專利名稱：超聲波處理花粉介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物基因轉(zhuǎn)化的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
隨著人口增長、環(huán)境污染、土地貧瘠造成的可耕地面積不斷縮小及原材料的逐漸減少，人類對(duì)作物品質(zhì)改良的要求也越來越緊迫。過去傳統(tǒng)的雜交育種方式，主要從降低株高、縮短生長發(fā)育時(shí)間和利用雜種優(yōu)勢大幅度地提高產(chǎn)量。但是在現(xiàn)階段，改良作物品質(zhì)已經(jīng)不能單純依靠傳統(tǒng)的雜交育種手段，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的生物技術(shù)近幾年來進(jìn)展迅速，成為農(nóng)業(yè)、食品、化學(xué)材料、醫(yī)藥、環(huán)境等研究領(lǐng)域的重要發(fā)展動(dòng)力。
自1983年第一例轉(zhuǎn)基因植物問世以來，雖然只有16年的時(shí)間，但植物基因工程的發(fā)展卻日新月異，碩果累累。植物基因工程使作物育種從雜交育種走向了基因育種，極大地拓寬了作物育種的深度和廣度。人們已能夠跨越物種間的界限，定向地改造作物性狀，從而使作物育種的進(jìn)度大大加快。迄今為止，利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已在培育抗病、抗蟲作物品種、改良作物品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量和抗逆性等方面取得了顯著進(jìn)展，已有一批轉(zhuǎn)基因植物投入生產(chǎn)。
在農(nóng)作物基因轉(zhuǎn)化研究中，植物基因轉(zhuǎn)化方法對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化是至關(guān)重要的，它決定了如何高效地將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，并再生出轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法是目前研究最多、理論機(jī)理最清楚、技術(shù)方法最成熟的基因轉(zhuǎn)化方法。但是該方法存在著宿主范圍小、菌株特異性強(qiáng)等問題，其最大的缺點(diǎn)是僅適用于大多數(shù)的雙子葉植物，對(duì)于單子葉植物，特別是禾本科植物不敏感，從而限制了它的適用范圍。然而，由于主要的禾谷類糧食作物都屬于單子葉植物，因此，單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化研究更具有重大的意義。
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，包括PEG介導(dǎo)法、電擊法、微針注射法等的最大優(yōu)點(diǎn)是無宿主范圍，適用于各種作物，特別是能應(yīng)用于單子葉植物。其另一個(gè)重要特點(diǎn)是通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得的再生植物無嵌合體發(fā)生，有利于生產(chǎn)實(shí)踐的應(yīng)用。而且能夠一次處理很多原生質(zhì)體，是瞬間表達(dá)研究的較好系統(tǒng)。但是目前對(duì)于大多數(shù)的植物而言，原生質(zhì)體培養(yǎng)仍然比較困難，再生頻率低，重復(fù)性差，不易獲得轉(zhuǎn)化植株，特別是單子葉植物原生質(zhì)體的培養(yǎng)更困難，因此，這種轉(zhuǎn)化方法比以組織或器官為受體的轉(zhuǎn)化方法要復(fù)雜得多，困難得多。
基因槍法是近年來迅速發(fā)展起來的轉(zhuǎn)化方法，它克服了以原生質(zhì)體為受體細(xì)胞的缺點(diǎn)，可適用于任何植物和材料。但是應(yīng)該看到，這種轉(zhuǎn)化方法設(shè)備復(fù)雜昂貴，耗資大，轉(zhuǎn)化率低，不易得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，而且該方法也是以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)周期較長。該項(xiàng)技術(shù)目前還不成熟，外源DNA整合的機(jī)理尚不清楚，整合的外源DNA結(jié)構(gòu)變化復(fù)雜，拷貝數(shù)較多，遺傳性較差等問題，尚需進(jìn)一步的完善和深入研究。而且這種方法的關(guān)鍵取決于受體外植體的選擇，所選擇的轟擊受體，一定要具有強(qiáng)的器官分化潛能。
許寧等進(jìn)行了超聲波誘導(dǎo)動(dòng)植物細(xì)胞外源基因?qū)氲膶?shí)驗(yàn)，并且在WO專利91/00358研究的基礎(chǔ)上，給出了一種超聲波誘導(dǎo)植物組織基因轉(zhuǎn)移的方法CN1180746A。該方法是將植物組織塊經(jīng)預(yù)處理后放入盛著適合于植物組織培養(yǎng)且含外源DNA的緩沖液的容器中，再將超聲波探頭置于容器壁上或直接伸入溶液中，開啟超聲波，在脈沖型超聲波的作用下，將外源基因?qū)胫参锝M織塊中。這種基因?qū)氲姆椒冗m合雙子葉植物，也適合于單子葉植物，特別是禾谷類作物的基因轉(zhuǎn)化，具有設(shè)備便宜，轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點(diǎn)。但是，該方法仍需要用組織培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，依然擺脫不了進(jìn)行植物組織的離體培養(yǎng)這一復(fù)雜的操作過程。
德國專利DE 3724154公開了一種將基因轉(zhuǎn)入植物的方法，該專利在否定了成熟的花粉粒能夠作為外源基因?qū)氲妮d體的前提下，提出了一種利用未成熟的花粉粒作為靶細(xì)胞的新的植物基因轉(zhuǎn)移方法。該方法是在營養(yǎng)溶液中從花藥分離未成熟的花粉粒，并移除它們所附著的組織，在一種營養(yǎng)溶液中培養(yǎng)這些分離的未成熟的花粉粒，在體外培養(yǎng)和成熟過程中轉(zhuǎn)移外源遺傳物質(zhì)至花粉粒，在體外使轉(zhuǎn)化的花粉粒完全成熟，最后，用轉(zhuǎn)化的花粉粒向受體植物傳粉，并從受體植物得到種子。該方法由于細(xì)胞培養(yǎng)期大大縮短，與其他方法比較，步驟大大簡化，特別是省去了伴有較麻煩的體細(xì)胞克隆變異現(xiàn)象的再生階段。而且該方法采用來成熟的花粉粒，避免了花粉粒立即產(chǎn)生花粉管，使基因不能轉(zhuǎn)化的缺點(diǎn)，延長了外源基因進(jìn)入花粉粒的時(shí)間，使轉(zhuǎn)化率得以提高。但是，該轉(zhuǎn)化方法的實(shí)質(zhì)只是利用花粉粒作為一種基因?qū)氲闹虚g體，外源基因的導(dǎo)入仍需使用諸如農(nóng)桿菌共培養(yǎng)、電激法、微針注射法等轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作仍然復(fù)雜。
Van der Leede-plegt等和董云洲等曾用基因槍直接轟擊花粉獲得了轉(zhuǎn)基因植株。但是基因槍直接轟擊花粉時(shí)，花粉容易濺起，而很不易操作。而且由于未遭受基因槍轟擊的花粉粒較基因槍轟擊過的轉(zhuǎn)化花粉在授粉時(shí)具有較強(qiáng)的競爭力，而容易受精，使得轉(zhuǎn)化效率降低。
本發(fā)明的目的是提供一種新的植物基因轉(zhuǎn)化方法，即利用超聲波誘導(dǎo)，采用花粉介導(dǎo)，促使外源DNA導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，進(jìn)行植物基因轉(zhuǎn)化的方法。
本發(fā)明的具體方案是在植物盛花期，取當(dāng)天開花的新鮮花粉，置于由5-15％蔗糖溶液組成的介質(zhì)溶液中，與外源質(zhì)粒DNA相混合，并輔以超聲波處理，然后將處理過的花粉授于植物柱頭上，套袋掛牌標(biāo)記，并最終從受體上收獲種子，在后代中篩選轉(zhuǎn)化植株。
超聲波處理的方法是采用聲強(qiáng)為200-300W的超聲波處理溶液，每次處理5秒，間隔10秒，共處理5-8次。
由于花粉粒在溶液中極易吸脹破裂而失去生活能力，因此，不能直接將質(zhì)粒DNA溶液與花粉混合，必須選擇含一定溶質(zhì)的溶液作為介質(zhì)，使質(zhì)粒DNA吸附于花粉粒上或進(jìn)入到花粉粒中，并維持花粉粒正常的膨壓。一定濃度的蔗糖溶液能夠維持花粉粒內(nèi)外的滲透壓，防止花粉粒吸水膨脹而喪失生活力，而且能促進(jìn)花粉粒萌發(fā)。然而隨著溶液中蔗糖濃度的提高，花粉粒的受損率也會(huì)增加，因此，我們選擇5％-15％的蔗糖溶液作為花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的介質(zhì)溶液。
為達(dá)到一定的基因轉(zhuǎn)化效率，外源質(zhì)粒DNA的濃度應(yīng)不低于40ug/L。
研究發(fā)現(xiàn)，超聲波的空化效應(yīng)是造成外源基因進(jìn)入細(xì)胞的重要機(jī)制。所謂空化效應(yīng)，就是液體中存在的一些小氣泡在超聲波作用下表現(xiàn)出的空泡湮滅過程。空化效應(yīng)發(fā)生時(shí)，在空化中心會(huì)產(chǎn)生局部的高溫高壓，甚至產(chǎn)生電離效應(yīng)及放電，導(dǎo)致空泡周圍的細(xì)胞壁產(chǎn)生局部的穿孔以及質(zhì)膜產(chǎn)生破損或局部和暫時(shí)的結(jié)構(gòu)改變。從而使溶液中的DNA分子籍此擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。超聲波所特有的這種空化作用以及穿透力大，在液體和固體中傳播時(shí)衰減小，界面反射使物質(zhì)受超聲波作用面積較大等特點(diǎn)，極可能是造成高效、瞬間表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的重要原因。這些特點(diǎn)使得超聲波基因轉(zhuǎn)化具有操作簡單、設(shè)備便宜、不受宿主范圍限制、轉(zhuǎn)化率高等優(yōu)勢。因此，我們利用超聲波的這種瞬間釋放出的高能和空化作用，促使外源質(zhì)粒DNA進(jìn)入到花粉的細(xì)胞核中。但是我們發(fā)現(xiàn)，在花粉粒的表面有一些核酸酶，如果將花粉粒與外源DNA直接混合，花粉粒表面的核酸酶會(huì)在幾分鐘內(nèi)將外源DNA降解掉而不能實(shí)現(xiàn)外源DNA的遺傳轉(zhuǎn)化。
進(jìn)而我們又發(fā)現(xiàn)超聲波處理不僅能夠促進(jìn)外源質(zhì)粒DNA進(jìn)入到花粉的細(xì)胞核內(nèi)，而且超聲波的高能作用還可以將花粉表面的核酸酶破壞掉，以防止核酸酶在介質(zhì)溶液中降解外源DNA。有效地保護(hù)外源DNA進(jìn)入植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明利用超聲波的高能和空化作用，將外源質(zhì)粒DNA成功地通過花粉導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，成為一種利用花粉作為載體的新的外源基因?qū)敕椒ā?br> 利用花粉作為載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化，既避免了傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法所要求的組織培養(yǎng)技術(shù)，以及長期組織培養(yǎng)所帶來的再生困難，幼苗早期夭亡、后代育性不正常、易產(chǎn)生變異等一系列問題，又避免了轉(zhuǎn)化體細(xì)胞所帶來的易形成嵌合體的問題，同時(shí)也避免了基因槍法轉(zhuǎn)化所帶來的耗資大、組織培養(yǎng)復(fù)雜、轉(zhuǎn)化率低以及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體分離困難等問題。因此，本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化方法簡便、有效、實(shí)用性強(qiáng)，所用儀器設(shè)備簡單、易操作、耗資少，具有較好的應(yīng)用前景。
我們采用本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化方法，首先在玉米上進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化獲得了成功。
玉米是重要的糧食作物，其遺傳轉(zhuǎn)化在國內(nèi)外都非常重視。目前已用超聲波法、基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電激法等方法獲得了轉(zhuǎn)基因植株。但是這些方法都需要用愈傷組織甚至是原生質(zhì)體作為受體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，玉米從愈傷組織到分化出再生植株，常出現(xiàn)變異，而且轉(zhuǎn)化植株在從試管移到田間(溫室)的過程中也易受損失，如植株夭亡和產(chǎn)生不育株等，使這些方法的應(yīng)用受到了很大限制。本發(fā)明提出的由花粉介導(dǎo)的、經(jīng)超聲波處理的轉(zhuǎn)基因方法，給玉米的遺傳轉(zhuǎn)化提供了一種簡便、有效的基因轉(zhuǎn)化新技術(shù)。
下面是本發(fā)明應(yīng)用于玉米基因轉(zhuǎn)化的具體應(yīng)用實(shí)例。
供體質(zhì)粒DNA的制備以質(zhì)粒pGLII-RC-1為基因供體材料。該質(zhì)粒攜帶有幾丁質(zhì)酶(chitinase)基因和潮霉素的抗性(hph)基因，其中hph基因?yàn)檫x擇標(biāo)記基因，它賦予植物以對(duì)潮霉素的抗性。幾丁質(zhì)酶基因片段大小為1.1kb。其物理圖譜如

圖1所示。質(zhì)粒DNA的制備采用裂解法。
受體材料太9101，E28，太早9505，5003，太早921，黃早4，海921，422，綜31，太411，自330等玉米(Zea may L.)自交系。
轉(zhuǎn)化方法供試玉米自交系在5月上旬播種，7月上、中旬抽穗、開花。抽絲前套袋隔離。在盛花期選取當(dāng)天開花的玉米花粉，于5％蔗糖溶液中與質(zhì)粒DNA混合，并采用寧波新芝科器研究所的JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎儀；以300W聲強(qiáng)的超聲波處理溶液8次，每次處理時(shí)間5秒，間隔10秒。之后將處理過的花粉授于剪短的玉米花絲上，并套袋掛牌標(biāo)記。
轉(zhuǎn)化結(jié)果按上述轉(zhuǎn)化方法，對(duì)供試材料進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化處理。共處理155穗，結(jié)實(shí)21穗，每穗結(jié)實(shí)粒數(shù)1-20粒不等，共收獲種子56粒，見表1。
表1轉(zhuǎn)化處理及結(jié)實(shí)情況<
轉(zhuǎn)化處理后的種子第二年春天播種，出苗54株(T1代)。在植株長到五、六片葉時(shí)取幼嫩葉片，提取總DNA，進(jìn)行分子檢測以確定轉(zhuǎn)化率。DNA斑點(diǎn)雜交轉(zhuǎn)化處理后第一代植株，采用Pich和Schubert的方法，提取單株葉片的總DNA，用地高辛標(biāo)記幾丁質(zhì)酶基因，用BamHI和HindIII雙酶切pGLII-RC-1質(zhì)粒，并回收1.1kb的幾丁質(zhì)酶基因片段，采用德國寶靈曼公司的Dig DNA Labeling and Detection Kit進(jìn)行幾丁質(zhì)酶基因的探針標(biāo)記和斑點(diǎn)雜交。用10ug的總DNA點(diǎn)于尼龍膜上，80℃烘烤2小時(shí)，68℃雜交。對(duì)28個(gè)轉(zhuǎn)化單株總DNA以及未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株進(jìn)行DNA斑點(diǎn)雜交，結(jié)果有14株呈陽性，未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株均為陰性。DNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果見表2。
表2 DNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果
圖2是其中13個(gè)轉(zhuǎn)化單株和未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株進(jìn)行DNA斑點(diǎn)雜交的結(jié)果。其中1A為太9101未轉(zhuǎn)化株；2A-3C分別為太9101不同的轉(zhuǎn)化單株，其中陽性斑點(diǎn)分別是太9101-11、太9101-18、太9101-3；4C-2D為綜31不同的轉(zhuǎn)化單株，分別是綜31-2、綜31-4、綜31-1；3D為綜31未轉(zhuǎn)化單株；4D為陽性對(duì)照(質(zhì)粒)。
PCR擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因的核苷酸序列，分別取5′端和3′端20bp的核苷酸對(duì)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物合成由上海生工生物工程公司完成。兩引物間的基因片段大小為923bp。PCR擴(kuò)增用大連寶生物公司的TaKaRa TaqTM試劑盒和PTC-200型PCR儀完成。對(duì)DNA斑點(diǎn)雜交呈陽性的太9101-3、太9101-11、太9101-18、綜31-4、綜31-2、綜31-1等單株，用100-150ng總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94℃5分鐘，94℃30秒，50℃30秒，72℃1分30秒，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10分鐘。PCR的檢測結(jié)果均為陽性，而未轉(zhuǎn)化對(duì)照單株為陰性，說明幾丁質(zhì)酶基因確實(shí)已導(dǎo)入到玉米植株中。PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果見圖3。
圖3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析(1.5％瓊脂糖凝膠)圖，其中1為分子量標(biāo)記；2為綜31未轉(zhuǎn)基因株；3、4、5分別為綜31轉(zhuǎn)基因株綜31-2、綜31-4、綜31-1；6為太9101未轉(zhuǎn)基因株；7、8、9分別為太9101轉(zhuǎn)基因株太9101-11、太9101-18、太9101-3；10為陽性對(duì)照(質(zhì)粒)。
利用本發(fā)明方法對(duì)玉米11個(gè)自交系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，根據(jù)DNA斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果證明，外源基因的確已導(dǎo)入到受體植物上，而且轉(zhuǎn)化率達(dá)到了48.28‰。
權(quán)利要求
1.一種超聲波處理花粉介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于該方法是取盛花期的植物新鮮花粉，于介質(zhì)溶液中與外源DNA混合，并對(duì)此溶液進(jìn)行超聲波處理，將處理后的花粉授于植物柱頭上，并從受體上收獲種子，在后代中篩選轉(zhuǎn)化植株。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用超聲波處理的花粉介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化方法。具體是將盛花期的新鮮花粉與質(zhì)粒DNA混合,并附加超聲波處理,然后輔以人工授粉的方法將外源基因?qū)氲绞荏w中。轉(zhuǎn)化結(jié)果經(jīng)DNA斑點(diǎn)雜交和PCR擴(kuò)增檢測得以證實(shí)。本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法簡便、易操作,具有很強(qiáng)的實(shí)用性。
文檔編號(hào)C12N15/87GK1250100SQ9912115
公開日2000年4月12日 申請(qǐng)日期1999年10月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月19日
發(fā)明者孫毅, 王景雪, 崔貴梅 申請(qǐng)人:山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心