專利名稱：用羥胺切割融合蛋白的方法制備重組人白細(xì)胞介素11的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物。
白細(xì)胞介素11(Interleukin11，簡稱IL-11)是人體內(nèi)分泌的一類重要細(xì)胞因子，它作用于骨髓細(xì)胞中的原始造血干細(xì)胞，促進(jìn)巨核細(xì)胞成熟，增加血小板數(shù)目，促進(jìn)血小板再生。重組白細(xì)胞介素11于1997年11月由美國FDA批準(zhǔn)上市，成為治療癌癥病人經(jīng)放、化療后血小板數(shù)降低的唯一藥物。
目前，用基因工程方法生產(chǎn)IL-11是唯一有效的途徑。但重組的完整IL-11在大腸桿菌中直接游離表達(dá)時有很大困難，以至不可能，這是因?yàn)橥暾腎L-11cDNA 5端GC含量特別豐富，尤其是前8個氨基酸中有6個脯氨酸，嚴(yán)重地阻礙了完整IL-11的直接表達(dá)。為了表達(dá)完整的IL-11只能用融合蛋白的方法，即在IL-11 N端前加入一段前導(dǎo)肽，構(gòu)成融合蛋白，以使IL-11得以高效表達(dá)，然后再將融合蛋白中的前導(dǎo)肽切掉，產(chǎn)生完整的IL-11?，F(xiàn)在一般采用的方法是用專一蛋白酶腸肽激酶(enterokinase)來切割融合蛋白產(chǎn)生IL-11，但這種酶切方法產(chǎn)生了切割用酶價格昂貴及異源蛋白污染等嚴(yán)重問題，使重組IL-11成本居高不下，純化困難。
本發(fā)明的目的是用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)重組的完整IL-11的融合蛋白，并在融合蛋白的前導(dǎo)肽與IL-11之間的結(jié)合部位插入化學(xué)試劑切割位點(diǎn)，以使生產(chǎn)成本大幅降低，純化工藝簡化，同時IL-11的生物學(xué)活性保持不變。
本發(fā)明的原理羥胺作為價格低廉的蛋白切割化學(xué)試劑，可以專一性地切開蛋白與多肽中的Asn-Gly肽鍵。
我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，白介素11多肽中不含有羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly肽鍵，而其N端又恰好為甘氨酸Gly，這樣我們在融合蛋白的前導(dǎo)肽與IL-11的連接處即IL-11的N端引入羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly(AACGGG)，在用大腸桿菌高效表達(dá)IL-11的融合蛋白后，再用羥胺進(jìn)行切割，恰好切出N端為Gly的完整的IL-11，且具有天然的生物學(xué)活性。
經(jīng)上述改造后轉(zhuǎn)化的工程菌種，在發(fā)酵表達(dá)后，經(jīng)菌體收集→菌體破碎→離心分離→陰離子交換層折→羥胺切割→陽離子交換層折等純化步驟，可制備得到純度大于95％，比活性達(dá)到8×106IU/mg的完整的白介素11。
最佳實(shí)施例在構(gòu)建IL-11融合蛋白的克隆過程中，在IL-11的前面放置大腸桿菌硫氧還蛋白(thioredoxin)作為前導(dǎo)肽，在thioredoxin和IL-11之間引入羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly，其中Gly既為該位點(diǎn)中的氨基酸又為IL-11的N端氨基酸。將上述改造后的IL-11融合蛋白cDNA放在表達(dá)載體pThioA中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH15a，用IPTG誘導(dǎo)的方式可高效表達(dá)產(chǎn)生IL-11融合蛋白，表達(dá)水平達(dá)30％，同時thioredoxin引導(dǎo)融合蛋白以可溶狀態(tài)存在于大腸桿菌的細(xì)胞漿中，且具天然活性。這一優(yōu)勢可以免去包涵體形式的蛋白所需的變性、復(fù)性及異構(gòu)體分離等問題。在用羥胺切割后，產(chǎn)生完整的IL-11。這樣純化工藝得以簡化，生產(chǎn)成本大大降低。
表達(dá)和制備方法如下在菌種平板上挑取一單菌落，接種于2ml LBA培養(yǎng)基中(LBA每升含10g蛋白胨，5g酵母膏，5g NaCl，60mg氨芐青霉素，PH7.0)，37度培養(yǎng)過夜作為種子，按1％的接種量接種于50ml LBA中，37度生長至O.D600=0.5時，加入IPTG至1mM誘導(dǎo)表達(dá)6小時，離心收獲菌體。將菌體懸浮在50mM PB(Na2HPO4+NaH2PO4，pH8.0)緩沖液中，超聲破碎菌體，20000g×20分鐘離心。取上清，上清過陰離子柱DEAE-Sepharose層析純化，用20mMPB，PH8.0緩沖液洗脫，收集IL-11融合蛋白富集峰。再加入羥胺至2M，調(diào)PH7-9，在37-45度下切割2-20小時，釋放出完整的IL-11。透析后再用陽離子柱CM-Sepharose進(jìn)一步純化，用0-1M NaCl，20mM PB，PH8.0線性梯度洗脫，在0.25mM NaCl左右濃度處洗下IL-11活性峰。SDS-PAGE電泳分析表明，得到的IL-11純度大于95％，測活結(jié)果為比活性達(dá)到8×106IU/mg。通過上述方法，可以得到高純度，高比活性的完整的重組白介素11。
本發(fā)明提供了一種成本低廉的用融合蛋白方式表達(dá)和切割制備IL-11的方法。它與世界上唯一生產(chǎn)IL-11的美國Genetics Institute的生產(chǎn)工藝相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1、融合蛋白切割試劑為價格低廉的化學(xué)試劑一羥胺，而G.I.公司的工藝需用價格昂貴的enterokinase來切割融合蛋白。2、本工藝采用的羥胺為小分子無機(jī)物質(zhì)，不帶來異源蛋白污染。而G.I.公司的工藝中存在著融合蛋白前導(dǎo)肽和加入的enterokinase的異源蛋白污染問題。3、由上述二個特點(diǎn)決定了本工藝純化方便且成本低廉。上述優(yōu)勢使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性和工藝先進(jìn)性，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
權(quán)利要求
1.可用羥胺特異切割的重組白介素11融合蛋白，其特征在于該IL-11的N端甘氨酸前引入一個羥胺特異性切割位點(diǎn)Asn-Gly，從而使大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白可用羥胺來切割以釋放完整的重組IL-11。
2.在如權(quán)利要求1所述的融合蛋白中，前導(dǎo)肽為大腸桿菌硫氧還蛋白thioredoxin，其特征在于它可引導(dǎo)后面融合的IL-11以可溶狀態(tài)存在于大腸桿菌的細(xì)胞漿中，并使之具有天然生物學(xué)活性。
3.如權(quán)利要求1所述的羥胺切割I(lǐng)L-11融合蛋白，其特征在于采用優(yōu)化的切割條件，羥胺濃度為0.5～4M，反應(yīng)PH為7.5～9.5，反應(yīng)溫度37～45度，反應(yīng)時間2～20小時。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用廉價化學(xué)試劑切割白細(xì)胞介素11融合蛋白從而制備IL－11的方法。該融合蛋白由大腸桿菌硫氧還蛋白和IL－11融合而成,并在二者的連接處引入了羥胺的特異切割位點(diǎn)Asn－Gly,使得在用大腸桿菌高效表達(dá)出該融合蛋白后,用羥胺可以專一地切開Asn－Gly肽鍵從而釋放出完整的IL－11,經(jīng)過幾步純化后,可制得高純度,高比活的完整的重組IL－11。
文檔編號C12N15/31GK1280984SQ9911233
公開日2001年1月24日 申請日期1999年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月19日
發(fā)明者王革 申請人:王革