專(zhuān)利名稱(chēng)：：利用白細(xì)胞分化抗原(cd)基因芯片的檢測(cè)疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用白細(xì)胞分化抗原(CD)基因芯片檢測(cè)疾病的方法，主要用于血液病的診斷和監(jiān)測(cè)、器官移植的配型等。生物學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了基因組時(shí)代，美國(guó)人類(lèi)基因組計(jì)劃和中國(guó)人類(lèi)基因組計(jì)劃預(yù)計(jì)到2005年，即可獲得人類(lèi)完整的基因(十萬(wàn)個(gè)左右)序列。但是基因定位和序列的獲得僅僅是這些基因的具體的解剖學(xué)定位，要認(rèn)識(shí)這些基因組的生物學(xué)功能，則必需對(duì)基因組表達(dá)的組合模型進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究。因此DNA芯片(基因芯片)技術(shù)在幾年前便應(yīng)運(yùn)而生了。DNA芯片技術(shù)并非是將所有的人體基因繪制成圖，而是找出人群之間、個(gè)體發(fā)育、疾病發(fā)展先后等基因之間的種種區(qū)別點(diǎn)，對(duì)獨(dú)特的基因組合方式進(jìn)行辨認(rèn)。用現(xiàn)階段所有分子生物學(xué)技術(shù)需要十年才能破譯的遺傳密碼，則可以用少數(shù)DNA芯片在短時(shí)間內(nèi)就可以達(dá)到。DNA芯片技術(shù)是一種高度集成的DNA檢測(cè)技術(shù)。首先采用專(zhuān)用自動(dòng)化設(shè)備將幾千甚至幾萬(wàn)個(gè)已知DNA寡核苷酸探針或全序列基因探針排列在玻片或硅片上，然后將待檢測(cè)樣本中的所有DNA成分與芯片探針雜交，有相對(duì)應(yīng)的靶DNA就會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的雜交信號(hào)。理論上可以做到一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)所有基因或可以表達(dá)的基因。因此這種技術(shù)對(duì)胚胎發(fā)育控制的研究、疾病發(fā)生發(fā)展的研究、以及生理病理的研究提供了最佳的研究手段。1995年10月斯坦福大學(xué)第一篇成熟的DNA芯片檢測(cè)技術(shù)發(fā)表在SCIENCE雜志上(SchenaM，etalScience1995，270467)，并成功地檢測(cè)了酵母菌的全部cDNA，和1046個(gè)人類(lèi)基因的檢測(cè)(SchenaM，etalProcNatlAcadUSA1996，9310614-619)。1998年美國(guó)由NIH、NHGRI、NCBI、NCI、NINDS、BEIP、DCRT等國(guó)立研究成立了DNA微芯片開(kāi)發(fā)計(jì)劃(μAP)(http//www.nhgri.nih.gov/dir/1cg/15k/html)，該項(xiàng)目擬利用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行mRNA表達(dá)模型的比較研究，其目標(biāo)是開(kāi)發(fā)一種含有所有mRNA表達(dá)基因的DNA芯片并進(jìn)行定量研究。DNA芯片技術(shù)的設(shè)想可以追溯到90年代初，美國(guó)Affymetrix公司首先開(kāi)始這方面的研究(http//www.affymetrix.com)。由于這項(xiàng)技術(shù)的廣泛的應(yīng)用前景以及巨大的經(jīng)濟(jì)效益，目前美國(guó)的斯坦福大學(xué)、美國(guó)橡樹(shù)嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)室、Incyte商業(yè)公司和Hyseq公司、德國(guó)的自動(dòng)化公司(http//www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/～autom)、都在進(jìn)行全力研究，競(jìng)爭(zhēng)市場(chǎng)份額。國(guó)內(nèi)也有單位開(kāi)始跟進(jìn)了DNA芯片的研究。雖然有人預(yù)測(cè)大約幾年后才會(huì)有真正實(shí)用的DNA芯片上市，然而誰(shuí)開(kāi)始得早，誰(shuí)就會(huì)贏(yíng)得主動(dòng)權(quán)。由于該技術(shù)需要高精度的DNA探針點(diǎn)樣設(shè)備或光刻合成設(shè)備和專(zhuān)用的激光掃描檢測(cè)裝置，尚未普及應(yīng)用。另一個(gè)重要的原因是，檢測(cè)的樣本必需是含有DNA的細(xì)胞或組織，而在臨床上這恰恰又是難以獲得的材料，因此該技術(shù)至今還未應(yīng)用到臨床上。本發(fā)明的目的是提供一種利用白細(xì)胞分化抗原(CD)基因芯片檢測(cè)疾病的方法。為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采取下列措施利用白細(xì)胞分化抗原DNA芯片檢測(cè)疾病的方法，它是收集近172個(gè)用于白細(xì)胞免疫分型的CD抗原的基因，并制成相應(yīng)的DNA寡核苷酸探針，每個(gè)探針的長(zhǎng)度依據(jù)雜交動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)設(shè)定在20～60個(gè)堿基左右，這些寡核苷酸探針在合成時(shí)進(jìn)行5’末端活性基團(tuán)以及活性基團(tuán)與探針之間的連接臂合成標(biāo)記，利用三維DNA點(diǎn)樣裝置將白細(xì)胞分化抗原探針按一定規(guī)律排列在載體玻片或硅片上，經(jīng)過(guò)固定和相關(guān)處理后可以進(jìn)行雜交檢測(cè)，雜交之前必須進(jìn)行被檢測(cè)mRNA(信使核糖核酸)進(jìn)行分離、純化以及互補(bǔ)DNA鏈的合成和熒光分子標(biāo)記，或者利用三明治式共用第二探針進(jìn)行靶分子的顯示，雜交時(shí)，將被標(biāo)記的cDNA分子與DNA芯片共同孵育雜交，應(yīng)用芯片專(zhuān)用掃描儀、共聚焦激光掃描顯微鏡或熒光顯微鏡進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)，根據(jù)各個(gè)探針位點(diǎn)的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，與已有的標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)模型或自身基因表達(dá)模型進(jìn)行比較，提供這些基因表達(dá)的信息，供臨床醫(yī)師或研究人員分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)臨床上，細(xì)菌、病毒的檢測(cè)以及血液病診斷與監(jiān)測(cè)以及白細(xì)胞配型是DNA芯片應(yīng)用的最具潛力的方面。本發(fā)明利用我們組裝的DNA排列設(shè)備(已申請(qǐng)中國(guó)專(zhuān)利)和現(xiàn)有的激光掃描儀，開(kāi)發(fā)可以用于白血病診斷、監(jiān)測(cè)等白血病相關(guān)基因和基因表達(dá)的DNA芯片技術(shù)。根據(jù)白細(xì)胞及正常骨髓容易得到的特點(diǎn)，建立一種高效、快速、并行的白血病染色體易位、斷裂、缺失的檢測(cè)、MDR1、MRP和LRP等與白血病個(gè)體化治療相關(guān)的基因、以及180余種用于白血病診斷、分型的白細(xì)胞分化抗原、MPO、TCR和免疫球蛋白基因的表達(dá)情況，提高診斷效率和診斷準(zhǔn)確性、降低檢測(cè)成本、縮短診斷時(shí)間。同時(shí)作為白血病臨床個(gè)體化治療的重要參考資料，提高臨床用藥的準(zhǔn)確性，降低檢測(cè)和治療成本。除此之外，白細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)還可用于器官移植的免疫配型。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明附圖是白血病分化抗原DNA芯片檢測(cè)和分析示意圖。本發(fā)明總結(jié)和分析了至目前為止用于血液病臨床診斷、病情監(jiān)測(cè)中所使用的各種細(xì)胞免疫表型的免疫分子，以及這些免疫分子相關(guān)的蛋白質(zhì)基因的序列，根據(jù)DNA序列特異性識(shí)別的原理設(shè)計(jì)這些免疫分子的DNA探針。該實(shí)用新型收集近200個(gè)左右用于白細(xì)胞免疫分型的CD抗原(Clustersofdifferentiationantigens)的DNA寡核苷酸片斷，每個(gè)探針依據(jù)雜交動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，其長(zhǎng)度設(shè)定在20～60個(gè)堿基左右。這些寡核苷酸探針在合成時(shí)進(jìn)行5’端活性基團(tuán)標(biāo)記以及活性基團(tuán)與探針之間的連接臂。在DNA芯片制備時(shí)，利用我們已組裝的三維DNA點(diǎn)樣裝置將白細(xì)胞分化抗原探針按一定規(guī)律排列在載體玻片或硅片上，經(jīng)過(guò)固定和相關(guān)處理后可以進(jìn)行下列雜交檢測(cè)。雜交之前必須進(jìn)行被檢測(cè)DNA的標(biāo)記。標(biāo)記擬采取直接標(biāo)記法如將熒光物質(zhì)標(biāo)記的核苷酸類(lèi)似物合成進(jìn)DNA分子，或者利用三明治式共用第二探針進(jìn)行靶分子的顯示?？赏ㄟ^(guò)專(zhuān)用激光芯片掃描儀或共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。雜交時(shí)，將被標(biāo)記的cDNA分子與DNA芯片共同孵育雜交。應(yīng)用芯片專(zhuān)用掃描儀、共聚焦激光掃描顯微鏡或熒光顯微鏡進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)。根據(jù)各個(gè)探針位點(diǎn)的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，與已有的標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)模型或自身基因表達(dá)模型進(jìn)行比較，提供這些基因表達(dá)的信息，供臨床醫(yī)師或研究人員分析。根據(jù)DNA序列特異性識(shí)別的原理設(shè)計(jì)這些白細(xì)胞分化抗原免疫分子的DNA探針。該實(shí)用新型收集近172個(gè)左右用于白細(xì)胞免疫分型的CD抗原的DNA寡核苷酸片斷，每個(gè)探針依據(jù)雜交動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，其長(zhǎng)度設(shè)定在20～60個(gè)堿基左右。為了DNA探針能有效地固定在玻片上，通常在DNA探針合成后進(jìn)行DNA探針5’末端活性基團(tuán)的標(biāo)記，這些活性基團(tuán)有氨基、疏基等，固定DNA的玻片也需進(jìn)行活化處理。通常進(jìn)行活化處理使之表面帶有醛基或氨基，可以與DNA探針形成共價(jià)健。在直接寡核苷酸DNA探針的固定中，先將DNA探針用無(wú)氨基污染的消毒雙蒸水稀釋至10～100pmol/μl和等量5XSSC(標(biāo)準(zhǔn)氯化納檸檬酸鈉雜交液)混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。在進(jìn)行雜交時(shí)，先將合成的已知序列DNA探針固定在芯片的相應(yīng)位置，然后將待檢DNA樣本進(jìn)行熒光標(biāo)記，再與DNA芯片雜交，因此可以同時(shí)檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因。這種方法是一種反向雜交技術(shù)。雜交信號(hào)檢測(cè)可以通過(guò)專(zhuān)用激光芯片掃描儀或共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。掃描獲得的圖像，用芯片圖像專(zhuān)用分析軟件分析每個(gè)基因的雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，從而獲得該基因芯片的基因表達(dá)模型。實(shí)施例1．探針的遴選被選用的白細(xì)胞分化抗原分子都是被證明有不同程度的臨床價(jià)值，這些蛋白質(zhì)大多是位于白血病細(xì)胞或白細(xì)胞表面，可以被相應(yīng)的抗體所識(shí)別，對(duì)這些抗原物質(zhì)的識(shí)別對(duì)于臨床上白血病的診斷以及在臨床病程的監(jiān)控都有重要的價(jià)值。本發(fā)明遴選所有已被證實(shí)有臨床價(jià)值的白細(xì)胞分化抗原的mRNA或相應(yīng)的cDNA作為探針序列的來(lái)源。這些探針的長(zhǎng)度一般是在25～60個(gè)堿基左右。這些基因探針序列如下(不含各種陰性、陽(yáng)性和空白對(duì)照基因探針)。2．寡核苷酸探針5′活性基團(tuán)標(biāo)記包括氨基、巰基的標(biāo)記，以及活性基團(tuán)與DNA分子之間的適宜的碳鏈長(zhǎng)度等，這些間隔的連接臂將增加探針與玻片表面的距離，有利于探針與被檢測(cè)DNA的雜交體的形成。固定DNA的玻片也需進(jìn)行活化處理。通常進(jìn)行活化處理使之表面帶有醛基或氨基，可以與DNA探針形成共價(jià)健。3．DNA探針排列和芯片制作在直接寡核苷酸DNA探針的固定中，先將DNA探針用無(wú)氨基污染的消毒雙蒸水稀釋至10～10pmol/μl和等量5XSSC(標(biāo)準(zhǔn)氯化納檸檬酸鈉雜交液)混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。完成DNA探針的合成之后，啟動(dòng)DNA點(diǎn)樣裝置，在芯片制作控制程序的控制下進(jìn)行DNA探針的打印。通過(guò)DNA打印針每次取一個(gè)DNA探針，通過(guò)三維定點(diǎn)傳遞裝置將DNA探針傳遇到指定的點(diǎn)樣位置。完成一次打印后，荷樣打印針至清洗裝置清洗、干燥，進(jìn)行下一輪DNA探針的點(diǎn)樣，依次類(lèi)推，直至所有DNA探針傳遞點(diǎn)樣完畢。4．檢測(cè)在檢測(cè)時(shí)，首先進(jìn)行被檢測(cè)DNA樣本的抽提、純化，然后作逆轉(zhuǎn)錄，DNA熒物質(zhì)標(biāo)記，再進(jìn)行目標(biāo)DNA與芯片探針雜交。在進(jìn)行雜交時(shí)，先將合成的已知序列DNA探針固定在芯片的相應(yīng)位置，然后將待檢DNA樣本進(jìn)行熒光標(biāo)記，再與DNA芯片雜交，因此可以同時(shí)檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因。這種方法是一種反向雜交技術(shù)。雜交信號(hào)檢測(cè)可以通過(guò)專(zhuān)用激光芯片掃描儀或共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。掃描獲得的圖像，用芯片圖像專(zhuān)用分析軟件分析每個(gè)基因的雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，從而獲得該基因芯片的基因表達(dá)模型。5．結(jié)果解釋該DNA芯片的檢測(cè)目的主要是比較這些基因1表達(dá)的情況，以及所有基因表達(dá)組合的變化，同時(shí)比較某一次檢測(cè)2與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)3基因表達(dá)的差異，如用于血液病的診斷、器官移植的配型；或者病人在經(jīng)過(guò)治療后基因表達(dá)的變化(圖示)(病情監(jiān)測(cè))。所以測(cè)試結(jié)果的判斷，主要依據(jù)①與正常基因表達(dá)模型的比較，即是將檢測(cè)的結(jié)果與眾多已知表達(dá)模型比較，以便了解該檢測(cè)的基因表達(dá)模型是屬于何中類(lèi)型；②與病人自身的比較，觀(guān)察病人的基因表達(dá)模型的改變方向。從而取得這些基因表達(dá)的資料信息，為臨床醫(yī)生服務(wù)。權(quán)利要求1．一種利用白細(xì)胞分化抗原DNA芯片檢測(cè)疾病的方法，其特征在于收集近172個(gè)用于白細(xì)胞免疫分型的CD抗原的基因，并制成相應(yīng)的DNA寡核苷酸探針，每個(gè)探針的長(zhǎng)度依據(jù)雜交動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)設(shè)定在20～60個(gè)堿基，這些寡核苷酸探針在合成時(shí)進(jìn)行5’末端活性基團(tuán)以及活性基團(tuán)與探針之間的連接臂合成標(biāo)記，利用三維DNA點(diǎn)樣裝置將白細(xì)胞分化抗原探針按一定規(guī)律排列在載體玻片或硅片上，經(jīng)過(guò)固定和相關(guān)處理后進(jìn)行雜交檢測(cè)，雜交之前必須進(jìn)行被檢測(cè)mRNA(信使核糖核酸)進(jìn)行分離、純化以及互補(bǔ)DNA鏈的合成和熒光分子標(biāo)記，或者利用三明治式共用第二探針進(jìn)行靶分子的顯示，雜交時(shí)，將被標(biāo)記的cDNA分子與DNA芯片共同孵育雜交，應(yīng)用芯片專(zhuān)用掃描儀、共聚焦激光掃描顯微鏡或熒光顯微鏡進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)，根據(jù)各個(gè)探針位點(diǎn)的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，與已有的標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)模型或自身基因表達(dá)模型進(jìn)行比較，提供這些基因表達(dá)的信息，供臨床醫(yī)師或研究人員分析。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用白細(xì)胞分化抗原基因芯片檢測(cè)疾病的方法，其特征在于所說(shuō)的172個(gè)用于白細(xì)胞免疫分型的CD抗原的基因?yàn)?lt;tablesnum="001"><table>編號(hào)名稱(chēng)標(biāo)記連接臂探針序列(5’→3’)1CD1a5’-NH2--(CH2)6-GGTTCTGGGACTTTTAAATTCAAAT2CD1b5’-NH2--(CH2)6-GCTCAATTGTTTTGGCAATAATAGT3CD1c5’-NH2--(CH2)6-AAGATGTATGTACACAGGCAAGTGA4CD1d5’-NH2--(CH2)6-AATGCTGACGAGACATGGTATCT5CD1e5’-NH2--(CH2)6-CTAATGCTGACGAGACATGGTATCT6CD25’-NH2--(CH2)6-CGAGCACAGAAATCTTAGAGATTTC7CD3d5’-NH2--(CH2)6-ATACAAGGACAAAGAATCTACCGTG8CD3e5’-NH2--(CH2)6-ACTACTGGAGCAAGAATAGAAAGGC</table></tables>全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種利用白細(xì)胞分化抗原DNA芯片檢測(cè)疾病的方法,它是收集近172個(gè)用于白細(xì)胞免疫分型的CD抗原的基因,并制成相應(yīng)的DNA寡核苷酸探針,利用三維DNA點(diǎn)樣裝置將白細(xì)胞分化抗原探針按一定現(xiàn)律排列在載體玻片或硅片上,經(jīng)過(guò)固定和相關(guān)處理后可以進(jìn)行雜交檢測(cè),應(yīng)用芯片專(zhuān)用掃描儀、共聚焦激光掃描顯微鏡或熒光顯微鏡進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè),根據(jù)各個(gè)探針位點(diǎn)的熒光信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)行比較,本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)提高診斷效率和診斷準(zhǔn)確性、降低檢測(cè)成本、縮短診斷時(shí)間。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1284568SQ9911079公開(kāi)日2001年2月21日申請(qǐng)日期1999年8月13日優(yōu)先權(quán)日1999年8月13日發(fā)明者楊夢(mèng)甦,繆金明申請(qǐng)人:楊夢(mèng)甦