專利名稱：動物角蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其基因工程方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉纖維改良基因工程，尤其是關(guān)于一種動物角蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其基因工程方法。
棉纖維作為一種天然纖維，一直是紡織業(yè)和其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的主要原材料。棉纖維由棉花種皮的表皮細(xì)胞分化產(chǎn)生。成熟棉纖維中纖維素含量達89％以上，同時含有一部分蛋白。棉纖維的品質(zhì)，主要決定于纖維強度、長度、伸長度等性狀。這些性狀主要受基因型控制，環(huán)境因子和栽培對其影響低于20％。隨著分子生物學(xué)研究的深入和植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟，用基因工程方法改良棉纖維品質(zhì)，將成為培育優(yōu)質(zhì)棉的重要手段。目前，美國、澳大利亞等國都投入大量資金進行棉纖維的分子生物學(xué)研究。美國Agrocetus公司的科學(xué)家M.E.John博士等克隆了數(shù)個棉纖維特異表達的基因(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773；John ME，Plant Mol Biol，1996，30297-306；John ME，Critical Reviewsin Biotechnology，1997，17(3)185-203)，并利用棉纖維特異表達啟動子將外源合成PHB的基因轉(zhuǎn)入棉花，使棉花纖維中產(chǎn)生脂肪聚酯復(fù)合物-PHB(多羥基丁酸酯)(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，9312768-12773)。
毛發(fā)由角蛋白組成，角蛋白來自多基因家族，根據(jù)其氨基酸組成可分為兩類，其中一類為角蛋白相關(guān)蛋白(KAP)，富含甘氨酸和酪氨酸。國外已從羊和兔中分離到了KAP基因(Fratini A等，The Journal ofBiological Chemistry，1993，268(6)4511-4518)，在哺乳動物中該基因保持高度同源性。
將兔毛或羊毛的角蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花，在棉纖維中特異表達，以改進棉纖維的纖維韌性及保暖性等。這是一種新的思路和技術(shù)，具有重大的實用意義。
本發(fā)明的目的是提供一種動物角蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其基因工程方法，即應(yīng)用基因工程途徑將兔或羊的角蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花，使棉纖維中產(chǎn)生兔毛或羊毛的角蛋白成分，改良棉纖維的韌性、保暖性等。
從亞洲棉基因組文庫中分離到棉纖維特異表達的啟動子；克隆出兔的角蛋白基因，并在原核細(xì)胞中表達，制備了角蛋白抗體；接著構(gòu)建由棉纖維特異啟動子驅(qū)動角蛋白基因的轉(zhuǎn)基因二元載體，轉(zhuǎn)化棉花后，對轉(zhuǎn)基因棉花進行了組織化學(xué)染色、PCR、Southern blot等分子驗證。轉(zhuǎn)基因棉花纖維現(xiàn)正處于生長期，待纖維成熟后進一步應(yīng)用Western blot驗證棉纖維中角蛋白的表達；最后對轉(zhuǎn)基因棉花纖維進行顯微結(jié)構(gòu)、強度、長度、保暖性等品質(zhì)特征分析。本發(fā)明技術(shù)方案詳述于后。
本發(fā)明提供一種動物角蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其基因工程方法，利用棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在棉纖維中特異表達動物毛(例如羊毛或兔毛)的角蛋白基因，能生產(chǎn)出全新的基因工程棉花，使棉纖維產(chǎn)生兔毛或羊毛的角蛋白成分，保暖性提高，手感等更好。
本發(fā)明動物(下面以兔子為例)角蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維及其轉(zhuǎn)基因工程方法及鑒定包括1、棉纖維特異表達的GAE6基因的克隆以亞洲棉D(zhuǎn)NA為模板進行PCR擴增。所用引物為參閱文獻(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773)設(shè)計的，分別為E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。
PCR產(chǎn)物純化后，采用TA克隆方法裝入pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化XL1-Blue(本實驗室保存菌種)，然后對插入片段進行PCR鑒定和酶切鑒定。DNA序列由中國科學(xué)院上海植物生理研究所分子遺傳構(gòu)建重點實驗室技術(shù)組用Applied biosystem373型全自動熒光序列分析儀測定。序列用PCGENE軟件系統(tǒng)分析。
以PCR-96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫，正向引物為E605’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物為E635’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。經(jīng)7輪篩選，將陽性孔噬菌體稀釋后鋪板，挑取單個噬菌斑到SM溶液中，再以PCR鑒定陽性噬菌斑，依照Stratagene的實驗指南釋放質(zhì)粒，得到一個陽性克隆，命名為GAE6-3A，經(jīng)多種酶切鑒定其插入片段長8.0千堿基對(見圖1)。
DNA序列由寶生物工程公司Applied biosystem373型全自動熒光序列分析儀測定，所得的GAE6-3A克隆上游啟動子長1457個堿基對，其序列見圖2。
將該啟動子克隆于含有內(nèi)含子的GUS基因前，基因槍法轉(zhuǎn)化了正常的棉花胚珠和突變體無絮棉胚珠，培養(yǎng)2天后進行組織化學(xué)染色檢查GUS的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常胚珠中染色多為深藍色并且GUS陽性比例遠遠高于突變體，初步說明該啟動子具有棉纖維特異性。
2、角蛋白基因的克隆提取兔子總DNA，根據(jù)文獻(Fratini A等，The Journal of BiologicalChemistry，1993，268(6)4511-4518)設(shè)計合成引物KAP1(5’GGATCCCATGTGTGGCTACTACGG3’)和KAP2(5’TCAGTAGTAGTAGCCAAAG 3’)，PCR擴增克隆了新西蘭大白兔角蛋白基因并亞克隆至pGEM-T載體中構(gòu)建了質(zhì)粒KT9。序列測定表明所克隆的角蛋白基因YXHKAP核苷酸序列與已發(fā)表的兔KAP61R基因同源性達99.5％(序列比較見圖3)，并將其克隆到原核及真核表達載體中以檢測其表達。
3、角蛋白抗體的制備割取聚丙烯酰胺凝膠電泳中角蛋白特異表達條帶免疫雞(角蛋白量為100-200μg)，每3周加強一次，免疫4次，一周后取血清作為角蛋白抗體以用于Western-blot檢測。
4、GAE6-3A啟動子的亞克隆及轉(zhuǎn)基因表達載體13BKT(由北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，1998年12月22日，保藏編號為CGMCC No.0378)的構(gòu)建為了使用正確的閱讀編碼框，應(yīng)用引物T3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)和反向引物PR3(CGGGATCCGGTGAGGAAG CCATGGCTATG)將BamHI位點引入GAE6-3A啟動子的3’端，亞克隆至pGEM-T載體中，構(gòu)建了質(zhì)粒TVPE，TVPE經(jīng)PstI/BamHI雙酶切亞克隆至pBCSK(+)(簡稱BSK(+)，本實驗室提供)中，構(gòu)建了質(zhì)粒BPE(見圖4)。KT9和BPE經(jīng)Sac I/BamHI雙酶切后連接，將角蛋白基因亞克隆至GAE6-3A啟動子后，構(gòu)建了BKT。最終將BKT經(jīng)Hind III和SacI雙酶切克隆至二元表達載體13012(中科院上海植物生理研究所開放實驗室提供)中，構(gòu)建了由GAE6-3A啟動子驅(qū)動的植物轉(zhuǎn)基因載體13BKT(含有由35S啟動子驅(qū)動的潮霉素篩選標(biāo)記基因及35S啟動子啟動的含有內(nèi)含子的GUS基因)BL-35S-Hyg-GAE6-KAP-35S-GUS-BR，見圖5。
5、棉花轉(zhuǎn)化三親雜交將構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，應(yīng)用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化棉花。同時大量提取質(zhì)粒，于棉花開花當(dāng)天經(jīng)花粉管途徑注射入子房中進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化棉花蘇抗103、蘇抗310、蘇8、蘇12、中16、中9、中20、石遠321、鹽城7159、鹽城7141、徐219及徐9236共12個品種。共獲得棉花種子1000粒。
6、轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的分子驗證，包括組織化學(xué)染色、PCR、Southern雜交，棉纖維中角蛋白的Western分析等。
取棉花種子進行無菌培養(yǎng)，待萌發(fā)3天后取根尖進行組織化學(xué)染色植物組織浸泡于GUS染色液中，37℃溫浴24h，以70％乙醇和90％乙醇各脫色一次。在解剖鏡下觀察并照相。共獲得GUS陽性植株(根尖染成藍色)72棵。
選取GUS活性強的37棵植株，提取DNA后進行PCR檢測，應(yīng)用引物P2正(5’GGAAGTTTTACTGACACTGC 3’)和引物KAP2進行PCR，復(fù)性溫度為52℃，15個循環(huán)后，取1μl反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用引物P正(5’CACCATTCACCACTTGCTC 3’)和KAP2再擴增25個循環(huán)，其中22棵棉花擴增出特異條帶。
任意選取7棵陽性植株的PCR產(chǎn)物，分別以質(zhì)粒13BKT和未轉(zhuǎn)化棉花的PCR擴增產(chǎn)物為正、負(fù)對照進行了DNA分子雜交鑒定，結(jié)果見圖6，證明所選蘇抗103-63、蘇抗310-394、石遠321-566等7個樣品中含有外源角蛋白基因。
7、轉(zhuǎn)基因植物的Western檢測取轉(zhuǎn)基因棉花的棉纖維，用液氮充分研磨后，加入適量的蛋白提取緩沖液(50mmol Tris/HCl，10mmol EDTA，pH8.0；1％巰基乙醇)，4℃，15,000rpm，離心10分鐘后，取上清液，按卡馬斯亮藍法測定蛋白含量。各取5μg總蛋白進行10％SDS-PAGE電泳，然后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(50mA電流轉(zhuǎn)移過夜，4℃)，按Sambrook方法(1989)進行雜交以檢測角蛋白的表達。雞抗角蛋白基因多克隆抗體以1∶300、第二抗體兔抗雞IgG抗體以1∶2500稀釋使用。顯色劑為BCIP和NBT(購自Promega公司)。
8、轉(zhuǎn)基因棉纖維的品質(zhì)分析轉(zhuǎn)基因棉花纖維的顯微結(jié)構(gòu)分析，強度、長度等品質(zhì)特征分析。
效果與優(yōu)點與棉纖維相比，兔毛、羊毛角蛋白在保暖性、光澤、手感等方面有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明最大的優(yōu)點和特點，是用基因工程的方法將動物角蛋白引入棉纖維，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因棉纖維便遺傳性地具有兔、羊毛的某些性狀而無需混紡，從而為棉纖維家族提供了新的成員，為棉纖維改良提供了一條新的途徑。將角蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花中并使其在棉纖維中特異表達，可使轉(zhuǎn)基因棉纖維含有動物毛的成分，使轉(zhuǎn)基因纖維具有新的特性，保暖性改善，手感等更好。
盡管以品種間雜交為主的傳統(tǒng)育種培育了一些具有較好纖維性狀的棉花品種，但是受到遠緣雜交不親和的局限，而且也不可能將動物毛、絲的性狀引入棉花。通過基因工程提高纖維品質(zhì)是棉花育種研究的新領(lǐng)域，這使所有生物的基因、甚至合成基因都成為可供利用的外源基因。通過遺傳轉(zhuǎn)化等方法將特定的外源基因?qū)朊藁ú⑹蛊浞€(wěn)定地遺傳表達，以改良特定的性狀。應(yīng)用棉纖維特異表達的啟動子可使角蛋白基因在棉纖維中特異表達而不在其它部位表達，避免影響棉花植株的性狀。
本發(fā)明通過以下的附圖和實施例作進一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1為GAE6基因克隆的酶切分析圖，其中泳道1為1kb LadderMarker DNA分子標(biāo)準(zhǔn)物，泳道2-6分別為GAE6-3A克隆經(jīng)EeoRI，EcoRI+Hind III，Nco I+EcoR I，Hind III，BamH I酶切產(chǎn)物。
圖2為GAE6-3A啟動子核苷酸序列。
圖3為所克隆的角蛋白基因YXHKAP與已發(fā)表家兔角蛋白基因KAP61R核苷酸序列比較。
圖4為GAE6-3A啟動子的改造(3’端引入BamHI位點)過程圖。
圖5為植物轉(zhuǎn)基因載體13BKT的構(gòu)建過程，其中35S-P為一個組成型表達的啟動子；Kan為卡那霉素；Hyg為潮霉素。
圖6為轉(zhuǎn)角蛋白基因棉花的DNA分子雜交結(jié)果。其中A為13BKT；B為未轉(zhuǎn)化棉花；C-I為轉(zhuǎn)角蛋白基因的蘇抗103-63、蘇抗310-394、石遠321-566、石遠321-571、石遠321-587、鹽城7159-647和鹽城7141-626，7株棉花。
實施例1、棉纖維特異表達的GAE6基因的克隆(1)亞洲棉葉片DNA的少量提取取約100毫克葉片加液氮迅速研磨成粉末，加入500μl抽提緩沖液(500mmol/L NaCl；50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；50mmol/L EDTA(pH8.0)；1％β-巰基乙醇)；加入60μl 20％的PVP及100μl 10％的SDS，混勻；65℃水浴20分鐘，加入160μl 3M的KAc(pH4.8)，冰浴30分鐘；4℃，15,000rpm離心10分鐘，上清移入新管，加0.6倍體積的異丙醇，混勻；冰浴10分鐘；4℃，12,000rpm離心5分鐘，棄去上清，75％乙醇洗滌后抽干，加入500μl TE溶解；加入等體積的酚∶氯仿∶異丙醇(25∶24∶1)抽提1-2次；12,000rpm室溫離心10分鐘，吸上清至新管，加入等體積的異丙醇，1/10體積3N的NaAc(pH5.2)，-20℃放置5分鐘；4℃，15,000rpm離心10分鐘，75％乙醇洗滌沉淀，抽干后獲得DNA，溶于100μl TE中。
(2)GAE6基因片段的擴增及序列分析以亞洲棉D(zhuǎn)NA為模板進行PCR擴增。兩個引物分別為E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。PCR反應(yīng)體系MgCl2(10×)3μl，PCR反應(yīng)緩沖液(10×)3μl，dNTPs(各2.5μmol)3μl，E61(25μmol)0.5μl，E62(25μmol)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性10分鐘；然后94℃變性40秒，54℃復(fù)性30秒，延伸30秒，共30個循環(huán)；最后，72℃延伸7分鐘。PCR反應(yīng)后獲得一特異擴增產(chǎn)物GAE6基因片段。
PCR產(chǎn)物經(jīng)Wizard柱(Promega公司)純化后，采用TA克隆方法將擴增片段裝入pGEM-T載體(購自Promega公司)中，轉(zhuǎn)化XL1-Blue(本實驗室保存菌種)，然后對插入片段進行PCR鑒定和酶切鑒定。DNA序列由中國科學(xué)院上海植物生理研究所分子遺傳國家重點實驗室技術(shù)組用Appliedbiosystem373型全自動熒光序列分析儀測定。結(jié)果表明所克隆片段與已發(fā)表海島棉的E6基因高度同源(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773)。
(3)從亞洲棉基因組文庫中篩選GAE6基因根據(jù)上述片段順序合成兩個引物，正向引物為E605’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物為E635’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。以PCR-96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫，取1μl基因組文庫(λ-ZAP)溶液(約108pfu)與400μl XL1-Blue菌液共培養(yǎng)30分鐘后，分置于96孔板各孔中37C培養(yǎng)8～9小時。每列8孔各取5μl混勻，各取1μl作PCR。選取陽性列的各孔分別作PCR。取陽性孔混合物進行倍比稀釋作PCR，以能擴增出條帶的最大稀釋度進行稀釋，再鋪96孔板。經(jīng)7輪篩選，獲得一陽性克隆。
依照Stratagene的實驗指南釋放質(zhì)粒。在1.5ml離心管中加入200μlXL1-BLUE細(xì)胞，200μl陽性噬菌斑SM溶液，1μl ExAssit helper噬菌體(Stratagen公司)，混勻，37℃溫育15分鐘。將混合液轉(zhuǎn)至3ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5小時。2,000g離心15分鐘，吸出上清液。70℃溫育15分鐘，4,000g離心15分鐘，吸出上清液。兩個1.5ml離心管中各加入200μl新鮮的SOLR細(xì)胞，并分別加入上述上清液100、10μl，37℃溫育15分鐘，各取10-50μl鋪LB(含100μg/ml Amp)平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑單克隆鑒定。經(jīng)限制性酶切結(jié)果顯示該克隆插入片段約為8.0kb(圖1)。DNA測序表明該基因為亞洲棉的E6基因，命名為GAE6-3A，上游啟動子長1457個堿基對(圖2)。
實施例2、GAE6-3A啟動子的表達特異性從棉花基因組文庫中分離出棉纖維特異表達啟動子，并將該啟動子克隆于含有內(nèi)含子的GUS基因前，基因槍法轉(zhuǎn)化了正常的棉花胚珠和突變體無絮棉胚珠，培養(yǎng)2天后進行組織化學(xué)染色檢查GUS的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常胚珠中染色多為深藍色并且GUS陽性比例遠遠高于突變體，初步說明該啟動子具有棉纖維特異性。
實施例3 角蛋白基因的克隆(1)兔子DNA的提取新西蘭大白兔耳緣靜脈取血8ml，加入肝素至終濃度20U/ml；加入5倍體積的PBS緩沖液，輕緩混勻；15,000rpm離心10分鐘；棄去上清液，加入9倍體積0.2％NaCl(冰上預(yù)冷)；30分鐘后加入等體積1.6％NaCl，使NaCl終濃度達0.9％；1500rpm，離心10分鐘；棄去上清液，余下的為白細(xì)胞，用0.9％NaCl洗一次；STE(配方參見《分子克隆》)、10％SDS、蛋白酶K消化，55℃恒溫?fù)u床過夜；加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻后，12,000rpm離心5分鐘；取上層溶液，加入1/10體積2M NaAc，無水乙醇沉淀；12000rpm離心，取沉淀，用70％乙醇清洗一次；吹干沉淀，加入500μl TE溶解；制備雙層膠(底層為1.0％，上層為0.3％)，取少量DNA電泳觀察。
(2)兔子角蛋白基因的擴增提取兔子總DNA后，應(yīng)用引物KAP1(5’GGATCCCATGTGTGGCTACTACGG3’)和KAP2(5’TCAGTAGTAGTAGCCAAAG 3’)擴增克隆了角蛋白基因并測定了其序列。
PCR反應(yīng)體系MgCl2(10×)5μl緩沖液(10×)5μldNTPs(各2.5μmol)5μlKAP1(25μmol)1μlKAP2(25μmol)1μl兔DNA(0.1μg/μl)1μlTaq DNA polymerase(5U/μl)0.5μl最后加水至30μlPCR條件94℃預(yù)變性10分鐘；然后94℃變性40秒，54℃復(fù)性30秒，延伸30秒，共30個循環(huán)；最后，72℃延伸7分鐘。反應(yīng)后獲得特異的長約220bp的擴增片段，克隆至pGEM-T載體中獲得KT9。DNA測序及序列分析表明其為角蛋白基因(序列見圖3)，與已發(fā)表的KAP61R基因的同源性達99.5％(Fratini A等，The Journal of Biological Chemistry，1993，268(6)4511-4518)。
實施例4 角蛋白基因的原核表達及抗體的制備應(yīng)用BamHI和SacI酶切下角蛋白基因，克隆至原核表達載體pET28b(+)中，獲得高效表達。從聚丙烯酰胺凝膠中割取角蛋白特異表達條帶免疫雞(角蛋白量為100-200μg)，每3周加強一次，免疫4次，一周后取血清測定效價，作為角蛋白抗體。加入0.02％的疊氮鈉保存于4℃或直接保存于-70℃?zhèn)溆谩?br> 實施例5 GAE6-3A啟動子的亞克隆及植物轉(zhuǎn)基因載體13BKT的構(gòu)建為了使用正確的閱讀編碼框，應(yīng)用引物T3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)和反向引物PR3(CGGGATCCGGTGAGGAAG CCATGGCTATG)將BamHI位點引入GAE6-3A啟動子的3’端，亞克隆至pGEM-T載體(購自Promega公司)中，構(gòu)建了質(zhì)粒TVPE，TVPE經(jīng)PstI/BamHI雙酶切亞克隆至pBCSK(+)(簡稱BSK(+)，本實驗室提供)中，構(gòu)建了質(zhì)粒BPE(見圖4)。KT9和BPE經(jīng)SacI/BamH I雙酶切后連接，將角蛋白基因亞克隆至GAE6-3A啟動子后，構(gòu)建了BKT。最終將BKT經(jīng)HindIII和SacI雙酶切克隆至二元表達載體13012(中科院上海植物生理研究所開放實驗室提供)中，構(gòu)建了由GAE6-3A啟動子驅(qū)動的植物轉(zhuǎn)基因載體13BKT(含有由35S啟動子驅(qū)動的潮霉素篩選標(biāo)記基因及35S啟動子啟動的含有內(nèi)含子的GUS基因)BL-35S-Hyg-GAE6-KAP-35S-GUS-BR，見圖5。以上所用酶均購自PROMEGA公司，反應(yīng)溫度條件為37℃溫育2小時。
實施例6 棉花的轉(zhuǎn)化(1)農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化棉花首先培養(yǎng)細(xì)菌農(nóng)桿菌LBA4404(本實驗室提供)培養(yǎng)于附加100mg/L利福平和300mg/L鏈霉素的LB培養(yǎng)基中，28℃振蕩過夜。HB101(含pRK2013，本實驗室提供)菌株培養(yǎng)于含卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。含中間載體的大腸桿菌(DH5α，本實驗室提供)于含添加卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜；三種培養(yǎng)物各取100μl于Eppendorf管內(nèi)混合，4000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入1ml LB重新懸浮菌體，短時離下菌體，棄去上清液；菌體重懸于50μl LB中，點于LB平板上，28℃培養(yǎng)過夜；次日將過夜培養(yǎng)的培養(yǎng)皿取出，交叉取2環(huán)培養(yǎng)，重新懸浮于100μl LB；倍比稀釋上述菌懸液；涂板，即取100-200μl菌液涂布于含100mg/L利福平，300mg/L鏈霉素和卡那霉素50mg/L的LB平板上，28℃培養(yǎng)2-3天；挑單菌落點于含如上三種抗生素的LB平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，再篩選一次；挑取數(shù)個菌落進行懸浮培養(yǎng)，PCR和質(zhì)粒酶切鑒定。三親雜交將構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA440后，應(yīng)用農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化棉花。
(2)花粉管微注射法轉(zhuǎn)化棉花大量提取質(zhì)粒，用于花粉管微注射法轉(zhuǎn)化棉花蘇抗103、蘇抗310、蘇8、蘇12、中16、中9、中20、石遠321、鹽城7159、鹽城7141、徐219及徐9236共12個品種。挑單克隆菌落于500ml LB培養(yǎng)基，振搖培養(yǎng)20小時；5,000rpm離心5分鐘收菌，棄去上清液；加入5ml溶液1(成分見《分子克隆》)，混勻；加入10ml溶液2(成分見《分子克隆》)，上下顛倒混勻，室溫靜置5分鐘；加入7.5ml溶液3(成分見《分子克隆》)，溫和混勻；7,000rpm離心5分鐘，取上清液倒入45ml離心管中，加入7.5ml異丙醇，混勻；7,000rpm離心2分鐘，上清液倒入另一支45ml離心管中，加6ml異丙醇，混勻；7,000rpm離心5分鐘，棄上清液；沉淀用200μl TE懸浮，轉(zhuǎn)入1.5ml小離心管中，再用200μl TE洗一遍含沉淀的離心管，合并于小離心管中，加入2μl RNase(10mg/ml)，37℃，放置30分鐘；加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，振蕩30秒。12,000rpm離心5分鐘；吸上層溶液至新的Eppendorf管中，加入1/10體積的3N醋酸鈉，再加總體積2-3倍的無水冷乙醇，-20℃放置10分鐘；10,000rpm離心5分鐘，棄上清；加入1ml 70％乙醇沖洗后，干燥；將沉淀溶于TE，10％PEG純化。
于棉花開花當(dāng)天將質(zhì)粒經(jīng)花粉管途徑注射入子房中進行轉(zhuǎn)化，共獲得棉花種子1000粒；實施例7 轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的分子驗證，包括組織化學(xué)染色、PCR、Southern雜交、棉纖維中角蛋白的Western blot分析等。
(1)組織化學(xué)染色取棉花種子進行無菌培養(yǎng)，待萌發(fā)3天后取根尖進行組織化學(xué)染色植物組織浸泡于GUS染色液中，37℃溫浴24h，以70％乙醇和90％乙醇各脫色一次。在解剖鏡下觀察并照相。GUS染色液25ml磷酸緩沖液(pH7.0)，0.25ml 0.1M K3[Fe(CN6)]，0.25ml 0.1M K4[Fe(CN6)]，1ml0.5M Na2EDTA，ddH2O 23.5ml，Gluc 50mg。共獲得GUS陽性植株(根尖GUS染色為藍色)72棵。
(2)PCR檢測選取GUS活性強的37棵植株，提取DNA后進行PCR檢測，應(yīng)用引物P2正(5’GGAAGTTTTACTGACACTGC 3’)和引物KAP2進行PCR，復(fù)性溫度為52℃，15個循環(huán)后，取1μl反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用引物P正(5’CACCATTCACCACTTGCTC 3’)和KAP2再擴增25個循環(huán)，其中22棵棉花擴增出特異條帶。
(3)DNA分子雜交a.棉花基因組DNA提取方法取1g棉花葉片加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加入5ml抽提緩沖液(500mmol NaCl；50mmol Tris/Hcl，pH8.0；50mmol EDTA，pH8.0；1％β-巰基乙醇)，0.6ml 20％PVP及1ml 10％SDS，輕輕混勻。65℃溫育20分鐘后，加入1/10體積的5M KAC，冰浴30分鐘。4℃，15,000rpm離心10分鐘，吸出上清液。加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，冰浴10分鐘，4℃，10,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。沉淀用75％乙醇洗滌后晾干，加入500μl TE溶解。加入適量的RNase，37℃溫育30分鐘后，用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1-2次。將上層液轉(zhuǎn)移到新管中，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3N NaAC(pH5.2)，冰浴10分鐘。4℃，12,000rpm離心5分鐘后，沉淀用75％乙醇洗滌抽干，溶于100μl TE中。
b.DNA雜交參見BOEHRINGER公司DIGDNA標(biāo)記和檢測試劑盒的產(chǎn)品說明。任意選取7棵陽性植株的PCR產(chǎn)物，分別以質(zhì)粒13BKT和未轉(zhuǎn)化棉花的PCR擴增產(chǎn)物為正、負(fù)對照進行了分子生物學(xué)鑒定(PCR-Southern)，結(jié)果見圖6，證明所選蘇抗103-63、蘇抗310-394、石遠321-566、石遠321-571、石遠321-587、鹽城7159-647和鹽城7141-626，7個樣品中含有外源角蛋白基因。
(4)轉(zhuǎn)基因植物的Western blot檢測取轉(zhuǎn)基因棉花的棉纖維，用液氮充分研磨后，加入適量的蛋白提取緩沖液(50mmol Tris/HCl，10mmol EDTA，pH8.0；1％巰基乙醇)，4℃，15,000rpm，離心10分鐘后，取上清液，按卡馬斯亮藍法測定蛋白含量。各取5μg總蛋白進行10％SDS-PAGE電泳，然后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移裝置(美國Bio-Rad公司出品)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(50mA電流轉(zhuǎn)移過夜，4℃)，按Sambrook方法(1989)進行雜交以證明轉(zhuǎn)基因棉纖維中角蛋白的表達。雞抗角蛋白基因多克隆抗體以1∶300、第二抗體兔抗雞IgG抗體(購自Promega公司)以1∶2500稀釋使用。顯色劑為BCIP和NBT(購自Promega公司)。實驗正進行中。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因棉纖維，其特征在于其為動物角蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因棉纖維，其特征在于所述動物是兔或羊。
3.如權(quán)利要求1所述動物角蛋白轉(zhuǎn)基因棉纖維獲得的基因工程方法，其特征在于分離棉纖維特異表達啟動子，將角蛋白基因克隆并構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因載體，轉(zhuǎn)化棉花以使動物角蛋白基因在棉纖維中特異表達，所用啟動子為棉纖維特異啟動子，GAE6-3A啟動子長1459個堿基對，序列為- AATTCATAGGTATAGGAAGAAGCCCTGTCAAATAGAGATTTTTTCTTTCG -50- ACCATATTTCGATTGTTAATACGATATATAAGGACCGCTACTACAAATAG -100- TACTACACCCTTGATCGTGAAATATCGATTGCTTGTTGAACCCTGTGAAT -150- TGCGTGAAAGTAGGATACTCCAAATTCGGGGGTCCAAGAGTTTTATAAAA -200- CGTTCTTGGTGGAAAAAAATGTGAATGAAAGATCCCACTGAATTGAATTG -250- GGTCCATGAATCTAAGAAATAGTGAGAATTCTCCTATTTTTATTTATTTA -300- TTTGCTTAGGAAGTTTTACTGACACTGCTTTTATTTTTCCATCAATCAAA -350- TTTAAGAGACAATTCACTTTTTATAATTAACAAAAAAAAACAAAAAGAAA -400- ATAAAAGAAATTACTTTTTTCTTTTTCGTGTTCGATACAAGATAGATGAA -450- ATATGAAAAATAAAATGAAATGAAAATATATTACTAGTGATATATCACCT -500- CCATTATGTAGGGGAAAGAAATAAAAATAATATTAATTTATGATACTTCC -550- ATAATGTGGTTAAAAATAATTATCTAGTATTTTTTTGTAAAAAAAAAAAG -600- TTGATATCTATGCTACTAATGAGGTTTCTTAGTGAGTTTGTTACTACTAA -650- TAAAGTTTATTTGCATGGTTGAGACCTTATGCTTTTCAAATACCCATTTT -700- TGAATTTTAAAAATTGTGAATTTTTATTATATTTAAAAAACAAGTTATTT -750- ATATAACTAGTAATGTATTATTTTGACTTTTTTTTAATCGAGTTAATGTT -800- GGTTATTTCGTTATACCAATTCAATAAAATATTTTATTTATATTAAATTA -850- TAGCATACTCACGATGTGGGTGAAGTAAAATTATTTAACAAATATATTTT -900- GAAAAATTGATAAAAATACTAAATGAGGTTTTGGTTGAATAGTAAGATAT -950- AATTATTACAAATTATAAATATGTAGGTTCAAAATCTATCATGTGTATAT -1000- TTGTACTATTATTCTATATAAATTGATAACCTTATAAAAGTATCTAATTT -1050- AGTTTATGGTTGATTGATCGATAATACCAAATTTATTAAAAATTAATATT -1100- AGTAAAGATATATAGTACAAAACTAAACATAAAATTTTATATGTTAAGGA -1150- AATAGCGGAAAAAATATCATATTTGTAGAACTGTTTAGCAGTGTGGGAGA -1200- ATGGGATCATTACAAGGAAAAATGAAATATATATCATTAATAACAAACAT -1250- AAAAGAAAGCGTCTTTTGATAAAGTTGTTATTGGTGTAATGTGAAGGGAC -1300- CACAATCATCACCATTCACCACTTGCTCCTAATTGAGTTGAAATCTTTTT -1350- ACAACATAGAAAACTAGAAGATCGCCCTTTCTTGCTTCATATATATAGAT -1400- TTTGTATCATCGCAATTTCACATCACACACACAAGTAAAGCATTAGCAAC -1450- CATAGCC -145全文摘要
一種含動物角蛋白棉纖維及其基因工程方法。應(yīng)用亞洲棉基因組DNA經(jīng)PCR擴增了E6基因片段,根據(jù)該序列設(shè)計引物,用PCR－96孔板方法篩選亞洲棉基因組文庫,得到該基因GAE6－3A克隆,其插入片段長約8kb,上游啟動子長1457bp。提取兔子總DNA,擴增克隆了編碼兔毛角蛋白基因,并將其裝入原核表達載體中獲得高效表達后,免疫雞制備角蛋白抗體。進一步構(gòu)建了由GAE6－3A啟動子驅(qū)動的角蛋白植物轉(zhuǎn)基因載體,轉(zhuǎn)化棉花,經(jīng)組織化學(xué)染色、PCR及DNA分子雜交驗證角蛋白基因已轉(zhuǎn)入棉花中。
文檔編號C12N15/64GK1262032SQ99113430
公開日2000年8月9日 申請日期1999年1月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月22日
發(fā)明者陳曉亞, 于曉紅, 朱勇清, 周寶良, 林芝萍, 賈軍偉 申請人:上海世華植物基因工程有限公司, 中國科學(xué)院上海植物生理研究所