專利名稱：生物傳感器的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及能夠簡單、快速地以高精度對試樣中的特定組分進行定量的生物傳感器。
以往，為了能對試樣溶液不作稀釋和攪拌等，就可簡單地對試樣中的特定組分進行定量，設計了各種生物傳感器。以下是生物傳感器的一個例子(日本專利公開公報平2-062952號)。
利用網(wǎng)版印刷等方法，在絕緣性基板上形成由工作電極、對極和參比電極組成的電極系，再在該電極系上固定上含有親水性高分子、氧化還原酶和電子接受體的酶反應層，這樣就構(gòu)成了生物傳感器。
在用以上方法制成的生物傳感器的酶反應層上滴加含有底物的試樣溶液，使酶反應層溶解，酶與底物反應，在進行反應的過程中，電子接受體被還原。酶反應結(jié)束后，被還原的電子接受體進行電化學氧化反應，此時由得到的氧化電流值可以求出試樣溶液中的底物濃度。
通過選擇以底物為測定對象的酶，以上構(gòu)成的生物傳感器理論上可對各種物質(zhì)進行測定。
酶以蛋白質(zhì)為主成分，一般以干燥狀態(tài)被保存于傳感器內(nèi)。
但是，受空氣的溫度和濕度等條件的影響，空氣中的水分會從酶表面向酶內(nèi)部轉(zhuǎn)移。所以，如果酶長時間與空氣接觸，則存在于酶內(nèi)部的水分量將發(fā)生微小變化，造成酶變性，酶活性下降。
制得傳感器后，如果在保存過程中傳感器內(nèi)的酶活性發(fā)生經(jīng)時下降，則會造成與底物反應的酶量不足。所以，導致所得響應電流值和底物濃度不成比例的問題。
解決這個問題的關鍵是使酶周圍的環(huán)境有益于長時間保持酶活性。
此外，在酶反應時使電子和底物的移動等順利進行，提高傳感器的靈敏度也是非常必要的。
鑒于上述問題，本發(fā)明的目的是提供保存過程中可抑制傳感器內(nèi)的酶活性下降，保存穩(wěn)定性較高的生物傳感器。
特別是本發(fā)明還提供了小型、便宜的一次性使用的生物傳感器。
本發(fā)明具備絕緣性基板，設置于前述基板上的至少由工作電極和對極構(gòu)成的電極系，以及形成于前述電極系上的至少包含酶和糖類的反應層。前述酶為選自葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶及果糖脫氫酶中的至少1種。前述糖類為選自海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇及核糖中的至少1種。
本發(fā)明中希望使用的前述酶是以吡咯并喹啉苯醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶，前述糖類是海藻糖。


圖1為本發(fā)明的一個實施例中的生物傳感器的除了反應層之外的平面簡圖。
圖2為同一生物傳感器的主要部分的縱截面圖。
圖3表示本發(fā)明的實施例和比較例的生物傳感器的響應特性。
圖4表示具有不同酶量的反應層的傳感器的響應特性。
圖5表示具有不同海藻糖量的反應層的傳感器保存后的響應值和初期響應值之比。
如上所述，本發(fā)明的生物傳感器的反應層中包含糖類。如果在酶溶液中添加糖類，然后滴下該溶液，使其干燥，作成反應層，就可使酶表面被糖類覆蓋。所以，即使溫度和濕度等環(huán)境條件有所變化，也能夠保護酶，長時間使酶活性穩(wěn)定。
另外，由于糖類易溶于水，所以在反應層中添加試樣溶液，使反應層直接溶解，就能夠使酶反應和電極反應順利進行，很方便。
可獲得上述效果的糖類有很多種，適用于本發(fā)明的生物傳感器的酶也有多種可供選擇。
使用選自葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶及果糖脫氫酶中的至少1種時，反應層中最好是選用海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇及核糖中的至少1種。
特別是使用以吡咯并喹啉苯醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶時，如果使用海藻糖，則可顯著維持前述酶活性，即使傳感器被長時間保存，也能夠獲得良好的傳感器靈敏度。
同時使用以吡咯并喹啉苯醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶和海藻糖時，以3～4μl血液為試樣溶液的拋棄型(一次性)傳感器頂端的前述酶和海藻糖的量一般分別是1～40個單位和4-400nM(毫微克分子量)，最好是5～20個單位和40～20nM。
電子接受體可以是鐵氰化離子、對苯醌及其衍生物、吩嗪硫酸甲酯、亞甲藍、二茂鐵及其衍生物等。以試樣溶液中溶存的氧為電子接受體時，也能夠獲得傳感器響應。
本發(fā)明的生物傳感器的反應層中除了上述酶類和糖類及電子接受體之外，最好還包含親水性高分子。
通過在反應層中添加親水性高分子，能夠防止反應層從電極系表面剝離。而且，具有防止反應層表面出現(xiàn)裂縫的效果，對提高生物傳感器的可靠性也有效。
理想的親水性高分子可使用羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚賴氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明膠及其衍生物、丙烯酸或其鹽的聚合物、甲基丙烯酸或其鹽的聚合物、淀粉及其衍生物、馬來酸酐或其鹽的聚合物、瓊脂糖及其衍生物。
生物傳感器內(nèi)的反應層除了可形成于電絕緣性基板上的電極系上之外，還包括其他各種形態(tài)。例如，可形成于前述基板的電極系上以外的地方，也可使用在前述基板間形成向前述電極系提供試樣溶液的試樣溶液供給通道的覆蓋部件，形成于該覆蓋部件露出于試樣溶液供給通道的表面。
氧化電流的測定方法包括僅由工作電極和對極構(gòu)成的二極電極方式和還包括參比電極的三極方式。三極法的測定準確性更高。
以下，列舉具體的實施例，對本發(fā)明進行更為詳細的說明。
圖1為本發(fā)明的一個實施例中的生物傳感器除去了反應層的平面簡圖。利用網(wǎng)版印刷法在聚對苯二甲酸乙二醇酯構(gòu)成的電絕緣性基板1上涂布含銀糊狀物，形成導線2、3。然后，在基板1上涂布含有樹脂粘合劑的導電性碳糊，形成工作電極4。該工作電極4與導線2接觸。另外，在基板1上涂布絕緣性糊狀物，形成絕緣層6。絕緣層6覆蓋于工作電極4的外周部分，這樣就能夠保持工作電極4的露出部分面積一定。另外，還在基板1上涂布含有樹脂粘合劑的導電性碳糊，使其與導線3接觸，形成環(huán)狀對極5。
圖2為圖1的生物傳感器的縱截面圖。按照圖1制得的電極系上形成了親水性高分子層7和至少含有酶和糖類的反應層8。
實施例1在圖1的基板1的電極上滴加作為親水性高分子的羧甲基纖維素鈉鹽(以下略稱為CMC)的0.5wt％水溶液，然后，在50℃的溫風干燥器中使其干燥10分鐘，形成CMC層7。接著，將5000個單位的以吡咯并喹啉苯醌(以下略稱為PQQ)為輔酶的葡萄糖脫氫酶(以下略稱為GDH)和20μM海藻糖及50μM鐵氰化鉀溶于1ml水中，在CMC層7上滴加該混合溶液4μl，形成反應層8，制得葡萄糖傳感器。
試樣溶液可使用各種濃度的葡萄糖水溶液。在反應層8上滴加調(diào)制而得的試樣溶液。如果向反應層提供含有葡萄糖的試樣溶液，則試樣中的葡萄糖就會被GDH氧化。同時，反應層中的鐵氰化鉀被還原為亞鐵氰化鉀。
在滴加試樣溶液1分鐘后，以對極5為基準，在工作電極4上施加+0.5V的電壓，使亞鐵氰化鉀氧化。5秒鐘后，測定對極和工作電極間的電流值。同樣，測定對應于各種濃度的葡萄糖水溶液的電流值，以橫軸為葡萄糖濃度、縱軸為電流值作圖，制成傳感器的響應特性圖。其結(jié)果如圖3所示。
另外，將同樣制得的生物傳感器保存6個月后，同樣制成響應特性圖。其結(jié)果如圖3所示。
從圖3可看出，濃度和電流值之間有一定相關性，具有良好的直線性。此外，剛制作完畢的傳感器和保存6個月后沒有什么差別，這說明其具備良好的保存性。
比較例1除了不在反應層8中添加海藻糖之外，其他操作與實施例1相同，制得葡萄糖傳感器。然后，與實施例1同樣，制得剛制作完畢的傳感器和保存6個月后的傳感器的響應特性圖。其結(jié)果如圖3所示。
從圖3可看出，所得響應電流值比實施例1低。另外，保存6個月后的傳感器的濃度和電流值之間的相關性下降，其響應電流值也比剛制作完畢時小。
然后，保持反應層中的海藻糖量一定(80nM)，改變以PQQ為輔酶的GDH量，制得傳感器，保存6個月后向反應層提供各種濃度的葡萄糖試樣溶液，測定傳感器的響應性。其結(jié)果如圖4所示。
另外，保存以PQQ為輔酶的GDH量一定(20個單位)，將海藻糖量分別定為4、40、200和400nM，制得傳感器。提供濃度為10mM(毫克分子量)的葡萄糖試樣溶液，分別測定初期和保存6個月后的傳感器響應情況。保存后的響應值和初期響應值之比如圖5所示。
從上述結(jié)果可看出，酶量為1個單位，葡萄糖濃度在600mg/dl以下時，葡萄糖濃度和傳感器響應值呈直線性。酶量超過40個單位，較多時，成本較高。這就說明傳感器頂端的酶量較好為1～40個單位，更好是5～20個單位。另外，海藻糖量為4nM和400nM時，保存性略有下降。所以，在4nM～400nM的范圍內(nèi)較理想，更好是在40～200nM的范圍內(nèi)。
實施例2除了用葡萄糖氧化酶代替葡萄糖脫氫酶之外，其他操作與實施例1相同，制得葡萄糖傳感器。然后，與實施例1同樣，制得剛制作完畢的傳感器和保存6個月后的傳感器的響應特性圖。
其結(jié)果是，葡萄糖濃度和電流值之間存在較高的相關性。另外，保存6個月后，于剛制作完畢時沒有差別，這表示其具備良好的保存性。
比較例2
除了未在反應層8中添加海藻糖之外，其他操作與實施例2相同，制得葡萄糖傳感器。然后，與實施例1相同，制得剛制作完畢的傳感器和保存6個月后的傳感器的響應特性圖。
其結(jié)果是，所得響應電流值低于實施例2。保存6個月后的傳感器的濃度和電流值之間的相關性下降，響應電流值也比剛制作完畢時低。
實施例3除了用果糖脫氫酶代替葡萄糖脫氫酶之外，其他操作與實施例1相同，制得傳感器。
用各種濃度的果糖溶液作為試樣溶液。使用這些試樣溶液，與實施例1同樣，制得剛制作完畢的傳感器和保存6個月后的傳感器的響應特性圖。
其結(jié)果是，果糖濃度和電流值之間存在較高的相關性。保存6個月后，與剛制作完畢時沒有差別，顯現(xiàn)出良好的保存性。
比較例3除了未在反應層8中添加海藻糖之外，其他操作與實施例3相同，制得傳感器。然后，與實施例3相同，制得剛制作完畢的傳感器和保存6個月后的傳感器的響應特性圖。
其結(jié)果是，所得響應電流值低于實施例3。保存6個月后的傳感器的濃度和電流值之間的相關性下降，響應電流值也比剛制作完畢時低。
如上所述，本發(fā)明能夠獲得具備良好的長期保存性的生物傳感器。
權(quán)利要求
1.一種生物傳感器，其特征在于，具備絕緣性基板、設置于前述基板的至少由工作電極和對極構(gòu)成的電極系、以及形成于前述電極系上的至少含有酶和糖類的反應層，前述酶為選自葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶及果糖脫氫酶中的至少1種，前述糖類為選自海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇及核糖中的至少1種。
2.如權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征還在于，前述酶為以吡咯并喹啉苯醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶，前述糖類為海藻糖。
3.如權(quán)利要求2所述的生物傳感器，其特征還在于，前述反應層中含有相當于傳感器頂端的前述葡萄糖脫氫酶1～40個單位，海藻糖4～400nM。
4.如權(quán)利要求2所述的生物傳感器，其特征還在于，前述反應層中含有相當于傳感器頂端的前述葡萄糖脫氫酶5～20個單位，海藻糖40～200nM。
全文摘要
本發(fā)明揭示了可抑制保存時酶活性下降,具備良好保存穩(wěn)定性的生物傳感器。該傳感器具備絕緣性基板、設置于前述基板的至少由工作電極和對極構(gòu)成的電極系、以及形成于前述電極系上的至少含有酶和糖類的反應層,前述酶為選自葡萄糖氧化酶、葡萄糖脫氫酶及果糖脫氫酶中的至少1種,前述糖類為選自海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇及核糖中的至少1種。所用酶為以吡咯并喹啉苯醌為輔酶的葡萄糖脫氫酶時,糖類最好是使用海藻糖。
文檔編號C12Q1/00GK1243952SQ99110178
公開日2000年2月9日 申請日期1999年7月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月3日
發(fā)明者湯川系子, 吉岡俊彥, 南海史朗 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社