專利名稱：用新的復(fù)性方法制備組織型纖溶酶原激活劑重組異構(gòu)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物。
組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)的39KD重組異構(gòu)體(簡(jiǎn)稱r-PA)是t-PA的一種分子改造衍生物。它包含有野生型t-PA的Kringle 2結(jié)構(gòu)域和蛋白酶結(jié)構(gòu)域，不含糖基化位點(diǎn)。r-PA具有t-PA的溶血栓活性，但半衰期延長(zhǎng)，并且出血副作用小，比t-PA具有使用方便、安全、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，是取代t-PA的理想溶血栓藥物。
因?yàn)閞-PA不含糖基化位點(diǎn)，可以用大腸桿菌來(lái)表達(dá)。我們構(gòu)建了高效表達(dá)r-PA的工程菌以表達(dá)r-PA。由于r-PA含有十對(duì)二硫鍵，用細(xì)菌表達(dá)的r-PA形成包含體形式，溶解變性后用常規(guī)方法復(fù)性很難正確折疊和復(fù)性成活性形式。這是由于組成十對(duì)二硫鍵的20個(gè)半胱氨酸在復(fù)性時(shí)錯(cuò)誤配對(duì)造成的。為了提高變性r-PA的復(fù)性率，我們發(fā)明了用二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)促進(jìn)復(fù)性的生產(chǎn)工藝，我們?cè)趓-PA的復(fù)性體系中加入重組人二硫鍵異構(gòu)酶(rhPDI)，使錯(cuò)配的二硫鍵打開(kāi)重新形成正確的二硫鍵，從而提高復(fù)性率，最終提高r-PA的產(chǎn)率，降低成本，并可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明原理是二硫鍵異構(gòu)酶PDI可以特異性地作用于蛋白分子中錯(cuò)配的二硫鍵，打開(kāi)該錯(cuò)配二硫鍵，并促進(jìn)其形成正確配對(duì)的二硫鍵，完成分子結(jié)構(gòu)重排，形成正確活性形式，達(dá)到復(fù)性目的。
本發(fā)明的目的使用二硫鍵異構(gòu)酶催化變性的r-PA形成正確配對(duì)的二硫鍵，從而復(fù)性成正確的有活性的分子構(gòu)型。這樣可提高r-PA的復(fù)性率，降低異構(gòu)體比例，簡(jiǎn)化后續(xù)純化步驟，由此提高r-PA的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
技術(shù)方案用工程菌表達(dá)r-PA→菌體破碎→包含體分離→鹽酸胍變性溶解→在復(fù)性體系中按一定比例加入重組人PDI以催化r-PA的復(fù)性→脫鹽→親和層析→陽(yáng)離子交換層析，經(jīng)上述步驟，即可制備得到純度大于95％，比活性達(dá)到6×105IU/mg的r-PA。
最佳實(shí)施例r-PA復(fù)性體系如下50mMTris,pH7～10，氧化型谷胱甘肽10～1mM，還原型谷胱甘肽1～0.1mM,r-PA蛋白濃度0.01～1mg/ml。在此復(fù)性體系中加入重組人二硫鍵異構(gòu)酶PDI，使r-PA與PDI的摩爾比為100∶1～10∶1。在加入PDI的復(fù)性體系中進(jìn)行復(fù)性，r-PA的復(fù)性率比不加PDI時(shí)有顯著提高，二硫鍵錯(cuò)配造成的異構(gòu)體比例大大降低，r-PA的終產(chǎn)率也相應(yīng)提高。
r-PA制備方法如下將表達(dá)后的r-PA工程菌菌體離心收集，懸浮于50mM Tris,pH8.0，超聲破碎并10000×g，30分鐘離心后制得r-PA包含體。包含體用6M鹽酸胍，50mM Tris,100mMDTT充分溶解后，10000×g，30分鐘離心，取上清，即為變性的r-PA。
將變性的r-PA逐滴滴入加入PDI的復(fù)性體系中，使得r-PA終濃度達(dá)到0.1mg/ml，室溫下放置過(guò)夜。將上述復(fù)性液超濾脫鹽后，用親和層析柱純化，再經(jīng)過(guò)CM-Sepharose柱層析(平衡緩沖20mM PB,pH6.0,0～1MNaCl線性梯度洗脫)，得到純度＞95％，比活性＞6×105IU/mg的r-PA。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種用PDI促進(jìn)變性r-PA折疊復(fù)性以制備r-PA的新型工藝方法。它與國(guó)外傳統(tǒng)的r-PA生產(chǎn)工藝相比具有以下特點(diǎn)①變性r-PA復(fù)性率高。②復(fù)性體系中r-PA蛋白濃度提高，復(fù)性體積減少，操作方便，節(jié)省試劑。③異構(gòu)體比例低，簡(jiǎn)化了后續(xù)純化步驟。④提高r-PA產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。上述優(yōu)勢(shì)使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性與工藝先進(jìn)性，成本降低，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)r-PA。
權(quán)利要求
1.用一種新的復(fù)性方法制備組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構(gòu)體(r-PA)。其特征在于在變性r-PA的復(fù)性體系中加入二硫鍵異構(gòu)酶，以提高r-PA的復(fù)性率。
2.組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構(gòu)體(r-PA)的制備工藝，其特征在于經(jīng)過(guò)工程菌表達(dá)→菌體破碎→包含體分離→變性→PDI催化復(fù)性→脫鹽→親和層析→陽(yáng)離子交換層析等步驟完成。
3.如權(quán)利要求2所述的組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構(gòu)體(r-PA)的變性，其特征在于用鹽酸胍作為變性劑，變性體系含6M鹽酸胍，20～100mM Tris,10～100mM DTT,pH7～10。
4.如權(quán)利要求2所述的PDI催化的組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構(gòu)體(r-PA)的復(fù)性，其特征在于PDI為重組人PDI或其它來(lái)源的PDI,r-PA與PDI的摩爾比為100∶1～10∶1。
5.如權(quán)利要求2所述的陽(yáng)離子交換層析，其特征在于采用CM-Sepharose陽(yáng)離子交換柱，洗脫條件是0～1M NaCl,pH7～10，最佳洗脫濃度是0.2～0.3M NaCl。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用二硫鍵異構(gòu)酶PDI促進(jìn)變性的組織型纖溶酶原激活劑39KD重組異構(gòu)體(r－PA)正確折疊并提高其復(fù)性率的新型方法。在r－PA的復(fù)性體系中加入一定比例的PDI,可以使r－PA中錯(cuò)誤配對(duì)的二硫鍵打開(kāi)并形成正確的二硫鍵,從而提高復(fù)性率,降低異構(gòu)體比例,簡(jiǎn)化后續(xù)純化工藝,提高r－PA產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1299822SQ9912041
公開(kāi)日2001年6月20日 申請(qǐng)日期1999年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月13日
發(fā)明者王革 申請(qǐng)人:王革