶劑如甲醇萃取，可以從培養(yǎng)物例如按照上述方法獲得的培養(yǎng)組織、培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基中分離出紫杉烷類雙萜。
對本申請第二個(gè)發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的組織培養(yǎng)實(shí)例可以進(jìn)行如下說明。
將一片紫杉屬植物的植物體，例如根、生長點(diǎn)、葉、莖、和種子等滅菌，置于用gelan膠固化的木本植物培養(yǎng)基中，于10-35℃保持約14-60天，這樣一部分組織碎片就變成了愈傷組織。通過將如此得到的愈傷組織傳代培養(yǎng)，生長速度逐漸增加，并且得到穩(wěn)定的愈傷組織。術(shù)語穩(wěn)定的愈傷組織是指在培養(yǎng)過程中保持愈傷組織狀態(tài)而沒有分化成莖葉或根，并且它的細(xì)胞生長速度均勻的愈傷組織。
將這種穩(wěn)定的愈傷組織轉(zhuǎn)入適于生長的液體培養(yǎng)基例如液體木本植物培養(yǎng)基中，并使其生長。在液體培養(yǎng)基中生長速度進(jìn)一步增加。按照本發(fā)明，使穩(wěn)定的愈傷組織或構(gòu)成上述愈傷組織的細(xì)胞在下述培養(yǎng)條件下生長，其中自培養(yǎng)的開始階段控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度低于大氣中氧的濃度、或者自培養(yǎng)的開始階段控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度低于同樣溫度下飽和溶解的氧濃度。
通過消耗氧(呼吸作用)，組織或細(xì)胞獲得用于維持和個(gè)體生長所需的能量。眾所周知，當(dāng)培養(yǎng)組織或細(xì)胞時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，細(xì)胞質(zhì)量增加，氧的消耗也增加。因此，除非從體系外部強(qiáng)行補(bǔ)充流通氣體，否則隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，含有組織或細(xì)胞的培養(yǎng)瓶(例如燒瓶)中氣相氧的濃度、或者與組織或細(xì)胞接觸的培養(yǎng)基中溶解氧的濃度自然下降到低于大氣中氧的濃度或者同樣溫度下飽和溶解的氧濃度。
本發(fā)明與上述發(fā)現(xiàn)的不同之處在于通過將含有組織或細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度、或者培養(yǎng)基中溶解氧的濃度能動地控制在低于大氣中氧的濃度或同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，進(jìn)行培養(yǎng)。
在增強(qiáng)本發(fā)明效果的一個(gè)說明性方法中，在增養(yǎng)瓶中的組織或細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)之前，將培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度或者液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度預(yù)先控制在低于大氣中氧的濃度或者同樣溫度下飽和溶解的氧濃度。
如上所述，控制時(shí)間沒有特別的限制，但是優(yōu)選在整個(gè)培養(yǎng)期間至少控制3天。
此外，控制方法沒有特別的限制，只要該方法可以將含有組織或細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度、或者與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度控制在低于大氣中氧的濃度或者同樣溫度下飽和溶解的氧濃度即可，該方法的某些實(shí)例是將通過使空氣與氮?dú)獾然旌?以降低氧濃度)得到的、具有控制的氧濃度的氣體直接通入培養(yǎng)瓶中的氣相中或培養(yǎng)基中；或者將這樣的氣體直接通入培養(yǎng)瓶外面的培養(yǎng)基中(即在通氣罐等中)，然后將該培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶中；或者將補(bǔ)充到培養(yǎng)瓶中的氣體(如空氣)以控制喂入速度的方式直接通入氣相或培養(yǎng)基中；或者將此氣體直接通入培養(yǎng)瓶外面的培養(yǎng)基中(即在通氣罐等中)，然后將此培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)瓶中；或者將培養(yǎng)瓶置于低氧氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)；或者在氧吸附劑存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明的組織培養(yǎng)溫度一般為約10-35℃，根據(jù)高生長速度，優(yōu)選約23-28℃。培養(yǎng)周期優(yōu)選為14-42天。
當(dāng)液體培養(yǎng)基用于本發(fā)明的培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)完成后可以通過例如傾析或過濾等方法從培養(yǎng)基中分離出培養(yǎng)細(xì)胞，并且通過例如用有機(jī)溶劑萃取等方法，可以從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離出所需的紫杉烷類雙萜。通過使吸附劑或合適的有機(jī)溶劑共存于培養(yǎng)體系中，還可以在培養(yǎng)過程中連續(xù)回收所需的化合物。
下面說明本申請的第三個(gè)發(fā)明。
按照本申請的第三個(gè)發(fā)明，可以列舉的含有培養(yǎng)細(xì)胞(所述細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后顯示了高紫杉烷類雙萜生產(chǎn)率)的層是比重為1.07或更低的層。
在一般的按其比重將細(xì)胞分層的已知方法中，由用于離心分離的培養(yǎng)基形成密度梯度，將細(xì)胞在其上分層，然后進(jìn)行離心分離。
作為離心分離用的培養(yǎng)基，可以使用Ficoll、Percoll(均由Pharmacia LKB Biotechnology Co.Ltd.生產(chǎn))、蔗糖和氯化銫等。在實(shí)施例中，通過使用Ficoll產(chǎn)生密度梯度，但是培養(yǎng)基沒有特別限定為任何物質(zhì)，只要其不損傷細(xì)胞即可。Ficoll已經(jīng)用于分離核外粒體等(Hess，R.等，Nature 208(1965)，856-858)或者用于分離動物細(xì)胞(Walder，I.A.等，Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.，112(1963)494-496)等。
形成密度梯度的層數(shù)沒有特別限定。
在實(shí)施例中，由比重為1.03、1.05、1.07、1.09和1.1l(g/ml)的層形成了各層比重之差為0.02的密度梯度，但是比重之差并不限于該值，而且各層比重之差可以相同或不同。
因此，密度梯度的定義包括其中梯度連續(xù)變化的情況(即其中形成密度梯度的層數(shù)接近于無窮大，而且各層間的比重差接近于0)。
通過如此形成密度梯度、使細(xì)胞分層和進(jìn)行離心分離，可以按其比重的差異將細(xì)胞分成多層。
所形成的層的比重一般為1.00-1.20g/ml、優(yōu)選1.03-1.11g/ml。作為用于培養(yǎng)的層，至少選擇一層，但是也可以選擇所有的層，并對其進(jìn)行培養(yǎng)。
當(dāng)選擇了多層并對所選層中所含的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以將細(xì)胞在各層中分別培養(yǎng)，但是，也可以將所選多層的兩層或更多層中的細(xì)胞混合并進(jìn)行培養(yǎng)。
通過培養(yǎng)比重為1.07或更低的層中所含的細(xì)胞，一般可以得到具有高紫杉烷類雙萜生產(chǎn)率的培養(yǎng)細(xì)胞，但是也不總是限定在這樣的比重范圍內(nèi)，因?yàn)楸戎貢S所培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)條件而波動。還有一種趨勢，就是當(dāng)按比重的差異進(jìn)行分層時(shí)，較高比重層中的細(xì)胞具有較高的紫杉烷類雙萜含量。因此，為了確?？梢缘玫揭愿弋a(chǎn)量生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞，需要將分配在所有層中的細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，然后測定各層細(xì)胞中紫杉烷類雙萜的濃度，并從這些層中選擇含有以高產(chǎn)量生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞的層。
迄今為止，未見有關(guān)在按照細(xì)胞的比重將其分配之后、對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的報(bào)道，并且出乎所有預(yù)料的是，按照比重之差可以將細(xì)胞分成具有不同紫杉烷類雙萜生產(chǎn)率的多個(gè)細(xì)胞層，而且通過培養(yǎng)比重為1.07或更低的層中所含的且在被分配時(shí)其紫杉烷類雙萜的含量并沒有如此之高的細(xì)胞可以得到以高產(chǎn)量生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的細(xì)胞。
按照本發(fā)明，還可以根據(jù)比重的不同，通過制備具有特定比重(例如1.07g/ml)的、用于離心分離的培養(yǎng)基，并按照上述方法進(jìn)行離心分離，將培養(yǎng)細(xì)胞分成多層。
本發(fā)明所用培養(yǎng)基包括通常的培養(yǎng)基成分。作為這樣的成分，通常使用無機(jī)成分和碳源，還可以加入植物激素、維生素、以及(如果需要)氨基酸。作為碳源，可以使用二糖如蔗糖、麥芽糖和乳糖，單糖如葡萄糖、果糖和半乳糖，淀粉或者以適當(dāng)比例混合的兩種或更多種這些糖源的混合物。
無機(jī)成分的說明性實(shí)例包括磷、氮、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、鋅、硼、銅、鉬、氯、鈉、碘和鈷，這些成分可以以化合物的形式加入，例如硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、氯化鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、硫酸銅、鉬酸鈉、三氧化鉬、碘化鉀和氯化鈷等。
作為植物激素，可以使用例如植物生長素如吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)以及細(xì)胞激動素如激動素、玉米素和二氫玉米素。
作為維生素，可以使用例如生物素、硫胺(維生素B1)、吡哆素(維生素B6)、泛酸、肌醇和煙酸等。
作為氨基酸，可以使用例如甘氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸等。
一般來說，無機(jī)成分的使用濃度約為0.1μM-100mM，碳源的使用濃度約為1-30g/l，植物激素的使用濃度約為0.01-10μM，而維生物和氨基酸的使用濃度分別為約0.01-100mg/l。
用于本發(fā)明的培養(yǎng)基的實(shí)例包括植物組織培養(yǎng)慣用的那些已知培養(yǎng)基，例如Murashige & Skoog培養(yǎng)基(1962)、Linsmaier & Skoog培養(yǎng)基(1965)、木本植物培養(yǎng)基(1981)、Gamborg’s B-5培養(yǎng)基和Mitsui’s M-9培養(yǎng)基。其中可以加入上述植物激素、以及(如果需要)上述碳源、維生素和氨基酸。
按照本發(fā)明，液體培養(yǎng)基和通常含有0.1-1％瓊脂和gelan膠的固體培養(yǎng)基都可以使用，但是優(yōu)選使用液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明的組織培養(yǎng)可以使用所述植物根的組織碎片或細(xì)胞、生長點(diǎn)、葉、莖、種子、花粉、花藥及花萼等，或者使用在上述培養(yǎng)基或其它常用培養(yǎng)基中通過其組織培養(yǎng)得到的培養(yǎng)細(xì)胞。
與沒有進(jìn)行分層的對照區(qū)域相比，通過將這些細(xì)胞分成特定的比重范圍、然后按照本發(fā)明對其進(jìn)行培養(yǎng)，可以得到具有較高紫杉烷類雙萜生產(chǎn)率的培養(yǎng)細(xì)胞。通過用有機(jī)溶劑如甲醇萃取，可以從這些培養(yǎng)細(xì)胞中分離出紫杉烷類雙萜。
本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的組織培養(yǎng)實(shí)例可以進(jìn)行如下說明。
將一片紫杉屬植物的植物體，例如根、生長點(diǎn)、葉、莖、和種子等滅菌，置于用gelan膠固化的木本植物培養(yǎng)基中，于10-35℃保持約14-60天，這樣一部分組織碎片就變成了愈傷組織。通過將如此得到的愈傷組織傳代培養(yǎng)，生長速度逐漸增加，并且得到穩(wěn)定的愈傷組織。術(shù)語穩(wěn)定的愈傷組織是指在培養(yǎng)過程中保持愈傷組織狀態(tài)而沒有分化成莖葉或根，并且它的細(xì)胞生長速度均勻的愈傷組織。
將這種穩(wěn)定的愈傷組織轉(zhuǎn)入適于生長的液體培養(yǎng)基例如液體木本植物培養(yǎng)基中，并使其生長。在液體培養(yǎng)基中生長速度進(jìn)一步增加。
本發(fā)明的組織培養(yǎng)溫度一般為約10-35℃，根據(jù)高生長速度，優(yōu)選約23-28℃。培養(yǎng)周期優(yōu)選為14-42天。
當(dāng)液體培養(yǎng)基用于本發(fā)明的培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)完成后可以通過例如傾析或過濾等方法從培養(yǎng)基中分離出培養(yǎng)細(xì)胞，并且通過例如用有機(jī)溶劑萃取等的方法，可以從中分離出所需的紫杉烷類雙萜。
按照本申請的第一個(gè)發(fā)明的第二個(gè)發(fā)明，可以容易地獲得大量紫杉烷類雙萜。
按照本申請的第三個(gè)發(fā)明，可以通過簡單的操作獲得以高產(chǎn)量生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的培養(yǎng)細(xì)胞。
當(dāng)本申請的第一個(gè)、第二個(gè)或第三個(gè)發(fā)明工業(yè)化實(shí)施時(shí)，通過單獨(dú)或者結(jié)合使用本申請的下列第四、第五、第六或第七個(gè)發(fā)明，可以進(jìn)一步增加其效率。
這就是說，必需向培養(yǎng)液中補(bǔ)充含氧氣體以培養(yǎng)產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞。空氣一般用于此目的，但是，經(jīng)過深入的研究之后，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)通過使用含有0.03-10％、優(yōu)選0.1-5％二氧化碳的氣體作為通入對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的罐中的氣體，可以有效地生產(chǎn)紫杉烷類雙萜，從而完成了本申請的第四個(gè)發(fā)明。
本申請人還發(fā)現(xiàn)通過對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行兩階段培養(yǎng)，可以明顯提高培養(yǎng)物中紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)率，并且可以控制因傳代培養(yǎng)所造成的紫杉烷類雙萜生產(chǎn)率的波動，所述兩階段包括第一階段和第二階段，在第一階段中使用加入了氧化劑或水溶性含氧有機(jī)化合物的培養(yǎng)基，以便獲得在隨后的階段中用于生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的活化的組織或細(xì)胞，第二階段是在促進(jìn)紫杉烷類雙萜生產(chǎn)的條件下進(jìn)行的，這樣便完成了本申請的第五個(gè)發(fā)明。在此，氧化劑的實(shí)例包括過硫酸鹽如過硫酸鉀和過氧化氫，水溶性含氧有機(jī)化合物的實(shí)例包括二甲基甲酰胺、二甲亞砜和乙二醇等。上述添加劑在培養(yǎng)基中的總濃度在加入后的當(dāng)即優(yōu)選為10-6M-10-1M，更優(yōu)選的是將其濃度控制在10-5M-10-2M。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過將組織或細(xì)胞接種于含有濃度為2-50g/l、優(yōu)選10-30g/l的糖化物和/或濃度為2-50mmol/l、優(yōu)選10-30mmol/l的硝酸根離子的培養(yǎng)基中，然后通過每天向培養(yǎng)基中連續(xù)或間歇加入含有0.2-5g/l、優(yōu)選0.5-3g/l糖化物和/或0.2-5mmol/l、優(yōu)選0.5-3mmol/l硝酸根離子的營養(yǎng)源(相對于所述培養(yǎng)基的初始體積)，可以對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng)，由此每一培養(yǎng)瓶中紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量可以明顯提高，這樣便完成了本申請的第六個(gè)發(fā)明。在此，我們稱“密度”為培養(yǎng)瓶中單位體積培養(yǎng)溶液的細(xì)胞質(zhì)量，表示為干細(xì)胞質(zhì)量(g)/升培養(yǎng)溶液。按照本申請的第六個(gè)發(fā)明，優(yōu)選在進(jìn)行培養(yǎng)的同時(shí)，通過加入上述營養(yǎng)源溶液、同時(shí)從組織或細(xì)胞中分離和取出相同體積的培養(yǎng)基對培養(yǎng)基進(jìn)行更新，并且從至少一種選自所得培養(yǎng)物、培養(yǎng)過程中取出的回收培養(yǎng)基和培養(yǎng)結(jié)束時(shí)所得的培養(yǎng)基的所得物中回收紫杉烷類雙萜。本申請的第六個(gè)發(fā)明對于改善高密度培養(yǎng)中紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)率特別有效，其中在開始培養(yǎng)時(shí)相對于培養(yǎng)基體積的上述植物的組織或細(xì)胞的密度為50g鮮重/升或者更高。
再者，盡管當(dāng)獲得高密度細(xì)胞時(shí)一般就終止培養(yǎng)，但是，本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，完成了在移出細(xì)胞的同時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)的連續(xù)培養(yǎng)，并且經(jīng)過進(jìn)一步檢驗(yàn)之后最終完成了連續(xù)培養(yǎng)方法，這就是本申請的第七個(gè)發(fā)明。這就是說，通過下述方法可以以常規(guī)方法難以實(shí)現(xiàn)的高速度產(chǎn)生紫杉烷類雙萜，所述方法是以0.1-10的特定更新比例(該比例由無量綱數(shù)F＝VI/V/μ定義，其中V是培養(yǎng)罐中培養(yǎng)基的總體積，VI是補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基的速度，μ是組織或細(xì)胞的具體生長速度)連續(xù)或間歇加入新鮮的培養(yǎng)基，并且從連續(xù)或間歇從培養(yǎng)罐中取出的、含組織或細(xì)胞的培養(yǎng)基中和/或連續(xù)或間歇從培養(yǎng)罐中取出的、既不含組織也不含細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中回收紫杉烷類雙萜，這樣便完成了本申請的第七個(gè)發(fā)明。更優(yōu)選的是將培養(yǎng)基的特定更新比例F設(shè)置為0.5-5。培養(yǎng)溶液中糖化物的濃度優(yōu)選為5-40g/l，培養(yǎng)溶液中硝酸根離子的濃度優(yōu)選為10-40mmol/l。對于每升中細(xì)胞鮮重為50-500g的細(xì)胞密度，本發(fā)明是有效的，但是，只要其所處的密度范圍不需要極劇烈的攪拌，那么密度越高，越能有效地生產(chǎn)紫杉烷類雙萜，因此優(yōu)選的密度為每升200g或者更高。
為了將本申請的上述第四、第五、第六或第七個(gè)發(fā)明與本申請上述第三個(gè)發(fā)明結(jié)合，可以按照本申請的第四、第五、第六或第七個(gè)發(fā)明，對本申請第三個(gè)發(fā)明所得到的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以生產(chǎn)所需的紫杉烷類雙萜。


圖1是表示在加入100μM茉莉酮酸甲酯后，培養(yǎng)基中紫杉醇產(chǎn)量的變化圖。
圖2是表示在加入100μM茉莉酮酸甲酯后，培養(yǎng)基中漿果赤霉素III產(chǎn)量的變化圖。
圖3是對按照本申請第二個(gè)發(fā)明進(jìn)行組織培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)裝置的一個(gè)實(shí)例的圖解說明。圖3中所用的每個(gè)數(shù)字具有如下含義。1空氣供入管2氮?dú)夤┤牍?培養(yǎng)瓶4補(bǔ)充含氧氣體的分布器5溶解氧的電極6溶解氧的濃度控制器7出口8閥門9氧氣流控制閥10空氣過濾器11高速攪拌機(jī)圖4是表示分層后在培養(yǎng)物中的生長圖。
圖5是表示分層后培養(yǎng)物中紫杉烷含量的圖。
圖6是表示細(xì)胞在各層中分布的圖。
圖7是表示各層中紫杉烷含量(在細(xì)胞中)的圖。
圖8是對按照本申請第六或第七個(gè)發(fā)明進(jìn)行組織培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)裝置的一個(gè)實(shí)例的圖解說明。圖8中所用的每個(gè)數(shù)字和字母具有如下含義。12培養(yǎng)基喂入管13培養(yǎng)基喂入口14只用于取出培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基不含組織和細(xì)胞)的帶有過濾器的開口15培養(yǎng)基出口管16補(bǔ)充含氧氣體的分布器17高速攪拌機(jī)18培養(yǎng)混合物(含組織或細(xì)胞的培養(yǎng)溶液)的排出管19加壓流入口a、b、c、d和e閥門實(shí)施本發(fā)明的最佳方式用下列實(shí)施例和比較實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是這些實(shí)施例不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。[實(shí)施例1]將預(yù)先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置于已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培基(含有0.25％重量的gelan膠)中，在25℃、于黑暗處進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基的錐瓶中，培養(yǎng)基中加有上述成分以達(dá)到同樣的濃度，并在旋轉(zhuǎn)搖動器上進(jìn)行搖動培養(yǎng)(振幅25mm，120rpm)，每21天對愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養(yǎng)細(xì)胞接種于含有20ml液體木本培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在25℃進(jìn)行為期14天的搖動培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后的第14天，加入作為通式(I)所示化合物的tuberonic acid的甲酯(通式(I)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6a表示氫原子，R6b是羥基，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵)，以使最終濃度達(dá)到0.01-1000μM，然后再培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)完成后，經(jīng)過濾和冷凍干燥收集歐洲紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞，然后稱量干重，得到每升液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的產(chǎn)量。用甲醇等從干燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過采用高效液相色譜法與標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤霉素III比效對其進(jìn)行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表1中。[比較實(shí)施例1]實(shí)施實(shí)施例1的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。所得結(jié)果示于表1中。[實(shí)施例2]實(shí)施實(shí)施例1的方法，只是從開始培養(yǎng)后的第7天開始，每2天一次，連續(xù)4次加入tuberonic acid的甲酯(每次達(dá)到25μM的最終濃度，并達(dá)到100μM的總濃度)。所得結(jié)果示于表l中。[實(shí)施例3]
實(shí)施實(shí)施例1的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第一天加入100μM的tuberonic acid的甲酯，然后再進(jìn)行20天的培養(yǎng)。所得結(jié)果示于表1中。[實(shí)施例4]實(shí)施實(shí)施例1的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第7天加入100μM的tuberonic acid的甲酯，然后再進(jìn)行14天的培養(yǎng)。所得結(jié)果示于表1中。
表1
*)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。[實(shí)施例5]首先用不銹鋼篩對由實(shí)施例1的方法得到的加快生長速度的細(xì)胞進(jìn)行篩分，得到粒度為250-840μM的細(xì)胞簇。用Ficoll制備比重為1.07(g/ml)的培養(yǎng)基，將上述細(xì)胞鋪于其上，并以700rpm的轉(zhuǎn)速離心6分鐘。細(xì)胞按其比重不同分為兩層。分出比重為1.07g/ml或更低的層中所含的細(xì)胞，用2％蔗糖溶液洗滌三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗滌后，將1克(鮮重)細(xì)胞轉(zhuǎn)入含20ml液體木本植物培養(yǎng)基的錐瓶中，并在25℃搖動培養(yǎng)14天。在培養(yǎng)開始后的第14天，加入tuberonic acid的甲酯，使其最終濃度達(dá)到250μM，再培養(yǎng)7天。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例1的方法。所得結(jié)果示于表2中。通過將選擇具有特定比重的細(xì)胞與添加tuberonic acid的甲酯相結(jié)合，可以大大提高紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)率。[比較實(shí)施例2]實(shí)施實(shí)施例5的方法，只是不加tuberonic acid的甲酯。所得結(jié)果示于表2中。
表2
*)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。[實(shí)施例6]向按實(shí)施例1的方法開始培養(yǎng)后的第14天獲得的短葉紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞中加入250μM tuberonic acid的甲酯，再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例1的方法。所得結(jié)果示于表3中。[比較實(shí)施例3]實(shí)施實(shí)施例6的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。結(jié)果示于表3中。[實(shí)施例7]實(shí)施實(shí)施例6的方法，只是使用米堤亞紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果示于表3中。[比較實(shí)施例4]實(shí)施實(shí)施例7的方法，只是不加入tuberonic acid的甲酯。結(jié)果示于表3中。
表
>*)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。[實(shí)施例8]將預(yù)先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置于已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養(yǎng)基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、于黑暗處進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在旋轉(zhuǎn)搖動器上進(jìn)行搖動培養(yǎng)(振幅25mm，120rpm)，每21天對愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養(yǎng)細(xì)胞接種于含有20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在25℃進(jìn)行為期14天的搖動培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后的第14天，加入作為一種茉莉酮酸類化合物的cucurbic acid的甲酯(通式(II)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵)，以使最終濃度達(dá)到0.01-1000μM，然后再培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)完成后，經(jīng)過濾和冷凍干燥收集歐洲紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞，然后稱量干重，得到每升液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的產(chǎn)量。用甲醇等從干燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過采用高效液相色譜法與標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤霉素III比較對其進(jìn)行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表4中。[比較實(shí)施例5]實(shí)施實(shí)施例8的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。所得結(jié)果示于表4中。[實(shí)施例9]實(shí)施實(shí)施例8的方法，只是從開始培養(yǎng)后的第7天開始，每2天一次，連續(xù)4次加入cucurbic acid的甲酯(每次達(dá)到25μM的最終濃度，并達(dá)到100μM的總濃度)。所得結(jié)果示于表4中。[實(shí)施例10]實(shí)施實(shí)施例8的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第一天加入100μM的cucurbic acid的甲酯，然后再進(jìn)行20天的培養(yǎng)。所得結(jié)果示于表4中。[實(shí)施例11]實(shí)施實(shí)施例8的方法，只在在開始培養(yǎng)后的第7天加入100μM的cucurbic acid的甲酯，然后再進(jìn)行14天的培養(yǎng)。所得結(jié)果示于表4中。
表4
*)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。[實(shí)施例12]首先用不銹鋼篩對由實(shí)施例8的方法得到的加快生長速度的細(xì)胞進(jìn)行篩分，得到粒度為250-840μM的細(xì)胞簇。用Ficoll制備比重為1.07(g/ml)的培養(yǎng)基，將上述細(xì)胞鋪于其上，并以700rpm的轉(zhuǎn)速離心6分鐘。細(xì)胞按其比重不同分為兩層。分出比重為1.07g/ml或更低的層中所含的細(xì)胞，用2％蔗糖溶液洗滌三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗滌后，將1克(鮮重)細(xì)胞接種至含20ml液體木本植物培養(yǎng)基的錐瓶中，并在25℃搖動培養(yǎng)14天。在培養(yǎng)開始后的第14天，加入cucurbic acid的甲酯，使其最終濃度達(dá)到250μM，再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例8的方法。所得結(jié)果示于表5中。通過將選擇具有特定比重的細(xì)胞與添加cucurbic acid的甲酯相結(jié)合，可以大大提高紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)率。[比較實(shí)施例6]實(shí)施實(shí)施例12的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。所得結(jié)果示于表5中。
表5
以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。[實(shí)施例13]向按實(shí)施例8的方法開始培養(yǎng)后的第14天獲得的短葉紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞中加入250μM cucurbic acid的甲酯，再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例8的方法。所得結(jié)果示于表6中。[比較實(shí)施例7]實(shí)施實(shí)施例13的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。結(jié)果示于表6中。[實(shí)施例14]實(shí)施實(shí)施例13的方法，只是使用米堤亞紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果示于表6中。[比較實(shí)施例8]實(shí)施例14的方法，只是不加入cucurbic acid的甲酯。結(jié)果示于表6中。
表6
*)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。[實(shí)施例15]將預(yù)先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置于已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養(yǎng)基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、于黑暗處進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在旋轉(zhuǎn)搖動器上進(jìn)行搖動培養(yǎng)(振幅25mm，120rpm)，每21天對愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養(yǎng)細(xì)胞接種于含有20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在25℃進(jìn)行為期14天的搖動培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后的第14天，加入作為一種茉莉酮酸類化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵，其中90％是反式，10％是順式)，以使最終濃度達(dá)到0.01-1000μM，然后再培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)完成后，經(jīng)過濾和冷凍干燥收集歐洲紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞，然后稱量干重，得到每升液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的產(chǎn)量。用甲醇等從干燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過采用高效液相色譜法與標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤霉素III比較對其進(jìn)行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表7中。[比較實(shí)施例9]實(shí)施實(shí)施例15的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。所得結(jié)果示于表7中。[實(shí)施例16]實(shí)施實(shí)施例15的方法，只是從開始培養(yǎng)后的第7天開始，每2天一次，連續(xù)4次加入茉莉酮酸甲酯(每次達(dá)到25μM的最終濃度，并達(dá)到100μM的總濃度)。所得結(jié)果示于表7中。[實(shí)施例17]實(shí)施實(shí)施例15的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第一天加入100μM的茉莉酮酸甲酯，然后再進(jìn)行20天的培養(yǎng)。所得結(jié)果示于表7中。[實(shí)施例18]實(shí)施實(shí)施例15的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第7天加入100μM的茉莉酮酸甲酯，然后再進(jìn)行14天的培養(yǎng)。所得結(jié)果示于表7中。[實(shí)施例19]實(shí)施實(shí)施例15的方法，只是加入作為一種茉莉酮酸類化合物的茉莉酮酸(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是羥基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵，其中90％是反式，10％是順式)，以使最終濃度達(dá)到0.01-1000μM。所得結(jié)果示于表8中。[比較實(shí)施例10]實(shí)施實(shí)施例19的方法，只是不加入茉莉酮酸。結(jié)果示于表8中。[實(shí)施例20]在加入100μM茉莉酮酸甲酯之前、加入后的第3天以及加入后的第7天，實(shí)施例15的培養(yǎng)基中所含的紫杉烷類雙萜的分析結(jié)果示于圖1和圖2中。在培養(yǎng)的第7天，約一半紫杉醇和約70％漿果霉素III滲入培養(yǎng)基中。實(shí)施實(shí)施例20的方法，只是不加茉莉酮酸甲酯。結(jié)果示于圖1和圖2中。首先用不銹鋼篩對由實(shí)施例15的方法得到的加快生長速度的細(xì)胞進(jìn)行篩分，得到粒度為250-840μM的細(xì)胞簇。用Ficoll制備比重為1.07(g/ml)的培養(yǎng)基，將上述細(xì)胞鋪于其上，并以700rpm的轉(zhuǎn)速離心6分鐘。細(xì)胞按其比重不同分為兩層。分出比重為1.07g/ml或更低的層中所含的細(xì)胞，用2％蔗糖溶液洗滌三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗滌后，將1克(鮮重)細(xì)胞接種至含20ml液體木本植物培養(yǎng)基的錐瓶中，并在25℃搖動培養(yǎng)14天。在培養(yǎng)開始后的第14天，加入茉莉酮酸甲酯，使其最終濃度達(dá)到250μM，再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例15的方法，所得結(jié)果示于表9中。通過將選擇具有特定比重的細(xì)胞與添加茉莉酮酸甲酯相結(jié)合，可以大大提高紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)率。[比較實(shí)施例12]實(shí)施實(shí)施例21的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。所得結(jié)果示于表9中。[實(shí)施例22]向按實(shí)施例15的方法開始培養(yǎng)后的第14天獲得的短葉紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞中加入250μM茉莉酮酸甲酯，再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例15的方法。所得結(jié)果示于表10中。[比較實(shí)施例13]實(shí)施實(shí)施例22的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。結(jié)果示于表10中。[實(shí)施例23]實(shí)施實(shí)施例22的方法，只是使用米堤亞紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果示于表10中。[比較實(shí)施例14]實(shí)施實(shí)施例23的方法，只是不加入茉莉酮酸甲酯。結(jié)果示于表10中。
表7
以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。
表8
*)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。
表9
*)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。
表10
*)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。[實(shí)施例24]將預(yù)先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置于已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養(yǎng)基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、于黑暗處進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在旋轉(zhuǎn)搖動器上進(jìn)行搖動培養(yǎng)(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養(yǎng)細(xì)胞接種于含有20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，加入作為含重金屬化合物的[Ag(S2O3)2]3-，使其最終濃度達(dá)到10-9M-1M。然后在25℃進(jìn)行為期21天的搖動培養(yǎng)。
培養(yǎng)完成后，過濾和冷凍干燥收集歐洲紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞，然后稱量干重，得到其生長速度。用甲醇等從干燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過采用高效液相色譜法與標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤霉素III比較對其進(jìn)行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例25]實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第7天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最終濃度達(dá)到10-3M，再進(jìn)行14天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例24的方法。結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例26]實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第14天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最終濃度達(dá)到10-3M，再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例24的方法。結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例27]實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第18天加入[Ag(S2O3)2]3-，使其最終濃度達(dá)到10-3M，再進(jìn)行3天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例24的方法。結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例28]實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是從開始培養(yǎng)(第0天)起，以4天的間隔，連續(xù)5次加入[Ag(S2O3)2]3-(每次達(dá)到2×10-4M的最終濃度，并達(dá)到10-3M的總濃度)。所得結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例29]實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(II)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵)，以使最終濃度達(dá)到10-4M。所得結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例30]實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是將燒瓶置于有氣體入口和氣體出口的瓶子(容量3000ml)中，然后將瓶子密封，使空氣和氮?dú)饣旌?，以使補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度達(dá)到10％，并且以每分鐘25ml的速度經(jīng)入口補(bǔ)充該氣體。所得結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例31]實(shí)施實(shí)施例30的方法，只是在培養(yǎng)的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最終濃度達(dá)到10-4M。所得結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例32]
實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是在培養(yǎng)開始時(shí)(第0天)加入10-3M的硝酸銀Ag(NO3)，代替[Ag(S2O3)2]3-.所得結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例33]實(shí)施實(shí)施例32的方法，只是在培養(yǎng)的第14天加入10-3M的硝酸銀Ag(NO3)代替[Ag(S2O3)2]3-。所得結(jié)果示于表11中。[比較實(shí)施例15]實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是不加[Ag(S2O3)2]3-。所得結(jié)果示于表11中。[實(shí)施例34]實(shí)施實(shí)施例24的方法，只是加入氯化鈷(CoCl2)代替[Ag(S2O3)2]3-作為含重金屬的化合物，使最終濃度達(dá)到10-9M-1M。所得結(jié)果示于表12中。[實(shí)施例35]實(shí)施實(shí)施例34的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第7天加入氯化鈷(CoCl2)代替[Ag(S2O3)2]3-，使最終濃度達(dá)到10-5M。再進(jìn)行14天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例34的方法。結(jié)果示于表12中。[實(shí)施例36]實(shí)施實(shí)施例34的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第14天加入氯化鈷，使最終濃度達(dá)到10-5M。再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例34的方法，結(jié)果示于表12中。[實(shí)施例37]實(shí)施實(shí)施例34的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第18天加入氯化鈷，使最終濃度達(dá)到10-5M。再進(jìn)行3天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例34的方法，結(jié)果示于表12中。[實(shí)施例38]實(shí)施實(shí)施例34的方法，只是從開始培養(yǎng)(第0天)起，以4天的間隔，連續(xù)5次加入氯化鈷(每次達(dá)到2×10-6M的最終濃度，并達(dá)到10-5M的總濃度)。所得結(jié)果示于表12中。[實(shí)施例39]實(shí)施實(shí)施例34的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵)，以使最終濃度達(dá)到10-4M。所得結(jié)果示于表12中。[實(shí)施例40]實(shí)施實(shí)施例34的方法，只是將燒瓶置于有氣體入口和氣體出口的瓶子(容量3000ml)中，然后將瓶子密封，使空氣和氮?dú)饣旌?，以使補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度達(dá)到10％，并且以每分鐘25ml的速度經(jīng)入口補(bǔ)充該氣體。所得結(jié)果示于表12中。[實(shí)施例41]實(shí)施實(shí)施例40的方法，只是在培養(yǎng)的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最終濃度達(dá)到10-4M。所得結(jié)果示于表12中。
表11 [b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加計(jì)算總產(chǎn)量。]
表12
>[a)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。][b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加計(jì)算總產(chǎn)量。][實(shí)施例42]將預(yù)先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置于已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養(yǎng)基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、于黑暗處進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在旋轉(zhuǎn)搖動器上進(jìn)行搖動培養(yǎng)(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養(yǎng)細(xì)胞接種于含有20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，然后加入作為胺的亞精胺，使其最終濃度達(dá)到10-9M-1M。然后在25℃進(jìn)行為期21天的搖動培養(yǎng)。
培養(yǎng)完成后，經(jīng)過過濾和冷凍干燥收集歐洲紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞，然后稱量干重，得到其生長速度。用甲醇等從干燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過采用高效液相色譜法與標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤霉素III比較對其進(jìn)行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表13中。[實(shí)施例43]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第7天加入亞精胺，使其最終濃度達(dá)到10-5M，再進(jìn)行14天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例42的方法。結(jié)果示于表13中。[實(shí)施例44]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第14天加入亞精胺，使其最終濃度達(dá)到10-5M，再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例42的方法。結(jié)果示于表13中。[實(shí)施例45]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第18天加入亞精胺，使其最終濃度達(dá)到10-5M，再進(jìn)行3天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例42的方法。結(jié)果示于表13中。[實(shí)施例46]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是從開始培養(yǎng)(第0天)起，以4天的間隔，連續(xù)5次加入亞精胺(每次達(dá)到2×10-6M的最終濃度，并達(dá)到10-5M的總濃度)。所得結(jié)果示于表13中。[實(shí)施例47]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第14天加入作為一種茉莉酮酸類化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵)，以使最終濃度達(dá)到10-4M。所得結(jié)果示于表13中。[實(shí)施例48]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是將燒瓶置于有氣體入口和氣體出口的瓶子(容量3000ml)中，然后將瓶子密封，使空氣和氮?dú)饣旌?，以使補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度達(dá)到10％，并且以每分鐘25ml的速度經(jīng)入口補(bǔ)充該氣體。所得結(jié)果示于表13中。[實(shí)施例49]實(shí)施實(shí)施例48的方法，只是在培養(yǎng)的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最終濃度達(dá)到10-4M。所得結(jié)果示于表13中。[比較實(shí)施例16]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是不加亞精胺。所得結(jié)果示于表13-15中。[實(shí)施例50]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是加入精胺代替亞精胺，使最終濃度達(dá)到10-9M-1M。所得結(jié)果示于表14中。[實(shí)施例51]實(shí)施實(shí)施例42的方法，只是加入腐胺代替精胺，使最終濃度達(dá)到10-9M-1M。所得結(jié)果示于表15中。
表13 [b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加計(jì)算總產(chǎn)量。]
表14<
a)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。][b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加，計(jì)算總產(chǎn)量。]
表15 [b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加，計(jì)算總產(chǎn)量。][實(shí)施例52]將預(yù)先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置于已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養(yǎng)基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、于黑暗處進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在旋轉(zhuǎn)搖動器上進(jìn)行搖動培養(yǎng)(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養(yǎng)細(xì)胞接種于含有20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在25℃進(jìn)行為期14天的搖動培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始后的第14天加入作為抗乙烯劑的乙酰水楊酸(HOOCC6H4OCOCH3)，使其最終濃度達(dá)到10-9M-1M。再進(jìn)行7天的培養(yǎng)。
培養(yǎng)完成后，經(jīng)過濾和冷凍干燥收集歐洲紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞，然后稱量干重，得到其生長速度。用甲醇等從干燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過采用高效液相色譜法與標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤霉素III比較對其進(jìn)行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表16中。[實(shí)施例53]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是在培養(yǎng)開始時(shí)(第0天)加入乙酰水楊酸，使其最終濃度達(dá)到10-5M，再進(jìn)行21天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例52的方法。結(jié)果示于表16中。[實(shí)施例54]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第7天加入乙酰水楊酸，使其最終濃度達(dá)到10-5M，再進(jìn)行14天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例52的方法。結(jié)果示于表16中。[實(shí)施例55]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第18天加入乙酰水楊酸，使其最終濃度達(dá)到10-5M，再進(jìn)行3天的培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，實(shí)施實(shí)施例52的方法。結(jié)果示于表16中。[實(shí)施例56]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是從開始培養(yǎng)后的第7天開始，以2天的間隔，連續(xù)5次加入乙酰水楊酸(每次達(dá)到2×10-6M的最終濃度，并達(dá)到10-5M的總濃度)。所得結(jié)果示于表16中。[實(shí)施例57]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第14天加入茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵)，以使最終濃度達(dá)到10-4M。所得結(jié)果示于表16中。[實(shí)施例58]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是將燒瓶置于有氣體入口和氣體出口的瓶子(容量3000ml)中，然后將瓶子密封，使空氣和氮?dú)饣旌?，以使補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度達(dá)到10％，并且以每分鐘25ml的速度經(jīng)入口補(bǔ)充該氣體。所得結(jié)果示于表16中。[實(shí)施例59]實(shí)施實(shí)施例58的方法，只是在培養(yǎng)的第14天加入茉莉酮酸甲酯，使最終濃度達(dá)到10-4M。所得結(jié)果示于表16中。[比較實(shí)施例17]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是不加乙酰水楊酸。所得結(jié)果示于表16中。[參照實(shí)施例1]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是在培養(yǎng)開始時(shí)(第0天)加入10-3M的乙烯利(C2H6O3ClP)代替乙酰水楊酸作為抗乙烯劑。所得結(jié)果示于表16中。[參照實(shí)施例2]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是在培養(yǎng)開始后的第14天加入10-3M的Ethrel代替乙酰水楊酸。所得結(jié)果示于表16中。[實(shí)施例60]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是加入鹽酸氨基羥乙酸[(H2NOCH2COOH)2HCl]作為抗乙烯劑，使最終濃度達(dá)到10-9M-1M。所得結(jié)果示于表17中。[實(shí)施例61]實(shí)施實(shí)施例52的方法，只是加入五倍子酸丙酯[(HO)3C6H2COOCH2CH2CH3]作為抗乙烯劑，使最終濃度達(dá)到10-9M-1M。所得結(jié)果示于表18中。
表16<
>[a)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。][b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加計(jì)算總產(chǎn)量。]
表17
a)以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。][b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加，計(jì)算總產(chǎn)量。]
表18 [b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加，計(jì)算總產(chǎn)量。][實(shí)施例62]將預(yù)先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置于已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養(yǎng)基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、于黑暗處進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在旋轉(zhuǎn)搖動器上進(jìn)行搖動培養(yǎng)(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以加快其生長速度。
將1克(鮮重)如此得到的培養(yǎng)細(xì)胞接種于含有20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并燒瓶置于有氣體入口和氣體出口的室式容器(容量3000ml)中，然后將室密封，使空氣和氮?dú)饣旌?，以使補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度達(dá)到4-15％，并且以每分鐘25ml的速度經(jīng)入口補(bǔ)充該氣體，在25℃進(jìn)行為期21天的搖動培養(yǎng)。
培養(yǎng)完成后，經(jīng)過濾和冷凍干燥收集歐洲紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞，然后稱量干重，得到其生長速度。用甲醇等從干燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過采用高效液相色譜法與標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤霉素III比較對其進(jìn)行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表19中。[比較實(shí)施例18]實(shí)施實(shí)施例62的方法，只是將補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度控制在20％。所得結(jié)果示于表19中。[參照實(shí)施例3]實(shí)施實(shí)施例62的方法，只是在大氣中對接種于培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。所得結(jié)果示于表19中。[實(shí)施例63]實(shí)施實(shí)施例62的方法，只是將補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度控制在10％，并從培養(yǎng)開始起補(bǔ)充該混合氣體，共補(bǔ)充3天，然后補(bǔ)充空氣至培養(yǎng)結(jié)束(18天)。所得結(jié)果示于表19中。[實(shí)施例64]實(shí)施實(shí)施例62的方法，只是將補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度控制在10％，并從培養(yǎng)開始起補(bǔ)充該混合氣體，共補(bǔ)充7天，然后補(bǔ)充空氣至培養(yǎng)結(jié)束(14天)。所得結(jié)果示于表19中。[實(shí)施例65]實(shí)施實(shí)施例62的方法，只是將補(bǔ)充到所培養(yǎng)細(xì)胞中的氣體中氧的濃度控制在10％，并從培養(yǎng)開始起補(bǔ)充該混合氣體，共補(bǔ)充14天，然后補(bǔ)充空氣至培養(yǎng)結(jié)束(7天)。所得結(jié)果示于表19中。[實(shí)施例66]實(shí)施實(shí)施例62的方法，只是在開始培養(yǎng)后的第14天，加入作為一種茉莉酮酸類化合物的茉莉酮酸甲酯(通式(III)所示化合物，其中R1a、R1b、R1c、R1d、R1e、R1f、R2、R3、R4、R5和R6表示氫原子，R7是甲氧基，n是1，C3和C4之間有一個(gè)雙鍵；其中90％是反式，10％是順式)，以使最終濃度達(dá)到1000μM。所得結(jié)果示于表20中。通過將補(bǔ)充低濃度氧與添加茉莉酮酸甲酯相結(jié)合，可以顯著提高紫杉烷類雙萜的生產(chǎn)率。[實(shí)施例67]將85克(鮮重)由實(shí)施例62的方法得到的加快生長速度的培養(yǎng)細(xì)胞接種于用于攪拌罐培養(yǎng)的罐(容量3000ml)中，該罐具有一個(gè)用于測定溶解氧濃度的電極和溶解氧濃度控制器，在該罐中已經(jīng)倒入了1700ml液體木本植物培養(yǎng)基。然后在25℃進(jìn)行為期21天的攪拌罐培養(yǎng)，同時(shí)通過調(diào)節(jié)空氣與氮?dú)獾幕旌媳壤?，將培養(yǎng)基中溶解氧的濃度控制在0.1ppm或者更低。培養(yǎng)裝置的圖解示于圖3中，所得結(jié)果示于表21中。[實(shí)施例68]實(shí)施實(shí)施例67的方法，只是通過調(diào)節(jié)混合比例，將溶解氧的濃度控制在1ppm或者更低。所得結(jié)果示于表21中。[實(shí)施例69]實(shí)施實(shí)施例67的方法，只是通過調(diào)節(jié)混合比例，將溶解氧的濃度控制在2ppm或者更低。所得結(jié)果示于表21中。[實(shí)施例70]實(shí)施實(shí)施例67的方法，只是通過調(diào)節(jié)混合比例，將溶解氧的濃度控制在4ppm或者更低。所得結(jié)果示于表21中。[實(shí)施例71]實(shí)施實(shí)施例67的方法，只是通過調(diào)節(jié)混合比例，將溶解氧的濃度控制在6ppm或者更低。所得結(jié)果示于表21中。[比較實(shí)施例19]實(shí)施實(shí)施例67的方法，只是補(bǔ)充空氣。所得結(jié)果示于表21中。[實(shí)施例72]實(shí)施實(shí)施例67的方法，只是從培養(yǎng)開始起，通過調(diào)節(jié)混合比例，將培養(yǎng)基中溶解氧的濃度控制在4ppm或者更低，共控制3天，然后補(bǔ)充空氣至培養(yǎng)結(jié)束(18天)。所得結(jié)果示于表21中。[實(shí)施例73]實(shí)施實(shí)施例67的方法，只是從培養(yǎng)開始起，通過調(diào)節(jié)混合比例，將培養(yǎng)基中溶解氧的濃度控制在4ppm或者更低，共控制7天，然后補(bǔ)充空氣至培養(yǎng)結(jié)束(14天)。所得結(jié)果示于表21中。[實(shí)施例74]實(shí)施實(shí)施例67的方法，只是從培養(yǎng)開始起，通過調(diào)節(jié)混合比例，將培養(yǎng)基中溶解氧的濃度控制在4ppm或者更低，共控制14天，然后補(bǔ)充空氣至培養(yǎng)結(jié)束(7天)。所得結(jié)果示于表21中。
表19 [b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加計(jì)算總產(chǎn)量。][c)該值表示在補(bǔ)充混合氣體期間室式容器中的最大氣相氧濃度。]
表20 [b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加，計(jì)算總產(chǎn)量。]表21 [b)通過將漿果赤霉素III的產(chǎn)量、cephalomannine的產(chǎn)量和紫杉醇的產(chǎn)量相加，計(jì)算總產(chǎn)量。][c)括號中的數(shù)字表示在25℃下在比較實(shí)施例和各個(gè)實(shí)施例中最大溶解氧的濃度相對于飽和溶解氧濃度(8ppm)的比例(％)。][d)該值表示在補(bǔ)充混合氣體期間培養(yǎng)基中的最大溶解氧濃度。][e)括號在數(shù)字表示在25℃、在補(bǔ)充混合氣體期間各個(gè)實(shí)施例中最大溶解氧的濃度相對于飽和溶解氧濃度(8ppm)的比例(％)。][實(shí)施例75]將預(yù)先用2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液等滅菌的歐洲紫杉的一部分莖置于已加有萘乙酸(濃度為10-5M)的固體木本植物培養(yǎng)基(含有0.25％(重量)的gelan膠)中，在25℃、于黑暗處進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，以得到歐洲紫杉的愈傷組織。將1克(鮮重)愈傷組織接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入上述成分以達(dá)到同樣的濃度)的錐瓶中，并在旋轉(zhuǎn)搖動器上進(jìn)行搖動培養(yǎng)(振幅25mm，100rpm)，每21天對愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以加快其生長速度。
首先用不銹鋼篩對將1克(鮮重)如此得到的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行篩分，得到粒度為250-840μM的細(xì)胞簇。用Ficoll制備比重為1.03、1.05、1.07、1.09和1.11(g/ml)的密度梯度，將上述細(xì)胞鋪于其上，并以700rpm的轉(zhuǎn)速離心6分鐘。細(xì)胞按其比重不同分配在各層中。分出每層中所含的細(xì)胞，使其不彼此混合，用2％蔗糖溶液洗滌三次或更多次，以洗掉Ficoll。洗滌后，將約0.1克(鮮重)細(xì)胞轉(zhuǎn)入內(nèi)徑為18mm、含0.8ml液體木本植物培養(yǎng)基的培養(yǎng)井中，并在25℃搖動培養(yǎng)21天。培養(yǎng)21天后，將全部細(xì)胞轉(zhuǎn)入內(nèi)徑為36mm、含3ml上述液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)井中，再于25℃繼續(xù)搖動培養(yǎng)28天。
培養(yǎng)完成后，經(jīng)過濾和冷凍干燥收集歐洲紫杉的培養(yǎng)細(xì)胞，然后稱量干重，得到其在每升液體培養(yǎng)基中的生長量。用甲醇等從干燥的愈傷組織中萃取紫杉烷類雙萜，通過采用高效液相色譜法與標(biāo)準(zhǔn)的紫杉醇、cephalomannine和漿果赤霉素III比較對其進(jìn)行測定，以測定紫杉烷類雙萜的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表22、圖4和圖5中。[比較實(shí)施例20]實(shí)施實(shí)施例75的方法，只是在用不銹鋼篩分離細(xì)胞簇后，不按密度梯度進(jìn)行分配。所得結(jié)果示于表22、圖4和圖5中。[實(shí)施例76]實(shí)施實(shí)施例75的方法，只是使用具有相同母體植物、但在不同階段形成愈傷組織的培養(yǎng)細(xì)胞。條件是在一組中，收集比重為1.07或更高的層中所含的細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)。所得結(jié)果示于表22中。[比較實(shí)施例21]實(shí)施實(shí)施例76的方法，只是在用不銹鋼篩分離細(xì)胞簇后，不按密度梯度進(jìn)行分配。所得結(jié)果示于表22中。
表22
*)用總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)除以細(xì)胞產(chǎn)量，計(jì)算含量。][參照實(shí)施例4]將約0.2克(鮮重)實(shí)施例75中得到的、分配于比重為1.03或更低(表22)的層中之后進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞接種于內(nèi)徑為36mm、含3ml液體木本植物培養(yǎng)基的培養(yǎng)井中，再于25℃搖動培養(yǎng)28天。培養(yǎng)完成后，細(xì)胞再依比重為1.03、1.05、1.07、1.09和1.11(g/ml)的密度梯度進(jìn)行分配。一經(jīng)密度梯度分配后，立即收集細(xì)胞，并且測定分配細(xì)胞的分布及紫杉烷類雙萜的含量。所得結(jié)果示于表23、圖6和圖7中。
表23 [實(shí)施例77]將1克(鮮重)實(shí)施例1中所用的相同培養(yǎng)細(xì)胞接種于含20ml液體(其中含10-5M-10-2M過硫酸鉀)的錐瓶中，并在25℃進(jìn)行為期21天的第一階段培養(yǎng)。
培養(yǎng)完成后，經(jīng)過濾收集培養(yǎng)細(xì)胞，一部分細(xì)胞用作第二階段培養(yǎng)的細(xì)胞，對剩余的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞中紫杉烷含量的測定。因此，將1克(鮮重)的培養(yǎng)細(xì)胞接種于含20ml液體木本植物培養(yǎng)基(向其中加入萘乙酸使?jié)舛冗_(dá)到10-5M)的錐瓶中，在25℃進(jìn)行為期14天的搖動培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第14天，向培養(yǎng)基中加入茉莉酮酸甲酯，使其在培養(yǎng)基中的濃度達(dá)到100μM，再繼續(xù)培養(yǎng)7天。另一方面，將第一階段培養(yǎng)中所得的剩余細(xì)胞凍干，然后測量干重，以得到其在每升液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)量。通過高效液相色譜法測定干細(xì)胞中紫杉醇的含量。通過與對第一階段培養(yǎng)中所得細(xì)胞進(jìn)行測定的同樣方式，測定第二階段培養(yǎng)中所得細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)量和紫杉醇產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表24中。[比較實(shí)施例22]實(shí)施實(shí)施例77的方法，只是不使用過硫酸鉀。所得結(jié)果示于表24中。
表24 將100克(鮮重)實(shí)施例1中所用的相同培養(yǎng)細(xì)胞接種于裝有1升標(biāo)準(zhǔn)液體木本植物培養(yǎng)基(蔗糖濃度20g/l，硝酸根離子濃度14.7mM，α-萘乙酸10-5M)(其中加有2mM[Ag(S2O3)2]-3)、用于攪拌罐培養(yǎng)的罐(容量2升；圖8)中，以40rpm的攪拌速度在25℃、于黑暗中開始培養(yǎng)，同時(shí)以每分鐘0.1升的速度通入空氣，從培養(yǎng)的第2天開始至第14天連續(xù)補(bǔ)充含20g/l蔗糖和20mM硝酸鈉的培養(yǎng)基，使得1天加入的蔗糖量為2g/l，1天加入的硝酸根離子的量為2mmol/l，并且通過排出口(這不同于營養(yǎng)源供入口，而且其上連有一個(gè)100目的不銹鋼過濾器)連續(xù)取出培養(yǎng)溶液，該取出速度與加入營養(yǎng)源溶液的速度(培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基的更新比例為每天10％)相同，以此進(jìn)行為期21天的攪拌罐培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，收集培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)基，按與所述實(shí)施例1中所用相同的方法測定紫杉醇的產(chǎn)量。所得結(jié)果示于表25中。[比較實(shí)施例23]實(shí)施實(shí)施例78的方法，只是中途不加入營養(yǎng)源。所得結(jié)果示于表25中。
表25
>[實(shí)施例79]將約50克(鮮重)實(shí)施例1中所用的相同培養(yǎng)細(xì)胞和1升液體木本植物培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入培養(yǎng)罐(容量2升)中，以40rpm的攪拌速度和每分鐘0.1升的通氣速度在25℃、于黑暗中進(jìn)行為期14天的培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)后的第14天測量的沉淀細(xì)胞體積(PCV)為0.2升。從第14天開始，補(bǔ)充新鮮的培養(yǎng)基(其中在與初始培養(yǎng)基具有同樣組成的培養(yǎng)基中加入了[Ag(S2O3)2]-3)、并取出不含細(xì)胞的培養(yǎng)溶液。新鮮培養(yǎng)基每天的補(bǔ)充量為在同一時(shí)間PCV的2/5，而不含細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的取出量則控制在1升。在培養(yǎng)開始后的第35天，PCV達(dá)到0.6升。此后，通過每天一次取出含細(xì)胞的培養(yǎng)溶液，以保持平均PCV為0.6升，并且通過取出不含細(xì)胞的培養(yǎng)溶液，保持培養(yǎng)溶液的量為1升，從而保持平穩(wěn)狀態(tài)。在培養(yǎng)開始后進(jìn)行為期90天的培養(yǎng)。在60天的平穩(wěn)期內(nèi)補(bǔ)充的新鮮培養(yǎng)基的量為15升，從培養(yǎng)罐中取出的培養(yǎng)基的量為14天，得到的細(xì)胞量為0.15kg(干重)，特定生長速度μ為0.08(天-1)，平均培養(yǎng)基更新比例為2.88。在平穩(wěn)期從培養(yǎng)罐中取出的細(xì)胞和培養(yǎng)基的分析結(jié)果表明產(chǎn)生了525mg紫杉酚。這相當(dāng)于8.8mg/升/天的生產(chǎn)率。
按與實(shí)施例1中所用相同的方法測定細(xì)胞和培養(yǎng)基中紫杉醇的含量。[實(shí)施例80]將50克(鮮重)實(shí)施例1中所用的相同培養(yǎng)細(xì)胞和1升液體木本植物培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入培養(yǎng)罐(容量2升)中，以40rpm的攪拌速度在25℃、于黑暗中進(jìn)行為期14天的培養(yǎng)，同時(shí)以每分鐘0.1升的速度通入加有2％二氧化碳的空氣。培養(yǎng)完成后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，得到15.2克干燥的細(xì)胞。按與實(shí)施例1中所用相同的方法測定細(xì)胞和培養(yǎng)基中紫杉醇的含量，結(jié)果表明產(chǎn)生了31克紫杉醇。[比較實(shí)施例24]實(shí)施實(shí)施例1的方法，只是加入茉莉酮代替methyl tuberonate，以使最終濃度達(dá)到0.01-1000μM。所得結(jié)果示于表26中。[比較實(shí)施例25]實(shí)施比較實(shí)施例24的方法，只是不加茉莉酮。所得結(jié)果示于表26中。
表26<
以總產(chǎn)量(細(xì)胞中+培養(yǎng)基中)為基礎(chǔ)計(jì)算產(chǎn)量。]工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可以工業(yè)化生產(chǎn)紫杉烷類雙萜，包括適于用作卵巢癌、乳腺癌和肺癌等的治療劑的紫杉醇。
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的方法，其中自培養(yǎng)的開始階段通過控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度低于大氣中氧的濃度、或者自培養(yǎng)的開始階段通過控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度低于同樣溫度下飽和溶解的氧濃度，對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后從所得培養(yǎng)物中回收紫杉烷類雙萜。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中通過控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度為4-15％、或者通過控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度為同樣溫度下飽和溶解氧濃度的1-75％，對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中通過控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度為6-12％、或者通過控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度為同樣溫度下飽和溶解氧濃度的10-75％，對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中通過控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度或者液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，所述控制方法是調(diào)節(jié)補(bǔ)充到培養(yǎng)瓶中和/或培養(yǎng)基中的通入氣體中氧的濃度、或者調(diào)節(jié)補(bǔ)充到培養(yǎng)瓶中和/或培養(yǎng)基中的通入氣體的供給速度。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其中在培養(yǎng)開始至開始培養(yǎng)后的第7天的期間內(nèi)開始控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度或者控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度，并且至少控制3天。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中紫杉烷類雙萜是至少一種選自紫杉醇、7-表紫杉醇、漿果赤霉素III、7-表漿果赤霉素III、cephalomannine、7-epicephalomannine、10-脫乙?；鶟{果赤霉素III、10-脫乙酰基cephalomannine、10-脫乙?；仙即肌axagifine、木糖基cephaloniannine和木糖基紫杉醇的化合物。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物是紫杉屬植物。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)在茉莉酮酸類化合物存在下進(jìn)行。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中通過將組織或細(xì)胞接種于含有濃度為2-50g/l的糖化物和/或濃度為2-50mmol/l的硝酸根離子的培養(yǎng)基中，然后通過每天向培養(yǎng)基中連續(xù)或間歇加入以所述培養(yǎng)基的初始體積為基準(zhǔn)含有0.2-5g/l糖化物和/或0.2-5mmol/l硝酸根離子的營養(yǎng)源溶液，對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后從所得培養(yǎng)物中回收紫杉烷類雙萜。
10.按照權(quán)利要求9的方法，其中在進(jìn)行培養(yǎng)的同時(shí)，通過加入上述營養(yǎng)源溶液、并從組織或細(xì)胞中分離和取出相同體積的培養(yǎng)基對培養(yǎng)基進(jìn)行更新，并且從至少一種選自所得組織和/或細(xì)胞、培養(yǎng)過程中回收的培養(yǎng)基和培養(yǎng)結(jié)束時(shí)所得的培養(yǎng)基的物質(zhì)中回收紫杉烷類雙萜。
11.按照權(quán)利要求1的方法，其中以0.1-10的特定更新比例連續(xù)或間歇加入新鮮的培養(yǎng)基，并且從連續(xù)或間歇從培養(yǎng)罐中取出的培養(yǎng)基或培養(yǎng)基中所含的組織或細(xì)胞中和/或連續(xù)或間歇從培養(yǎng)罐中取出的不含組織和細(xì)胞的培養(yǎng)基中，回收紫杉烷類雙萜，上述特定更新比例由無量綱數(shù)F＝VI/V/μ定義，其中V是培養(yǎng)罐中培養(yǎng)溶液的總體積，VI是補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基的速度，μ是組織或細(xì)胞的特定生長速度。
12.按照權(quán)利要求1的方法，其中通過將含有0.03-10％二氧化碳的含氧氣體通入培養(yǎng)瓶中，對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)紫杉烷類雙萜的方法,其中自培養(yǎng)的開始階段通過控制培養(yǎng)瓶中氣相氧的濃度低于大氣中氧的濃度、或者自培養(yǎng)的開始階段通過控制與組織或細(xì)胞接觸的液體培養(yǎng)基中溶解氧的濃度低于同樣溫度下飽和溶解的氧濃度,對產(chǎn)生紫杉烷類雙萜的植物組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),然后從所得培養(yǎng)物中回收紫杉烷類雙萜。
文檔編號C12P17/02GK1248630SQ9911015
公開日2000年3月29日 申請日期1999年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月15日
發(fā)明者行宗敬人, 大西直人, 原康弘, 多葉田譽(yù), 東庸介, 菅忠三, 松原浩一 申請人:三井化學(xué)株式會社