專(zhuān)利名稱(chēng)：一種食管癌相關(guān)新基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食管癌相關(guān)基因、該基因編碼的多肽、以及該基因和多肽的用途和制備方法。
利用分子生物學(xué)技術(shù)，從分子水平認(rèn)識(shí)疾病的病理根源是發(fā)現(xiàn)或提供這些疾病的有效治療方法的有利途徑。由于現(xiàn)有技術(shù)中還有大量疾病沒(méi)有找到有效的治療方法，包括大部分癌癥，因此迫切需要找到與這些疾病的病理相關(guān)的基因，特別是那些與這些疾病呈負(fù)相關(guān)、可能用于這些疾病的治療的基因。
本發(fā)明的目的就是提供一種新的與食管癌負(fù)相關(guān)的基因和該基因編碼的多肽。
本發(fā)明涉及一種分離的多核苷酸，其包含選自下組的成員(a)編碼SEQ ID No.2所示多肽或編碼CGMCC保藏號(hào)0403(cDRC2)的克隆所含cDNA所編碼的成熟多肽的多核苷酸；(b)能與(a)的多核苷酸雜交并與其有至少70％一致性的多核苷酸；和(c)(a)或(b)多核苷酸的多核苷酸片段。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有上述多核苷酸的載體，用該載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞和包括培養(yǎng)該宿主細(xì)胞以表達(dá)所述多核苷酸編碼的多肽并從培養(yǎng)物中回收目標(biāo)多肽的多肽生產(chǎn)方法。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面涉及選自下組的一種多肽(a)具有SEQ ID No.2的推定氨基酸序列的多肽或其片段、類(lèi)似物和衍生物；(b)CGMCC保藏號(hào)0403的克隆所含cDNA編碼的多肽或其片段、類(lèi)似物和衍生物。
本發(fā)明也涉及抗上述多肽的抗體。
本發(fā)明還涉及一種體外診斷與本發(fā)明上述多肽的表達(dá)有關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，包括在來(lái)自宿主的樣品中(a)測(cè)定編碼所述多肽的基因核酸序列中的突變、缺失及重排；和/或(b)測(cè)定編碼所述多肽的基因核酸序列中的甲基化；和/或(c)測(cè)定編碼所述多肽的基因mRNA的異常。
本發(fā)明另外涉及一種體外診斷方法，包括在來(lái)自宿主的樣品中分析本發(fā)明多肽的存在或量的改變。
本發(fā)明上述的和其它的方面對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，從本文以下的詳細(xì)描述看應(yīng)該是很清楚的。
本發(fā)明一方面提供了新的多肽，它們是人食管蛋白質(zhì)多肽pDRC2，及其具有生物活性的診斷或治療有用的片段、類(lèi)似物和衍生物。本發(fā)明的另一方面，提供了編碼這些多肽的分離的核酸分子(DRC2)，包括mRNA、DNA、cDNA(cDRC2)和基因組DNA(gDRC2)，及其具有生物活性的診斷或治療有用的片段、類(lèi)似物和衍生物。本發(fā)明的再一方面提供了核酸的探針，它包含足夠長(zhǎng)度的核酸分子以及與DRC2基因序列進(jìn)行特異性雜交的序列。


圖1顯示了DRC2的cDNA序列和由此推斷的氨基酸序列。這里所用的是標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸單字母縮寫(xiě)。用ABIPRISM*377 DNA自動(dòng)測(cè)序儀(Takara公司)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的準(zhǔn)確性預(yù)計(jì)高于98％。
圖2是NORTHERN印跡分析的結(jié)果圖。
圖3是RT-PCR分析的結(jié)果圖。
依據(jù)本發(fā)明的一方面，它提供了一種分離的核酸(多核苷酸)，這些核苷酸編碼具有圖1(SEQ ID No.2)所示的推定的氨基酸序列的多肽或者編碼1999年6月23日以CGMCC保藏號(hào)0403(cDRC2)保藏的克隆cDNA編碼的多肽。
編碼pDRC2的多核苷酸可以從許多成人和胎兒的cDNA文庫(kù)中分離，如成人食管的cDNA文庫(kù)。SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列具有編碼一個(gè)一個(gè)含479氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框架。該蛋白與突變的人紅細(xì)胞膜糖蛋白(GenBank No.2909821)N-端具有最高程度的同源性，在連續(xù)的309個(gè)氨基酸中有55％的氨基酸相同，71％的氨基酸類(lèi)似。與正常的人紅細(xì)胞膜糖蛋白(GenBank No.2909819)N-端在連續(xù)的422個(gè)氨基酸中有48％的氨基酸相同，64％的氨基酸類(lèi)似。
本發(fā)明的多核苷酸可能以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成的DNA。DNA可以是雙鏈或者單鏈的，單鏈也可以是編碼鏈或者非編碼(反義)鏈。編碼多肽的編碼序列可以與圖1(SEQID No.1)所示的編碼序列相同，也可以與所保藏的克隆的編碼序列相同，或者可以是一個(gè)不同的編碼序列，由于遺傳密碼的冗余或簡(jiǎn)并性，它與圖1(SEQ ID No.2)的或者保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1(SEQ ID No.2)的多肽或者由保藏的cDNA編碼的多肽的多核苷酸可以包括僅僅是成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和任意的另外編碼序列及非編碼序列，例如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5’端和/或3’端非編碼序列。
由此，術(shù)語(yǔ)“編碼一種多肽的多核苷酸”包括僅含有該多肽編碼序列的多核苷酸，也包括含有額外編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及上面所描述的多核苷酸的各種變體，它們編碼含有圖1(SEQ ID No.2)所示的推定的氨基酸序列的多肽或保藏的克隆cDNA編碼的多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。這些多核苷酸變體可以是天然存在的等位基因變體或非天然存在的多核苷酸變體。
所以，本發(fā)明包括了編碼圖1(SEQ ID No.2)所示的相同多肽或者保藏克隆的cDNA所編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及這樣的多核苷酸的變體，這些變體編碼圖1(SEQ ID No.2)所示的多肽或保藏克隆的cDNA所編碼的多肽的片段、類(lèi)似物或衍生物。這些核苷酸變體包括缺失變體、置換變體和附加或插入變體。
正如上面所提到的，該多核苷酸可能具有作為圖1(SEQ ID No.1)所示的編碼序列或保藏序列的天然存在的等位基因變體的編碼序列。據(jù)本領(lǐng)域所知，一個(gè)等位基因變異體是一種發(fā)生了一個(gè)或多個(gè)核苷酸取代、缺失或添加的多核苷酸序列的替代形式，它基本上并不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明的多核苷酸也可能含有與標(biāo)記序列在同一讀框中相融合的編碼序列，標(biāo)記序列幫助本發(fā)明多肽的純化。標(biāo)記序列在使用細(xì)菌宿主時(shí)可以是pQE載體的六聚組氨酸標(biāo)記，以利于融合有標(biāo)記的成熟多肽的純化，或者使用哺乳類(lèi)宿主(如猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系)時(shí)，標(biāo)記序列可以是一種血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。HA標(biāo)記相當(dāng)于由流感血細(xì)胞凝集素蛋白衍生的一個(gè)表位(Wilson等Cell 37767，1984)。
“基因”一詞指產(chǎn)生多肽鏈中涉及的DNA片段，它包括編碼區(qū)域之前和之后的區(qū)域(前導(dǎo)和尾部)及各編碼片段(外顯子)之間的間隔序列(內(nèi)含子)。
本發(fā)明的全長(zhǎng)基因的DNA片段可以用作cDNA文庫(kù)的雜交探針去分離出全長(zhǎng)的cDNA和分離出其它與該基因序列高度類(lèi)似或生物學(xué)功能相似的cDNA。這種類(lèi)型的探針優(yōu)選具有至少具有30個(gè)堿基，例如包含50或者更多的堿基。這種探針也可以用來(lái)鑒定相應(yīng)于全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆和包含調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子及內(nèi)含子的完整基因的基因組克隆。篩選的一個(gè)例子是，利用已知的DNA序列合成一個(gè)寡核苷酸探針去分離基因的編碼區(qū)域。序列與本發(fā)明的基因互補(bǔ)的標(biāo)記的寡核苷酸用于篩選人類(lèi)cDNA、基因組DNA或mRNA文庫(kù)，確定與探針雜交的成員。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及與上述序列雜交的多核苷酸，這兩個(gè)序列間至少有70％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的一致性。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。這里所用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”意味著兩序列之間有95％，優(yōu)選至少97％一致性才能發(fā)生雜交。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽基本保持了與圖1的(SEQ ID No.1)或保藏的cDNA編碼的多肽相同的生物功能或活性。
另一選擇是，與本發(fā)明的多核苷酸雜交的多核苷酸至少含20個(gè)堿基，優(yōu)選至少30個(gè)堿基，更優(yōu)選至少50個(gè)堿基并且具有上面所描述的一致性，可以保留或不保留活性。例如，這樣的多核苷酸可以用作為SEQ ID No.1多核苷酸的探針；又如，可以用于多核苷酸的回收或者作為一種診斷探針或PCR引物。
這樣，本發(fā)明涉及與編碼SEQ ID No.2多肽的多核苷酸有至少70％的一致性，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％的一致性的多核苷酸及其片段，這些片段至少有30個(gè)堿基，優(yōu)選至少有50個(gè)堿基；還涉及這些多核苷酸編碼的多肽。
這里所提及的保藏保持是在國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約條件下。這些保藏僅僅是本領(lǐng)域的技術(shù)人員的便利準(zhǔn)備的，并不是承認(rèn)根據(jù)中國(guó)專(zhuān)利法實(shí)施細(xì)則第25條需要保藏。保藏材料中所含有的多核苷酸序列和多核苷酸編碼的氨基酸序列引入本文以供參考，當(dāng)對(duì)本文序列描述有任何爭(zhēng)議時(shí)用于核實(shí)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有圖1(SEQ ID No.2)所示推定氨基酸序列或者具有保藏的cDNA所編碼的氨基酸序列的多肽及其片段、類(lèi)似物和衍生物。
圖1(SEQ ID No.2)所示或保藏的cDNA所編碼的多肽的“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”指能基本保留該多肽的生物學(xué)功能或活性的多肽。由此，類(lèi)似物包括了蛋白原，蛋白原被切去一部分后被激活，產(chǎn)生一個(gè)有活性的成熟多肽。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1(SEQ ID No.2)所示的或保藏的cDNA所編碼的多肽的片段、衍生物和類(lèi)似物可以是(i)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被保守或非保守的氨基酸殘基所取代(優(yōu)選是保守的氨基酸殘基)，取代的氨基酸殘基是或不是由遺傳密碼所編碼的氨基酸；或(ii)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基帶有取代基團(tuán)；或(iii)成熟多肽與另一化合物融合在一起，如提高多肽半壽期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)另外的氨基酸與成熟多肽相融合，諸如幫助純化成熟蛋白的序列或蛋白原序列等。從這些公開(kāi)內(nèi)容看，這樣的片段、衍生物和類(lèi)似物相信處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選是以分離的形式提供并被純化到均一的程度。
“分離的”一詞指將物質(zhì)從它原來(lái)的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán)境)之中移出。比如說(shuō)，一個(gè)自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動(dòng)物中就是沒(méi)有被分離出來(lái)，但同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開(kāi)就是分離的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分。既然載體或組合物不是它天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的。
本發(fā)明的多肽包括SEQ ID No.2所示的多肽(特別指成熟多肽)，也包括與SEQ ID No.2多肽至少有70％相似性(優(yōu)選是70％一致性)的多肽，優(yōu)選至少有90％相似性(優(yōu)選是90％的一致性)的多肽，更優(yōu)選至少有95％相似性(優(yōu)選是95％一致性)的多肽，也包括這些多肽的一些部分，通常這些多肽部分至少含有30個(gè)氨基酸、優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸。
如本領(lǐng)域所知，兩個(gè)多肽的相似性是通過(guò)比較一個(gè)多肽與另一多肽的氨基酸序列及其保守性氨基酸取代而決定的。
本發(fā)明多肽的片段或部分可以用于經(jīng)肽合成產(chǎn)生相關(guān)的全長(zhǎng)多肽。因此，這些片段可作為產(chǎn)生全長(zhǎng)多肽的中間體。本發(fā)明多核苷酸的片段或部分可以用來(lái)合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明多核苷酸的載體、帶有本發(fā)明載體的遺傳工程宿主細(xì)胞和依靠重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體進(jìn)行遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)的，載體可以是一個(gè)克隆載體或表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒粒子、噬菌體等等。工程化的宿主細(xì)胞能在為適于活化啟動(dòng)子、篩選轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增DRC2基因而改變的傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件諸如溫度、pH等與被選擇的細(xì)胞原來(lái)所用的表達(dá)條件一致，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很明顯的。
本發(fā)明的多核苷酸可以用來(lái)經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生多肽。例如，該多核苷酸可以存在于一系列用于表達(dá)多肽的表達(dá)載體中的任一載體上，這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA、酵母質(zhì)粒、衍生于質(zhì)粒和噬菌體DNA結(jié)合的載體、病毒DNA、桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及偽狂犬病毒。不過(guò)，只要能在宿主中復(fù)制和存活，其它載體也可以利用。
合適的DNA序列可以通過(guò)許多方法插到載體中。通常，DNA序列用本領(lǐng)域中已知的方法插入到合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上。這些方法相信處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
表達(dá)載體中的DNA序列被有效地與一個(gè)合適的表達(dá)控制序列(啟動(dòng)子)連在一起，從而指導(dǎo)mRNA的合成。下面提到的是這種啟動(dòng)子的代表LTR或SV40啟動(dòng)子、大腸桿菌的Lac或trp啟動(dòng)子、λ噬菌體的PL啟動(dòng)子以及已知控制原核或真核細(xì)胞或其病毒中基因表達(dá)的其它啟動(dòng)子。表達(dá)載體也包含翻譯起始所需要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可以具有增強(qiáng)表達(dá)的合適序列。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含能提供表型特征的一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，以便于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的篩選，例如真核細(xì)胞的培養(yǎng)可用二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，大腸桿菌則可用四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述合適的DNA序列、合適的啟動(dòng)子或控制序列的載體可以用于轉(zhuǎn)化合適的宿主，讓宿主表達(dá)該蛋白。
下面列舉的是合適宿主的代表細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌、鏈霉菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌；真菌細(xì)胞，如酵母；昆蟲(chóng)細(xì)胞，如果蠅S2和草地夜蛾Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS(猴腎成纖維細(xì)胞系)或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細(xì)胞等等。從這些講授看，合適宿主的選擇應(yīng)該在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
特別值得提及的是，本發(fā)明也包括含上面概括性描述的一個(gè)或多個(gè)序列的重組構(gòu)建體。該構(gòu)建體包括載體，如質(zhì)?；虿《据d體，其中正向或反向插入了本發(fā)明的一個(gè)序列。在此實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，該構(gòu)建體還包含調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子，它被有效地連接到該序列上。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，許多載體和啟動(dòng)子都是已知的，并可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。下面列舉幾種載體。細(xì)菌的pQE-70、pQE-60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不過(guò)，只要是能在宿主中復(fù)制和存活，其它質(zhì)粒或載體也可應(yīng)用。
啟動(dòng)子區(qū)域可以利用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其它具有選擇標(biāo)記的載體從想要的基因中選擇出來(lái)。pKK232-8和pCM7是兩個(gè)合適的載體。特稱(chēng)的細(xì)菌啟動(dòng)子包括LacI、LacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL和trp。真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白I。合適載體和啟動(dòng)子的選擇應(yīng)在本領(lǐng)域普通的技術(shù)水平之內(nèi)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，比如哺乳類(lèi)細(xì)胞，或者是低等真核細(xì)胞，比如酵母細(xì)胞，還可以是原核細(xì)胞，比如細(xì)菌細(xì)胞。將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法有磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔或基因槍方法。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體能夠通過(guò)傳統(tǒng)的方法產(chǎn)生重組序列編碼的基因產(chǎn)物。另一途徑是，可用傳統(tǒng)的肽合成儀合成本發(fā)明的多肽。
在合適的啟動(dòng)子控制下可以在哺乳類(lèi)細(xì)胞、酵母、細(xì)菌或其它細(xì)胞中表達(dá)成熟蛋白。利用由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA，也可以用無(wú)細(xì)胞翻譯體系產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。適合于原核和真核宿主的克隆和表達(dá)載體Sambrook等人已在《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版，冷泉港出版社，紐約，1989)中進(jìn)行了描述。
在高等真核生物中，編碼本發(fā)明多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可以通過(guò)在載體中插入一增強(qiáng)子序列而被提高。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常有大約l0-300bp，作用于啟動(dòng)子，提高它的轉(zhuǎn)錄。例如，SV40的位于復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)100-270bp處的增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)后側(cè)的多形瘤增強(qiáng)子及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包含復(fù)制起點(diǎn)和用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記，例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，還包含從高效表達(dá)基因而來(lái)的啟動(dòng)子，從而介導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列的轉(zhuǎn)錄。這些啟動(dòng)子可以從編碼糖酵解酶的操縱子中得來(lái)，諸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白。異源的結(jié)構(gòu)序列以適當(dāng)?shù)姆轿慌c翻譯起始和終止序列以及其它優(yōu)選的序列裝配在一起?？蛇x擇的情況是，異源的序列可以編碼一個(gè)融合蛋白，該蛋白含有一個(gè)N末端確認(rèn)肽，表現(xiàn)出預(yù)期的特征，例如所表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定化和提純簡(jiǎn)化。
細(xì)菌適用的有效表達(dá)載體這樣來(lái)構(gòu)建將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列隨同適當(dāng)?shù)姆g起始和終止信號(hào)被插入到帶有一個(gè)功能啟動(dòng)子的可操縱的閱讀框中。載體應(yīng)包含一個(gè)或多個(gè)表型選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)保證了載體在宿主中能保留下來(lái)，更理想的是能使載體得到擴(kuò)增。適于轉(zhuǎn)化的原核宿主有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌以及假單孢菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種細(xì)菌，其它的宿主也可以被選擇。
作為一個(gè)代表性的但非限定性的例子，細(xì)菌適用的有效表達(dá)載體包括一個(gè)選擇標(biāo)記和細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)，它衍生于從商業(yè)途徑獲得的、具有眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件的質(zhì)粒。這些商業(yè)化的載體包括諸如pKK223-3(Pharmacia)和pGEM1 (Promega)等。pBR322的“骨架”部分與合適的啟動(dòng)子和被表達(dá)的結(jié)構(gòu)序列組合在一起。
在轉(zhuǎn)化合適的宿主菌株和宿主菌株生長(zhǎng)到恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用適當(dāng)?shù)姆椒?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)藥品誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
通常用離心的方法收獲細(xì)胞，用物理或化學(xué)的方法破碎細(xì)胞，將粗提物保留以進(jìn)一步純化。用于表達(dá)蛋白的微生物細(xì)胞可以用任何便捷的方法破碎，包括凍融循環(huán)、超聲波、機(jī)械破碎，或者使用細(xì)胞溶解劑，這些方法都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。
各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)也能用于表達(dá)重組蛋白。哺乳類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)的例子有Gluzman(Cell 23175，1981)所描述猴腎成纖維細(xì)胞的COS-7細(xì)胞系，及其它的能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳類(lèi)表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多腺苷化位點(diǎn)、拼接供體和受體位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列和5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位點(diǎn)可用于提供所需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
多肽可以從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化出來(lái)，回收和純化的方法有硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。形成成熟蛋白的完整構(gòu)象需要蛋白質(zhì)的再折疊步驟。高效液相層析(HPLC)應(yīng)用于最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是純化的天然產(chǎn)物，也可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，還可以從原核或真核宿主(例如，培養(yǎng)的細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方法中所用的宿主不同，本發(fā)明中的多肽可能被糖基化或不被糖基化。該多肽也可能具有起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明中的多核苷酸和多肽可用作研究試劑和材料，以發(fā)現(xiàn)人類(lèi)疾病的治療和診斷方法。
這種多核苷酸和其編碼的多肽也用于體外的相關(guān)科學(xué)研究、DNA合成和DNA載體的制備，還用于設(shè)計(jì)治療和診斷人類(lèi)疾病的方法。
全長(zhǎng)DRC2基因的片段可以用作cDNA文庫(kù)的雜交探針，從而分離出全長(zhǎng)的基因和與之有高度序列相似性或相似生物學(xué)活性的其它基因。這種類(lèi)型的探針一般至少有20個(gè)堿基。但是，這些探針優(yōu)選至少有30個(gè)堿基并且一般不超過(guò)50個(gè)堿基，盡管它們可以具有更多的堿基。該探針也可以用于鑒定相應(yīng)于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆或具有完整基因，包括調(diào)節(jié)和啟動(dòng)子區(qū)域、外顯子及內(nèi)含子的基因組克隆。篩選的一種方法是，利用已知的DNA序列合成一個(gè)寡核苷酸探針，用它去分離出基因的編碼區(qū)域。序列與本發(fā)明的基因互補(bǔ)的標(biāo)記的寡核苷酸可用于篩選人類(lèi)cDNA文庫(kù)、基因組文庫(kù)、mRNA文庫(kù)，以確定文庫(kù)中哪些成員與探針雜交。
本發(fā)明還涉及以DRC2基因產(chǎn)物作為檢測(cè)與DRC2的核酸序列突變或甲基化相關(guān)的疾病或?qū)膊〉囊赘行缘脑\斷方法的構(gòu)成部分。這些疾病與本發(fā)明的DRC2基因的mRNA及編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)不足有關(guān)，例如腫瘤和癌癥。
可以用各種技術(shù)在DNA的水平上檢測(cè)出DRC2基因突變的個(gè)體。用于診斷的核酸可以從病人的細(xì)胞中獲得，例如血液、尿液、唾液、活組織檢查和尸體解剖材料?；蚪MDNA可以直接用于檢測(cè)，也可以在檢測(cè)分析前用PCR(Saiki et al.Nature 324163-166，1986)進(jìn)行酶法擴(kuò)增。RNA或cDNA也可用于同樣目的。例如，與編碼DRC2基因的核酸互補(bǔ)的PCR引物可用來(lái)鑒定和分析DRC2基因的突變。例如，從擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與正常基因型相比發(fā)生的變化中可以檢出缺失和插入突變。將擴(kuò)增的DNA與放射性標(biāo)記的DRC2 RNA雜交可檢測(cè)點(diǎn)突變，或者使用放射性標(biāo)記DRC2反義DNA序列來(lái)雜交。用RNA酶A消化或從熔解溫度的不同可以區(qū)分完全配對(duì)的序列與錯(cuò)配的雙螺旋。
通過(guò)檢測(cè)DNA片段在含有或不含有變性劑的凝膠中的電泳遷移率的變化，可以進(jìn)行基于DNA序列差異的遺傳學(xué)測(cè)試。小序列的缺失和插入可以從高分辨率的凝膠電泳中看出。例如，不同大小的DNA片段可以在變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中區(qū)別出來(lái)。含有點(diǎn)突變的DNA序列與正常的DNA序列分別變性后在不含變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中可因構(gòu)象的不同(泳動(dòng)速度不同)而區(qū)別開(kāi)來(lái)。
核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)可以揭示特定位置的序列變化，比如RNA酶和S1酶保護(hù)法或者化學(xué)斷裂法(例如，Cotton等PNAS 854397-4401，1985)。
本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)各種組織中DRC2基因的DNA甲基化的診斷方法。DNA水平的甲基化可以直接導(dǎo)致基因mRNA轉(zhuǎn)錄的改變，也可以通過(guò)引起基因組的不穩(wěn)定、從而引發(fā)基因突變而改變基因的正常轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化可以采用Herman(PNAS 939821-9826，1996)描述的甲基化特異性PCR方法進(jìn)行檢測(cè)總之，特異DNA序列可以用下述方法檢測(cè)雜交、RNA酶保護(hù)、化學(xué)斷裂、直接DNA測(cè)序或使用限制性內(nèi)切酶(例如，限制片段長(zhǎng)度的多態(tài)性RFLP)及基因組DNA的Southern印跡技術(shù)。
除了較傳統(tǒng)的凝膠電泳和DNA測(cè)序方法外，突變還可用原位分析檢測(cè)出來(lái)。
本發(fā)明也涉及用于檢測(cè)各種組織中DRC2基因的mRNA表達(dá)異常的診斷方法。mRNA水平的變化可用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、Northern Blot、DotBlot或RNA原位雜交等方法進(jìn)行檢測(cè)。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，從本文的公開(kāi)看應(yīng)該是很清楚的。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)各種組織中DRC2基因蛋白水平改變的診斷方法，與正常對(duì)照組織樣品相比，DRC2基因蛋白的減少可檢測(cè)疾病或?qū)膊∫赘行缘拇嬖?如腫瘤)。測(cè)定宿主樣品中DRC2基因蛋白水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括放射性免疫測(cè)定法、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法、Western印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附法和夾心測(cè)定法。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)(Coligan等.Current Protocols in Immunology Vol.1，No.2，Chapter 6，1991)要預(yù)先準(zhǔn)備對(duì)DRC2抗原的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。另外，還要準(zhǔn)備抗單克隆抗體的報(bào)告抗體。報(bào)告抗體上連有一個(gè)可檢測(cè)的試劑，諸如放射性、熒光或辣根過(guò)氧化物酶。從宿主取得樣品并在一個(gè)固相載體上溫育，例如聚苯乙烯反應(yīng)板，它能吸附樣品中的蛋白。然后用一種非特異性蛋白如牛血清白蛋白(BSA)溫育，覆蓋板上任何游離的蛋白結(jié)合位點(diǎn)。第二步，加入單克隆抗體在板中溫育，這時(shí)，單克隆抗體與附著在聚苯乙烯反應(yīng)板上的DRC2基因蛋白結(jié)合。所有未結(jié)合上的單克隆抗體用緩沖液洗去。與辣根過(guò)氧化物酶相連的報(bào)告抗體此時(shí)加入板中，結(jié)果報(bào)告抗體就與結(jié)合在DRC2抗原上的單克隆抗體相結(jié)合。未結(jié)合上的報(bào)告抗體也被洗掉。然后加入過(guò)氧化物酶的底物，在一定的時(shí)間內(nèi)所形成的顏色的深淺與標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較，就能測(cè)出一定體積的病人樣品中DRC2基因蛋白的含量。
競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法也使用于這項(xiàng)檢測(cè)。將DRC2抗原的特異性抗體連到一個(gè)固相載體上，然后讓標(biāo)記的DRC2和從宿主獲得的樣品一起通過(guò)固相載體并檢測(cè)標(biāo)記物的數(shù)量，例如用液相閃爍色譜，標(biāo)記物的數(shù)量與樣品中的DRC2的數(shù)量相關(guān)。夾心測(cè)定法類(lèi)似于酶聯(lián)免疫吸附法。在夾心測(cè)定法中，DRC2通過(guò)固體載體，與吸附在固相載體上的抗體結(jié)合。第二種抗體又結(jié)合到DRC2上。第三種抗體是被標(biāo)記的并對(duì)第二種抗體有特異性，當(dāng)它通過(guò)固相載體時(shí)就結(jié)合到第二種抗體上，然后檢測(cè)它的數(shù)量。
pDRC2多肽及其具有生物活性的診斷或治療有用的片段、類(lèi)似物和衍生物可以與藥學(xué)可接受載體一起在組合物中使用，下面將對(duì)此進(jìn)行描述。
pDRC2多肽及其具有生物活性的診斷或治療有用的片段、類(lèi)似物和衍生物可以與合適的藥物載體結(jié)合使用。這樣的組合物中包括有效治療劑量的多肽和藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。這樣的載體有一但并不限制于一鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。配制品應(yīng)該適合給藥方式。
本發(fā)明也提供了一種藥物包裝或試劑盒，包括一個(gè)或多個(gè)裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物的成分的容器。另外，這些多肽及其具有生物活性的診斷或治療有用的片段、類(lèi)似物和衍生物也可與其它的治療化合物組合使用。
這些藥物組合物可用一種方便的方式給藥，諸如表皮、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或真皮內(nèi)途徑。這些藥物組合物以治療和/或預(yù)防具體適應(yīng)癥的有效劑量使用。
根據(jù)本發(fā)明，pDRC2多肽可經(jīng)體內(nèi)表達(dá)而使用，通常稱(chēng)之為“基因治療”。
例如，病人的細(xì)胞可以在離體情況下用一個(gè)編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)工程化，再將工程化的細(xì)胞供給待治療的病人。這樣的方法是本領(lǐng)域中大家所熟悉的。例如，可以用包含編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒進(jìn)行細(xì)胞工程化。
同樣，用本領(lǐng)域所知的方法可以在體內(nèi)工程化細(xì)胞以體內(nèi)表達(dá)多肽。如本領(lǐng)域中所知，用于產(chǎn)生含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞可以注入病人體內(nèi)，使體內(nèi)細(xì)胞工程化并在體內(nèi)表達(dá)該多肽。從本發(fā)明的講授看，這些以及其它的多肽給藥方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是很清楚的。例如除了逆轉(zhuǎn)錄病毒外，還有別的用于工程化細(xì)胞的表達(dá)載體，例如腺病毒，把它與一個(gè)合適的運(yùn)輸載體結(jié)合后可在體內(nèi)工程化細(xì)胞。
可以衍生出上述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒包括-但并非限制于-Moloney鼠白血病病毒、脾壞死病毒、勞斯氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和哺乳動(dòng)物腫瘤病毒。一個(gè)實(shí)施方案是逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可衍生于Moloney小鼠白血病病毒。
載體包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子。可使用的合適啟動(dòng)子包括-但并非限制于-逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR、SV40啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(MillerBiotechniques，Vo1.7，No.9，pp980-990，1989)或其它啟動(dòng)子(例如，細(xì)胞的啟動(dòng)子，比如真核細(xì)胞的啟動(dòng)子有-但不限制于一組蛋白、polIII、β-肌動(dòng)蛋白的啟動(dòng)子)。其它可用的病毒啟動(dòng)子有-但不限制于-腺病毒啟動(dòng)子、胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子和B19細(xì)小病毒啟動(dòng)子。從這里的講授，本領(lǐng)域技術(shù)人員將對(duì)合適啟動(dòng)子的選擇很清楚了。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列在相應(yīng)啟動(dòng)子的控制之下。合適的啟動(dòng)子包括，但不限制于，腺病毒的啟動(dòng)子，比如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子；或異源啟動(dòng)子，比如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子；呼吸道合胞體病毒(RSV)啟動(dòng)子；可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，比如MMT啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子；熱休克啟動(dòng)子；白蛋白啟動(dòng)子；ApoAI啟動(dòng)子；人珠蛋白啟動(dòng)子；病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，比如單純性皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子；逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR(包括上面所描述的修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR)；β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；及人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子。也可以是控制編碼該多肽的基因的自身啟動(dòng)子。
用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系而形成生產(chǎn)細(xì)胞系。用于轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞包括，但不限制于，PE501、PA317、Ψ-2、Ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、GP+E-86、GP+envAM12和DNA細(xì)胞系，如Miller所描述(Human Gene Therapy Vol.1，pp5-14，1990)，可參考全文?？捎帽绢I(lǐng)域的已知方法用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系。這些方法包括，但不限制于，電穿孔、使用脂質(zhì)體和磷酸鈣沉淀。一種可選擇的方法是將逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒載體包裹進(jìn)脂質(zhì)體中或與脂類(lèi)偶聯(lián)，然后注入宿主中。
生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生具感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，此病毒顆粒中包含編碼這些多肽的核酸序列。這樣的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?？捎糜隗w外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞將表達(dá)編碼多肽的核酸序列?？捎糜谵D(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括，但不限制于，胚胎干細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
多肽及其片段、衍生物或類(lèi)似物或表達(dá)它們的細(xì)胞可用作免疫原以產(chǎn)生其抗體。這些抗體可以是多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包含了嵌和的、單鏈的和人源化的抗體以及Fab片段、或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域已知的各種方法可用于這樣的抗體和片段的產(chǎn)生。
所產(chǎn)生的抗本發(fā)明序列相應(yīng)的多肽的抗體可通過(guò)直接將多肽注射給動(dòng)物或?qū)⒍嚯膶?dǎo)入動(dòng)物(最好不是人)而獲得。所得到的抗體可與多肽本身結(jié)合。用這種方法，甚至用只編碼一個(gè)多肽片段的序列也能產(chǎn)生結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。然后，抗體可用來(lái)把多肽從表達(dá)它的組織中分離出來(lái)。
制備單克隆抗體可以用連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的技術(shù)。例如，用雜交瘤技術(shù)(Kohle＆MilsteinNature 256495-497，1975)、Trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等.Immunology Today 472，1983)和EBV-雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生人的單克隆抗體(Cole等MonoclonalAntibodles and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Incpp77-96，1985)。
單鏈抗體產(chǎn)生技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4，946，778)適用于產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可用來(lái)表達(dá)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述。但是本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。所有的份和量，除非另有說(shuō)明都按重量計(jì)。
為便于理解下面的實(shí)施例，先解釋一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語(yǔ)。
“質(zhì)粒”的命名用一小寫(xiě)的p，在前面和/或后面接大寫(xiě)的字母和/或數(shù)字。出發(fā)質(zhì)?？蓮纳虡I(yè)獲得，也可在不受限制的基礎(chǔ)上公開(kāi)獲得，或者按已公布的方法從可獲得的質(zhì)粒構(gòu)建。另外，所描述質(zhì)粒的等價(jià)質(zhì)粒在本領(lǐng)域中已知，對(duì)于一般的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很清楚的。
DNA的“消化”指用限制酶對(duì)DNA進(jìn)行催化性切割，限制酶只作用于DNA序列的特定位點(diǎn)。這里所用的各種限制酶可從商業(yè)獲得，它們的反應(yīng)條件、輔助因子和其它的要求按照一般技術(shù)人員所知的應(yīng)用。為了分析需要，通常在大約20μl的緩沖溶液中加入1μg質(zhì)?；駾NA片段和大約2個(gè)單位的酶。為了分離DNA片段用于質(zhì)粒構(gòu)建，通常在一個(gè)較大的的體積中用20到250個(gè)單位的酶消化5到50μg的DNA。生產(chǎn)廠家會(huì)指明對(duì)特異限制酶合適的緩沖液和底物的量。通常所用的溫育時(shí)間大約是37℃一個(gè)小時(shí)，但根據(jù)廠家的指示可以有所改變。限制性消化之后直接在聚丙烯酰胺膠上進(jìn)行電泳，分離出想要的片段。
根據(jù)所切割成的片段大小進(jìn)行分離可用8％的聚丙烯酰胺凝膠(Goedde等.Nucleic Acids Research 84057，1980)。
“寡核苷酸”指能化學(xué)合成的單鏈多脫氧核糖核苷酸或兩條互補(bǔ)的多脫氧核糖核苷酸鏈。這些合成的寡核苷酸不含有5’端磷酸，所以如果沒(méi)有在激酶作用下用ATP加上一個(gè)磷酸，它就不能與另一個(gè)寡核苷酸連接。合成的寡核苷酸將與沒(méi)有被脫磷酸化的片段連接。
“連接”指在兩個(gè)雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過(guò)程。除非提供了別的方法，連接可以在已知的緩沖液和條件下進(jìn)行，即每0.5mg約等摩爾量的用于連接的DNA片段加10個(gè)單位的T4 DNA連接酶(“連接酶”)。
除非另有說(shuō)明，轉(zhuǎn)化均用Graham＆Van der EbVirology 52456-457，1973中所描述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例1cDRC2的克隆用Trizol(Gibco)試劑按說(shuō)明書(shū)分別提取手術(shù)切除的食管癌標(biāo)本及切端正常組織(病理切片證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞)的總RNA，用無(wú)RNase活性的DNase消化以去除殘留的基因組DNA。紫外分光光度儀定量后，各取3mg總RNA在20ml體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為1 X PCR緩沖液，2.5mMMgCl2，10mM DTT，500mM dNTPs，10mM GTl5N(N代表A，G和C)，Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶200單位(Gibco)，42℃保溫60分鐘后，所得cDNA于-20℃保存。
取0.5mlcDNA在20ml反應(yīng)體系進(jìn)行如下差異顯示PCR(DD-PCR)1XPCR緩沖液，1．5mMgCl2，200mM dNTPs，1mM 10-mmer隨機(jī)引物(Operon)，3mM GT15N (N代表A，G和C)，Taq酶(Gibco)1單位。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性1分鐘，95℃ 15秒，39℃ 4分鐘，72℃ 2分鐘4個(gè)循環(huán)后，95℃ 15秒，39℃ 2分鐘，72℃ 1分鐘再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5分鐘。PCR反應(yīng)在PE9600 PCR系統(tǒng)中進(jìn)行。
DD-PCR產(chǎn)物以食管癌和切端正常組織相臨泳道上樣，于6％的變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)中電泳，用硝酸銀染色后可見(jiàn)清晰的條帶。切下正常組織泳道可見(jiàn)、癌組織泳道缺少的差異帶作為模板，按上述DD-PCR條件進(jìn)行二次擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用Wizard PCR Preps DNA PurificationSystem (Promega)直接回收，克隆于pGEM-T Easy載體(Promega)，用ABIPRISM*377 DNA自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。由此獲得cDRC2的3’端序列。
根據(jù)測(cè)序結(jié)果合成引物，用Marathon cDNA RACE System(Clontech)釣取cDRC2的5’上游序列，克隆測(cè)序后與上述3’端序列拼接。再根據(jù)拼接后的序列兩端合成引物，用PCR方法擴(kuò)增cDRC2全長(zhǎng)cDNA，進(jìn)一步克隆測(cè)序加以驗(yàn)證。結(jié)果，獲得了含有SEQ.ID.NO.1所示核苷酸序列的質(zhì)粒pGEM-T Easy，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌菌株DH5α已于1999年6月23日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國(guó)北京中關(guān)村，100080)保藏，保藏號(hào)為CGMCC 0403。
實(shí)施例2DRC2基因的Northern印跡和RT-PCR分析以克隆的cDRC2 3’端序列為探針，用Primer-a-Gene隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒對(duì)探針進(jìn)行α-32P-dATP/dCTP標(biāo)記。將食管癌和切端正常組織RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜并固定，用標(biāo)記的探針與之進(jìn)行Northern雜交，鑒定克隆的cDNA片段確實(shí)來(lái)自PAGE膠上所切的帶(即切端正常組織表達(dá)，食管癌不表達(dá))同時(shí)估計(jì)DRC2基因的RNA大小。Northern印記的結(jié)果如圖2所示，圖中T1、T2代表食管癌組織，N1、N2代表癌旁組織。
按照cDRC2 3’端序列合成引物，擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR，α-Tubulin用作內(nèi)對(duì)照)分析，RT-PCR分析的結(jié)果見(jiàn)圖3。圖中上邊一行代表α-Tubulin對(duì)照，下邊一行代表DRC2。T代表食管癌組織，N代表癌旁組織，A、B代表食管癌細(xì)胞系。根據(jù)cDRC1在所有切端正常組織標(biāo)本均有PCR產(chǎn)物、而在大多數(shù)食管癌標(biāo)本缺少PCR產(chǎn)物的結(jié)果，判斷cDRC2是與食管癌發(fā)生相關(guān)的基因。
實(shí)施例3DRC2的細(xì)菌表達(dá)和純化編碼pDRC2的cDNA序列用PCR擴(kuò)增，所用的寡核苷酸引物與cDRC2核酸序列的5’和3’末端相應(yīng)。另外的與DRC2基因相應(yīng)的核苷酸也分別加入到5’和3’末端序列中。5’端寡核苷酸引物的序列是5’-CGGCCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3，(SEQ ID No.3)，它包含一個(gè)NcoI限制酶切位點(diǎn)(斜體)，接著是DRC2編碼序列的17個(gè)核苷酸(劃線部分)，從cDRC2開(kāi)放閱讀框序列的第5個(gè)核苷酸開(kāi)始。ATG密碼子包含在NcoI位點(diǎn)中。在ATG之后的那個(gè)密碼子中，第一個(gè)堿基來(lái)自NcoI位點(diǎn)，剩下的兩個(gè)堿基與cDRC2開(kāi)放閱讀框序列的第5-6核苷酸一致。3’端序列為5'-CCCGGATCCACCTGCCCTGGGAGCCTA-3’(SEQ ID No.4)，它包含一個(gè)BamHI位點(diǎn)(斜體)，接著是包含基因終止密碼子的特異序列的18個(gè)核苷酸(下劃線部分)。這些限制酶切位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE-60(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA)上的限制酶切位點(diǎn)一致。pQE-60編碼抗生素抗性(ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)一個(gè)IPTG調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-His標(biāo)記和限制酶切位點(diǎn)。然后用NcoI和BamHI消化pQE-60。將擴(kuò)增的序列連到pQE-60中，插入到編碼組氨酸標(biāo)記和RBS序列的框架中。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15/rep4(Qiagen，Inc.)，所用的方法在Sambrook等著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)中有描述。M15/rep4含有多拷貝的pREP4質(zhì)粒，該質(zhì)粒表達(dá)LacI抑制因子，也表現(xiàn)卡那霉素抗性(Kanr)。轉(zhuǎn)化子在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上鑒定，選擇能生長(zhǎng)的抗性菌落。分離出質(zhì)粒DNA并用限制性分析確認(rèn)。讓含有想要的構(gòu)建體的克隆在補(bǔ)有Amp(100mg/ml)和Kan(25m／ml)的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜生長(zhǎng)(O／N)。再將O／N培養(yǎng)物以1∶100到1∶250的比率接種到大的培養(yǎng)液中。讓細(xì)胞生長(zhǎng)到最佳密度O.D.600在0.4到0.6之間。然后加入終濃度為1mM的IPTG(異丙基-β-D-硫代砒喃半乳糖苷)。IPTG通過(guò)使LacI抑制因子失活而進(jìn)行誘導(dǎo)，清理P/O導(dǎo)致基因表達(dá)增高。再讓細(xì)胞生長(zhǎng)3到4小時(shí)。通過(guò)離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶解在6M的pH5.0鹽酸胍中。澄清之后，在允許包括6-His標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，用鎳螯合柱層析從溶液中純化出溶解的DRC2(Hochuli et al.J chromatography 411177-184，1984)。用6M鹽酸胍將DRC2(純度＞98％)從柱上洗脫下來(lái)。除去鹽酸胍使蛋白質(zhì)復(fù)性可用幾種方案達(dá)到(Jaenicke＆RudolphProtein Structure-A Practical Approach，IRL Press，NewYork，1990)。首先，用分步透析除去鹽酸胍?；蛘撸瑢逆囼现戏蛛x下來(lái)的純化的蛋白結(jié)合到另一個(gè)柱上，這個(gè)柱有一線性降低的鹽酸胍梯度。結(jié)合到這個(gè)柱上時(shí)蛋白質(zhì)就可以復(fù)性了，然后用含有250mM咪唑、150mM NaCl、25mM Tris-HCl pH7.5和10％甘油的緩沖液洗脫下來(lái)。最后，用含有5mM碳酸氫銨的儲(chǔ)存緩沖液對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行透析。
實(shí)施例4重組DRC2在COS細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒DRC2 HA衍生自載體pcDNAI/Amp(Invitrogen，Inc.)，其包括1)SV40復(fù)制起點(diǎn)；2)氨芐青霉素抗性基因；3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；4)CMV啟動(dòng)子，后接一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)域、一個(gè)SV40內(nèi)含子和多聚腺苷化位點(diǎn)。編碼整個(gè)DRC2及其3’末端同框融合的一個(gè)HA標(biāo)記的DNA片段被克隆進(jìn)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，重組蛋白在CMV啟動(dòng)子的支配下表達(dá)。HA標(biāo)記是前面描述過(guò)的流感血細(xì)胞凝集素蛋白(Wilson等Cell37767，1984)的一個(gè)表位。HA標(biāo)記融合到靶蛋白上便于用識(shí)別HA表位的抗體檢出重組蛋白。
下面是質(zhì)粒的構(gòu)建策略編碼pDRC2的cDNA序列用雙引物PCR構(gòu)建5’端引物為5’-CCCAAGCTTCAGCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’(SEQ ID No.5)，它包含一個(gè)HindIII限制酶切位點(diǎn)(斜體)，接著是DRC2編碼序列的25個(gè)核苷酸(下劃線部分)，ATG密碼子為位于HindIII位點(diǎn)后的第5-7堿基。3’端序列是5’-CCCTCTAGACCTCACCTGCCCTGGGAGCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA-3，(SEQ ID No.6)，它包含一個(gè)XbaI位點(diǎn)(斜體)、DRC2基因編碼序列后22個(gè)核苷酸(劃線部分，最后3堿基為終止密碼子)和HA標(biāo)記。所以PCR產(chǎn)物包含一個(gè)HindIII位點(diǎn)、DRC2的完整編碼序列、緊接的融合在同一個(gè)框架的HA標(biāo)記、DRC2的翻譯終止密碼子及其后19堿基的非編碼序列、一個(gè)XbaI位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp用HindIII和XbaI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化并連接起來(lái)。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株SURE(Stratagene，Inc.)。將轉(zhuǎn)化物鋪在氨卞青霉素平板上，選擇抗性菌落。從轉(zhuǎn)化子中分離出質(zhì)粒DNA，并用限制性分析檢查是否出現(xiàn)了正確的片段。為了表達(dá)重組DRC2，通過(guò)DEAE-葡聚糖方法(Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。DRC2-HA蛋白的表達(dá)可用放射性標(biāo)記和免疫沉淀法檢測(cè)(Harlow＆Lane抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1988)。轉(zhuǎn)染后兩天用35S-半胱氨酸標(biāo)記細(xì)胞8小時(shí)，然后收集培養(yǎng)液，用去污劑裂解細(xì)胞(RIPA緩沖液150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mM Tirs，pH7.5)。用一種HA特異的單克隆抗體沉淀細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)液，再用SDS-PAGE分析沉淀蛋白。
實(shí)施例5用桿狀病毒表達(dá)體系克隆和表達(dá)DRC2編碼全長(zhǎng)DRC2蛋白的DNA序列用PCR擴(kuò)增，寡核苷酸引物與基因的5’和3’端序列一致5’端引物序列是5’-CCCGGATCCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’(SEQ ID No.7)，它包含一個(gè)BamHI限制酶切位點(diǎn)(斜體)，接著是DRC2編碼序列的21個(gè)核苷酸(下劃線、部分)，ATG密碼子為位于BamHI位點(diǎn)后的第1-3堿基。3’端序列是5’-CCCGGTACCTCACCTGCCCTGGGAGCCTA-3’(SEQ ID No.8)，它包含一個(gè)Asp781位點(diǎn)(斜體)，接著是包含終止密碼子的DRC2基因20個(gè)核苷酸特異序列(下劃線部分)。擴(kuò)增的序列用一個(gè)商業(yè)上可得到的試劑盒(Qiagen，Inc.)從1％瓊脂糖凝膠中分離出來(lái)。用內(nèi)切酶BamHI和Asp781消化該片段，然后再次在1％瓊脂糖凝膠上純化。該片段被指定為F2。
載體pRGl(pVL941載體的修飾物)被用于桿狀病毒表達(dá)體系中的DRC2蛋白的表達(dá)(Sumers＆Smith桿狀病毒載體和昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)方法手冊(cè)，1987)。此表達(dá)載體包括苜蓿Y紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體蛋白啟動(dòng)子及其后的限制性內(nèi)切酶BamHI和Asp781的識(shí)別位點(diǎn)。猴病毒SV40的多腺苷酸化位點(diǎn)被用于高效多腺苷酸化。為了便于選擇重組病毒，在多角體蛋白啟動(dòng)子的同一方向插入了大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因，后面跟著多角體蛋白基因的多腺苷酸化信號(hào)。多角體蛋白序列兩側(cè)是病毒序列，用于與共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA進(jìn)行細(xì)胞介導(dǎo)的同源重組。許多其它的桿狀病毒載體可代替pRGl，例如pAc373、pVL941和pAcIM1等。
用限制酶BamHI和Asp781消化質(zhì)粒，然后用小牛小腸磷酸酶經(jīng)本領(lǐng)域已知的方法去磷酸化。用商業(yè)所獲得的試劑盒(Qiagen，Inc.)從1％瓊脂糖凝膠中分離出DNA。這個(gè)載體DNA被指定為V2。
F2片段和去磷酸化的質(zhì)粒V2用T4 DNA連接酶連接起來(lái)，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，用BamHI和Asp781酶鑒定出含有帶DRC2基因的質(zhì)粒(pBac-DRC2)的細(xì)菌。被克隆片段的序列用DNA測(cè)序確認(rèn)。
5μg的質(zhì)粒pBac-DRC2與1μg的商業(yè)獲得的線性化桿狀病毒(“BaculoGoldTMbaculovirus DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)一起轉(zhuǎn)染，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(Felgner et al.Proc Natl Acad Sci USA847413-7417，1987)。
1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的質(zhì)粒pBac-DRC2在無(wú)菌的微量滴定板的加樣孔中混合，孔中含有50μl無(wú)血清的Grace氏培養(yǎng)基(LifeTechnologies IncGaithersburg，MD)。再加入10μl脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑和9)μl Grace氏培養(yǎng)液，混勻，室溫下溫育15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物滴加到Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞(ATCC CRL1711)中，這些細(xì)胞用1ml無(wú)血清的Grace氏培養(yǎng)液接種在一塊35mm的組織培養(yǎng)板上。前后晃動(dòng)培養(yǎng)板以混勻新加進(jìn)的溶液，27℃溫育5個(gè)小時(shí)。5小時(shí)后從培養(yǎng)板上移去轉(zhuǎn)染溶液，加入1ml添加了10％胎牛血清的Grace氏昆蟲(chóng)培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板重新放回培養(yǎng)箱中，27℃持續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后收集上清夜，用類(lèi)似于Summers和Smith所描述的方法進(jìn)行噬菌斑試驗(yàn)。改變之處是使用了帶有“Blue Gal”(Life Technologies IncGaithersburg)的瓊脂糖凝膠，它使得可以很容易的分離出藍(lán)色嗜菌斑。(關(guān)于嗜菌斑試驗(yàn)的詳細(xì)描述可參見(jiàn)Life Technologles IncGaithersburg分送的昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)及桿狀病毒學(xué)用戶指導(dǎo)的第9-10頁(yè)。)系列稀釋后四天，病毒進(jìn)到細(xì)胞中，用Eppendorf吸管頭挑取藍(lán)色嗜菌斑。在含有200μl Grace氏培養(yǎng)液的Eppendorf管中重懸含有重組病毒的瓊脂。短暫離心去除瓊脂，含有重組桿狀病毒的上清液用于接種在35mm平皿里的Sf9細(xì)胞。4天后收獲培養(yǎng)皿中的上清液，儲(chǔ)存在4℃。
Sf9細(xì)胞生長(zhǎng)在補(bǔ)充有10％熱滅活FBS的Grace氏培養(yǎng)基中。這些細(xì)胞用重組桿狀病毒V-DRC2感染，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2。6小時(shí)后除去原培養(yǎng)基，用不含甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培養(yǎng)基取代(LifeTechnologies IncGaithersburg)。42小時(shí)后加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi的35S-半胱氨酸(Amersham)。再將細(xì)胞溫育16小時(shí)，離心收獲細(xì)胞，用SDS-PAGE和放射自顯影可看到被標(biāo)記的蛋白。
實(shí)施例6基因治療表達(dá)成纖維細(xì)胞可從一皮膚活組織檢查對(duì)象獲得。所得組織被放到組織培養(yǎng)基中分成小塊。小而厚的組織塊被放到一個(gè)組織培養(yǎng)瓶的潮濕面上，大約每瓶放十塊。將瓶子倒轉(zhuǎn)、蓋緊，室溫中放置過(guò)夜。室溫中24小時(shí)后，倒轉(zhuǎn)瓶子，組織塊仍固定在瓶底，加入新鮮的含有10％FBS、青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基(例如Ham’s F12培養(yǎng)基)。然后在37℃培養(yǎng)約一個(gè)星期。這時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基，此后每隔幾天換一次。再培養(yǎng)兩個(gè)星期后，出現(xiàn)了一單層成纖維細(xì)胞，將其用胰蛋白酶消化并刮入更大的培養(yǎng)瓶中。
pMV-7(Kirschmeier et al.DNA 7219-25，1988)側(cè)翼是Moloney小鼠肉瘤病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列，用EcoRI和HindIII消化它，隨后用小牛小腸鱗酸酶處理。線性的載體在瓊脂糖凝膠上分開(kāi)并用玻璃珠純化出來(lái)。
編碼本發(fā)明多肽的cDNA用PCR擴(kuò)增，引物分別與5’和3’末端序列相符。5’端引物含有一個(gè)EcoRI位點(diǎn)，3’端引物含有一個(gè)HindIII位點(diǎn)。將等量的Moloney小鼠肉瘤病毒的線性骨架擴(kuò)增的EcoRI和HindIII位點(diǎn)片段加在一起，再加入T4 DNA連接酶，保持在適合于兩片段連接的條件下。連接混合物用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌HB101，然后為了確定載體上具有正確插入的基因?qū)⒓?xì)菌鋪到含卡那霉素的瓊脂上。
兼嗜性的pA317或Gp+am12包裝細(xì)胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和鏈霉素的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中組織培養(yǎng)到鋪滿的密度。在培養(yǎng)基中加入含所需基因的載體，用它轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。包裝細(xì)胞產(chǎn)生帶所需基因的具感染力的病毒顆粒(包裝細(xì)胞在此稱(chēng)為生產(chǎn)細(xì)胞)。
在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞中加入新鮮的培養(yǎng)基，隨后從鋪滿生產(chǎn)細(xì)胞的10cm板上收獲培養(yǎng)液。耗盡的培養(yǎng)液中含有具抗感染力的病毒顆粒，用微孔濾膜過(guò)濾除去解離的生產(chǎn)細(xì)胞，這一培養(yǎng)液又用于感染成纖維細(xì)胞。從亞鋪滿的成纖維細(xì)胞除去培養(yǎng)基，快速換為來(lái)自生產(chǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)液。又用新鮮的培養(yǎng)基取代這一培養(yǎng)基。如果病毒的滴度高，那么基本上所有的成纖維細(xì)胞都將被轉(zhuǎn)染，不需要進(jìn)行選擇。如果滴度非常低，那么需要用一個(gè)帶有選擇標(biāo)記諸如neo或his的逆轉(zhuǎn)錄載體。
工程化的成纖維細(xì)胞可以單獨(dú)注入宿主，或者在Cytodex3微載體珠上生長(zhǎng)到鋪滿時(shí)注入宿主。這時(shí)，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物。
根據(jù)上面的講授，可能對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變異，所以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以以不同于已具體描述的方式實(shí)施。
序列表SEQ ID No.1cDRC21，949bp，5’-3’ORF41-1，480(1，440bp)479aa1 GGAACCGCCC GCTGCCAGCC CGGCCAGGCA CCCCTGCAGC ATGGCCTGGA51 ACACCAACCT CCGCTGGCGG CTGCCGCTCA CCTGCCTGCT CCTGCAGGTG101 ATTATGGTGA TTCTCTTCGG GGTGTTCGTG CGCTACGACT TCGAGGCCGA151 CGCCCACTGG TGGTCAGAGA GGACGCACAA GAACTTGAGC GACATGGAGA201 ACGAATTCTA CTATCGCTAC CCAAGCTTCC AGGACGTGCA CGTGATGGTC251 TTCGTGGGCT TCGGCTTCCT CATGACTTTC CTGCAGCGCT ACGGCTTCAG301 CGCCGTGGGC TTCAACTTCC TGTTGGCAGC CTTCGGCATC CAGTGGGCGC351 TGCTCATGCA GGGCTGGTTC CACTTCTTAC AAGACCGCTA CATCGTCGTG401 GGCGTGGAGA ACCTCATCAA CGCTGACTTC TGCGTGGCCT CTGTCTGCGT451 GGCCTTTGGG GCAGTTCTGG GTAAAGTCAG CCCCATTCAG CTGCTCATCA501 TGACTTTCTT CCAAGTGACC CTCTTCGCTG TGAATGAGTT CATTCTCCTT551 AACCTGCTAA AGGTGAAGGA TGCAGGAGGC TCCATGACCA TCCACACATT601 TGGCGCCTAC TTTGGGCTCA CAGTGACCCG GATCCTCTAC CGACGCAACC651 TAGAGCAGAG CAAGGAGAGA CAGAATTCTG TGTACCAGTC GGACCTCTTT701 GCCATGATTG GCACCCTCTT CCTGTGGATG TACTGGCCCA GCTTCAACTC751 AGCCATATCC TACCATGGGG ACAGCCAGCA CCGAGCCGCC ATCAACACCT801 ACTGCTCCTT GGCAGCCTGC GTGCTTACCT CGGTGGCAAT ATCCAGTGCC851 CTGCACAAGA AGGGCAAGCT GGACATGGTG CACATCCAGA ATGCCACGCT901 CGCAGGAGGG GTGGCCGTGG GTACCGCTGC TGAGATGATG CTCATGCCTT951 ACGGTGCCCT CATCATCGGC TTCGTCTGCG GCATCATCTC CACCCTGGGT1001 TTTGTATACC TGACCCCATT CCTGGAGTCC CGGCTGCACA TCCAGGACAC1051 ATGTGGCATT AACAATCTGC ATGGCATTCC TGGCATCATA GGCGGCATCG1101 TGGGTGCTGT GACAGCGGCC TCCGCCAGCC TTGAAGTCTA TGGAAAAGAA1151 GGGCTTGTCC ATTCCTTTGA CTTTCAAGGT TTCAACGGGG ACTGGACCGC1201 AAGAACACAG GGAAAGTTCC AGATTTATGG TCTCTTGGTG ACCCTGGCCA1251 TGGCCCTGAT GGGTGGCATC ATTGTGGGGC TCATTTTGAG ATTACCATTC1301 TGGGGACAAC CTTCAGATGA GAACTGCTTT GAGGATGCGG TCTACTGGGA1351 GATGCCTGAA GGGAACAGCA CTGTCTACAT CCCTGAGGAC CCCACCTTCA1401 AGCCCTCAGG ACCCTCAGTA CCCTCAGTAC CCATGGTGTC CCCACTACCC1451 ATGGCTTCCT CGGTACCCTT GGTACCCTAG GCTCCCAGGG CAGGTGAGGA1501 GCAGGCTCCA CAGACTGTCC TGGGGCCCAG AGGAGCTGGT GCTGACCTAG1551 CTAGGGATGC AAGAGTGAGC AAGCAGCACC CCCACCTGCT GGCTTGGCCT1601 CAAGGTGCCT CCACCCCTGC CCTCCCCTTC ATCCCAGGGG GTCTGACTGA1651 GAATGGAGAA GGAGAAGCTA CAAAGTGGGC ATCCAAGCCG GGTTCTGGCT1701 GCAGAAGTTC TGCCTCTGCC TGGGGTCTTG GCCACATTGG AGAAAAACAG1751 GCTCAAAGTG GGGCTGGGAC CTGGTGGGTG AACCTGAGCT CTCCCAGGAG1801 ACAACTTAGC TGCCAGTCAC CACCTATGAG GCTCTTCTAC CCCGTGCCTG1851 CACCTCGGCC AGCATCTCCT ATGCTCCCTG GGTCCCCCAG ACCTCTCTGT1901 GTTGTGTGCG TGGCAGCCTC CAGGAATAAA CATTCTTGTT GTCCTTTGCSEQ ID No.2pDRC2(479aa)MAWNTNLRWRLPLTCLLLQVIMVILFGVFVRYDFEADAHWWSERTHKNLSDMENEFYYRYPSFQDVHVMVFVGFGFLMTFLQRYGFSAVGFNFLLAAFGIQWALLMQGWFHFLQDRYIVVGVENLINADFCVASVCVAFGAVLGKVSPIQLLIMTFFQVTLFAVNEFILLNLLKVKDAGGSMTIHTFGAYFGLTVTRILYRRNLEQSKERQNSVYQSDLFAMIGTLFLWMYWPSFNSAISYHGDSQHRAAINTYCSLAACVLTSVAISSALHKKGKLDMVHIQNATLAGGVAVGTAAEMMLMPYGALIIGFVCGIISTLGFVYLTPFLESRLHIQDTCGINNLHGIPGIIGGIVGAVTAASASLEVYGKEGLVHSFDFQGFNGDWTARTQGKFQIYGLLVTLAMALMGGIIVGLILRLPFWGQPSDENCFEDAVYWEMPEGNSTVYIPEDPTFKPSGPSVPSVPMVSPLPMASSVPLVPSEQ ID No.35’-CGGCCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’ 26bpSEQ ID No. 4: 5’-CCCGGATCCACCTGCCCTGGGAGCCTA-3’27bpSEQ ID No. 5: 5’-CCCAAGCTTCAGCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’ 34bpSEQ ID No. 6: 5’-CCCTCTAGACCTCACCTGCCCTGGGAGCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA-3’ 58bpSEQ ID No. 7: 5’-CCCGGATCCATGGCCTGGAACACCAACCTC-3’ 30bpSEQ ID No. 8: 5’-CCCGGTACCTCACCTGCCCTGGGAGCCTA-3’
權(quán)利要求
1．一種分離的多核苷酸，包括選自下組的成員(a) 編碼SEQ ID No.2所示多肽的多核苷酸；(b)能與(a)的多核苷酸雜交并與其有至少70％一致性的多核苷酸；和(c)(a)或(b)多核苷酸的多核苷酸片段。
2．權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3．權(quán)利要求2的多核苷酸，其編碼含SEQ ID No.2中從1到479位氨基酸的多肽。
4．權(quán)利要求2的多核苷酸，其核苷酸序列選自SEQ ID No.1的核苷酸序列。
5．一種分離的多核苷酸，包括選自下組的成員(a)編碼CGMCC保藏號(hào)0403(cDRC2)的克隆所含cDNA所編碼的成熟多肽的多核苷酸；(b)能與(a)的多核苷酸雜交并與其有至少70％一致性的多核苷酸；和(c)(a)或(b)多核苷酸的多核苷酸片段。
6．含有權(quán)利要求2的DNA的載體。
7．用權(quán)利要求7的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
8．一種產(chǎn)生多肽的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞以表達(dá)所述DNA編碼的多肽，并從培養(yǎng)物中回收目標(biāo)多肽。
9．一種產(chǎn)生能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
10．選自下組的一種多肽(a)具有SEQ ID No.2的推定氨基酸序列的多肽或其片段、類(lèi)似物和衍生物；(b)CGMCC保藏號(hào)0403的克隆所含cDNA編碼的多肽或其片段、類(lèi)似物和衍生物。
11．抗權(quán)利要求10的多肽的抗體。
12．含有權(quán)利要求1或5的多核苷酸或權(quán)利要求10的多肽和藥用載體的藥物組合物。
13．體外診斷與權(quán)利要求10的多肽的表達(dá)有關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，包括在來(lái)自宿主的樣品中(a)測(cè)定編碼所述多肽的基因核酸序列中的突變、缺失及重排；和/或(b)測(cè)定編碼所述多肽的基因核酸序列中的甲基化；和/或(c)測(cè)定編碼所述多肽的基因mRNA的異常。
14．一種疾病的體外診斷方法，包括在來(lái)自宿主的樣品中分析權(quán)利要求10的多肽的存在或量的改變。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了分離的食管癌相關(guān)新基因DRC2的DNA、RNA及其編碼的多肽,以及應(yīng)用重組技術(shù)產(chǎn)生這種多肽的方法。并且公開(kāi)了通過(guò)檢測(cè)該基因核酸序列突變、甲基化、RNA及多肽水平的改變,檢測(cè)與該基因的核酸及其編碼多肽異常有關(guān)的疾病的診斷方法,也公開(kāi)了利用該基因的核酸序列和多肽治療與該基因異常有關(guān)的疾病(如腫瘤和癌癥)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1283694SQ9911752
公開(kāi)日2001年2月14日 申請(qǐng)日期1999年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月10日
發(fā)明者王明榮, 許智雄, 徐昕, 蔡巖, 韓亞玲, 王子平, 吳孔明, 王秀琴, 吳旻 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所