專利名稱：用大腸桿菌表達機體保護因子串聯體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術機體保護因子(簡稱BPC)是人正常胃液中的一種多肽，由15個氨基酸殘基組成，在三種實驗性潰湯模型(48小時應激性潰瘍、皮下注射巰基乙胺和96％酒精燒灼的潰瘍中)，分別在潰瘍形成前，期間和形成后，給予BPC，觀察BPC的療效，結果發(fā)現BPC在所有的實驗模型的不同階段都有效。而對照藥物在一種模型中無效或根據用藥計量和時間部分有效，如阿莫他啶，法莫替丁，西咪替丁和善得定等在應激性潰瘍中無效。神經肽Y、高血糖素和腸促胰液素對巰基乙胺造成的潰瘍模型的保護作用與應用劑量有關，根據治療的時間不同，高血糖素對酒精造成的潰瘍有部分保護作用，膽囊收縮素則無效。BPC保護作用是通過對內皮細胞強有效的保護而實現的。
BPC是由15個氨基酸組成的酸性多肽，等電點5.0，分子量為1418，其氨基酸序為N-Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Lys-Pro-Ala-Asp-Asp-Ala-Gly-Leu-Val-C。本發(fā)明根據BPC的氨基酸序列，推導并合成了其編碼核苷酸序列，并以串連的方式組裝入腸桿菌表達載體，然后以大腸桿菌發(fā)酵的方式獲得高純度、高活性的BPC生物活性物質。
本發(fā)明的技術方案按大腸桿菌慣用密碼子合成BPC基因，采用串聯體的方式，使BPC在大腸桿菌中得以大量(15％)表達，采用常壓離子交換方法加以純化。
技術方案的具體步驟為1．按照大腸桿菌的慣用密碼子把BPC的15個氨基酸轉化為以下核苷酸序列5′GGT GAA CCG CCA CCT GGT AAA CCA GCT GAT GAC GCA GGT CTG GTA3′CCA CTT GGC GGT GGA CCA TTT GGT CGA CTA CTG CGT CCA GAC CAT2．克隆技術路線EcoRⅠ BglⅡ Met BPC基因Met BamHⅠ Stop Codon XbaⅠAATTC AGATCT ATG========ATG GGATCC TAA TAG TCTAGA
采用BamHⅠ和BglⅡ酶切后實現BPC基因的串聯。3．采用亞磷酰胺法合成2條基因片段BCP1:AA TTC AgA TCT ATg ggT gAA CCg CCA CCT ggT AAA CCA gCT gAT gACgCA ggT CTg gTA ATg ggA TCC TAA TAg T(75nt)BCP2:CT AgA CTA TTA ggA TCC CAT TAC CAg ACC TgC gTC ATC AgC Tgg TTTACC Agg Tgg Cgg TTC ACC CAT AgA TCT g(75nt)4．合成片段的退火用TE(10mmTrisHCl,0.1mmEDTA)溶解BPC1,BPC2，使其終濃度為1μg/μl，各取10μl，再加10μlTE，總體積50μl,75℃，退火10分鐘。5．質粒的酶切消化取pUC19質粒1μg，用EcoRⅠ和XbaⅠ酶雙酶切，然后電泳酶切產物，回收所需條帶，溶于10μlddH2O中。6．連法取步驟④退火的片段5μl,T4DNA連接酶1.0μl，連接緩沖液1.5μl，步驟⑤所回收的質粒片段5μl,ddH2O2.5μl,16℃連接過夜。7．連接產物轉化大腸桿菌用步驟⑥所產生連接產物轉化大腸桿菌JM105感受態(tài)。8．陽性克隆的篩選通過鋪板、培養(yǎng)、擴增、酶切等方法初選出陽性克隆，最后通過測序確定陽性克隆。9．BPC基因的串聯挑選陽性克隆大量提取質粒，把質粒分為兩份，一份用ScaⅠ+BamHⅠ酶切(Promega Buffer B)，回收其小片段部分(905bp+60bp=965bp)，一份用ScaⅠ+BglⅡ酶切(Promega Buffer B)，回收其大片段(1754bp+69bp=1823bp)，兩份回收部分再進行步驟⑥-⑧重復，共進行二次，直到產生4串體或8串體為止。10．高效表達形體的構建將含BPC基因的pUC19經EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，回收BPC4串體，插入原核融合表達載體pThioHis A(硫氧還蛋白融合載體)中，形成pThioHisA BPC④重組體。11．工程菌的建立宿主菌為大腸桿菌Top10，將連結好的pThioA④BPC用CaCl2法轉化大腸桿菌Top10株，在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上挑取菌落，LB培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)，提取質粒，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，篩選出目的菌株。12．pThioHisA BPC④在大腸桿菌中的表達將經篩選后的pThioHisA BPC④37℃培養(yǎng)過夜，1mmol/L IPTG 37℃誘導5小時，菌體經2×載樣緩沖液處理，進行SDS-PAGE，染色，脫色，干膠后掃描分析，在分子量21.356KD左右處有明顯表達條帶，此帶占菌體總蛋白的15％。13．pThioHisA BPC④實驗室純化pThioHisA BPC④表達菌經誘導后收集菌體。菌體用7mol/L鹽酸胍裂解，取裂菌上清用生理鹽水透析過夜，再用10mmol/L磷酸鹽緩沖液pH5.5充分透析。粗提液經SP柱層析，0～1mol/L NaCl線性梯度洗脫，收集穿過峰。穿過峰經DEAE柱層析，0～1mol/L NaCl線性梯度洗脫，收集主峰，透析除鹽，冷凍干燥。
PBC 4串體的裂解及單體的純化CNBr裂解，CNBr與蛋白之比為1比1,CNBr溶于80％的甲酸中，室溫裂解過夜，裂解完畢后，裂解產物加10倍體積水滅活CNBr，通風2-4小時，冷凍干燥，干燥產物用含1mmol/L 2巰基乙醇、0.1mmol/L DTT的HAc-NaAc緩沖液溶解，經SP柱層析，0～1mol/L NaCl線性梯度洗脫，收集穿過峰。穿過峰過濾、分裝，冷凍干燥。
工程菌株穩(wěn)定性檢測實驗室規(guī)模發(fā)酵、分離純化后表明此工程菌株具有良好的穩(wěn)定性，表達量占菌體蛋白的15％，說明此工程菌株符合于開發(fā)生產。
蛋白含量測定應用Lowzy′s法測定BPC的蛋白含量約為0.16mg/ml。
純度分析Tricine-SDS-PAGE和HPLC鑒定BPC半成品純度大于95％。
等電點測定平板等電聚焦法測定BPC等電點為5～6。
N端氨基酸序列分析1-4位氨基酸為Gly Glu Pro Pro肽圖測定基因工程菌表達BPC與人工全合成的BPC之間大部分色譜峰是一致的。
BPC半成品紫外掃描呈蛋白質吸收曲線，未測出氨芐青霉素活性，殘余DNA含量100pg以下。
藥效學與人工全合成的BPC相比，在促進潰瘍愈合的不同階段都有效。而對照藥物在一種或幾種模型中無效或根據用藥計量和時間部分有效，如阿莫他啶，法莫替丁，西咪替丁和善得定等在應激性潰瘍中無效。BPC保護作用是通過對內皮細胞強有效的保護而實現的。
臨床前毒理學研究基因工程表達的BPC對小鼠的自主活動、行為活動、犬的呼吸系統、心血管系統無明顯影響；無致突變作用，無肌肉刺激和全身致敏作用。藥代動力學研究表明，基因工程表達的BPC肌肉注射后吸收很快，0.5h達高峰，T1/2為1h，其分布以血、腎、肺、肝、小腸、心濃度較好，主要從尿中排泄。
本發(fā)明的優(yōu)點分離純化方法簡單，成本低。用基因工程方法生產的BPC比起國外的化學合成法，成本大為降低，比起組織提取方法來又具有操作簡單，易于放大，工藝取材不受限制，量大，活性高等優(yōu)點。
具體實施例方式采用BPC工程菌發(fā)酵，以30L發(fā)酵罐為例，每升發(fā)酵液收菌5克，30L共發(fā)酵150克，每次發(fā)酵周期為2天，每周發(fā)酵3次，每個月10次，共收菌150×10=1500克，以表達量10％，純化效率為50％，每個月共生產BPC 1500克×10％×50％=75克。每支藥100μg，共裝75000000/100=750000支，每支售價按100元，月產值為750000×100=75000000元，年產值為75000000×12=225000000元，即2.25億元。
權利要求
1.用大腸桿菌表達機體保護因子串聯體，其特征是首先按照大腸桿菌的慣用密碼子把BPC的15氨基酸轉化為以下核苷酸序列E F R SM G E P P P G K P ABcoR Ⅰ/Glu Phe BglⅡ/Arg Ser Met Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro AlaGAA TTC AGA TCT ATG GGT GAA CCG CCA CCT GGT AAA CCA GCTCCT AAG TCT AGA TAC CCA CTT GGC GGT GGA CCA TTT GGT CGAD D A G L V M G SS RAsp Asp Ala Gly Leu Val Met BamHⅠ/Gly Ser Stop coden Xbal/Ser ArgGAT GAC GCA GGT CTG GTA ATG GGA TCC TAA TAG TCT AGACTA CTG CGT CCA GAC CAT TAC CCT AGG ATT ATC AGA TCT然后在BPC基因前依次接上核酸內切酶EcoRⅠ、BglⅡ，蛋氨酸對應的核苷酸序列，在BPC基因后依次加上蛋氨酸、核酸內切酶BamHⅠ、終止密碼子(TAA、TAG)、XbaⅠ對應的核苷酸序列。把pUC19用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，然后把退火過的BPC基因連同其前后的附加序列用T4 DNA連接酶與pUC19/EcoRⅠ+XbaⅠ連接后，克隆入pUC19的EcoRⅠ和XbaⅠ位點，酶切、測序證明正確的克隆經擴大培養(yǎng)后，提取質粒，分為兩份，一份用ScaⅠ+BamHⅠ酶切(Promega ButterB)，回收其小片斷部分(905bp+60bp=965bp)，一份用ScaⅠ+BglⅡ酶切(PromegaButter B)，回收其大片斷(1754bp+69bp=1823bp)；兩份回收部分再進行連接，如此重復二次，直到產生4串體或8串體為止。上述克隆技術路線如下EcoRⅠ BglⅡ Met BPC基因M BamHⅠ stopcodon XbaⅠAATTC AGATCT ATG========ATG GGATCC TAA TAG TCTAGA采用BamHⅠ和BglⅡ酶切后實現BPC基因的串聯，然后克隆入pThioHisA/EcoRⅠ+XbaⅠ位點，用重組子轉化大腸桿菌，進行表達。
2.根據權利要求1所述的用大腸桿菌表達機體保護因子串聯體，其特征是BPC以4串體形式在大腸桿菌中表達，還可以以8串體的融合形式在大腸桿菌中表達，其具體技術方案與權利要求1的不同之處是，在4串體的基礎之上再用ScaⅠ+BglⅡ和ScaⅠ+BamHⅠ進行再次串聯，即成8串體BPC。
3.根據權利要求1或2所述的用大腸桿菌表達機體保護因子串聯體，其特征是還可把BPC串聯體基因以融合形式接于野生或突變的腫瘤壞死因子基因之后，或以雙順反子形式在大腸桿菌中表達。
全文摘要
用大腸桿菌表達機體保護因子串聯體,涉及基因工程技術。其特征是:按大腸桿菌慣用密碼子合成BPC基因,采用串聯體的方式,使BPC在大腸桿菌中得以大量(15%)表達,采用常壓離子交換方法加以純化。具有分離純化方法簡單,成本低,易于放大,工藝取材不受限制,獲得的BPC生物活性物質純度高、活性高等優(yōu)點,具有很大的經濟與社會效益。
文檔編號C12N15/70GK1296079SQ9911590
公開日2001年5月23日 申請日期1999年11月10日 優(yōu)先權日1999年11月10日
發(fā)明者趙永同, 張英起 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學