專利名稱：雙鏈引物聚合酶鏈反應(yīng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由含雙鏈引物的DNA體外擴增技術(shù)。
在現(xiàn)有的DNA體外擴增技術(shù)中，聚合酶鏈反應(yīng)(polymeras chain reaction,PCR)是最主要也是最有效的技術(shù)。該技術(shù)系將含有耐熱DNA聚合酶、特異性引物、dNTP底物、模板DNA、鎂離子等的反應(yīng)體系反復(fù)進行高溫模板變性、低溫引物與模板結(jié)合、中溫引物延伸的熱循環(huán)，而使靶DNA片段在體外得到擴增。在常規(guī)的PCR中，很容易出現(xiàn)引物二聚體的擴增和其它非特異性的DNA擴增，從而降低特異性靶DNA擴增的效率，導(dǎo)致擴增的假陽性和假陰性，影響擴增結(jié)果的判定。這一缺點在以粗制的變性DNA標本作模板進行PCR時尤為突出。因而出現(xiàn)了幾種改良的PCR方法來克服上述問題。其中最成功的有下述三種1、熱啟動PCR，即所用試劑及擴增條件與常規(guī)PCR相同，只是不象常規(guī)PCR那樣在室溫或室溫以下將耐熱DNA聚合酶與其他成分預(yù)先混合好，而是在進入擴增的前夕，反應(yīng)體系處于較高的溫度下(如80℃)時最后加入，加入酶之后隨即進入熱循環(huán)；2、固體石蠟?zāi)し≒CR，即預(yù)先將耐熱DNA聚合酶與其他反應(yīng)成分隔開，而在進入擴增前隨著溫度升高到一定程度(如超過60℃)時，石蠟?zāi)と诨?，DNA聚合酶與其他反應(yīng)成分才開始混合，然后進入熱循環(huán)；3、抗體-酶法PCR，即用耐熱DNA聚合酶的單克隆抗體預(yù)先與酶結(jié)合，將其暫時滅活，在反應(yīng)體系進入高溫后，抗體失活，酶被釋放出來發(fā)揮作用，并進入熱循環(huán)。上述三種方法都利用在較高溫度時讓酶促反應(yīng)才開始進行，從而降低非特異擴增、提高特異擴增的效率。但它們也有缺點，例如第一種方法增加了操作的難度和污染的機會，且不適合大批量的反應(yīng)；第二種方法在反應(yīng)結(jié)束后石蠟?zāi)蹋o取樣帶來困難；第三種方法需要價格昂貴的單克隆抗體。而且這三種方法本質(zhì)上都屬于熱啟動PCR，即讓反應(yīng)在較高溫度時才開始進行，而一旦反應(yīng)開始后，就與常規(guī)PCR無異。
本發(fā)明目的在于提供一種操作簡單，不僅能夠在反應(yīng)開始之前發(fā)揮作用，而且能夠在整個反應(yīng)過程中發(fā)揮作用，從而提高特異性擴增、降低非特異性擴增效率的DNA體外擴增技術(shù)。
本發(fā)明雙鏈引物聚合酶鏈反應(yīng)(doubl-strand primered polymerase chain reaction,DSP-PCR)首先根據(jù)待擴增的靶DNA序列合成一對特異性的單鏈引物，記作正引物，這一對正引物界定待擴增的靶DNA片段；再根據(jù)上述兩條引物序列分別合成與其互補的兩條引物，隨后將后者的3’-末端進行加雙脫氧核苷酸或磷酸化修飾，使其失去延伸能力，記作反引物；最后將正、反引物按小于1的比例混合并使正引物完全與修飾后的反引物退火成雙鏈引物。將雙鏈引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等混勻成反應(yīng)體系，在熱循環(huán)儀上進行高溫、低溫、中溫的反復(fù)熱循環(huán)。在反應(yīng)體系混勻時，由于正引物全部以雙鏈引物的形式存在，即使溫度較低也不會形成引物二聚體及引物與DNA的非特異性結(jié)合，而仍保持單鏈狀態(tài)的剩余部分反引物即便能夠非特異性地與DNA結(jié)合，因其沒有延伸能力，也不能形成擴增產(chǎn)物，只有當(dāng)經(jīng)過熱變性步驟后，正引物才釋放出來，發(fā)揮引物的作用，引導(dǎo)靶DNA片段的擴增。因而能夠起到熱啟動的效果。在反應(yīng)過程中，反應(yīng)體系由高溫降到低溫時，一部分解鏈為單鏈的正引物與特異的靶DNA結(jié)合引導(dǎo)靶DNA片段的特異擴增，同時，多余的單鏈正引物能與單鏈反引物復(fù)性為雙鏈引物，迅速降低能夠引起非特異擴增的正引物的濃度，抑制非特異擴增的產(chǎn)生。當(dāng)溫度再度升高時雙鏈引物又解鏈釋放出正引物，從而引導(dǎo)又一輪擴增。這樣經(jīng)過25-35個熱循環(huán)后，就能獲得上百萬拷貝的特異的正引物界定的靶DNA片段。
下面以擴增脆性X智力低下1號基因(fragile X mental retardation 1,FMR1)的5’非翻譯區(qū)為例來進行詳細說明。鏈則在重復(fù)序列區(qū)新鏈延伸受阻，不能合成完整互補新鏈。75℃時ORS從(GCC)n模板鏈上脫離下來，使該模板此時可以指導(dǎo)合成完整互補新鏈。這樣經(jīng)過25-35個熱循環(huán)后，就能獲得上百萬拷貝的特異的含重復(fù)序列的靶DNA片段。
權(quán)利要求
1.一種將含有雙鏈引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等的反應(yīng)體系進行高溫、低溫、中溫反復(fù)熱循環(huán)而達到目的DNA片段大量擴增的DNA體外擴增技術(shù)，其中的雙鏈引物為依據(jù)靶DNA序列合成的能夠延伸的一對正引物(包括一條正向引物和一條反向引物)和3’-末端經(jīng)過修飾的不能延伸的與該對正引物分別互補的反引物退火而成。該雙鏈引物在PCR反應(yīng)前的低溫條件下保持雙鏈狀態(tài)，不形成二聚體和非特異性退火；在PCR過程中的高溫時解鏈，釋放出正引物，使其在低溫時與靶DNA的相應(yīng)區(qū)段退火，引導(dǎo)特異的DNA片段的合成；同時還可與反引物退火迅速降低正引物的濃度，降低反應(yīng)過程中的非特異擴增。經(jīng)過多次的熱循環(huán)，產(chǎn)生大量的靶DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈引物DNA體外擴增技術(shù)，其特征在于使用的引物為雙鏈引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙鏈引物，其特征為系依據(jù)靶DNA序列合成的能夠延伸的一對正引物(包括一條正向引物和一條反向引物)和3’-末端經(jīng)過修飾的不能延伸的與該對正引物分別互補的反引物退火而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的3’-末端經(jīng)過修飾的不能延伸的與該對正引物分別互補的反引物，其3’末端進行磷酸化或加雙脫氧核苷酸修飾，或使用能夠與正引物特異結(jié)合但又不能在耐熱DNA聚合酶的作用下延伸的其他物質(zhì)，如肽核酸(PNA)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙鏈引物DNA體外擴增技術(shù)，依據(jù)該技術(shù)裝配的DNA體外擴增試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明是一種由含雙鏈引物的DNA體外擴增技術(shù)。首先根據(jù)待擴增的靶DNA序列合成一對特異性的單鏈引物，再分別合成與其互補的兩條引物，并對后者的3’－末端進行修飾，使其失去延伸能力，然后讓它們分別退火成雙鏈引物。將該雙鏈引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等混勻成反應(yīng)體系，在熱循環(huán)儀上進行高溫、低溫、中溫的反復(fù)熱循環(huán)，從而獲得上百萬拷貝的特異的靶DNA片段。本發(fā)明中用雙鏈引物取代常規(guī)PCR中使用的單鏈引物，不僅能夠達到熱啟動的效果，而且在整個反應(yīng)過程中都能起到降低非特異擴增的作用。
文檔編號C12P19/00GK1238387SQ99114950
公開日1999年12月15日 申請日期1999年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月22日
發(fā)明者夏慶杰 申請人:夏慶杰