專利名稱：大腸桿菌可溶性表達載體的設計及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
大腸桿菌表達體系是基因工程的首選表達體系，具有生長周期短，方法簡便，價格低廉，表達水平高等諸多優(yōu)點。但外源基因在大腸桿菌中表達時，往往以不溶性，無生物活性的包涵體形式存在。盡管包涵體產(chǎn)物形式為分離純化提供了不少便利，但產(chǎn)物必須經(jīng)體外變復性才能獲得生物活性。蛋白質(zhì)體外復性過程復雜，而且得率低。對多硫鍵的蛋白質(zhì)(尤其是藥用蛋白質(zhì))，存在二硫鍵錯配的異構(gòu)體，從而為下游的分離純化加大了難度，帶來了困難。為防止基因工程包涵體產(chǎn)物的形成，科學家采用了融合表達的方法即將外源基因和能在大腸桿菌中高水平表達，且產(chǎn)物溶解性很好的蛋白質(zhì)(如金黃色葡萄球菌蛋白A，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白malE，大腸桿菌硫氧還蛋白等)構(gòu)建成融合蛋白的形式，借助于溶解性能好，高水平表達的融合伙伴蛋白使所需要的目標蛋白質(zhì)(即外源基因產(chǎn)物)亦獲得可溶性的大量表達，從而避免包涵體產(chǎn)物的生成。同時借助于融合蛋白的性質(zhì)，方便了目標產(chǎn)物的分離純化。John M.McCoy等人研制的、由Novagen公司繼而開發(fā)并商業(yè)化推廣的的大腸桿菌硫氧還蛋白融合表達系統(tǒng)即為目前性能最好的融合表達系統(tǒng)(LaVallie，E.R.等Bio/Technology 11，187-193，1993)。但由于重組蛋白質(zhì)作為基因工程藥品及其它一些用途時，目標產(chǎn)物必須是像天然蛋白質(zhì)一樣的完整產(chǎn)物，而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表達產(chǎn)物必須進行產(chǎn)物后加工即融合蛋白的特異性裂解，才能獲得完整的目標產(chǎn)物。目前最為常用的裂解方法為1.化學法用溴化氫斷裂；2.蛋白酶法用凝血酶和腸激酶特異性裂解。以上裂解方法都要求1.目標蛋白質(zhì)內(nèi)不含裂解試劑特異性斷裂的氨基酸序列；2.為避免雜質(zhì)蛋白酶引發(fā)的不必要的裂解反應發(fā)生，需要高純度的凝血酶和腸激酶，價格昂貴；3.由于溴化氰為劇毒化合物，而裂解用蛋白酶為可能引起毒副作用的雜質(zhì)蛋白質(zhì)，因此溴化氰及蛋白酶必須從最終產(chǎn)物中除凈，這又帶來了進一步純化的麻煩，并人為增加了產(chǎn)品質(zhì)量控制和檢測的難度。
為了克服上述缺陷，本發(fā)明研制了一種新的大腸桿菌可溶性表達載體，該類表達載體既能顯著改善目標蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物的可溶性，有效避免或盡量減少包涵體產(chǎn)物的形成，又避免走融合蛋白表達系統(tǒng)的老路，表達產(chǎn)物以完整的非融合形式存在，有效避免融合表達產(chǎn)物后加工處理的麻煩和問題。這種表達載體目前在國內(nèi)外都未見報道。該類表達載體對有效避免或減少基因工程產(chǎn)物包涵體的難題，獲得有生物活性的基因工程產(chǎn)品，尤其是重組多肽藥物具有重要的實用價值。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達到大腸桿菌可溶性表達載體由通用的大腸桿菌表達質(zhì)粒改造得到，其中將外源基因和大腸桿菌硫氧還蛋白基因以多順反子形式共同置于同一個大腸桿菌啟動子的控制下，然后在大腸桿菌中共同表達，大部分表達產(chǎn)物以可溶性的生物活性形式存在。該表達載體可以和例如LysS，LysE或含分子伴侶，二硫鍵異構(gòu)酶等基因的相容性質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并共同表達，從而達到抑制目標產(chǎn)物誘導前的泄漏表達，或借助于分子伴侶或二硫鍵異構(gòu)酶的作用，進一步改善目標產(chǎn)物的可溶性，減少包涵體產(chǎn)物的形成等目的。本發(fā)明所述大腸桿菌可溶性表達載體可用于解決目前大腸桿菌基因工程表達產(chǎn)物易形成包涵體的難題，對可溶的、具有生物活性的基因工程產(chǎn)品，尤其是基因工程多肽、蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)具有實用價值。
實施例為了和目前最為流行的，改善表達產(chǎn)物可溶性性能最佳的pET32表達質(zhì)粒(美國Novagen公司)作一對比，本實例中使用了與pET32結(jié)構(gòu)相似的表達質(zhì)粒pNJUTRX-1。
1.表達質(zhì)粒pNJUTRX-1如圖所示，含有T7啟動子(圖中1)及T7啟動子控制的大腸桿菌硫氧還蛋白基因(圖中2)，和硫氧還蛋白基因終止密碼子重疊2個連續(xù)的SD序列(圖中3)，包含在NcoI識別位點中的ATG起始密碼子及一段多克隆位點序列(圖中4)，以及T7終止序列(圖中5)；2.心臟特異性同源異型蛋白Csx(含3對二硫鍵)cDNA經(jīng)NcoI，EcoRI酶解克隆進經(jīng)NcoI，EcoRI消解的pNJUTRX-1載體中，在大腸桿菌中經(jīng)IPTG誘導表達；3.表達產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎，分別收集裂解上清液和沉淀兩部分，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
結(jié)果表明幾乎所有Csx表達產(chǎn)物(完整Csx表達條帶分子量為35.6KDa)都以完整的非融合蛋白形式可溶性地存在于細胞裂解上清液中，沉淀中Csx包涵體產(chǎn)物的含量少于占沉淀中總蛋白質(zhì)的1％。而與此形成明顯對照的是克隆在融合表達載體pET32中的Csx，經(jīng)IPTG誘導后，表達產(chǎn)物分子量為54.6KDa，即為硫氧還蛋白-Csx融合表達產(chǎn)物，大部分融合表達產(chǎn)物以不溶性包涵體形式存在，硫氧還蛋白-Csx融合蛋白包涵體占裂解沉淀中總蛋白質(zhì)的49.1％。從本實例中可以看到本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較有明顯的如下優(yōu)點1.本發(fā)明設計的表達載體可顯著改善重組目標表達產(chǎn)物的可溶性，極大減少包涵體產(chǎn)物的形成，結(jié)果明顯好于目前性能最好的pET32硫氧還蛋白融合表達載體。在pET32硫氧還蛋白融合表達體系中，51.2％的重組硫氧還蛋白-Csx融合蛋白產(chǎn)物存在于包涵體沉淀中，40.6％的重組硫氧還蛋白-Csx融合蛋白產(chǎn)物存在于裂解上清液中；而在pNJUTRX-1中，96％的重組Csx表達產(chǎn)物都以完整的非融合蛋白形式可溶性地存在于細胞裂解上清液中，僅僅有不到1％的重組Csx表達產(chǎn)物存在于沉淀中；2.本發(fā)明設計的表達載體所表達的目標蛋白質(zhì)產(chǎn)物為非融合的完整蛋白質(zhì)，因此省去了融合表達體系中融合表達產(chǎn)物須經(jīng)特異性斷裂試劑裂解，才能獲得完整目標產(chǎn)物的復雜步驟；3.本發(fā)明中的表達載體可以和pET32一樣，和LysS，LysE以及含分子伴侶或二硫鍵異構(gòu)酶等基因的相容性質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
實施例


表達載體pNJUTRX-1示意圖。圖中1T7啟動子；2硫氧還蛋白基因trxA；3含有硫氧還蛋白基因終止密碼子和與其重疊的2個連續(xù)的SD序列的連接序列；4多克隆位點(Nco I，EcoR V，BamH I，EcoR I，Sac I，Sal I，Hind III，Not I，Eag I，Xho I，Ava I)；5T7終止子序列；6f1起始序列(f1 origin)；7氨芐抗性基因(Ap)；8復制起始序列(ori)；9乳糖操縱元阻遏蛋白基因(lac I)。
權(quán)利要求
1.一種大腸桿菌可溶性表達載體，其特征在于表達載體中將需要表達的外源基因和大腸桿菌硫氧還蛋白(thioredoxin)基因以多順反子形式共同置于同一個常用大腸桿菌啟動子的控制下，在大腸桿菌中共同表達，從而顯著提高外源基因在大腸桿菌中可溶性表達產(chǎn)物的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1.所述的新型表達載體，其特征是可以和含Lys S或LysE或含分子伴侶，或二硫鍵異構(gòu)酶等基因的相容性質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并共同表達，以抑制誘導前泄漏表達或進一步改善目標產(chǎn)物的可溶性和正確折疊等。
3.一種大腸桿菌可溶性表達載體，其特征在于解決目前大腸桿菌基因工程表達產(chǎn)物易形成包涵體的難題，對可溶的、具有生物活性的基因工程產(chǎn)品，尤其是基因工程多肽、蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)具有實用價值。
全文摘要
一種新的大腸桿菌可溶性表達載體:1.外源基因和大腸桿菌Thioredoxin(硫氧還蛋白)以多順反子形式在常用大腸桿菌啟動子控制下共表達;2.該表達載體顯著改善外源基因在大腸桿菌中表達產(chǎn)物的可溶性,減少包涵體產(chǎn)物的形成;3.該表達載體能和其它相容性質(zhì)粒共同使用,達到抑制泄漏表達或進一步改善表達產(chǎn)物可溶性等目的;4.其應用是解決目前大腸桿菌基因工程表達產(chǎn)物易形成包涵體的難題,對可溶的、具有生物活性的基因工程產(chǎn)品,尤其是基因工程多肽、蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)具有實用價值。
文檔編號C12N15/70GK1259575SQ9911400
公開日2000年7月12日 申請日期1999年1月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月5日
發(fā)明者華子春, 楊杉, 趙景暉 申請人:南京大學