專利名稱：香蕉束頂病毒中國漳州分離物基因組1和4的全序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及香蕉束頂病毒(Banana Bunchy Top Virus，BBTV)基因組基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及BBTV DNA 1和4的全序列；BBTV DNA1和4各開放閱讀框架其編碼的氨基酸的序列；BBTV DNA 1和4開放閱讀框架其編碼的氨基酸的正向和反向的核苷酸序列及其由此衍生的重組質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因植物，以增強(qiáng)香蕉抗BBTV能力；BBTV DNA 1和4開放閱讀框架其編碼氨基酸的全部核苷酸序列或部分核苷酸序列及其互補(bǔ)序列，并用于BBTV的PCR診斷；BBTV DNA 1和4基因間區(qū)(非編碼區(qū))的序列或互補(bǔ)序列有高達(dá)20％的變異度；含有BBTV DNA 1和4非編碼區(qū)核苷酸序列及其缺失核苷酸序列的重組質(zhì)粒，并提供在目的基因上游，以調(diào)節(jié)目的基因在轉(zhuǎn)基因的單子葉或雙子葉植物中的組成性或組織特異性的表達(dá)。
香蕉束頂病是香蕉病害中最為嚴(yán)重的一種，其癥狀為葉片外緣黃化，葉脈、葉柄和假莖具墨綠色條紋，束頂及明顯矮化，嚴(yán)重時(shí)造成毀滅性災(zāi)害，此病正在世界(包括中國)的香蕉種植區(qū)蔓延。Harding[1]和Thomas[2]等人1991年報(bào)道從感病香蕉組織中純化到18～20nm等軸球形病毒顆粒，其外殼蛋白分子量為20,100。Thomas[2]等人用蕉芽(Pentalonianigronervosa)成功地進(jìn)行了此提純物的回接試驗(yàn)，證明BBTV是引起香蕉束頂病的病原。Harding等人[3]1993年報(bào)道克隆了BBTV的一個(gè)基因組(BBTV DNA 1)，同時(shí)證明BBTV基因組是環(huán)狀單鏈DNA?；诖嬖谝粋€(gè)dNTP-位點(diǎn)(GGEGKT)，推測主要閱讀框架可能編碼一個(gè)復(fù)制酶。然而并沒有找到能編碼外殼蛋白這樣大小的閱讀框架，估計(jì)BBTV基因組不止這一個(gè)組分。此后，Burns等人[4](1994)研究表明BBTV基因組至少含有5個(gè)或可能7個(gè)組分。Karan等人[5](1994)克隆了來自10個(gè)不同地域BBTV分離物的BBTV DNA 1，分析表明可分成兩個(gè)組，南太平洋組(澳大利亞、埃及、斐濟(jì)、印度等7個(gè)分離物)和亞洲組(菲律賓、中國臺(tái)灣和越南3個(gè)分離物)，平均序列差異每組內(nèi)為1.9～3.0％，兩組之間大約10％，主要開放閱讀框架編碼的蛋白質(zhì)差異大約為5.0％。Xie等人[6](1994)從夏威夷分離物克隆了BBTV DNA 1，2和5，序列分析表明均屬南太平洋組。Burns等人[7](1995)分析了BBTV DNA 1～6序列。Wanitchakorn等人[8](1997)確認(rèn)BBTV DNA 3可編碼20kDa的外殼蛋白。Dugdale等人[9](1998)曾報(bào)道了BBTV DNA 1～6基因間區(qū)(非編碼區(qū))在轉(zhuǎn)基因植物中具有不同的啟動(dòng)子活性。肖火根等人[11]在1999年也報(bào)道了中國廣東分離物BBTV DNA 1全序列以及DNA 3和4編碼區(qū)的序列(屬亞洲組)。
澳大利亞昆士蘭大學(xué)(Queensland University)《BBTV DNA序列》專利(WO96/38564)曾報(bào)道BBTV DNA 3，4和6的序列、相應(yīng)于開放閱讀框架的DNA和氨基酸序列。以及在《BBTV基因間區(qū)》專利(WO96/38554)中報(bào)道BBTV DNA 1～6元件基因間區(qū)一部分片段或衍生自所說的基因間區(qū)DNA分子或其互補(bǔ)序列有高達(dá)20％的變異度；含有上述DNA分子，能增強(qiáng)在單子葉和雙子葉植物細(xì)胞中表達(dá)目的基因。
而本發(fā)明具體涉及的中國漳州地區(qū)分離物BBTV DNA1和BBTV DNA4它們有別于已有報(bào)道。本發(fā)明在純化BBTV中國漳州分離物和研究其理化特性[10]基礎(chǔ)上參考亞洲組BBTV DNA 1編碼區(qū)序列[5]設(shè)計(jì)了兩個(gè)非相鄰的引物，以漳州地區(qū)具典型香蕉束頂病癥狀的香蕉組織總DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到約500bp片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBV1-1/2，測序后序列分析確定是BBTV DNA 1的部分(半長)序列。按測知的半長序列設(shè)計(jì)了一對(duì)相鄰引物，以漳州地區(qū)感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得約1kb片段，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBV1，測序表明漳州分離物BBTV DNA 1全長為1,104個(gè)核苷酸(已被GenBank/EMBL/DDBJ接收，Accession numberAF110266，將于1999年12月31日公開)。與澳大利亞、中國臺(tái)灣和廣東分離物BBTV DNA 1比較，其核苷酸序列同源性分別為89％、96％和95％；編碼區(qū)核苷酸序列同源性分別為91％、96％和95％；與澳大利亞分離物BBTVDNA 1比較其非編碼區(qū)的主要共同(CR-M)區(qū)序列同源性為69％。所以漳州分離物BBTV DNA 1應(yīng)歸屬于亞洲組的新分離物。
按照漳州分離物BBTV DNA 1非編碼區(qū)的(CR-M)區(qū)序列設(shè)計(jì)了三對(duì)非相鄰的引物，以漳州分離物BBTV DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。只有用其中一對(duì)非相鄰的引物擴(kuò)增出約1kb的片段，重組質(zhì)粒命名為pCM21，pCM22，在已測知序列編碼區(qū)又設(shè)計(jì)了一對(duì)相鄰引物，以漳州分離物BBTV DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得獲得約1kb片段，重組質(zhì)粒命名為p400，p700，p160，測序表明漳州分離物BBTV DNA 4全長為1,039個(gè)核苷酸。序列分析指出與澳大利亞分離物BBTV DNA 4核苷酸序列同源性為79％。與澳大利亞和中國廣東分離物編碼區(qū)氨基酸序列同源性分別為81％和87％。其非編碼區(qū)的CR-M區(qū)與澳大利亞分離物BBTV DNA 4的CR-M區(qū)序列同源性為70％。因此漳州分離物BBTV DNA 4也應(yīng)歸屬于亞洲組，而且是亞洲組內(nèi)第一次報(bào)道BBTV DNA 4的全序列。
綜上所述，本發(fā)明與澳大利亞昆士蘭大學(xué)專利所涉及的BBTV DNA序列不屬于同一組，并且序列變異度超出20％。本發(fā)明提供了漳州分離物BBTVDNA 1和4的全序列；DNA 1由1,104nt組成(

圖1)；DNA 4由1,039nt組成(圖5)；兩個(gè)序列非編碼區(qū)的CR-M區(qū)同源性為82％；DNA 1有一個(gè)861核苷酸序列編碼286個(gè)氨基酸殘基組成的分子量為33kDa的蛋白質(zhì)(含有dNTP-結(jié)合位點(diǎn)GGEKT(圖2)，推測可能編碼與BBTV復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì))和129核苷酸序列編碼42個(gè)氨基酸殘基組成的分子量為5kDa的小蛋白質(zhì)；DNA 4有一個(gè)351核苷酸序列編碼116個(gè)氨基酸殘基組成的分子量為15.5kDa的蛋白質(zhì)，其N末端含有大約30個(gè)疏水性氨基酸殘基(圖6)，推測可能編碼一個(gè)運(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)；本發(fā)明還包括漳州分離物BBTV DNA 1和4基因間區(qū)(非編碼區(qū))的序列或互補(bǔ)序列并有高達(dá)20％的變異度。
圖1BBTV漳州分離物DNA 1的全長核苷酸序列。劃虛線的部分核苷酸為CR-M區(qū)圖2BBTV漳州分離物DNA 1開放閱讀框架編碼33kDa大蛋白的氨基酸序列。
圖3CTAB法提取的香蕉病株和健康株組織的總DNA的PCR結(jié)果比較11kb DNA Lader2以健康香蕉組織的總DNA為模板的PCR；3作1103稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR4作1104稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR
5作1105稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR6作1106稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR7作1107稀釋的感染BBTV的香蕉組織總DNA為模板的PCR圖4含BBTV漳州分離物DNA 1編碼區(qū)重組質(zhì)粒構(gòu)建模式圖。
圖5BBTV漳州分離物DNA 4的全長核苷酸序列。
圖6BBTV漳州分離物DNA 4開放閱讀框架編碼15.5kDa蛋白的氨基酸序列。
圖7BBTV漳州分離物DNA 4非編碼區(qū)核苷酸序列。
圖8BBTV漳州分離物DNA 4非編碼區(qū)部分缺失核苷酸序列1圖9BBTV漳州分離物DNA 4非編碼區(qū)部分缺失核苷酸序列2圖10含漳州分離物DNA 4表達(dá)編碼區(qū)基因的雙元載體的構(gòu)建模圖。
引物A5’-CTCCATGGCGCGATATGTGGT-3’Nco I引物B5’-CTGCAGACCCAAATA/TATG/TCTTCGAT-3’Pst I引物C5’-CAGGCGCACACCTTGAGAAACG-3’引物D5’-GGAAGAAGCCTCTCATCTGCTTC-3’1.2 pBluescript II SK T-載體的制備取3μg pBluscript II SK質(zhì)粒，在100μl體系中用0.5μl EcoR V(10u/μl)37℃酶切反應(yīng)1h，取2μl電泳檢查。酚∶氯仿∶異戊醇混合溶液(25∶24∶1)抽提上述溶液并用乙醇沉淀、70％乙醇洗滌。此酶切載體在100μl PCR擴(kuò)增體系(含10u/μlTaq0.5μl、2mmol/L dTTP)中，72℃反應(yīng)2h，對(duì)此反應(yīng)液進(jìn)行酚抽提純化并在50μl連接反應(yīng)體系(含10u/μlT4DNA連接酶2μl)中，16℃反應(yīng)12h后電泳回收約3kb DNA片段。1.3 感染BBTV香蕉組織總DNA的提取從-70℃冰箱中取出經(jīng)液氮研磨好的來自漳州的感染BBTV香蕉組織50mg，加入300μl CTAB提取緩沖液(100mmol/L Tris，pH8.0、1.4mol/LNaCl、20mmol/L EDTA、2％ CTAB)，65℃溫浴30min。加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合溶液，顛倒混勻，12000r/min離心5min，取上清液并加入等體積4℃預(yù)冷的氯仿∶異戊醇(24∶1)混合溶液，顛倒混勻，12000r/min離心5min，向回收的上清溶液中加入預(yù)冷的等體積異丙醇或兩倍體積的無水乙醇，12000r/min 離心5min，再用70％乙醇洗滌一次，乙醇揮發(fā)干后加入50μl滅菌去離子水，取5μl電泳檢查。1.4 BBTV DNA 1的半長克隆的構(gòu)建PCR擴(kuò)增體系中，每種dNTP為2mmol/L，兩個(gè)半長克隆的引物A、B分別是0.4μmol/L，Taq plus II 0.03u/μl，DNA模板1％(V/V)。PCR擴(kuò)增條件是94℃預(yù)變性4min；94℃ 1min，51℃ 1min，72℃ 30s，循環(huán)30次；72℃ 10min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(500多bp的片段)經(jīng)純化回收后，與pBluscript II SKT-載體以8∶1的摩爾數(shù)比在16℃下進(jìn)行連接反應(yīng)8h后，取0.5μl電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliJM109后，涂于含X-Gal和IPTG的氨芐青霉素(50μg/μl)LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)8h，挑選白色菌落，提取質(zhì)粒后用EcoR I和Hind III酶切后電泳分析，選出陽性重組質(zhì)粒pBV1-1/2。1.5 BBTV DNA 1的全長克隆的構(gòu)建PCR擴(kuò)增體系與以上類同，引物C與引物D代替引物A與引物B。PCR擴(kuò)增條件是94℃預(yù)變性4min；94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 30s，循環(huán)30次；72℃ 10min。引物C、D的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(1,104kb片段)克隆方法如1.4。通過EcoR I和Hind III雙酶切分析，選出陽性重組質(zhì)粒pBV1。1.6漳州分離物BBTV DNA 1編碼大蛋白質(zhì)的開放閱讀框架克隆的構(gòu)建PCR擴(kuò)增體系中，每種dNTP為2mmol/L，兩個(gè)引物A、E分別是0.4μmol/L，Taq plus II 0.03u/μl，感病香蕉組織總DNA為1％(V/V)。PCR條件是94℃預(yù)變性4min；94℃ 1min，51℃ 1min，72℃ 1min，循環(huán)30次；72℃ 10min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(500多bp的片段)經(jīng)純化回收后，經(jīng)Klenow補(bǔ)平后，再用EcoR I酶切并回收大片段。pBluscript II SK經(jīng)Smal I和EcoR I雙酶切后，回收大片段。回收后的兩個(gè)片段在16℃下進(jìn)行連接反應(yīng)8h后，取0.5μl電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliJM109后，涂于含X-Gal和IPTG的氨芐青霉素(50μg/μl)LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)8h，挑選白色菌落，提取質(zhì)粒后用EcoR I和HindIII酶切后電泳分析，選出陽性重組質(zhì)粒pBtvorf1(圖4)。
PCR擴(kuò)增條件為(1)94℃ 4min。(2)94℃ 50s，63℃ 50s，72℃ 1min?？偣?5個(gè)循環(huán)。(3)72℃ 10min。
PCR擴(kuò)增體系如下每種引物濃度為10pmol，dNTPs為200μmol/L，Taq plus II為1u，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，0.1％ Triton X-100， BBTV DNA為1μl，反應(yīng)體積為50μl。
只有用引物1和引物2這對(duì)引物才擴(kuò)增出約1kb的片段。為了保證擴(kuò)增特異性，采用了較高的退火溫度(63℃)，同時(shí)調(diào)節(jié)了引物濃度，以及BBTV DNA的量。從瓊脂糖凝膠中回收并純化約1kb大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用Klenow酶補(bǔ)平其兩端，同時(shí)純化經(jīng)EcoR V酶切的pBluescriptII-KS載體。將上述兩片段在16℃的溫度下連接12-16h，并轉(zhuǎn)化采用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5α。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于涂有40μl X-gal(20mg/ml)，4μl IPTG(200mg/ml)的氨芐青霉素(60μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，然后在37℃溫箱中培養(yǎng)12-16h。挑選白色菌落在上述LB固體培養(yǎng)基上劃線繼續(xù)培養(yǎng)12-16h，之后轉(zhuǎn)移到含氨芐青霉(60μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12-16h。采用煮沸法或者堿法提取質(zhì)粒。能用雙酶(Kpn I，EcoRI)切出，同時(shí)PCR也能擴(kuò)增出約1kb大小片段的質(zhì)粒的克隆為陽性克隆。通過這種方法檢測得到了二個(gè)陽性克隆pCM21和pCM22。通過手工測序和機(jī)器測序并進(jìn)行序列分析，得知這二個(gè)陽性克隆的序列完全一致，而且其序列與澳大利亞分離物BBTV DNA 4具有同源性。3.4 漳州分離物BBTV DNA 4全長克隆的構(gòu)建引物設(shè)計(jì)根據(jù)上述所得到的BBTV DNA 4非全長克隆編碼區(qū)序列又設(shè)計(jì)了如下一對(duì)相鄰?fù)庀蛞颬rimer 5GAGGTATTGTGGAAGAGPrimer 6TGACGAGCTCTGCATCTPCR擴(kuò)增條件為(1)94℃ 4min(2)94℃ 1min，63℃ 1min，72℃ 1min。總共35個(gè)循環(huán)。(3)72℃ 10min。
PCR擴(kuò)增體系如下每種引物濃度為10pmol，dNTPS為200μmol/L，Taqplus II為1u，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，0.1％ Triton X-100，BBTV DNA為1μl，反應(yīng)體積為50μl。
按3.3方法構(gòu)建漳州分離物BBTV DNA 4全長克隆，獲得三個(gè)陽性克隆P400、P700和P160。測序結(jié)果表明這三個(gè)陽性克隆的序列完全一致，其序列全長為1,039nt。與澳大利亞分離物BBTV DNA 4序列同源性為79％，就其非編碼區(qū)的主要共同(CR-M)區(qū)序列同源性為70％。漳州分離物BBTV DNA4應(yīng)歸屬于亞洲組。而且是亞洲組內(nèi)第一次報(bào)道BBTV DNA 4的全序列。從推導(dǎo)氨基酸序列得知中國漳州地區(qū)BBTV DNA4的N端有一段約由30個(gè)疏水性氨基酸組成的β折疊區(qū)，所以BBTV基因組4的開放閱讀框架很可能編碼BBTV的運(yùn)動(dòng)蛋白。3.5 漳州分離物BBTV DNA 4編碼區(qū)正向序列的克隆的構(gòu)建引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)根據(jù)已克隆的漳州分離物BBTV DNA 4全序列，在編碼區(qū)5’端和3’端分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物。其中Primer PB和PrimerPS是一對(duì)引物，Primer NB和Primer NS是一對(duì)引物。Primer PBCGGGATCCAACCATGGCATTGACAACAGAGCPrimer PSCGCGTCGACGTATTAAAACATAGGGCCGPrimer NBCGGGATCCGTATTAAAACATAGGGCCGPrimer NSCGCGTCGACATGGCATTGACAACAGAGCPCR擴(kuò)增條件為(1)94℃，4min。(2)94℃ 30s，63℃ 30s，72℃30s，總共35個(gè)循環(huán)。(3)72℃，10min。
PCR擴(kuò)增體系如下每種引物濃度為10pmol，dNTPS為200μmol/L，Taq plus I為1u，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，20mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，0.1％Triton X-100，p400質(zhì)粒DNA為1μl，反應(yīng)體積為50μl。
從Primer PB和Primer PS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中回收并純化約351bp大小的片段，然后用BamH I和Sal I雙酶切其兩端，同時(shí)純化經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切的pBluescript II-KS載體。將上述兩片段在16℃的溫度下連接12-16h，并轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5α。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于涂有40ul X-gal(20mg/ml)，4μl IPTG(200mg/ml)的氨芐青霉素(60μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，然后在37℃溫箱中培養(yǎng)12-16h。挑選白色菌落在上述LB固體培養(yǎng)基上劃線繼續(xù)培養(yǎng)12-16h。之后轉(zhuǎn)移到含氨芐青霉素(60μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12-16h。采用煮浮法或者堿法提質(zhì)粒。能用雙酶(BamH I和Sal I)切出，同時(shí)PCR也可擴(kuò)增出約350bp大小的片段的質(zhì)粒的克隆為陽性克隆。通過這種方法檢測得到的陽性克隆為P14。然后采用USB公司的測序試劑盒對(duì)這兩個(gè)陽性克隆進(jìn)行手工測序，并進(jìn)行測序分析。測序分析表明P14中編碼區(qū)序列與P400中編碼區(qū)序列列完全一致，其序列全長為351nt。推導(dǎo)的N端氨基酸序列有一段約由30個(gè)疏水性氨基酸組成的β折疊區(qū)，所以BBTV DNA 4很可能編碼BBTV的運(yùn)動(dòng)蛋白。3.6 漳州分離物BBTV DNA 4編碼區(qū)反向序列的克隆的構(gòu)建從Primer NB和Primer NS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中回收并純化約351bp大小的片段，并采用3.5的方法得到了陽性克隆N17。測序分析表明N17中編碼區(qū)反向克隆序列與P400中編碼區(qū)反向序列列完全一致，其序列全長為351nt。
PCR擴(kuò)增體系如下引物濃度為10pmol，dNTPs為2mmol/L，Taq plusI為1u，p400質(zhì)粒DNA為1μl，反應(yīng)體積為50μl。
從采用Primer PRP，Primer PRP41S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中回收并純化約688bp大小的片段，然后用BamH I和EcoR I雙酶切其兩端，同時(shí)純化經(jīng)BamH I和EcoRI雙切的pBluescript II-KS載體。將上述兩片段在16℃的溫度下連接12-16h，并轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞DH5α。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于涂有40μl X-gal(20mg/ml)，4ul IPTG(200mg/ml)的氨芐青霉素(60μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，然后在37℃溫箱中培養(yǎng)12-16h。挑選白色菌落在上述LB固體培養(yǎng)基上劃線繼續(xù)培養(yǎng)12-16h。之后轉(zhuǎn)移到含氨芐青霉素(60μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12-16h。采用煮沸法或者堿法提取質(zhì)粒。能用雙酶(BamH I和EcoR I)切出，同時(shí)PCR也可擴(kuò)增出約688bp大小的片段的質(zhì)粒的克隆為陽性克隆。通過這種方法檢測得到的陽性克隆為PP400。然后采用USB公司的測序試劑盒對(duì)這兩個(gè)陽性克隆進(jìn)行手工測序，并進(jìn)行測序分析。測序分析表明PP400中克隆序列與P400中非編碼區(qū)序列列完全一致，其序列全長為688nt。5.2 非編碼區(qū)第一個(gè)缺失改造克隆的構(gòu)建引物設(shè)計(jì)Primer PRP41PGGAATTCTGTACGGGAAAGTGATCPrimer PRP41SCGGGATCCATGGTTCACTGCCTCTTATTTPCR擴(kuò)增條件為(1)94℃ 4min。(2)94℃ 30s，63℃ 30s，72℃30s?？偣?5個(gè)循環(huán)。(3)72℃ 10min。PCR擴(kuò)增體系同7.1。
從采用Primer PRP41P，PrimerPRP41S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中回收并純化約351bp大小的片段，并采用5.1的方法得到了陽性克隆PRP413。測序分析表明PRP413中克隆序列與P400中非編碼區(qū)3′端部分序列完全一致，其序列全長為351nt。5.3 非編碼區(qū)第二個(gè)缺失改造克隆的構(gòu)建引物Primer PRP42PGGAATTCCATCACGTGCAACTAACPrimer PRP41SCGGGATCCATGGTTCACTGCCTCTTATTTPCR擴(kuò)增條件為(1)94℃，4min(2)94℃，25s，63℃，25s，72℃，25s。總共35個(gè)循環(huán)。(3)72℃，10min。PCR擴(kuò)增體系同7.1。
從采用Primer PRP42P，PrimerPRP41S的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中回收并純化約240bp大小的片段，并采用5.1的方法得到了陽性克隆PRP422。測序分析表明PRP422中克隆序列與P400中非編碼區(qū)3′端部分序列列完全一致，其序列全長為240nt。
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1.一種香蕉束頂病毒(Banana Bunchy Top Virus，BBTV)中國漳州分離物基因組1的開放閱讀框架，其特征在于長度為具有861核苷酸，其編碼33kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列為M A R Y V V C W M F T I N N P A S L P V M R D E I K Y M V Y Q V E34R G Q E G T R H V Q G Y V E M K R R S S L K Q M R G F F P G A H L67E K R K G S Q E E A R A Y C M K E D T R I E G P F E F G A F K L S100C N D N L F D V I Q D M R E A H K R P L E Y L Y D C P N T F D R S133K D T L Y R V Q A E L N K T K A M N S W K T S F N A W T S E V E N166I M A E P C Y R S I I W V Y G P N E G E G K P T Y A K Y L M K P K199N A F Y S P G G K S L D I C R L Y N Y E D I V I F D I P R C K E E232Y L N Y G L L E E F K N G I I Q S G K Y E P V L K I V E Y V E V R265L M A N F L P K E G I F S E D R I K L V A C和長度為具有129核苷酸，其編碼5kDa小蛋白質(zhì)的氨基酸序列為M I I Y L M S Y R I C V K L I N G L W N I Y M I V R I P S T E V R34I H Y T E C K Q S
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的BBTV中國漳州分離物基因組1的編碼33kDa蛋白質(zhì)的氨基酸其核苷酸序列為ATGGCGCGAT ATGTGGTATG CTGGATGTTC ACCATCAACA ATCCCGCTTC GCTACCAGTG61ATGCGGGATG AGATTAAATA TATGGTATAT CAAGTGGAGA GGGGACAGGA GGGTACTCGT121CATGTGCAAG GATACGTCGA GATGAAGAGA CGAAGCTCTC TGAAGCACAT GAGAGGCTTC181TTCCCAGGCG CACACCTTGA GAAACGAAAG GGGAGCCAAG AGAGAGCACG GGCTTACTGT241ATGAAGGAAG ATACAAGAAT CGAAGGTCCC TTCGAGTTTG GTGCATTTAA ATTGTCATGT301AATGATAATT TATTTGATGT CATACTGGAT ATGCGTGAAG CTCATAAACG GCCTCTGGAA361TATTTATATG ATTGTCCGAA TACCTTCCAC AGAAGTAAGG ATACATTATA CAGAGTGCAA421GCAGAGCTGA ATAAAACGAA GGCGATGAAT AGCTGGAAGA CATCCTTCAA TGCATGGACA481TCTGAAGTAG AAAATATTAT GGCGGAGCCA TGTTATCGAA GCATTATTTG GGTCTATGGC541CCAAATGAAG GTGAAGGAAA GCCAACCTAT GCAAAATATT TAATGAAGCC TAAGAATGCG601TTTTATTCGC CAGGAGGAAA ATCATTGGAT ATATGTAGAT TGTATAATTA TGAGGATATA661GTTATATTTG ATATTCCCAG ATGCAAGGAG GAATATTTAA ACTATGGTTT ATTAGAAGAA721TTTAAAAATG GAATTATTCA AAGCGGGAAA TATGAACCCG TTTTGAAAAT TGTAGAATAT781GTGGAAGTCA GGCTAATGGC TAACTTCCTT CCGAAGGAAG GAATCTTTTC TGAAGATCGA841ATAAAGCTAG TTGCTTGCTG A和編碼5kDa小蛋白質(zhì)氨基酸其核苷酸序列為ATGATAATTT ATTTGATGTC ATACTGGATA TGCGTGAAGC TCATAAACGG CCTCTGGAAT61ATTTATATGA TTGTCCGAAT ACCTTCCACA GAAGTAAGGA TACATTATAC AGAGTGCAAG121CAGAGCTGA
3.一種BBTV中國漳州分離物基因組4的開放閱讀框架，其特征在于長度為具有351核苷酸，其編碼15.5kDa蛋白質(zhì)的氨基酸序列為M A L T T E R V K L F F E W F L F I G A I F I A I T I L Y I L L A34L L F E V P K Y I K E V V K Y L V E Y M T R R R V W M Q K T Q L T67E A T G D A E L V R G I V E E R R D Q Q A A I I P Q A S H V N P S100Q A R R D D Q G R R G N I G P M F
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的BBTV中國漳州分離物基因組4的編碼15.5kDa蛋白質(zhì)的氨基酸其核苷酸序列為ATGGCATTGA CAACAGAGCG GGTGAAACTA TTCTTCGAAT GGTTTCTGTT TATTGGAGCA61ATATTCATTG CGATAACAAT ATTATATATA TTGTTGGCAT TGCTCTTTGA GGTTCCCAAG121TATATTAAGG AGGTTGTGAA GTATCTCGTA GAATACATGA CCAGACGACG TGTATGGATG181CAGAAAACGC AGTTGACGGA GGCAACCGGA GATGCAGAGC TCGTCAGAGG TATTGTGGAA241GAGAGACGCG ATCAACAAGC GGCTATCATA CCACAGGCAA GTCATGTTAA CCCTTCTCAA301GCAAGAAGGG ATGACCAAGG AAGACGAGGA AACATCGGCC CTATGTTTTA A
5.一個(gè)在權(quán)利要求2和4中所要求的核苷酸序列或部分核苷酸序列或其互補(bǔ)序列，并可以應(yīng)用于BBTV的PCR診斷。
6.一組重組質(zhì)粒，它含有在權(quán)利要求2和4中所要求的核苷酸序列及其反向核苷酸序列，并可以應(yīng)用于培育抗BBTV轉(zhuǎn)基因香蕉植株。
7.一種BBTV中國漳州分離物基因組1基因間區(qū)(非編碼區(qū))，其特征在于其核苷酸序列為ACACGCTATG ACAATCGTAC GATATGACAA AAGGGGAAAA GCAAAGATTC GGGGGAAGAT61TGTGCTATCC TAACGATTAA GGGCCGCAGG CCCGTCAAGA TGGACGACGC GATCATATGT121CCCTAGTTAG TGCGCCACGT AAGCGCTGGG GCTTATTATT ACCCCCAGCG CTCGGGACGG181GACATTTGCA TCTATAAATA GACCTTCCCC CGCTCCACTA CAAGATCATC ATCGACGACA240GAA
8.一種BBTV中國漳州分離物基因組4基因間區(qū)(非編碼區(qū))，其特征在于其核苷酸序列為TACACTGTAT TATAATATAC GAGAATATAA ATGGATAAGG ATATTTACTG CAAACATATA61TAAGCGAAAA TAATATATGT TGTAAAAGAA ACATATTGTA ATATGTGANT TGTATACGAG121TGTTGTATTT ATAAACTATA CAACACGCTA TGACAAACGG GGAAAAATGA AGAATCGGGG181GTTGATTGGT CTATCGTATC GCTTAAGGGC CGCAGGCCCG TTGAAATGAT TCTTTATTAA241ACAAATATAC ATGATATGGA TAGTTGAATA TATAAACAAC TATGTATAAA TACAACAGAA301TGTTGTAAAC AATAAAATAA TGAGAAGATA AGTATATTTG TACGGGAAAG TGATCACACC361CACCACTTTA GTGGTGGGTC ATATGTCCCG AGTTAGTGCG CCACGTAAGC GCTGGGGCTT421ATTATTACCC CCAGCGCTCG GGACGGGACA TCACGTGCAA CTAACAAATG CACGTGACTG481ATATGTATGA TATAACGGTT CAATGAACCG GTATGTGAAG TTGTAACGAA ACGTCACGTA541TGAAAGAGAC ATAAACGTGA CGTAGTCAAA TGTATTGAAT AAACATTTGA CGTCCGGTAG601CTTCCGAAGG AAGCCATGAT TGCTTCGAGG CGAAGCAAAA CATTTATATA TTGGCCTGAA661CTGCTGCCTA TAAATAAGAG GCAGTGAA
9.一個(gè)在權(quán)利要求7和8中所要求的核苷酸序列或其缺失核苷酸序列或基本互補(bǔ)的序列有高達(dá)20％的變異度。
10.一組重組質(zhì)粒，它含有在權(quán)利要求7和8中所要求的核苷酸序列或其缺失核苷酸序列及其互補(bǔ)核苷酸序列，提供其在一個(gè)目的基因上游可能調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄，并在單子葉或雙子葉植物中組成性或組織特異性的表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及中國漳州分離物BBTV基因組1和4的全序列及各開放閱讀框架其編碼的氨基酸的序列;編碼氨基酸的正向和反向的核苷酸序列及其由此衍生的重組質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因植物,以增強(qiáng)香蕉抗BBTV能力;編碼氨基酸的全部或部分核苷酸序列及其互補(bǔ)序列,用于BBTV的PCR診斷;BBTVDNA1和4基因間區(qū)核苷酸序列及其缺失序列的重組質(zhì)粒,以提供在目的基因上游調(diào)節(jié)目的的基因在轉(zhuǎn)基因的單子葉或雙子葉植物中的組成性或組織特異性的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1285406SQ99111668
公開日2001年2月28日 申請(qǐng)日期1999年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月20日
發(fā)明者蔡文啟, 孫德俊, 臘平 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所