專利名稱：以同步化法配合半連續(xù)培養(yǎng)法制備高溫丁醇菌菌體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌體的培養(yǎng)方法。具體地說是以同步化法配合半連續(xù)培養(yǎng)法制備高溫丁醇菌菌體。該方法所得到的菌體可以高轉(zhuǎn)化率地用于石蠟油轉(zhuǎn)化成乙醇和丁醇。
某種厭氣性、嗜熱性、形成內(nèi)生孢子的梭菌屬細(xì)菌可用于限制性代謝生產(chǎn)酵素，抗生素、毒素蛋白質(zhì)或用于經(jīng)丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵法制容劑。詳細(xì)地說，在含有選擇性的防止細(xì)胞任意生長的，可緩慢代謝的碳源培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)使該細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量上可以同步化。同步化的細(xì)胞最少延長到營養(yǎng)細(xì)胞的三倍，此時，細(xì)胞就成為產(chǎn)溶劑的細(xì)菌。同時，如在培養(yǎng)基中添加某一二價陽離子，其濃度不少于0．01M，就可穩(wěn)定細(xì)胞在質(zhì)量和數(shù)量上的同步化。
作為上述理想的梭菌類型是熱解糖梭菌(Clostridumthermosachrolgticum)的種類ATCC7956，．NCA3814。其中可利用的種類有C．perfringens ATCC#13124，C．theromocellum ATCC#27405，C．thermohgdrosnlfuricum ATCC#35045，acetobutylicum ATCC#824，C．thermosul-furigenes ATCC#33743，C．thermoacelicum DSM#521，C．thermoautotrophicum DSM#1974，C．beijerinckii ATCC#25752和C．butyricum ATCC#19398。
利用上述菌種，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可制備出產(chǎn)溶劑的細(xì)菌，其選擇的生長培養(yǎng)基是含有大約0．1-15．0％(W／V)的慢代謝碳源基質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。作為這種碳源可包括苦杏仁苷、阿拉伯糖、纖維二糖、豐乳糖、糖原、密二糖、α甲基葡萄糖苷、β甲基葡萄糖苷、棉子糖、水楊苷、淀粉、海澡糖、木聚糖、乙酸鈣、丁酸鈣、檸檬酸鈣、甲酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣。另外，在培養(yǎng)基內(nèi)添加二價陽離子Ca、Mg、Mn、Fe或、Zn，并為促使大量二價陽離子被利用，可在培養(yǎng)基中加入超過其溶解度的量，這樣，隨著過量二價化合物的溶解，此二價陽離子源便構(gòu)成了進(jìn)行增殖細(xì)胞的合并成分。因而更理想的二價陽離子的濃度為0．1M左右。在上述二價陽離子中葡萄糖鈣是最理想的二價離子源，因?yàn)樗粌H提供所需要的鈣離子，而且，還可做為極好的碳源。
通過常規(guī)的系列稀釋，過濾或離心技術(shù)，生長的細(xì)胞可以達(dá)到同步化。隨后，在最適生長的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)的時間是梭菌至少達(dá)到1×106個／ml所需的時間，大約一個體積的原培體接種于10個體積的木聚糖培養(yǎng)基，后者作為分批培養(yǎng)。直到增加2-3倍的濃度，即大約1．0-1．5代。如此，再進(jìn)行分批培養(yǎng)。用來維持細(xì)胞按照上述代謝途徑進(jìn)行代謝的生長培養(yǎng)基，常用在木聚糖培養(yǎng)基中補(bǔ)充無機(jī)或有機(jī)二價陽離子來制備。而進(jìn)一步如所需終產(chǎn)物只是產(chǎn)溶劑細(xì)胞，最好利用含蛋白胨-酵母膏的培養(yǎng)基，并補(bǔ)充有機(jī)酸的二價鹽作為唯一碳源，其最理想的制備方法是以濃度不小于4．3％(w／v，0．1M)葡萄糖酸鈣作為唯一的緩慢代謝的碳源補(bǔ)充于含有通常組成成分的液體蛋白胨-酵母膏培養(yǎng)基中。
徐經(jīng)上述培養(yǎng)過程的代謝產(chǎn)物可按各種常規(guī)方法來收回。例如，如果產(chǎn)物是高溫下產(chǎn)生的溶劑，在50℃上，可用下述兩種真空發(fā)酵的方法回收。一種方法是“實(shí)驗(yàn)室有機(jī)物導(dǎo)論”，一種現(xiàn)代方法“第548-552頁(W．B／Saunder．1976)”；另一種是“用真空的快速乙醇發(fā)酵及細(xì)胞回收”(生物技術(shù)和工程19卷1125-1143頁，1977)。
但是，在所有試驗(yàn)過的具體方案中，為了使產(chǎn)生溶劑具有較長時期，延長的同步細(xì)胞常常需要一種緩慢代謝的碳源，正常的細(xì)胞分裂必須經(jīng)由溫度的交替或添加化學(xué)生長抑制劑來防止，以及細(xì)胞必須與鈣結(jié)合，即在通常的生長培養(yǎng)基中必須添加葡萄糖酸鈣。另外，培養(yǎng)基的碳源通常為木聚糖，其成本也較高。
本發(fā)明的目的是提供一種以同步化法制備高溫丁醇菌菌體的方法。該方法中培養(yǎng)可使用更廉價的碳源代替木聚糖，并且也可以不補(bǔ)充二價陽離子，即生長培養(yǎng)基中不用添加葡萄糖酸鈣，不但能進(jìn)一步降低制備菌體的成本，并可結(jié)合半連續(xù)的菌體培養(yǎng)法，使制備高溫丁醇菌菌體適于在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明對以同步化法制備高溫丁醇菌菌體的方法進(jìn)行改進(jìn)而提出一種更簡便易于工業(yè)化生產(chǎn)的菌體培養(yǎng)方法。具體地說，本發(fā)明的以同步化法制備高溫丁醇菌菌體的方法包括原菌種培養(yǎng)和分批培養(yǎng)，其特征在于分批培養(yǎng)的同步化過程在不含二價陽離子的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行，并且每當(dāng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度達(dá)到1-6×109個／ml時就進(jìn)行稀釋，稀釋用與分批培養(yǎng)相同的生長培養(yǎng)基，把培養(yǎng)體以1／2以上的稀釋比例進(jìn)行稀釋，最終得到用于石蠟油轉(zhuǎn)化為乙醇和丁醇的，細(xì)胞濃度為1-3×109個／ml的同步的高溫丁醇菌種。
在上述本發(fā)明的方法中，其分批培養(yǎng)的不含二價陽離子的生長培養(yǎng)基含有0．1-15．0％(W／V)的慢代謝碳源，所謂慢代謝碳源可選擇修飾玉米淀粉?；蚺从衩椎矸?。
其中更可取的是玉米淀粉。
另外，上述本發(fā)明的方法中當(dāng)培養(yǎng)體中的細(xì)胞濃度最好達(dá)到1-3×109個／ml時就進(jìn)行稀釋，并且把培養(yǎng)體以1／15以下的稀釋比例進(jìn)行稀釋。在分步培養(yǎng)中，雖然培養(yǎng)體的稀釋可以按任何比例進(jìn)行，但是當(dāng)稀釋比例小于1／2時，稀釋進(jìn)行的頻率過快不利工業(yè)化生產(chǎn)，同時培養(yǎng)體的生產(chǎn)效率低，而當(dāng)稀釋比例大于1／15時，每步培養(yǎng)進(jìn)行的時間過長，也難于提高生產(chǎn)效率。因此，合適的稀釋比例為1／2-1／15，最理想的稀釋比例為1／8-1／11。
按照上述本發(fā)明的以同步化法制備高溫丁醇菌種的方法中，由于分批培養(yǎng)是用同樣的生長培養(yǎng)基進(jìn)行，因此，可在同一發(fā)酵罐中，通過加入生長培養(yǎng)基的方法進(jìn)行培養(yǎng)體的稀釋。這樣可實(shí)現(xiàn)半連續(xù)的進(jìn)行菌種的培養(yǎng)，使該法易于在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。另外，培養(yǎng)體的稀釋也可在不同發(fā)酵罐中進(jìn)行，即先在一發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)達(dá)到一定量的培養(yǎng)體之后，再分別于不同發(fā)酵罐中進(jìn)行接近用于發(fā)酵石蠟油量的分批培養(yǎng)，提高設(shè)備的使用效率，同時可實(shí)現(xiàn)半連續(xù)式的發(fā)酵過程。因此，本發(fā)明的方法是以分步化配合半連續(xù)培養(yǎng)法來制備高溫丁醇菌種。
在上述的本發(fā)明的方法中，菌種采用嗜高溫厭氣菌梭芽孢桿菌(clostridium thermosaccharolgticum)ATCC7956?？衫玫姆N類如前所述有C．perfringens ATCC#13124，C．theromocellum ATCC#27405，C．thermohgdrosulfuricum ATCC#35045，C．a(chǎn)cetobutylicum ATCC#824，C．thermosul-furigenes ATCC#33743，C．thermoacelicum DSM#521，C．thermoautotrophicum DSM#1974，C．beijerinckii ATCC#25752和C．butyricum ATCC#19398。使得生長著的細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上的同步化過程，并改變了野生型梭芽孢桿菌ATCC#7956在純培養(yǎng)中的細(xì)胞分化。有關(guān)菌種原種培養(yǎng)及培養(yǎng)的制備都可參照常規(guī)的技術(shù)進(jìn)行。
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)給予進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1梭芽孢桿菌的培養(yǎng)1．菌種梭芽孢桿菌ATCC#7956；2．原種培養(yǎng)基豌豆肉湯培養(yǎng)基六顆干燥的阿拉斯加種豌豆加入10ml 2％蛋白胨溶液中，滅菌15分鐘，立即用2ml滅菌石蠟油覆蓋。
3．原種培養(yǎng)將處于對數(shù)生長的梭芽孢桿菌的培養(yǎng)體接種于豌豆肉湯培養(yǎng)基中，隨后在56℃下培養(yǎng)8小時。
4．分批培養(yǎng)將1ml上述原種培養(yǎng)所得的培養(yǎng)體接種于10ml新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中作為分批培養(yǎng)。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基0．2％蛋白胨，0．5酵母膏，0．1％(NH4)2SO4，0．01％CaCl2·2H2O，0．01％MgSO4，0．01％MnSO4·H2O，0．0005％ZnSO4·7H2O，0．0005％CuSO4·5H2O，0．0001％(NH4)6Mo7O24·4H2O，0．000002％對氨基苯甲酸，0．0001％鹽酸硫胺，0．0000001％生物素。
溶于1L水中鹽酸硫胺和生物素經(jīng)過過濾除菌，再加入滅菌后的培養(yǎng)基中，加入0．55％(W／V)玉米淀粉于培養(yǎng)基作為碳源。培養(yǎng)基用1M NaOH調(diào)至pH7后滅菌。接種前培養(yǎng)基在56℃預(yù)溫。
分批培養(yǎng)步驟所有的步驟均采用Hungate方法在無菌條件下進(jìn)行。原種培養(yǎng)活化后，轉(zhuǎn)接于預(yù)溫的含有0．55％玉米淀粉做為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接著在56℃下培養(yǎng)六小時，此時細(xì)胞的濃度大約為5×106，1ml的這種液體培養(yǎng)體無菌地轉(zhuǎn)接于10ml預(yù)溫的新鮮玉米淀粉基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再讓它做為分批培養(yǎng)在56℃下生長。
10小時后，培養(yǎng)體中的細(xì)胞濃度大約為1-2×109／ml。
重復(fù)轉(zhuǎn)移到玉米淀粉培養(yǎng)基生長在六小時內(nèi)而同步化的培養(yǎng)體，進(jìn)一步在玉米淀粉培養(yǎng)基中生長45小時，證明了細(xì)胞在數(shù)量和質(zhì)量上均有高度的同步化。按常規(guī)方法由差別計(jì)數(shù)表明了細(xì)胞質(zhì)量上的同步化可達(dá)69．3％。數(shù)量上的上述同步化可達(dá)76．7％。90％以上的同步化的產(chǎn)溶媒的細(xì)胞至少延長四倍，并且顯示一種修飾過的細(xì)胞分裂保持在至少4倍于營養(yǎng)細(xì)胞長度的特定長度上。折光性的孢子幾乎可以忽略不計(jì)。
實(shí)施例2高溫丁醇菌菌體的制備A將實(shí)施例1制備的培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)8小時，得活化的細(xì)胞，稀釋10倍接種至120ml的相同玉米淀粉為碳源的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)1．5世代濃度達(dá)1-2×109個／ml后。轉(zhuǎn)移至1．5L發(fā)酵罐含玉米淀粉為碳源的產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，稀釋10倍，培養(yǎng)溫度維持56℃，控制攪拌速率及通氣量，在發(fā)酵罐中進(jìn)行同步培養(yǎng)，制備同步的產(chǎn)溶劑細(xì)胞，當(dāng)濃度達(dá)到2-3×109個／ml，迅速降溫至30℃，停止細(xì)胞繼續(xù)分裂，即可得到可用于石蠟油發(fā)酵轉(zhuǎn)換為乙醇和丁醇的本發(fā)明的高溫丁醇菌體A。第一次將活化培養(yǎng)體稀釋10倍接種到120ml的培養(yǎng)過程約8小時。第二次接種至1．5L發(fā)酵罐的培養(yǎng)過程約10小時。由培養(yǎng)液內(nèi)菌種的濃度決定進(jìn)行稀釋的操作。
實(shí)施例3高溫丁醇菌菌體的制備B除下列步驟外，其他步驟同實(shí)施例2。第二次接種至1．5L發(fā)酵罐中后以含玉米淀粉為碳源的產(chǎn)孢培養(yǎng)基稀釋2倍，當(dāng)濃度達(dá)到1-2×109個／ml時，再用同樣培養(yǎng)基稀釋5倍，在發(fā)酵罐進(jìn)行第三次同步培養(yǎng)，制備高溫丁醇菌體B。實(shí)施例3制備高溫丁醇菌種B需要20小時。
實(shí)施例4高溫丁醇菌菌體的制備C除下列步驟外，其他步驟同實(shí)施例2。在第一次于120ml培養(yǎng)基中經(jīng)培養(yǎng)1．5世代濃度達(dá)1-2×109個／ml后再以同樣培養(yǎng)基稀釋100倍接種到1．5L發(fā)酵罐中，制備高溫丁醇菌體C，該制備過程需要28小時。
實(shí)施例5 高溫丁醇菌菌體用于石蠟油轉(zhuǎn)換成乙醇和丁醇1在上述實(shí)施例2進(jìn)行后，用1ml孔徑通氣針頭由發(fā)酵罐度部通氣。通氮?dú)膺^程共須10分鐘，每分鐘沿圓周移動一次，氮?dú)饬魉偌s400ml／ml。
通氮?dú)?分鐘后，緩緩將150ml礦物油沿邊緣加入，覆蓋于培養(yǎng)基上。通氮?dú)?0分鐘后，緩緩取出通氣針頭，并將氮?dú)獬錆M發(fā)酵罐上部空間，之后在保持30℃下進(jìn)行210小時發(fā)酵。
上述1．5公升的發(fā)酵槽中，攪拌和通氣均為自動化的控制系統(tǒng)，將發(fā)酵罐中原有的攪拌器底部加裝不銹鋼絲，改裝成發(fā)酵槽的刮削器，用以均勻攪拌并防止細(xì)胞間產(chǎn)生凝聚現(xiàn)象。而通氣系統(tǒng)則是以定時器及通氣控制閥定時控制氮?dú)馔ㄈ氲牧考巴鈺r間。通常將刮削器轉(zhuǎn)速控制為160rpm，通氣的時間大約控制為每兩小時通氮?dú)?-15分鐘，氮?dú)獾牧魉賱t為150-250ml／min，氮?dú)饧兌葹?9．99％(vo／vol)，發(fā)酵溫度則控制為30℃。
在1．5公升發(fā)酵罐中進(jìn)行210小時之后，將發(fā)酵液取出，離心之后，以氣相層析儀分析發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)積分計(jì)算其結(jié)果，測得乙醇最終濃度為3．95％(vo／vol)，異丙醇最終濃度為4．15％(vo／vol)，丁醇最終濃度為8．7％(vo／vol)，合計(jì)得有機(jī)溶劑16．8％(vo／vol)。
上述發(fā)酵產(chǎn)物分析是于實(shí)驗(yàn)過程中取出發(fā)酵液1ml，在12，000xg轉(zhuǎn)速下離心10分鐘；取上層澄清部分，再離心5分鐘，重復(fù)兩次，最后將此處理過程的樣品冷藏于4℃，待分析。
發(fā)酵產(chǎn)物的測定，包括乙醇、丁醇、異丙醇或丙酮等，皆由氣相層析儀分析。每次取處理過的樣品0．2ml注入氣相層析儀(Hewlett-Packardmodel HP 5890A gas chromatograph)等中分析；使用長30m，內(nèi)徑0．32mm，填充物Rtx-225(Retek Co．，USA)的毛細(xì)管柱；oven的初溫設(shè)定為60℃，維持5分鐘，之后以4℃／分加熱，末溫設(shè)定為180℃；注射口設(shè)定溫度200℃，火焰離子偵測器設(shè)定溫度220℃；載氣體為氮?dú)?，氣體液速為1ml／分。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，基質(zhì)中含玉米淀粉、石蠟油及水，還有通入細(xì)胞液中的氧分子，而培養(yǎng)基中占比例最高的水也是可能的基質(zhì)。細(xì)胞利用上述的基質(zhì)可用來增加細(xì)胞質(zhì)量，或釋放出二氧化碳，并將之轉(zhuǎn)換為乙醇、異丙醇、正丁醇等發(fā)酵產(chǎn)物。
在1．5L發(fā)酵罐中，計(jì)算得0．55％(vo／vol)玉米淀粉72．5g，覆蓋于培養(yǎng)基上的石蠟油最后被消耗掉150ml，而石蠟油的平均密度為0．86，因此當(dāng)作基質(zhì)部分的石蠟油為129g。根據(jù)細(xì)胞濃度(1010個／nl)，發(fā)酵液體積(1500ml)，及細(xì)胞干重(8×1013g／細(xì)胞)，可計(jì)算得細(xì)胞質(zhì)量為12．0g。生長時所釋放出的CO2則可根據(jù)理論計(jì)算，得知其摩爾數(shù)為0．4mol；此外，發(fā)酵產(chǎn)物為乙醇、異丙醇和丁醇，最終濃度分別為3．95％，4．15％，8．7％(vo／vol)，由于三者的密度分別為0．79，0．78，0．81g／cm3，計(jì)算得其重量分別為46．8，48．8，105．6g。由各基質(zhì)及產(chǎn)物的質(zhì)量或摩爾數(shù)，可計(jì)算其碳、氫、氧的摩爾數(shù)，并計(jì)算碳、氫、氧的回收率。經(jīng)計(jì)算結(jié)果，碳的回收率高達(dá)97．9％，這足以證明消耗掉的150ml石蠟油，完全被轉(zhuǎn)換為產(chǎn)物。事實(shí)上，培養(yǎng)基中的碳源，大部分用來做菌體及CO2，石蠟油的碳則完全轉(zhuǎn)換為乙醇丁醇及異丙醇的碳骨架。由計(jì)算可知，本發(fā)明制備出的高溫丁醇菌體的確有分解飽和碳?xì)浠衔?如石蠟油)的能力。
實(shí)施例6高溫丁醇菌菌體用于石蠟油轉(zhuǎn)換成乙醇和丁醇2除下述步驟外，按實(shí)施例5所述的方法分別在實(shí)施例3和4進(jìn)行后充入300ml石蠟油，通氮?dú)獾牧魉贋?00ml／分，在120小時內(nèi)分別向?qū)嵤├?和4的發(fā)酵罐中充入純度99．9％的氮?dú)?70ml和260ml。發(fā)酵期間結(jié)束后對實(shí)施例3和4發(fā)酵罐中乙醇和丁醇會計(jì)濃度分別為3．22％和2．92％。
實(shí)施例7除用含1．1％(W／V)糖密作碳源的培養(yǎng)基代替0．55％(W／V)玉米淀粉作碳源的培養(yǎng)基外，按實(shí)施例3的方法和實(shí)施例6的方法制備高溫丁醇菌和用于石蠟轉(zhuǎn)換成乙醇和丁醇發(fā)酵，發(fā)酵其結(jié)束后乙醇和丁醇合計(jì)濃度為2．98％。
比較例梭芽孢桿菌的制備及用于石蠟油轉(zhuǎn)換除下述步驟外，按實(shí)施例3制備出適用于石蠟油轉(zhuǎn)換成乙醇和丁醇的培養(yǎng)體。其中第一次培養(yǎng)基中碳源合0．5％(W／V)木聚糖，第二次發(fā)酵罐中采用含0．5％(W／V)木聚糖和4．3％葡萄糖酸鈣的培養(yǎng)基。
制備出培養(yǎng)體后再按實(shí)施例6的步驟與實(shí)施例3相同的方法進(jìn)行石蠟油的發(fā)酵。發(fā)酵期結(jié)束后乙醇和丁醇合計(jì)濃度為3．15％。
由上述實(shí)施例和比較例的結(jié)果可以看到，本發(fā)明只利用廉價的玉米淀粉作為碳源所配制的培養(yǎng)基就可制備出適于石蠟轉(zhuǎn)換成乙醇和丁醇的高溫丁醇菌，并得到與用木聚糖和葡萄糖酸鈣為碳源的培養(yǎng)基相近的由石蠟油制乙醇和丁醇的產(chǎn)率。但是本發(fā)明的方法在操作中比目前的方法更簡單，發(fā)酵條件易控制，可實(shí)現(xiàn)半連續(xù)化的工業(yè)生產(chǎn)，同時作為以玉米淀粉碳源的成本也比采用木聚糖和葡萄糖酸鈣要降低25-40％。
權(quán)利要求
1．一種以細(xì)胞分化同步化法法制備高溫丁醇菌菌體的方法，包括原菌種培養(yǎng)和分批培養(yǎng)，其特征在于，分批培養(yǎng)的同步化過程在不含二價陽離子的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行，并且每當(dāng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度達(dá)到1-6×109個／ml時就進(jìn)行稀釋，稀釋用與分批培養(yǎng)相同的生長培養(yǎng)基，把培養(yǎng)體以1／2以上的稀釋比例進(jìn)行稀釋，最終得到細(xì)胞濃度為1×109-5×1010／ml的同步的高溫丁醇菌體。
2．按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其分批培養(yǎng)的不含二價陽離子的生長培養(yǎng)基含有0．1-15．0％(W／V)的慢代謝碳源，所謂慢代謝碳源可選擇修飾玉米淀粉或糯玉米淀粉。
3．按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，把培養(yǎng)體以1／2-1／15的比例進(jìn)行稀釋。
4．按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，把培養(yǎng)體以1／8-1／11的比例進(jìn)行稀釋。
5．按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每當(dāng)培養(yǎng)其中的細(xì)胞濃度達(dá)到1-2×109個／ml時就進(jìn)行稀釋，最終得到細(xì)胞濃度為2-3×109個／ml的同步的高溫丁醇菌體。
全文摘要
一種以細(xì)胞分化同步化法制備高溫丁醇菌菌體的方法,包括原菌種培養(yǎng)和分批培養(yǎng),分批培養(yǎng)的同步化過程在不含二價陽離子的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行,并且每當(dāng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度達(dá)到1－6×10
文檔編號C12P7/16GK1282790SQ99111180
公開日2001年2月7日 申請日期1999年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月29日
發(fā)明者毛桂震, 許駿發(fā) 申請人:毛桂震, 許駿發(fā)