專利名稱:人工合成的干擾素α-2b基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)的制作方法
基因工程人工干擾素α-2b(rhIFNα-2b)對多種病毒感染有較好的療效,甚至對某些腫瘤,特別是血癌,也有治療效果。如能降低生產(chǎn)成本,大量提供廉價的rhIFNα-2b藥品,將會產(chǎn)生很高的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
本發(fā)明提供了一個比以前更好的rhIFNα-2b表達(dá)系統(tǒng)。它是通過選用大腸桿菌偏愛的密碼子,并用計算機(jī)模擬計算了翻譯起始區(qū)和干擾素α-2b基因5′二級結(jié)構(gòu)的最小生成自由能,綜合考慮了上述兩個因素,設(shè)計并合成了人干擾素α-2b基因序列,將其裝入高效表達(dá)載體pLy4,構(gòu)建成pHX-hIFNα-2b表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建所得的基因工程干擾素生產(chǎn)菌是一個能高效表達(dá)人基因工程干擾素α-2b系統(tǒng),具有很高工業(yè)化生產(chǎn)價值,將用于生產(chǎn)人干擾素α-2b注射液和人干擾素α-2b應(yīng)用膠囊等制劑的藥物生產(chǎn)。
本發(fā)明的特征是在于設(shè)計了人干擾素α-2b在大腸桿菌表達(dá)的基因序列,并進(jìn)行人工合成,構(gòu)建了人干擾素α-2b的表達(dá)質(zhì)粒pHX-hIFNα-2b,構(gòu)建了人干擾素α-2b大腸桿菌生產(chǎn)菌,并進(jìn)行了人干擾素α-2b的高效表達(dá),表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的30%左右,具有很高的生產(chǎn)價值。并證明工程菌是穩(wěn)定的。
本發(fā)明是通過的下述實(shí)施例進(jìn)行實(shí)施發(fā)明中的
圖1、人工合成hIFNα-2b基因DNA順序圖2、FI、FII、FIII片段的拼接及克隆圖3、hIFNα-2b基因中片段PCR合成電泳圖MpGEM DNA Marker圖4、M13mp18-F II·F III的構(gòu)建圖5、M13mp18-F I·F II·F III的構(gòu)建圖6、PUC18-hIFNα-2b圖7-1基因測序5′→圖7-2基因測序3′→圖8、pHX-hIFNα-2b表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖9、pHX-hIFNα-2b質(zhì)粒酶切鑒定圖
1.λ/Hind III+EcoR I2.質(zhì)粒3.EcoR I4.Bg1 II5.EcoR I/BgL II6.EcoR I/Sal I圖10、pHX-IFNα-2b 50代次酶切圖1.λ/Hind III Marker2.pHX-hIFNα-2b第10代酶切圖譜3.pHX-hIFNα-2b第20代酶切圖譜4.pHX-hIFNα-2b第30代酶切圖譜5.pHX-hIFNα-2b第40代酶切圖譜6.pHX-hIFNα-2b第50代酶切圖譜7.λ/Hind III Marker圖11、pHX-hIFNα-2b 50代次蛋白質(zhì)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖MSDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白1.pHX-hIFNα-2b第10代次蛋白質(zhì)表達(dá)2.pHX-hIFNα-2b第20代次蛋白質(zhì)表達(dá)3.pHX-hIFNα-2b第30代次蛋白質(zhì)表達(dá)40.pHX-hIFNα-2b第40代次蛋白質(zhì)表達(dá)50.pHX-hIFNα-2b第50代次蛋白質(zhì)表達(dá)培養(yǎng)條件M9培養(yǎng)基、30℃過夜、42℃誘導(dǎo)。
實(shí)施例1 表達(dá)基因合成本發(fā)明選用了大腸桿菌偏愛的密碼子,并用計算機(jī)模擬計算了翻譯起始區(qū)和IFNα-2b基因5′端二級結(jié)構(gòu)最小生成自由能,綜合考慮上述兩個因素設(shè)計了全合成人干擾素α-2b(hIFNα-2b)基因序列(見圖1-1和圖1-2)及合成組裝路線。
1、小片段合成將hIFNα-2b基因的正、負(fù)兩鏈分解成16個依序部份重疊的小片段,分別用DNA合成儀進(jìn)行合成。
2、中片段拼接合成的16個小片段按順序分成三組,分別經(jīng)PCR連接成三個中片段(FI、FII、FIII),長度分別為FI-200bp、FII-100pb、FIII220bp,它們各自的末端均含酶切位點(diǎn)FI(EcoR I/Bgl II.Bam H I),F(xiàn)II(Bam H I.Bgl II/Hind III),F(xiàn)III(Hind III/Sal I)。分別按各自的末端酶切位點(diǎn)酶切,并克隆到M13mp18或M13mp19中,測定DNA順序,從中篩選出含正確序列的M13mp18-FI,M13mp19-FII和M13mp18-FIII。中片段的拼接簡程(見圖2)。PCR電泳圖鑒定(見圖3)。
3、M13mp18.FII.FIII的構(gòu)建用Hind III和Pvu I分別酶切M13mp19-FII.和M13mp18-FIII,將切出的FII片段與酶切的M13mp18-FIII連接,克隆,用BamH1和Sall酶切、篩選,得到M13mp18-FII.FIII.構(gòu)建簡程(見圖4)。
4、M13mp18FI.FII.FIII的構(gòu)建 用Bam h I和Sal I酶切M13mp18-FII.FIII得到FII.FIII片段,與經(jīng)同樣酶切的M13mp18-FI相連接、克隆,用EcoR I和Sal I酶切篩選,得到M13mp18-FI.FII.FIII構(gòu)建簡程(見圖5)。
5、PUC18-hIFNα-2b的構(gòu)建用EcoR I和Sal I酶切M13mp18-FI.FII.FIII,所得FI.FII.FIII片段與經(jīng)同樣酶切的PUC18相連接。得到PUC18FI.FII.FIII。該質(zhì)粒用Bgl II酶切,再連接,即得到PUC18-hIFNα-2b(見圖6)。DNA測序確證人工合成hIFNα-2b基因與設(shè)計相符,編碼正確(見圖7-1、圖7-2、圖1-1和圖1-2)。
實(shí)施例2 pHX-HIFNα-2b表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建高效表達(dá)載體pLY4由劉新垣教授實(shí)驗(yàn)室提供,這是劉新垣教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的一個溫度誘導(dǎo)型高表達(dá)載體。詳細(xì)構(gòu)建資料參閱《中國科學(xué)》(B輯),1995,25(10)1063-1070。用EcoR I和Sal I從PUC18-hIFNα-2b中切出hIFNα-2b基因克隆到pLY4中,得到表達(dá)質(zhì)粒pHX-hIFNα-2b(見圖8)。該質(zhì)粒在大腸桿菌中高效表達(dá),表達(dá)水平可達(dá)菌體總蛋白的30%左右。質(zhì)粒大小及酶切鑒定圖(見圖9)。
實(shí)施例3干擾素α-2b生產(chǎn)菌的構(gòu)建1、宿主菌大腸桿圖DH5α2、質(zhì)粒pHX-hIFNα-2b的轉(zhuǎn)化從新鮮的大腸桿DH5αLB平板挑取菌接種于LB試管中,37℃培養(yǎng)過夜,再轉(zhuǎn)接于三角瓶中,繼續(xù)振落培養(yǎng)2-2.5小時。培養(yǎng)物置冰浴10分鐘后,離心收集菌體,并用預(yù)冷的氯化鈣溶液懸浮,冰浴20分鐘后,離心收集菌體,再懸浮于預(yù)冷的氯化鈣溶液,并分裝于Eppendorf管中,冷藏備用。
取一管氯化鈣處理過的菌液,加入質(zhì)粒pHX-hIFNα-2b,冰浴20分鐘后,轉(zhuǎn)置42℃水浴2分鐘,涂布適量菌液于含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)過夜,即得到轉(zhuǎn)化菌菌落。
3、轉(zhuǎn)化菌的篩選從新鮮轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化菌落,分別接種于含有氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基的試管中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,分別離心收集菌體。用堿裂解法,將菌體懸浮,氫氧化鈉裂解、醋酸鈉中和,離心所得上清液,分別用酚-氯仿抽提,乙醇沉淀,離心回收質(zhì)粒DNA。回收的質(zhì)粒DNA分別溶解于TE后,用EcoR I/Sal I雙酶切,瓊脂糖電泳,篩選出含500bp左右小片段的樣品。
將篩選所得的攜有重組質(zhì)粒的菌樣,分別接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)接于M9培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)2小時后,42℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時,離心收集菌體。
部分菌體用SDS-PAGE電泳檢查全菌蛋白,在15KD處有明顯表達(dá)條帶,占菌體總蛋白的30%左右。
另一部分菌體用鹽酸胍溶解,用WISH細(xì)胞,以VSV為基本檢測系統(tǒng),按細(xì)胞病變抑制法測定生物活性,得到陽性結(jié)果。
以上結(jié)果說明,構(gòu)建所得的人基因工作α-2b干擾素生產(chǎn)菌是一個能高效表達(dá)人基因工程α-2b干擾素的系統(tǒng),具有工業(yè)化生產(chǎn)價值。
實(shí)施例4菌種穩(wěn)定性用上述方法構(gòu)建成的大腸桿菌DH5α(CCTCC No.M99002)(pHX-IFNα-2b)在LB氨芐青霉素斜面轉(zhuǎn)接50次后提取菌體中的質(zhì)粒DNA,并用限制性內(nèi)切酶(EcoR I/Sal I)鑒定,酶切圖譜與原菌種相同(圖10)。SDS-PAGE圖表明,50代次表達(dá)水平未見顯著差異(圖11)。以上結(jié)果說明該工程菌是穩(wěn)定的。
權(quán)利要求
1.一個人工合成的干擾素α-2b基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)系統(tǒng),其特征在于(1)設(shè)計并合成的人干擾素α-2b基因序列1 10Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg ArgGAG GAA TTC ATG TGT GAC CTG CCG CAG ACC CAC TCT CTG GGT TCT CGT CGTCTC CTT AAG TAC ACA CTG GAC GGC GTC TGG GTG AGA GAC CCA AGA GCA GCA20 30Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys LeuACC CTG ATG CTG CTG GCT CAG ATG CGT CGT ATC TCT CTG TTC TCT TGC CTGTGG GAC TAC GAC GAC CGA GTC TAC GCA GCA TAG AGA GAC AAG AGA ACG GAC40Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln PheAAA GAC CGT CAC GAC TTC GGT TTC CCG CAG GAA GAG TTC GGT AAC CAG TTCTTT CTG GCA GTG CTG AAG CCA AAG GGC GTC CTT CTC AAG CCA TTG GTC AAG50 60Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile PheCAG AAA GCT GAA ACC ATC CCG GTT CTG CAC GAA ATG ATC CAG CAG ATC TTCGTC TTT CGA CTT TGG TAG GGC CAA GAC GTG CTT TAC TAG GTC CTC TAG AAG70 80Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu LeuAAC CTG TTC TCT ACC AAA GAC TCT TCT GCT GCT TGG GAC GAA ACC CTG CTGTTG GAC AAG AGA TGG TTT CTG AGA AGA CGA CGA ACC CTG CTT TGG GAC GAC90Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu AlaCTG GAC AAA TTC TAC ACC GAA CTG TAC CAG CAG CTG AAC GAC CTG GAA GCTGAC CTG TTT AAG ATG TGG CTT GAC ATG GTC GTC GAC TTG CTG GAC CTT CGA100 110Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu AspTGC GTT ATC CAG GGT GTT GGT GTT ACC GAA ACC CCG CTG ATG AAA GAA GACACG CAA TAG GTC CCA CAA CCA CAA TGG CTT TGG GGC GAC TAC TTT CTT CTG120 130Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu LysTCT ATC CTG GCT GTT CGT AAA TAC TTC CAG CGT ATC ACC CTG TAC CTG AAAAGA TAG GAC CGA CAA GCA TTT ATG AAG GTC GCA TAG TGG GAC ATG GAC TTT140Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile MetGAA AAG AAA TAC TCT CCG TGC GCT TGG GAA GTT GTT CGT GCT GAA ATC ATGCTT TTC TTT ATG AGA GGC ACG CGA ACC CTT CAA CAA GCA CGA CTT TAG TAC150 160Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys GluCGT TCT TTC TCT CTG TCT ACC AAC CTG CAG GAA TCT CTG CGT TCT AAA GAAGCA AGA AAG AGA GAC AGA TGG TTG GAC GTC CTT AGA GAC GCA AGA TTT CTTTAAATT(2)將合成基因裝入高效表達(dá)載體pLY4,成pHX-hIFNα-2b表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建所得的基因工程干擾素α-2b工程菌(CCTCC Mo.99002)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用合成基因裝入高效表達(dá)載體pLY4,構(gòu)建的工程菌制備的人基因工程干擾素α-2b可用于注射劑、外用膠囊藥物的生產(chǎn)應(yīng)用和其他產(chǎn)品的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明設(shè)計合成了在大腸桿菌中高效表達(dá)的基因序列,構(gòu)建了高效表達(dá)質(zhì)粒pHX-h(huán)IFNα-2b、人干擾素α-2b大腸桿菌生產(chǎn)菌,具有很高的生產(chǎn)價值,可用于多種藥物制劑及其它產(chǎn)品的生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/70GK1240830SQ9911373
公開日2000年1月12日 申請日期1999年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月25日
發(fā)明者劉新垣 申請人:上海華新生物高技術(shù)有限公司