專利名稱：巨大芽孢桿菌青霉素g酰化酶的枯草芽孢桿菌表達(dá)元件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，具體涉及到巨大芽孢桿菌青霉素G?；富虻目莶菅挎邨U菌表達(dá)元件。
青霉素G?；?Penicillin G acylase EC3．5．1．11，簡稱PGA)能催化β-內(nèi)酰胺類抗生素發(fā)生脫?；饔枚a(chǎn)6-氨基青霉烷酸(6-APA)，6-APA在半合成青霉素中有廣泛用途，因而PGA在工業(yè)生產(chǎn)中越來越重要。PGA廣泛存在于各種微生物中，目前都應(yīng)用大腸桿菌分泌的PGA，但巨大芽孢桿菌能將PGA分泌至胞外，在工業(yè)提取上更有利。但巨大芽孢桿菌天然菌株有缺陷在菌培養(yǎng)過程中需頻繁加入苯乙酸誘導(dǎo)酶產(chǎn)生，且需變溫發(fā)酵，即在28℃培養(yǎng)2天，再在25℃培養(yǎng)1天以誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生，發(fā)酵周期較長，這些對于大規(guī)模發(fā)酵都是不利的。利用基因工程方法構(gòu)建高產(chǎn)和分泌型的產(chǎn)酶菌，將促進(jìn)其在工業(yè)上的應(yīng)用。
文獻(xiàn)報道[張?zhí)m芳等，生物工程學(xué)報，1991，7(1)，47-53；Martin L et al，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，1995，125287-92]分別克隆到巨大芽孢桿菌pga，并在大腸桿菌中作了表達(dá)。Martin等篩選到的巨大芽孢桿菌青霉素G酰化酶基因在E．coli HB101中表達(dá)不需苯乙酸的誘導(dǎo)，但表達(dá)量十分微弱，且在胞外檢測不到酶活性。張?zhí)m芳等克隆到巨大芽孢桿菌青霉素G?；富?包括結(jié)構(gòu)基因及調(diào)節(jié)基因)，在E．coli MC1061中表達(dá)，表達(dá)只能在28℃進(jìn)行。此外，苯乙酸的誘導(dǎo)對產(chǎn)酶是必須的。
枯草芽孢桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)有以下優(yōu)點(1)能夠把有功能的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外；(2)非致病性；(3)沒有明顯的偏愛密碼子。與枯草芽孢桿菌相比，大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，由于同巨大芽孢桿菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，可能不能正確完成后加工。許多革蘭氏陽性菌的蛋白質(zhì)在其自身表達(dá)信號控制下可在枯草芽孢桿菌表達(dá)。當(dāng)產(chǎn)某種蛋白的原始菌的生長條件較為苛刻時，將其基因克隆到一個多拷貝質(zhì)粒中，表達(dá)水平通常能提高。此外還發(fā)現(xiàn)某些在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的蛋白較之原始菌所產(chǎn)蛋白有更好的熱穩(wěn)定性或更寬的pH范圍。而枯草芽孢桿菌能將不斷產(chǎn)生的可能有害的蛋白質(zhì)分泌到體外的培養(yǎng)基中。避免了對細(xì)胞的毒害，故可能獲得高活性的青霉素G?；浮ang等曾在枯草芽孢桿菌中表達(dá)巨大芽孢桿菌青霉素?；?，但表達(dá)量較低[Kang J H etal，Journal of Biotechnology，1991，17(2)99-108]。我們實驗室對PGA在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)做了深入廣泛的研究，也曾發(fā)表過文章[黃艷紅等，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，1999，15(1)169-71]，在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌中都作了表達(dá)，但是酶活水平較低，LB培養(yǎng)基中＜0．8U／ml。
為此，本發(fā)明目的是提供改進(jìn)的巨大芽孢桿菌青霉素G酰化酶表達(dá)元件，轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌宿主，獲得穩(wěn)定高效分泌表達(dá)PGA的枯草芽孢桿菌基因工程菌株；可使生產(chǎn)工藝簡化，發(fā)酵周期縮短，適宜工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。
本發(fā)明提供改進(jìn)的PGA表達(dá)元件(圖1)，PGA表達(dá)元件包含枯草芽孢桿菌啟動子和巨大芽孢桿菌來源PGA的核糖體結(jié)合位點及其結(jié)構(gòu)基因。作為啟動子序列，可使用任何一種適于在枯草芽孢桿菌中表達(dá)所需蛋白質(zhì)的啟動子，選用能在不同時間啟動表達(dá)的重疊啟動子效果更好。表達(dá)元件中的核糖體結(jié)合位點序列為GGAGGTGGAAATGTA。將啟動子、核糖體結(jié)合位點和PGA結(jié)構(gòu)基因以重組DNA技術(shù)按照圖1所示連接得到PGA的枯草芽孢桿菌表達(dá)元件。以T4 DNA連接酶將表達(dá)元件和表達(dá)載體(表達(dá)質(zhì)?；蛉旧w整合載體)連接，轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌宿主中，獲得包含上述表達(dá)元件的表達(dá)PGA的枯草芽孢桿菌基因工程菌株。
巨大芽孢桿菌青霉素G?；富蚣捌浜颂求w結(jié)合位點來源于巨大芽孢桿菌(如Bacillus megaterium CA4098，ATCC14945等)基因組。本發(fā)明根據(jù)已報道序列設(shè)計兩端引物，直接以PCR方法擴(kuò)增到結(jié)構(gòu)基因和核糖體結(jié)合位點。也可以根據(jù)已報道的巨大芽孢桿菌青霉素G?；富虻纳舷掠涡蛄?，用限制性內(nèi)切酶建立次級文庫結(jié)合菌落原位雜交的方法(需合成一段寡聚核苷酸探針)從基因組DNA中獲得。
作為啟動子序列，可使用任何一種適于在枯草芽孢桿菌中表達(dá)所需蛋白質(zhì)的啟動子，例如P43、HpaⅡ、veg、rrnT2等。重疊啟動子P43效果最佳，該啟動子可在枯草芽孢桿菌生長期和靜止期分別啟動基因轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體可以為枯草芽孢桿菌質(zhì)?；蚩莶菅挎邨U菌染色體整合載體，為提高表達(dá)量，采用質(zhì)粒載體更具優(yōu)勢?？莶菅挎邨U菌中構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒應(yīng)首先考慮的因素是質(zhì)粒的穩(wěn)定性。表達(dá)質(zhì)粒一般采用最穩(wěn)定的pUB110或pUB110的衍生質(zhì)粒(本發(fā)明實施例中的pPZW103即是包含P43啟動子的pUB110衍生質(zhì)粒)。選擇適當(dāng)?shù)拿盖形稽c，將巨大芽孢桿菌青霉素G?；富蚣捌浜颂求w結(jié)合位點序列以T4 DNA連接酶連接于表達(dá)載體的啟動子之后，即獲得包含PGA表達(dá)元件的枯草芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒。
最后，以SP法或原生質(zhì)體法或電轉(zhuǎn)化法等將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌宿主細(xì)胞Bacillus subtilis 168(其它如BR151，BCL1050，DB104或WB600等均可)，獲得表達(dá)PGA的枯草芽孢桿菌基因工程菌株pga-SIBAS205(于1999年6月7日保藏在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No．0398)。表達(dá)溫度為37℃最佳。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，上清測得PGA活力3-6U／ml，無需苯乙酸的誘導(dǎo)。酶活測定采用NIPAB法[上海第三制藥廠等，醫(yī)藥工業(yè)，1978，722-4]。在不含抗生素選擇壓力的條件下，經(jīng)過連續(xù)10天傳代實驗，產(chǎn)酶量無明顯下降(見圖3)，證明了pga-SIBAS205傳代穩(wěn)定。
優(yōu)點本發(fā)明提供的PGA表達(dá)元件通過優(yōu)選枯草芽孢桿菌啟動子來代替PGA在巨大芽孢桿菌中的原有啟動子，在枯草芽孢桿菌的生長期和靜止期分別啟動轉(zhuǎn)錄，提高了轉(zhuǎn)錄水平，并得以避開變溫發(fā)酵和苯乙酸誘導(dǎo)(苯乙酸的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平)；通過沿用巨大芽孢桿菌原來的核糖體結(jié)合位點來保證翻譯起始效率；大大提高了PGA在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)量，產(chǎn)酶速度快，不需誘導(dǎo)，傳代穩(wěn)定，使生產(chǎn)工藝簡化，生產(chǎn)周期大為縮短，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。


圖1巨大芽孢桿菌青霉素酰化酶的枯草芽孢桿菌表達(dá)元件示意圖。
圖2青霉素G酰化酶表達(dá)質(zhì)粒pEES102的構(gòu)建示意圖。
圖3PGA表達(dá)元件穩(wěn)定性曲線圖。
本發(fā)明通過以下實施例進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 巨大芽孢桿菌青霉素G?；富虻目寺?．巨大芽孢桿菌基因組的抽提選擇培養(yǎng)14小時的巨大芽孢桿菌CA4098抽提基因組。取3ml菌液，6000r/min離心5分鐘，取400μl TE(pH8．0，10mmol／L Tris，1mmol／L EDTA)懸浮菌體，加入溶菌酶至終濃度7mg／ml菌液，37℃消化1小時，酚抽提一次，酚／氯仿抽提二次，最后由氯仿抽提一次，吸取上清，2倍體積乙醇沉淀，12，000rpm離心5分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌一遍，12，000rpm離心，棄上清，沉淀自然干燥，溶于100μl TE溶液中，加入2μl 10mg/ml RNA酶A，室溫放置半小時，0．7％Agarose電泳檢驗。
2．引物設(shè)計及PCR反應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)報道的巨大芽孢桿菌青霉素?；富虻男蛄?Martin L etal，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，1995，125287-92)，設(shè)計了兩段引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR引物由Sangon合成引物1 5’GCCGAATTCGGAGGTGGAAATGTAAT3’引物2 5’ATGGATCCTTACTTACTCATATTTAA3’在設(shè)計基因5’端引物(引物1)包含了核糖體結(jié)合位點，同時引入了一個EcoRI酶切位點?；?’端引物(引物2)包含了終止密碼子TAG附近的序列，并引入一個BamHI酶切位點。
以巨大芽孢桿菌染色體DNA為模板，加入一定量的引物1、引物2、TaqDNA聚合酶及dNTP混合物，于92℃變性7分鐘，然后按下列步驟進(jìn)行30個循環(huán)92℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘，最后一次循環(huán)在72℃延伸10分鐘。產(chǎn)物經(jīng)PCR純化試劑盒純化，0．7％Agarose電泳檢驗。
3．PCR產(chǎn)物的克隆PCR產(chǎn)物用酚／氯仿抽提除去蛋白，酒精沉淀回收DNA，抽干后重新用10μl TE溶解；pBluescript SK(+)1μg以EcoRI和BamHI消化完全，將酶切液進(jìn)行0．7％Agarose電泳，回收2．96kb片段。將以上二種片段按4∶1比例混合，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E．coli XL1-Blue。構(gòu)建的質(zhì)粒稱為pPGA(圖2)。
實施例2青霉素?；富虮磉_(dá)質(zhì)粒pEES102的構(gòu)建(圖2)將連接有青霉素?；富虻膒PGA質(zhì)粒5μg用EcoRI消化完全，加入2μl dNTP混合物及2UKlenow酶，室溫反應(yīng)30分鐘。用酚／氯仿抽提除去蛋白，酒精沉淀回收DNA，抽干后重新用20μl TE溶解，再用BamHI完全酶切，將酶切液進(jìn)行0．7％Agarose電泳，回收2．6kb片段。同時用SmaI和BamHI酶切表達(dá)載體pPZW103(由中國科技大學(xué)生物系王培之提供)2μg，將以上二種片段按4∶1比例混合，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis 168。
實施例3 表達(dá)質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)化于第一天下午取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168甘油菌劃平板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第二天挑單菌落至1ml SPI培養(yǎng)基中(SPI培養(yǎng)基SP鹽加入1％體積濃度為50％(W／V)葡萄糖溶液，1％體積100×CAYE溶液；SP鹽溶液0．2％(NH4)2SO4，1．4％K2HPO4，0．6％KH2PO4，0．02％MgSO4·7H2O，0．1％檸檬酸鈉)，37℃，250rpm培養(yǎng)3小時。取0．1ml培養(yǎng)液至5ml SPⅠ培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)4小時。轉(zhuǎn)移其中1．2ml至12mlSPⅡ培養(yǎng)基中(SPⅡ培養(yǎng)基SPⅠ培養(yǎng)基加入1％體積50mmol·L-1CaCl2溶液，1％體積250mmol·L-1MgCl2溶液)，37℃，100rpm培養(yǎng)90分鐘。分裝成0．5ml每管，各加入5μl 10mmol／L EGTA，再于37℃，100rpm培養(yǎng)10分鐘。加入5μl連接液，再于37℃，240rpm培養(yǎng)90分鐘，取菌液涂布卡那霉素(50mg／L)LB平板，得轉(zhuǎn)化子即是枯草芽孢桿菌基因工程菌株pga-SIBAS205。
實施例4巨大芽孢桿菌青霉素G?；副磉_(dá)從含卡那霉素60μg/ml的LB平板(LB培養(yǎng)基蛋白胨1％，酵母膏0．5％，NaCl 1％，平板加1．5％Agar)上接SIBAS 205單菌落在LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，250r／min培養(yǎng)24小時。離心取20μl上清。加入980μl磷酸緩沖液里，37℃溫浴。再加入2ml 37℃預(yù)熱的0．9mg/ml NIPAB(6-硝基-3-(苯乙酰氨基)苯甲酸)溶液。反應(yīng)4分鐘，取出加入2ml 95％乙醇終止反應(yīng)。空白對照先加2ml 95％乙醇，后加酶液。于405nm測定吸光度。酶活力定義為1分鐘內(nèi)水解產(chǎn)生1μmol的6-硝基-3-氨基-苯甲酸所需青霉素?；傅牧繛?單位。
發(fā)酵液上清的PGA活力為3-6u／ml。
實施例5 pEES102質(zhì)粒穩(wěn)定性的檢測從含卡那霉素60μg／ml LB平板上接pga-SIBAS205單菌落于3ml LB培養(yǎng)基中，于37℃，250rpm培養(yǎng)24小時。菌液離心取上清測定活力。同時取30μl菌液作為種子菌轉(zhuǎn)接至3mlLB培養(yǎng)基中，同樣條件進(jìn)行傳代及活力測定。
由圖3可看出在不含抗生素選擇壓力的條件下，經(jīng)過連續(xù)10天傳代實驗，產(chǎn)酶量無明顯下降。
權(quán)利要求
1．一種巨大芽孢桿菌青霉素G?；傅目莶菅挎邨U菌表達(dá)元件，其特征在于該表達(dá)元件包含枯草芽孢桿菌啟動子和巨大芽孢桿菌來源青霉素G?；傅暮颂求w結(jié)合位點及其結(jié)構(gòu)基因。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)元件，其特征在于所述啟動子為枯草芽孢桿菌重疊啟動子P43。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)元件，其特征在于所述巨大芽孢桿菌青霉素G酰化酶的核糖體結(jié)合位點的序列為GGAGGTGGAAATGTA。
4．一種包含權(quán)利要求1所述表達(dá)元件的保藏登記號為CGMCC No．0398的表達(dá)巨大芽孢桿菌青霉素G?；傅目莶菅挎邨U菌基因工程菌株，其特征在于該菌株是將所述表達(dá)元件轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌168中得到的基因工程菌株pga-SIBAS205。
全文摘要
一種巨大芽孢桿菌青霉素G酰化酶的枯草芽孢桿菌表達(dá)元件,包含枯草芽孢桿菌啟動子和巨大芽孢桿菌來源青霉素G?；傅暮颂求w結(jié)合位點及其結(jié)構(gòu)基因。該表達(dá)元件轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌宿主,獲得穩(wěn)定表達(dá)巨大芽孢桿菌青霉素G?；傅目莶菅挎邨U菌基因工程菌株,提高了巨大芽孢桿菌青霉素G?；冈诳莶菅挎邨U菌中的表達(dá)量,產(chǎn)酶速度快,不需誘導(dǎo),傳代穩(wěn)定,使生產(chǎn)工藝簡化,生產(chǎn)周期大為縮短,適宜于工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。
文檔編號C12N15/74GK1281049SQ9911388
公開日2001年1月24日 申請日期1999年7月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月16日
發(fā)明者袁中一, 楊晟, 李士云, 黃曉冬 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所